ارزیابی اثر سیتوسیدالی مگنتوزوم باکتری مگنتواسپریلیم گریفس والدنز بر روی رده سلولی سرطان سینه

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه آزاد اسلامی شیراز، دانشکده علوم پایه، گروه میکروب شناسی، کرمانشاه، ایران

2 دانشگاه آزاد اسلامی واحد زنجان، مرکز تحقیقات بیولوژی، زنجان، ایران

چکیده

هدف: هدف از این پژوهش خالص‏سازی مگنتوزوم باکتری مگنتواسپریلیم گریفس والدنز و بررسی اثر سیتوتوکسیسیتی نانو ذرات مگنتوزوم خالص شده بر علیه رده سلولی سرطان سینه است.
مواد و روش‏ها: پس از تهیه سویه استاندارد، باکتری بر روی محیط DSMZ براث کشت داده شد و در دمای 28 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 10-7 روز در شرایط میکروائروفیل انکوبه شد. جهت اطمینان از آزمون‏های فنوتیپی و روش مولکولی PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی MT1166 و عکسبرداری با میکروسکوپ الکترونی انجام شد. تاثیر مگنتوزوم خالص شده از مگنتو اسپریلیم گریفس والدنز با غلظت‏های مختلف بر روی رده سلولی سرطان سینه مورد بررسی قرار گرفت. جهت تجزیه و تحلیل آماری داده‏ها از آزمون Kruskalwalis و نرم افزار SPPSS-21 استفاده شد.
نتایج: در نتایج رنگ آمیزی گرم باکتری به‏شکل مارپیچ گرم منفی مشاهده شد. نتایج میکروسکوپ الکترونی نشان داد که باکتری تولیدکننده مگنتوزوم با اندازه 60 نانومتر می‏باشد. درصد سلول‏های زنده در برابر مگنتوزوم خالص شده از باکتری مگنتواسپریلیم گریفس والدنز 85 درصد به‏دست آمد که با توجه به آنالیز آماری (04/0=p) حاصل شد.
نتیجه‏گیری: مگنتوزوم باکتری مگنتواسپریلیم گریفس والدنز، منجر به مرگ 15 درصد سلولهای سرطانی شد .نتایج نشان داد که اندازه و ساختار مگنتوزوم‏های باکتری‏های مگنتوتاکتیک از اهیت بالایی در از بین بردن سلولهای سرطان سینه دارا می‏باشند.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

نانوذرات آهن کاربرد وسیعی در علم پزشکی به‫خصوص در ساخت شناسه‏گرهای زیستی فلورسانس، درمان تومورهای سرطانی، تشخیص زیستی پاتوژن‏ها دارند (1-3). باکتری‏های مگنتوتاکتیک گروهی از باکتری‏های گرم منفی که به‏صورت آرام در طول میدان مغناطیسی و میدان‏های دیگر جهت‏گیری و شنا می‏کند. این توانایی بر روی ساختار کریستال درون سلولی به‏نام مگنتوزوم‏ها بنا شده است (4). مگنتوزوم‏های موجود در باکتری‏های مغناطیسی اطراف غشاء از مواد معدنی آهن مگنتیک، مگنتیت (Fe3O4) یا گریگیت (Fe3S4) تشکیل شده‏اند (5).

درمیان روش‌‌های مختلف موجود در بیوسنتر نانوذرات، استفاده از باکتری‌‌های پروکاریوتی از توجه ویژ‌ه‌ای برخوردار است. مگنتیت یکی از محصولات رایج احیا، از طریق باکتری بوده که می‌تواند به‏عنوان یک شاخص پتانسیل فیزیکی به‏صورت اکتیویته زیست‌شناسی در سیستم‌‌های زمین‌شناسی استفاده شد باکتری‏های مگنتوتاکتیک قادر به‏تولید کریستال‌‌های مغناطیسی (Fe3O4)  تک-دامنه است که به‏طور متوالی و به‏صورت زنجیره‌‌های دوتایی و اشکال دایره‌ای تشکیل می‌شوند (6). مطالعات مختلفی بر روی گونه‏های ﺑﺎﮐﺘﺮیﻫﺎی مگنتوتاکتیک در ﻧﻘﺎط ﻣﺨﺘﻠﻒ ﺟﻬﺎن انجام شده است. سویه مگنتواسپریلیم گریفسوالدنزیک باکتری میکروائروفیل و گرم منفی از باکتری‏های مغناطیسی است که از شاخه پروتئوباکتر، طبقه آلفا پروتئوباکتر، رده رودوسپیریلا می‏باشد (7). شکل‏گیری مگنتوزوم نسبت به تغییر شرایط شیمیایی و فیزیکی بسیار حساس می‏باشد. غلظت اکسیژن یکی از مهم‏ترین فاکتورهای محیطی است که نه تنها بر معدنی شدن زیستی مگنتوزوم تاثیر می‏گذارد بلکه بر رشد باکتری‏های مگنتوتاکتیک اثرگذار است (8). شاید ادعای اینکه سرطان را می‌توان با استفاده از آهن‌ربا درمان کرد، ادعای گزافی به‌نظر برسد. اما گروهی از محققان فرانسوی از ساختارهای اکسید آهن استخراج شده از باکتری‌ها برای کشتن انتخابی سلول‌های سرطانی با استفاده از یک میدان مغناطیسی متناوب بهره برده‌اند. مطالعات نشان داده‏اند که مگنتوزوم‏ها باعث ازبین‏رفتن انسجام بین سلول‏های سرطانی شده که منجر به افزایش نفوذ داروهای ضد سرطانی درون تومور می‏شود و این عملکرد با افزایش تخریب سلول‏های سرطانی همراه می‏باشد (9).

