بررسی اثرات زولپیدم بر اووژنز ومیزان FSH,LH موش بالغ نژاد NMRI

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه آزاد اسلامی،واحد علوم و تحقیقات ، کارشناس ارشد گروه زیست شناسی ، تهران ، ایران

2 دانشگاه آزاد اسلامی،واحد علوم و تحقیقات ، استادیار گروه زیست شناسی ، تهران ، ایران

3 دانشگاه آزاد اسلامی،واحد علوم و تحقیقات ، استاد گروه زیست شناسی ، تهران ، ایران

چکیده

هدف: این مطالعه با هدف بررسی اثرات زولپیدم بر اووژنزو هورمون‏های جنسی FSH و LH موش ماده نژاد NMRI صورت گرفت.
مواد و روش‏ها: در این تحقیق از 30 موش بالغ نژاد NMRI با وزن تقریبی 30±26 گرم که توسط تهیه اسمیر واژنی در مرحله استروس از سیکل جنسی بودند انتخاب شدند و به گروه‏های تجربی، شاهد و کنترل تقسیم شدند. گروه‏های تجربی در 3 دسته مختلف این دارو را به‏صورت تزریق درون صفاقی به‏میزان 5، 10، 20 میلی‏گرم بر کیلوگرم وزن موش به‏مدت 14 روز دریافت نمودند گروه سم 05/0 میلی‏لیتر آب مقطر و کنترل هیچ ماده‏ای دریافت نکرد در پایان روز چهاردهم اندازه‏گیری میزان سرم هورمون‏های FSH  وLH توسط روش الیزا انجام شد و همچنین تخمدان از بدن حیوانات خارج شد ومقاطع بافتی با رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین ائوزین تهیه شد و تحت مطالعات میکروسکوپی و هیستولوژیکی قرار گرفت و نتایج از طریق آزمون‏های  (One-way  ANOVA)و تست Tukey)) با معنی‏داری (05/0>p) تجزیه وتحلیل آماری شد.
نتایج: تزریق داروی زولپیدم به‏طور معنی‏داری (05/0>p) باعث کاهش سرمی هورمون‏های FSH  و LH در گروه‏های تجربی نسبت به سم و کنترل شد، در بررسی‏های بافتی (05/0>p) افزایش فولیکول‏های بدوی، کاهش فولیکول ثانویه، گراف، جسم زرد نسبت به گروه سم و کنترل مشاهده شد همچنین کاهش معنی‏دارای در قطر فولیکول های ثانویه، گراف، جسم زرد و افزایش معنی‏داری در قطر فولیکول‏های بدوی، فولیکول‏های آترتیک در گروه های تجربی نسبت به سم و کنترل شد.
نتیجه‏گیری: تزریق زولپیدم باعث تغییرات معنی‏داری در روند اووژنز و هورمون‏های FSH  و LH می‏شود.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