Alphandery و همکارانش (9) در سال 2014 به‏منظور ارزیابی کردن فعالیت ضدتوموری از سوسپانسیون محتوی مگنتوزوم استفاده کردند. تومورهای سینه xeno-grafted زیر پوست موش که تحت تاثیر جریان میدان مغناطیسی قرار گرفته بودند با تیمار با مگنتوزوم ها، اثرات مثبت در درمان سرطان به‏ثبت رسید. با توجه به‏فراوانی سرطان سینه در دنیا و عوارض داروهای شیمی درمانی، هدف از این پژوهش ارزیابی اثر سمیت سلولی مگنتوزوم باکتری مگنتواسپریلیم گریفس والدنز بر روی رده سلولی سرطان سینه MCF-7 می‏باشد.

 

مواد و روش‌ها

سویه استاندارد مگنتواسپریلیم گریفس والدنز گونه MSR-1 با کد اختصاصی (DSM6361) از شرکتDetschesammlung von microorganismen und zellkulturen آلمان خریداری شد. این سویه در محیط کشت اختصاصی DSMZ  آلمان کشت داده شد. برای تهیه محیط کشت مواد بر طبق روش استاندارد DSMZ Medium 380 (آلمان) باکتری Magnetospirillum عمل شد. محلول عناصر معدنی و محلول ویتامین در حجم یک لیتر و محلول کوئینات فریک در حجم 100 میلی‏لیتر تهیه شد. به‏ازای هر لیتر محلول مادر، 10 میلی لیتر محلول ویتامین، 5 میلی مولار محلول عناصر معدنی، 2 میلی‏مولار محلول کوئینات فریک،KH2PO4  68/0 گرم،Succinic acid  37/0گرم ،L(+)-Tartaric acid 37/0 گرم،  Na05/0 گرم، Na-thioglycolate 05/0 گرم، NaNO3 acetat 12/0 گرم و Resazurin 5/0 میلی‏گرم مورد استفاده قرار گرفت. قبل ازمخلوط کردن این ترکیبات  pHمحلول حاوی عناصر معدنی با اضافه کردن  KOHیا هیدروکسید پتاسیم به 5/6 رسانده و به‏کمک گاز  N2اکسیژن‏زدایی شد. محلول کوئینات فریک و عناصر معدنی به‏مدت 15 دقیقه با فشار 15پاسکال در دمای 121 درجه سانتی‏گراد اتوکلاو شدند. بعد از اتوکلاوگذاری، زمانی که دمای محلول به 45 درجه سانتی‏گراد رسید، محلول ویتامین فیلتر شده به آن اضافه شد. محلول ویتامین واجد Pyridoxine-HCl،Nicotinic acid ،Riboflavin ،Thiamine-HCl·2H2O Folic acid می‏باشد. سایر مواد از شرکت Merck آلمان تهیه شد. با سوزن استریل مقداری از باکتری MSR-1 که داخل محیط است برداشته و داخل محیط کشت مایع باکتری تزریق شد و بعد درون جار بی‏هوازی قرار داده و برای شارژکردن به دستگاه آنوکسومات وصل شد و به‏مدت 1 هفته تا 10روز برای رشد باکتری درون انکوباتور گذاشته تا زمانی که رنگش کدر شود (10، 11). بعد از 1 هفته تا 10روز که باکتری ها بر روی محیط مایع رشد کرد از روی محیط مایع برداشته بر روی محیط کشت جامد DSMZ به‏صورت کشت خطی کشت داده و درون جار بی‏هوازی و هوازی در دمای 28 درجه سانتی‫گراد به‏مدت 1 هفته تا 10روز نگه‫داری شد (12). جهت شناسایی باکتری از رنگ آمیزی گرم و ارزیابی حرکت  باکتری در زیر میکروسکوپ به‏وسیله آهن‏ربای مغناطیسی انجام شد. به ‏این منظور مقداری از باکتری‏هایی که رشد کرده را با سرنگ برداشته بر روی لام گذاشته و آّب مقطر را بر روی آن ریخته و در زیر میکروسکوپ نوری با قرار دادن آهن‏ربا از طرف قطب شمال و جنوب حرکت باکتری مشاهده و ثبت شد (13). به‏منظور بررسی دقیق باکتری و مشاهده نانوذرات آهن درون آن، عکس‏برداری با میکروسکوپ الکترونی زایس مدل EM900 انجام گرفت. برای مشاهده نمونه به‏وسیله میکروسکوپ الکترونی چند لاندا از محیط کشت غلیظ شده حاوی باکتری را برداشته بر روی گرید (شبکه مسی) ریخته شد. پس از خشک شدن  WFI (آب تزریقی) ریخته داخل محفظه مخصوص قرار داده و به‏وسیله میکروسکوپ الکترونی (Ziemens 300kv) در آزمایشگاه دانشکده هوا و فضا خواجه نصیر طوسی مشاهده و عکس‏برداری شد (14).جهت جداسازی و خالص‏سازی مگنتوزوم‏ها، از روش فیزیکی استفاده شد که دیواره باکتری با استفاده از دستگاه French press (شرکت Thermo، آلمان) پاره شد که عصاره سلولی حاصل شد. این دستگاه با فشار مستقیم باعث لیز سلول می‏شود. نحوه‏ی کار آن بدین گونه می‏باشد که با سانتریفیوژ 7000 دور در دقیقه محیط کشت باعث جدا شدن باکتری از محیط می‏شود. در انتها رسوب به‏دست آمده را از خروجی دستگاه برداشته می‏شود. حدودا 10 گرم (بر اساس محاسبات  ODباکتری) از سلول‏های مگنتواسپریلیم گریفیس والدنز استخراج شده را در 50 میلی لیتر از HEPES 50 میلی‏مولار و EDTA  4 میلی‏مولار با سه بارعبور دادن از دستگاه French press (2000IB/IN2) دیواره سلولی باکتری را پاره کرد (کلیه بافرهای نام برده که برای استخراج مگنتوزوم استفاده شد، حاوی فنیل متیل سولفونیل فلوراید به‏عنوان بازدارنده پروتئین می‏باشد). سلول‏های سالم و آشغال‏های سلول به‏وسیله سانترفیوژ با دور rpm 10000 در دقیقه جداسازی شد. مایع رویی از میان ستون جداسازی مغناطیسی عبور داده شد (ستون بین دو مغناطیس قرار داده شد که این ستون یک میدان مغناطیسی قوی را تولید می‏کند و جاذب مغناطیسی آهن است).