اختلال‏هایی نظیر اضطراب، افسردگی و تنش­های ذهنی و عاطفی، مشکل در روابط زناشویی و سوء مصرف الکل و یا کافیئن می­تواند در بروز بی­خوابی نقش داشته باشند. داروهایی که برای درمان این اختلال‏ها مصرف می‏شود بیشتر بر اساس تعدیل عملکرد ناقل­های عصبی مغز به‏ویژه سروتونین، نوراپی­نفرین، دوپامین  ساخته می­شوند (1، 2). معمولا افسردگی و اضطراب دلایل مشابهی دارند و در بیش‏تر موارد از داروهای مشابه برای درمان آن­ها استفاده می­شود (1، 3)، بنزودیازپین­ها داروهایی هستند که به‏عنوان ضداضطراب استفاده می­شوند ولی به‏علت عوارضی مانند اعتیاد، خواب‏آلودگی و اختلال در یادگیری، مصرف آن­ها با محدودیت همراه است. زولپیدم دارویی غیر بنزویازپینی، نیمه عمر 2 تا3 ساعت دارد یک خواب‏آور عمومی است و دارای ویژگی­های مسکن، ضد اضطراب و آرام­بخش می­باشد و مهم‏ترین بازدارنده انتقال دهنده­ی عصبی در مغز پستانداران می‏باشد (4)، جذب این دارو به خون سریع است و در مدت زمان 1 الی 3 ساعت به حداکثر غلظت خود در خون می‏رسد (5) اثرات این دارو با فلومازنیل متوقف می­شود (6، 7) و بر خلاف بنزودیازپین­ها اثرات شل کنندگی عضله و ضد تشنج آن بسیار کم است (7، 8)، زولپیدم توسط کبد و از طریق اکسیداسیون و هیدروکسیلاسیون به‏سرعت به متابولیت‏های غیرفعال متابولیزه می­شود (9،10). اگر چه کارایی زولپیدم در درمان اختلالات خواب مشابه بنزودیازپین­های خواب­آور است، اما برتری­هایی از قبیل کاهش عوارض فراموشی و اختلالات سایکوموتور در روز بعد از مصرف  دارد (11). همچنین مصرف آن باعث خواب بدون وقفه سریع در طول شب شده و از نظر ایجاد وابستگی نسبت به داروهای بنزودیازپینی نظیر دیازپام ایمن­تر بوده و عوارض ناشی از آن­ها از جمله وابستگی، تحمل نسبت به دارو، تغییر ریتم خواب، تضعیف تنفس را به‏دنبال ندارد (12، 13). با این وجود، مصرف داروی زولپیدم در دوزهای بالا منجر به اختلال‏هایی از جمله منگی، سنگینی و عدم تعادل، افت فشار خون، گرفتگی عضلانی، اختلالات رفتاری نظیر بی­قراری عصبی، کج خلقی و راه رفتن در خواب می ­شود (14، 15). اووژنز فرآیندی است که طی آن سلول‏های اووگونی به اووسیت‏های بالغ تمایز می یابند. در پستانداران فرآیند اووژنز در دوره‏ی جنینی با تشکیل سلول‏های زایای بدوی آغاز شده و پس از آن در دوره‏ی بلوغ جنسی ادامه می‏یابد (16). عملکرد گنادی در مهره‏دارانی با هورمون­های گنادوتروپیک آزاد شده از غده هیپوفیز تنظیم می­شود این غدد خود تحت کنترل نوروهورمون­های مغزی GnRH آزاد شده از هییپوتالاموس می­باشند. هورمون­های گنادوتروپیکی موثر بر روی تخمدان LH و FSH است. این دو هورمون که به‏صورت سینرژیک عمل می­کند اووژنز رو تنظیم می­کند و باعث رشد فولیکول می‏شود (17). زولپیدم به‏عنوان گیرنده‏ی آگونیستی گابا نوع A اثر مهاری خود را بر سیستم عصبی مرکزی القا می‏کند (18). زولپیدم می‏تواند باغث کاهش عملکرد محور هیپوفیز-گناد شد (19). زولپیدم به‏سرعت از روده جذب می‏شود و محل اصلی آن کبد می‏باشد و به کبد و کلیه آسیب نیز می‏رساند (20). زولپیدم از  جفت عبور می‏کند و همچنین موجب ناهنجاری‏هایی در جنین نیز می شود (21). زولپیدم می‏تواند التهاب گلو، برونشیت، التهاب ریه را ایجاد کند (22). زولپیدم، از دسته داروهای غیر بنزودیازپینی، آگونیست گیرنده­های گابا نوع A می­باشد که استفاده از آن در درمان اختلالات عصبی اضطرابی اخیرا گسترش یافته (23) مصرف زولپیدم در افراد بالغ به‏خصوص خانم‏ها به‏علت استرسهای زندگی زیاد است و ممکن است با این حقیقت همراه باشد که بی‏خوابی در خانم‏ها متداول‏تر است (24، 25) یکی از عوامل ناباروری در مشکلات تخمدان می‏باشد و همچنین مشکلات هورمونی شایع‏ترین دلایل برای عدم تخمک‏گذاری و باروری هستند )26، 27). و از آن‏جاکه تاکنون مطالعه‏ای بر روی دستگاه تناسلی جنس ماده و بافت تخمدان موش صورت نگرفته است لذا مطالعه­ی حاضر با هدف بررسی اثرات داروی زولپیدم بر اووژنز و هورمون هایLH و HSF در موش­های سوری ماده صورت گرفته است.

 

مواد و روش‌ها

تمامی آزمایشات در مجتمع آزمایشگاهی رازی و بر اساس دستور العمل کمیته اخلاق دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات انجام شد.