ابتدا ذرات مغناطیسی خارج شده با 50 میلی‏لیتر از HEPES 10 میلی‏مولار و NaCl 200 میلی‏مولار (pH=7/4) بعد با 100 میلی‏لیتر از HEPES 10 میلی‏مولار شستشو داده شد. سپس ستون از ذرات مغناطیس پاک شد و ذرات مغناطیسی با بافرHEPES  10 میلی‏مولار از ستون به‏وسیله فلاش کردن یا با فشار خارج شد و در یخچال نگه‏داری شد (15).

جهت شناسایی مولکولی استخراج DNA با استفاده از کیت (یکتا تجهیز آزما-ایران) براساس دستورالعمل کیت انجام شد. برای شناسایی دقیق‏تر و جهت تکثیر از پرایمرهای اختصاصی MT12166 رفت و برگشت  مگنتواسپیریلیم گریفیس استفاده شد (16). واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با استفاده از دستگاه ترموسایکلر (Bio Rad-USA) انجام گرفت.  تمام اجزا واکنش از شرکت یکتا تجهیز آزما خریداری شد. مخلوط واکنش شامل: 25 ماکرولیتر Master Mix (شامل بافر PCR با غلظت 10 برابر، کلرید منیزیم dNTP، آنزیم Taq DNA پلی‏مراز) 3 ماکرولیتر DNA، 2 ماکرولیتر پرایمر رفت (5′-TTAAGGGGCAGAGAGGGAA-3′)، 2 ماکرولیتر پرایمر برگشت (5′-GGCGACGATGAAGCTCTTAC-3′) با غلظت 10 پیکومول و 18 ماکرولیتر آب می باشد. توالی پرایمرها بر اساس مطالعات چاپ شده انتخاب شدند و سنتز آن‫ها توسط شرکت توپاز ژن در ایران انجام شد. در این تکنیک برای آغاز فرایند پلیمریزاسیون دستگاه ترمال سیکلر به‏مدت 1 دقیقه بر روی دمای 94 درجه سلسیوس تنظیم شد و متعاقبا 35 سیکل PCR به‏صورت 94 درجه سلسیوس برای 1 دقیقه، 8/58 درجه سلسیوس برای 30 ثانیه و 72 درجه سلسیوس برای مدت 1 دقیقه اجرا شد. در نهایت به‏مدت 4 دقیقه نیز عمل طویل سازی نهایی در 72 درجه سلسیوس انجام شد. سپس جهت اطمینان از تکثیر ژن S rDNA 16، الکتروفورز بر روی ژل آگارز 1 درصد، حاوی بافر TBE 1X به‏مدت 60 دقیقه در ولتاژ 90 انجام شد (16). در نهایت جهت مشاهده نتایج ژل از دستگاه UV Transilluminator-USA استفاده شد (17). در نهایت محصول PCR به حجم 30 میکرولیتر همراه با پرایمرهای رفت و برگشت (با غلظت‏های 10 پیکومول بر میکرولیتر) برای توالی یابی به شرکت First Base به کشور مالزی ارسال شد. در این پژوهش رده سلولی سرطان سینه انسانی  MCF-7که مشابه سلول‏های اپیتلیال می‏باشد با کد C135 جهت بررسی خاصیت ضدسرطانی مگنتووزم استخراج شده، از کلکسیون رده سلولی انیستیتو پاستور ایران تهیه شد .سلول‏ها در محیط کشتRPMI 1640 Sigma-Aldrichav)، امریکا) حاوی 2 میلی‏مولار ال-گلوتامین، 10 درصد سرم جنین گاوی، پنی سیلین به‏میزان unit/mL 100 و استریتوماسیون به‏میزان 100 میکروگرم در میلی‏لیتر در دمای 37 درجه سانتی‏گراد، 95 درصد اکسیژن و فشار 5 درصد CO2 کشت داده شدند. شمارش سلول‏ها با کمک هموسایتومتر انجام شد. درصد سلول‏های زنده با تریپان‏بلو تعیین شد. به‏منظور بررسی فعالیت ضدتکثیری مگنتزوم باکتری مگنتواسپیریلیم گریفیس ابتدا سلول‏های رده سلولی کشت داده شدند به‏طوری‏که به‏هر چاهک پلیت96 خانه‏ای تعداد104×1 سلول اضافه شد. ظروف کشت حاوی سلول به‏مدت24 ساعت در انکوباتور CO2دار و در دمای 37 درجه سانتی‏گراد قرارگرفتند. سپس سلول‏ها با 10 میکرولیتر مگنتوزوم‏های خالص شده با غلظت‏های مختلف (غلظت‏های 1، 1/.، 01/.، 001/.، 0001/.، 00001/. میلی گرم بر میلی لیتر) به‏مدت 24 ساعت انکوبه و تیمار سلولی انجام گرفت. نمونه کنترل مثبت (سلول‏های کشته شده با تریتون 100X) و کنترل منفی (فاقد توکسین) نیز ارزیابی شد. پس از اتمام مراحل کار کشت سلولی و اثر دادن غلظت های مختلف بر سلول‏های هدف، به‏هر چاهک 10 میکرولیتر محلول 5 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر ازMTT  اضافه شد. سپس به‏مدت 3 ساعت در انکوباتور (5 درصد) CO2 در 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد. پس از آن، مایع رویی دور ریخته شد و با افزودن 100 میکرولیتر محلول دی متیل سولفوکساید به‏هر چاهک و قرار دادن آن برای مدت 30 دقیقه بر روی شیکر و دور از روشنایی، کریستال‏های فورمازان ایجاد شده حل شدند. سپس با استفاده ازالیزا ریدر میزان جذب نوری چاهک‏ها در طول موج 595 نانومتر در مقابل کنترل قرائت شد (18، 19).

آنالیز آماری

تحلیل نتایج آزمون با استفاده از نرم افزار آماری spss نسخه 21 و آزمون آتالیز واریانس و تست اماری غیرپارامتریک Kruskaiwalis انجام شد. همچنین از نرم افزارCurve expert 1.4 جهت به‏دست آوردن IC50 مگنتوزوم جدا شده از باکتری در راستای کشت سلول استفاده شد.

 

نتایج

پس از کشت باکتری مگنتواسپریلیوم گریفس والدنز، کلنی‏های این باکتری به‏صورت برآمده، با شکلی نامنظم و به‏رنگ کرم مشاهده شد (شکل 1).

 

 

شکل 1: مرفولوژی کلنی مگنتواسپریلیم گریفس والدنز درمحیط کشتDSMZ

کلنی‏های باکتری مگنتو اسپریلیم گریفس والدنز بعد از کشت رنگ آمیزی شدند و مارپیچ‏های گرم منفی مشاهده و ثبت شد (شکل 2).