حیوانات آزمایشگاهی و گروه‏بندی: ابتدا موش‏های سفید آزمایشگاهی بالغ نژاد NMRI ماده با وزن 25 تا 30 گرم را از انیستیتو پاستور تهران خریداری نموده و به اتاق نگه‏داری حیوانات دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات انتقال داده شدند. به‏منظور تطبیق موش‏ها با محیط جدید، پس از یک هفته آزمایشات انجام شد. جانوران در قفس‏های پلاستیکی با ابعاد مشخص و استاندارد که غذا و آب در دسترس آن‏ها قرار داشت نگه‏داری می­شدند و از تراشه­های چوب به‏عنوان بستر در قفس آن‏ها استفاده می­شد. تغذیه این حیوانات از پلیت‏های آماده و مخصوص صورت می­گرفت و آب مورد استفاده، آب لوله­کشی شهری بود که توسط شیشه­های مخصوصی در اختیار جانوران قرار می­گرفت. میزان درجه حرارت اتاق پرورش حیوانات 2±23 درجه سانتی‏گراد بود. قفس موش­ها هر هفته دو بار نظافت می­شد. موش‏ها توسط تهیه اسمیر واژنی مورد ارزیابی قرار گرفته و در مرحله استروس از سیکل جنسی بودند، موش­ها به 5 گروه تقسیم شدند: یک: گروه کنترل (بدون تاثیر زولپیدم)، دو: گروه شم (با تزریق 5/0 میلی لیتر آب مقطر به‏عنوان حلال زولپیدم)، سه: گروه تجربی 1 با تزریق 5/0 میلی‏لیتر غلظت 5 میلی‏گرم/کیلوگرم وزن موش از زولپیدم، چهار: گروه تجربی 2 با ترزیق 5/0 میلی لیتر غلظت 10 میلی‏گرم/کیلوگرم وزن موش از زولپیدم، پنج: گروه تجربی 3 با تزریق 5/0 میلی‏لیتر غلظت 20 میلی‏گرم/کیلوگرم وزن موش از زولپیدم، دوز مورد استفاده از این دارو در انسان 5 و 10 میلی‏گرم می‏باشد که در موش بر اساس وزن آن‏ها محاسبه شد و تزریق شد (28) هنگام کار با موش ها موازین اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی رعایت شد.

مواد دارویی: زولپیدم به‏صورت  قرص جامد با دوز 5 و 10 میلی‏گرم از شرکت داروسازی اکسیر تهیه شد.

نحوه آماده کردن محلول زولپیدم و تزریق به موش: موش‏های مورد نظر پیش از تزریق وزن شدند و میزان ماده­ی تزریقی براساس وزن موش­ها محاسبه شد. تزریق به‏صورت درون صفاقی بود، برای گروه کنترل هیچ تزریقی صورت نگرفت. برای گروه سم، آب مقطر و برای گروه­های تجربی غلظت مورد نظر از زولپیدم، به‏مدت 14 روز متوالی تزریق انجام شد (29).

سنجش میزان سرم‏ها: همه‏ی گروه‏های مورد بررسی موش‏ها یک روز بعد از گذشت آخرین تزریق، توسط اتر بیهوش شدند خون‏گیری به‏طور مستقیم از بطن چپ صورت گرفت نمونه‏های خونی به‏مدت 15 تا 20 دقیقه در آزمایشگاه ثابت نگه‏داری شدند و بعد به‏مدت 5 دقیقه با 3600 دور در دقیقه (rpm) نمونه‏ها سانتریفوژ شد و سنجش میزان سرم هورمون‏های FSH و LH از طریق روش الیزا Mouse Kit انجام شد, براساس روش (ELISA و (Enzyme Immuno assay0 و با استفاده از آنتی­بادی مونوکونال می­باشد به این منظور از پلت­های 96 خانه­ای که به‏ترتیب با آنتی­بادی­های علیه LH و FSH پوشش داده شده­اند استفاده شد پس از اضافه کردن نمونه (سرم موش NMRI) و مجاور شدن با آنتی­بادی پوشش داده شده، آنتی­بادی ثانویه ضد  LH ,FSHکه متصل به آنزیم نشان­دار هستند.  ESH- Enzyme (onjugate) و (LH-Enzyme) اضافه می‫شد، بعد از انکوباسیون و شستشو محلول رنگ‏زا داخل چاهک­ها ریخته شد که رنگ حاصله با کمپلکس ایمنی تشکیل شده با غلظت LH-FSH موجود در نمونه متناسب است غلظت نهایی با دستگاه الایزاریدر قرائت شد.