با قرار دادن باکتری مگنتواسپریلیم گریفس والدنز در زیر میکروسکوپ نوری و قرار دادن آهن‏ربا در دو طرف قطب شمال و جنوب در نزدیکی صفحه میکروسکوپ، باکتری به‏سرعت به‏طرف قطب شمال آهنربا تمایل داشت که North seeking تشخیص داده شد.

 

 

شکل2: رنگآمیزیگرمباکتری مگنتواسپریلیم گریفس والدنزکه باکتری مارپیچی مشاهده شد.

 

عکس‏برداری با استفاده از میکروسوپ الکترونی جهت تعیین ساختار باکتری و مگنتوزوم مگنتواسپریلیم گریفس والدنز انجام شد. این از باکتری مارپیچی شکل، دارای دو تاژک یکی در ابتدا و یکی در انتها، که توانایی تولید 20 مگنتوزوم دارند مشاهده شدند. اندازه مگنتوزوم این باکتری 50 و 60 نانومتر مشاهده شد که جز دسته مگنتوزوم‏های بزرگ در باکتری‏های مگنتوتاکتیک می‏باشد (شکل3).

الف

ب

شکل 3: ساختار مگنتوزوم با میکروسکوپ الکترونی. الف: باکتری مگنتواسپریلیم گریفس والدنز با مقیاس 750 نانومتر. ب: ذرات مگنتوزوم با مقیاس 60  نانومتر.

در شناسایی مولکولی باند 1166 جفت بازی حاصل شد که بعد از انجام تعیین توالی، 98 درصد همولوژی با باکتری مگنتواسپیریایم گریفیس در بانک ژنی نشان داد. نتایج ژل الکتروز درشکل  4 آمده است.

 

 

شکل4: ژل الکتروفورز محصول PCR. ستون اول مارکر 100 جفت بازی سیناژن. ستون دوم  محصول PCR حاصل از ژن مگنتواسپریلیم گریفس والدنز با اندازه 1166 جفت باز می‏باشد.

پس از جداسازی مگنتوزوم باکتری مگنتوتاکتیک، اثر سیتوسیدالی آن‏ها در غلظت‏های مختلف به‏مدت 24 ساعت ارزیابی شد، نتایج در شکل 5 آمده است. توان سلول‏های زنده و خاصیت ضد سرطانی مگنتوزوم باکتری مگنتو اسپریلیم گریفس والدنز در غلظت‏های مختلف بر روی رده سلولی سرطان سینه MCF-7 در مقایسه با نمونه‏های کنترل منفی (فاقد مگنتوزوم) مورد مقایسه قرار گرفته شد. نمودار نشان میدهد که روند اثر غلظت بر توان سلول های زنده و خاصیت ضد سرطانی نمونه مگنتوزوم باکتری جداسازی شده تاثیر مثبتی ندارد. علاوه‏براین ماکزیمم توان سلول‏های زنده در برابر مگنتواسپریلیم گریفس والدنز 85 درصد می‏باشد که با توجه به تست آماری Kruskalwalis (04/0=p) این تفاوت معنی‫دار نمی‏باشد.

 

 

 

شکل5: ارزیابی اثر مگنتوزوم باکتری مگنتوتاکتیک در خوانش 24 ساعته برروی رده‏ی سرطانی سینه MCF-7. M: باکتری مگنتواسپریلیم گریفس والدنز می‏باشد که سمیت سلولی مکنتوزوم باکتری مگنتواسپریلیم گریفس والدنز در غلظت‏های مختلف بر رده سلولی MCF-7 با نمونه‏های کنترل مقایسه شده است. با توجه به آنالیز آماری 04/0 حاصل شد.

 

 

 

عکس‏برداری با میکروسکوپ معکوس

اثر سیتوپاتیک مگنتوزوم باکتری مگنتواسپریلیم گریفس والدنزبر روی رده سلولی سرطان سینه با استفاده از میکروسکوپ معکوس مشاهده و ثبت شد (شکل 6).

 

 

شکل 6: عکس‏برداری با میکروسکپ معکوس (Micros, Austalia). سمت چپ: کنترل منفی، سمت راست: سلول‏های تیمار شده با مگنتوزوم باکتری مگنتواسپریلیم گریفس برروی رده سلول سرطانی سینه MCF-7 با بزرگ‏نمایی µm 30

 

سلول‏های رده سلولی سرطان سینه انسانی MCF-7، دوکی شکل بوده و به‏صورت چسبیده به‏هم مشاهده شدند. سلول‏های تیمار شده با مگنتوزوم باکتری مگنتو اسپریلیم گریفس والدنز، اتصال بین رده سلول‏های سرطانی از بین نرفته و حجم سلول کاهش نیافته و از بین رفتن شکل سلول و متلاشی شدن آن بسیار کم مشاهده شد. همان طور که در شکل 6 مشاهده می‫شود، تاثیر مگنتوزوم به‏تنهایی اثرات سایتوپاتیک نشان نداد و سلول‏های چسبیده به‏هم بدون از دست دادن ساختار باقی ماندند.

 

بحث

در سال‏های اخیر استفاده از ترکیبات طبیعی برای مقابله با سرطان با توجه به‏عوارض جانبی کم و تاثیرات امید بخش مورد توجه قرار گرفته است. روش‏های درمانی معمول با چالش‏های بسیاری روبه‏رو هستند و ازاین‏رو روش‏های درمانی جایگزین مورد نیاز زیادی هستند. علاوه‏براین، طبیعت بهترین الهام بخش را ارائه می‏دهد و اخیرا بسیاری از روش‏های درمانی با منشا طبیعی در برابر سرطان را ثابت کرده‏اند که باکتری‏های مغناطیسی و روش‏های درمانی مبتنی بر مگنتوزوم از جمله آن‏ها هستند (20، 21).

در کل درمان تومور بسیار دشوار است زیرا سوخت و ساز و میزان اکسیژن سلول­های قسمت خارجی و داخلی تومور کاملا متفاوت است و همین امر درمان را با مشکل مواجه می­کند. محققان دانشگاه مک گیل و پلیتکنیکی در کانادا برای حل این مشکل، از باکتری­های مغناطیسی استفاده کردند. این باکتری­ها به‏راحتی توسط یک میدان مغناطیسی ضعیف هدایت شده و به‏محل تومور می­رسند و دارورسانی می­کنند. یکی‏دیگر از مزیت‏های باکتری­های مغناطیسی این است که این باکتری­ها تمایل دارند به‏سمت مکان‏های فاقد اکسیژن مهاجرت کنند و هسته تومور دقیقا جایی است که در آن غلظت اکسیژن کم است. میدان مغناطیسی مورد نیاز برای حرکت نانوربات‫های باکتریایی بسیار ضعیف بوده و هیچ صدمه­ای به‏بدن وارد نمی‏کند (22).

پژوهش حاضر به‏منظور ارزیابی اثر سیتوسیدالی مگنتوزوم باکتری مگنتوسپریلیم گریفس والدنس برروی رده سلولی سرطان سینه مورد بررسی قرار گرفته شد. باکتری‏های مگنتوتاکتیک میکروآیروفیل بوده و تشکیل مگنتوزوم در آن فقط در فشار پایین اکسیژن میسر می‏باشد (23).

در تحقیق حاضر نیز تولید نانوذرات آهن در شرایط میکروآیروفیل امکان‏پذیر بود. همچنین، این باکتری‏ها درمجاورت میدان مغناطیسی دارای مگنتوتاکسی بوده و به‏سمت قطب شمال حرکت می‏کردند که مطابق با تحقیقات پژوهشگران پیشین می‏باشد (24).

در عکس‏های میکروسکوپ الکترونی SEM تجمعات خارج سلولی نانوذرات آهن توسط باکتری مگنتواسپیریلیم والدنس به‏وضوح قابل مشاهده می‏باشد، که نشان‏گر توانایی ترشحی و خارج سلولی بودن نانوذرات تولیدی توسط این باکتری می‏باشد.

نتایج این پژوهش با پژوهش Alphandery و همکاران مشابه بود که این باکتری‏ها تحت تاثیر میدان ژئومغناطیسی و در جهت آن حرکت می‏کنند که به‏این رفتار باکتری‏ها مگنتوتاکسیس می‏گویند به‏عبارتی این باکتری‏ها یا به‏سمت شمال حرکت می‏کنند یا جنوب که این وابسته به جهت‏یابی مغناطیسی دوقطبی‏های سلولی است. Alphandery و همکارانش بیان کردند که این باکتری جز پروکاریوت‏های گرم منفی­اند، متحرک بوده و از طریق تاژه حرکت می­کنند­. میکروائروفیل و مزوفیل و همه‏ی آن‏ها دارای مگنتوزوم می‏باشند­. که در واقع  مگنتوزوم ساختاری ویزیکول مانند در درون این باکتری­ها است که در آن واکنش کانی سازی زیستی انجام می­شود و طی آن اشکال معدنی شامل مگنتیت  Fe3O4و گرگیت Fe3S4  ایجاد می­شود (25).

معمولا نانوذرات مغناطیسی که به‏صورت شیمیایی سنتز شده­اند و جهت حرارت درمانی مغناطیسی  سرطان پستان مورد استفاده قرار می‏گیرند، بسیار کوچک بوده و دارای اندازه­ای کمتر از 20 نانومتر می­باشند. از این روش با موفقیت بر روی سرطان پستان زیر پوست موش استفاده شده است (26). در پژوهش حاضر بعد از جدا سازی مگنتوزوم باکتری، این ذرات با میکروسکوپ الکترونی مشاهده شد و اندازه‏ی این ذرات در حدود 60 نانومتر محاسبه شد. با توجه به این که اندازه‏ی ذرات در درمان سرطان بسیار مهم می‏باشد و با ایجاد فرویید در تومور باید عملکرد خود را نشان دهد، نمونه‏ی مگنتوزوم در این پژوهش از لحاظ اندازه مناسب ایجاد عملکرد در درمان رده‏ی سلولی سرطان پستان گزارش نشد زیرا اندازه آن‫ها بزرگ می‏باشد (26).