آنالیز بافت شناسی بافت تخمدان:پس از خون‏گیری از قلب،  تخمدان‏ها جهت بررسی‏های هیستولوژیکی خارج شد سپس به ظرف حاوی بوئن منتقل شدند، پس از گذشت 4 ساعت، تخمدان‏ها داخل الکل (الکل 70 درصد) گذاشته شدند. پس از مراحل آب‏گیری و قالب‏گیری از هر گروه 12 لام با برش‏های سریالی 5 تا 7 میکرومتری با میکروتوم تهیه و به‏وسیله‏ی هماتوکسیلین ائوزین رنگ‏آمیزی شدند ضخامت قطر بافت تخمدان با استفاده از عدسی چشمی مدرج اندازه‏گیری شد همچنین  تعداد و ضخامت قطر فولیکول‏های بدوی، فولیکول‏های اولیه،  فولیکول‏های درحال رشد، فولیکول‏های ثانویه، فولیکول‏های گراف، فولیکول غیر طبیعی و جسم زرد، خونی در 5 مقطع از مقاطع بافتی از گروه‏های مختلف  مورد بررسی‏های میکروسکوپی قرار گرفت میانگین اعداد در 5 مرتبه تکرار شمارش فولیکولی ملاک نتایج تحقیق قرار گرفته است.

 

آنالیز آماری

تحلیل و مقایسه میانگین­ها با استفاده از نرم­افزار Spss20 در 05/0>p، 001/0>p، 1/0>p، با درنظر گرفتن انحراف معیار (SE) با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه (One-way ANOVA) و تست (Tukey) توکی انجام شد و سپس با استفاده از نرم­افزار Excel هیستوگرام­ها ترسیم شدند.

 

نتایج

نتایج حاصل از پنج گروه بررسی شده نشان می‏دهد که اختلاف معنی‏داری در اندازه‏گیری وزن جانوران، وزن تخمدان‏ها، ضخامت قطر بافت تخمدان، تعداد فولیکول‏های اولیه و تعداد فولیکول‏های غیر طبیعی بین گروه‏های تجربی و کنترل و شاهد مشاهده نشد. بررسی‏های میکروسکوپی بیانگر افزایش معنی‏داری در تعداد فولیکول‏های بدوی و اتریک در گروه های تجربی 1، 2، 3 نسبت به گروه کنترل و شاهد بود. همچنین کاهش معنی‏داری در تعداد فولیکول‏های در حال رشد، فولیکول‏های ثانویه، فولیکول‏های گراف و تعداد جسم‏های زرد در گروه‏های تجربی 2، 3 نسبت به گروه کنترل و شاهد مشاهده شد. افزایش معنی‏داری در تعداد رگ‏های خونی در گروه تجربی 3 نسبت به گروه کنترل و شاهد مشاهده شد. همچنین نتایج نشانگر این بود که اختلاف معنی‏داری در قطر فولیکول‏های بدوی، ثانویه، قطر رگ‏های خونی تخمدان و قطر فولیکول های غیر طبیعی بین گروه‏های تجربی و کنترل و شاهد مشاهده نشد. افزایش معنی‏داری در قطر فولیکول‏های اولیه و اتریک و کاهش معنی‏داری در قطر فولیکول‏های در حال رشد، گراف و قطر جسم زرد در گروه‏های تجربی 1، 2، 3 نسبت به گروه کنترل و شاهد مشاهده شد. سنجش هورمونی FSH از سرم خون گروه‏های تجربی و کنترل و شاهد اندازه‏گیری شد و در نمودار 2 دیده می‏شود و بیان‏گر کاهش  معنی‏داری میزان FSH سرم خون در گروه‏های تجربی 1,2,3 نسبت به گروه کنترل و شاهد می‏باشد که این کاهش در گروه تجربی 1 در سطح 05/0>p و گروه تجربی 2، 05/0>p و گروه تجربی 3، 01/0>p می‏باشد(mlu/ml). سنجش هورمونی  LHاز سرم خون گروه‏های تجربی و کنترل و شاهد اندازه‏گیری شد و در نمودار 1 دیده می‏شود و بیان‏گر کاهش معنی‏داری میزان LH سرم خون در گروه‏های تجربی 2,3 نسبت به گروه کنترل و شاهد می‏باشد که این کاهش  در گروه تجربی 2 در سطح 05/0>p و گروه تجربی 3، 01/0>p می‏باشد (mlu/mL).

 

 

 

 

 

نمودار1: نتایج تحلیل مقایسه‏ی میزان هورمون LH در گروه‏های کنترل، سم٬ تجربی 1، 2، 3 کاهش معنی‏داری میزان LH سرم خون در گروه‏های تجربی 2,3 نسبت به گروه کنترل و شاهد (x¯ ± SE) (* p<0.05,** p<0.01, ***p<0.001).