باکتری‏های مگنتوتاکتیک و مگنتوزوم‏ها  برای درمان سرطان در سال 2015 توسطAbhilasha  استفاده شده و در درمان سرطان پیشنهاد شدند (27). با توجه به گزارش‫های بالا می‏توان بیان کرد که نانوذرات می‏توانند در درمان سرطان بسیار موثر باشند. اما با توجه به این‫که ساختار این ذرات، در عملکرد این ذرات بسیار موثر می‏باشند،  باید به اندازه‏ی این ذرات هم توجه شود. نانوذرات مغناطیسی به‏دلیل دارا بودن خصوصیت ویژه مغناطیسی، اهمیت کاربردی بالایی را در تشخیص و درمان سرطان پیدا کرده اند. نتایج پژوهش‏های مختلف نشان می‏دهند که نانوذرات مغناطیسی از طریق تقویت تولید گونه های فعال اکسیژن یا مکانیسم های ناشناخته دیگر، عملکرد داروهای ضد سرطانی (مانند داروی دوکسوروبیسین و سیسپلاتین) را در کشتن سلول‏های سرطانی تقویت می‏کنند. به‏عبارت‏دیگر نانوذرات مغناطیسی موجب افزایش سمیت سلولی داروی ضد سرطانی شده و نیز نقش مهمی را در انتقال دارو به سلول‏های توموری ایفا می‏کند (27، 28). امروزه فناوری‏های نانو برای انتقال هدفمند دارو برای کاهش عوارض جانبی درمان با داروها در حال توسعه است. محققان بر این عقیده‏اند که مگنتوزوم‏های تولید شده توسط باکتری‫های مگنتوتاکتیک یک نوع نانومواد مغناطیسی جدید با خصوصیات منحصر به‏فردی هستند که به‏عنوان نانوکریستال‫های آرمان‏گرایانه متمایزدسته‏بندی می‏شوند. با توجه به نتایج این تحقیق پیشنهاد می‏شود که باکتری‏های مغناطیسی با مگنتوزومهای با اندازه کوچک‏تر جداسازی و به‫عنوان حامل دارو ارزیابی شد.

 

نتیجه­گیری

هدف از این پژوهش ارزیابی اثرسمیت سلولی مگنتوزوم باکتری مگنتوسپریلیم گریفس والدنس برروی رده سلولی سرطان سینه می‏باشد. در ایران تاکنون تحقیقی دال بر تاثیر مگنتوزوم باکتری‫های مگنتوتاکتیک بر روی سلول‏های سرطانی صورت نگرفته است. نتایج این تحقیق نشان داد که اندازه و ساختار نانوذرات آهنربایی از اهمیت بالایی در از بین بردن سلول‏های سرطان سینه دارا می‏باشند.

 

تشکر و قدردانی

نویسندگان این مقاله از انستیتو پاستور تهران و همچنین خانم دکتر حاتمی گیگلو، به‏خاطر همکاری شایسته‏شان در انجام پژوهش حاضر تشکر و قدردانی می‏شود.

1. Silveira TS, Martins JL, Silva KT, Abreu F, et al. Microscopystudies on uncultivated magnetotacticbacteria, Modern Research andEducational Topics in Microscopy. FORMATEX. 2007; 111-121.

2. Shamsipor F, Zamani AH, Ghodsi R. Conjugation of Nanoparticles for Monoclonal Antibodies to Super Paramagnetic Iron oxide Detection of HER2/neu antigen on Breast cancer cell lines. AJMB. 2009; 10(1): 1-31.

3. Bazylinski DA, Williams TJ,  Lefèvre CT,  Trubitsyn D, et al. Magnetovibrioblakemorei gen. nov., sp. nov., a magnetotactic bacterium (Alphaproteobacteria: Rhodospirillaceae) isolated from a salt marsh. INT J of SYST EVOL MICR. 2013; 63(Pt3): 1824-1833.

4. Lefèvre CT, Pósfai M, Abreu F, Lins U, et al. Morphological features of elongated-anisotropic magnetosome crystals in magnetotactic bacteria of the Nitrospirae phylum and the Deltaproteobacteria class. Earth Planet Sci Lett. 2011; 312(1-2): 194–200.

5. Yang J, Li SH, Huang X, Tabg T, et al. A key time point for cell growth and magnetosome synthesis of Magnetospirillum gryphis waldense based on real-time analysis of physiological factors. Fron Microbiol. 2013; 4(210): 173-182.

6. Yan l, zhang S, chen P, liu H, et al. Magnetotactic bacteria, magnetosomoses and their application. Microbiol Reserch. 2012;167(9): 507-519.

7. Bazylinski DA, Schlezinger DR, Howes BH, Frankel RB,et al. Occurrence    and distribution of diverse populations of magnetic protists in a chemically stratified coastal salt pond. Chemical Geology. 2000;169(3-4): 319-328.

8. Hayashi K, Nakamura M, Miki H,  Ozaki S, et al. Magnetically Responsive Smart Nanoparticles for Cancer Treatment with a Combination of Magnetic Hyperthermia and Remote-Control Drug Release. Theranostics. 2014; 4(8): 834-844.

9. Alphandéry E. Perspectives of breast cancer thermotherapies. J Cancer. 2014; 5(6):472-9.

10. Xiang L, Wei J, Jianbo S, Guili W, et al. Purified and sterilized magnetosomes from Magnetospirillum gryphis waldense MSR-1 were not toxic to mouse fibroblasts in vitro. Lett Appl Microbiol. 2007; 45(1): 75-80.

11. Hatami-GiklouJajan L, Hosseini SN, Ghorbani M, Mousavi SF, et al. Effects of Environmental Conditions on High-Yield Magnetosome Production by Magnetospirillum gryphis waldense MSR-1. Iran Biomed J. 2019; 23(3): 209-19.

13. Fdez-Gubieda ML, Muela A, Alonso J, García-Prieto A, et al.

 

14. Raschdorf O, Schüler D, Uebe R. Preparation of Bacterial Magnetosomes for Proteome Analysis. Methods Mol Biol. 2018; 1841: 45-57.

15. Jogler C, Lin W, Meyerdierks A, Kube M, et al. Toward Cloning of the MagnetotacticMetagenome: Identification of Magnetosome Island Gene Clusters in Uncultivated Magnetotactic Bacteria from Different Aquatic Sediments. Appl Environ Microbiol. 2009; 75(12): 3972–3979.

16. Moazamian E, Bahador N, Azarpira N, Rasouli M. Anti-cancer Parasporin Toxins of New Bacillus thuringiensis Against Human Colon (HCT-116) and Blood (CCRF-CEM) Cancer Cell Lines. Curr Microbiol. 2018; 75(8): 1090-1098.

17. Ohba M, Mizuki E, Uemori A. Parasporin, A New Anti-Cancer Protein Group from Bacillus Thuringiensis. Anticancer Res. 2009; 29(1): 427-433.

18. Nabiuni M, Yarahmadi A, Delfan B, Mirsepasi S. The anti-proliftrative and lethal effects of D-alpha tocopheryl succinate (vitamin E succinate) and Honey bee venom (BV) on human promylocyte leukemia cell line (HL-60). JCT. 2013; 3(4): 287-296.

19. JohnJacob J, Suthindhiran K. Magnetotactic bacteria and magnetosomes. Mater Sci Eng. 2016; (68)1:919-928.

20. Yan L,Xing W. Chapter 12 - Methods to Study Magnetotactic Bacteria and Magnetosomes. Methods in Microbiology. 2018; 45: 357-386.

21. Chien T, TalDanino A. Advances in bacterial cancer therapies using synthetic biology. Curr Opin Cell Biol. 2017; 5: 1-8.

22. Arakaki A, Nakazawa H, Nemoto M, Mori T, et al. Formation of magnetite by bacteria and its application. J R SOC INTERFACE. 2008; 5(26): 977-999.

23. Vincenti B, Ramos G, Cordero ML, Douarche C, et al. Clement E. Magnetotactic bacteria in a droplet self-assemble into a rotary motor. Nat Commun. 2019; 8; 10(1): 5082.

24. DeNardo SJ, DeNardo GL, Natarajan A, Miers LA, et al. Thermal dosimetry predictive of efficacy of 111In-ChL6 nanoparticle AMF- induced thermoablative therapy for human breast cacer in mice. J Nucl Med. 2007; 48(3): 437-444.

25. Alphandery E, Chebbi I, Guyot F, Durand-Dubief M. Use of bacterial magnetosomes in the magnetic hyperthermia treatment of tumours: A review. Int J Hyperth. 2013; 39(1): 801-9.

26. Alphandery E. Efficacy of Thermotherapy to Treat Breast Cancer: A Review. Alphandéry, Journal Women’s Health Care. 2013; 1: 2-4.

27. Abhilasha S. Magnetotactic bacteria for cancer therapy. Biotechnol Let. 2015; 37(3): 491-498.

28. Mathuriya AS.  Magnetotactic bacteria: nanodrivers of the future. CritRev  Biotechnol. 2015; 36(5): 788-802.