 

 

 

 

 

نمودار 2: نتایج تحلیل مقایسه‏ی میزان هورمونFSH  در گروه‏های کنترل٬ سم٬ تجربی 1، 2، 3 کاهش  معنی‏داری میزان FSH سرم خون در گروه‏های تجربی 1، 2، 3 نسبت به گروه کنترل و شاهد (x¯ ± SE) (* p<0.05,**p<0.01, ***p<0.001).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 1: نتایج تحلیل آماری تاثیر زولپیدم بر روی قسمت‏های مختلف قطر بافت تخمدان، تعداد فولیکول در گروه‏های کنترل، سم، تجربی 1، تجربی 2 و تجربی 3 ((x¯± SE. *نشانه‏ی معنی‏داری گروه‏های تجربی با گروه‏‏های کنترل و سم می‏باشد.

 

تجربی 3

تجربی 2

تجربی 1

سم

کنترل

فاکتور اندازه گیری

 

26 ± 0/57

 

29/50 ± 0/80

 

32 ± 0/57

 

33/50 ±  0/56

 

34/50 ± 0/99

 

وزن جانور

 

8/91 ± 0/30

 

9/91 ± 0/29

 

11/30± 0/25

 

12/31  ±  0/25

13/40 ± 0/53

وزن تخمدان

 

101/25 ± 1/25

 

104/16 ± 2/63

 

110/41±  3/84

 

134/58 ± 3/25

131/66  ± 3

قطر تخمدان  (μm)

 

**10/33± 0/33

 

**8/66  ± 0/21

 

7 ± 0/25

 

4/66 ± 0/21

 

4/50± 0/22

تعداد فولیکول بدوی

 

4/43 ± 0/16

 

5/33  ± 0/21

 

 

4/16 ± 0/16

 

3/33± 0/21

 

3/16 ± 0/16

تعداد فولیکول اولیه

 

**4  ± 0/25

 

 

**4  ± 0/25

 

2/83 ± 0/40

 

3  ± 0/36

 

 

2/33 ± 0/42

تعدادفولیکول درحال رشد

 

***1/33± 0/21

 

**1/33 ± 0/21

 

2 ± 0/36

 

 

 

4/50± 0/22

 

 

5/50 ± 0/22

تعداد فولیکول گراآف

 

***5/33± 0/21

 

***4 ± 0/36

 

*2/66 ± 0/21

 

0/33 ± 0/21

 

0

تعداد فولیکول اترتیک

 

***1/33± 0/21

 

***2  ± 0

 

*2/16 ± 0/30

 

3/50 ± 0/42

 

3/66 ± 0/21

تعداد جسم زرد

 

**13/66± 0/45

 

13/50 ± 0/67

 

11/16 ± 0/87

 

12/66 ± 1/05

 

8/83 ± 0/16

تعداد رگ خونی

 

1/50 ± 0/28

 

1/25 ± 0/25

 

1  ± 0

 

0

 

 

0

تعداد فولیکول غیر طبیعی(2 و3اووسیت در فولیکول)

3/88 ± 0/36

3/33 ± 0/21

3/66 ± 0/33

4 ± 0

4/50 ± 0/22

قطر فولیکول بدوی (μm)

*10/33 ± 0/55

9/66  ±0/21

10/33 ± 0/33

8/66  ± 0/33

7/83  ±0/16

قطر فولیکول اولیه(μm)

***12/50± 1/70

15 ± 0

15/83 ± 0/83

20/83 ± 0/54

22/50 ± 1/11

قطر فولیکول در حال رشد(μm)

12  ± 0/81

13/50±0/22

14/50 ± 0/84

18/50 ± 0/34

19/16 ± 0/83

قطرفولیکول ثانویه(μm)

**25   ± 1/09

*26/83 ± 1/35

30/50± 1/7

37/50 ± 1/11

39/16 ±0/83

قطرفولیکول گراآف(μm)

*18/50 ±  0/76

*16/83 ± 1/53

15  ± 1/12

13/33 ± 1/66

5/83 ±  3/74

قطر فولیکول اترتیک(μm)

**24/83± 1/60

*24/16 ± 0/83

29/66 ± 1/11

32/50 ± 1/11

36/66 ± 1/66

قطر جسم زرد(μm)

6/16 ± 0/47

6/16 ± 0/40

5/66 ±  0/33

5/83 ± 0/54

5 ± 0

قطر رگ خونی(μm)

13/75 ± 2/39

13/75 ± 1/25

12 ± 0/70

0

0

قطر فولیکول غیر طبیعی(μm)

 

از مقاطع نمونه­های تخمدان گروه­های تجربی و کنترل و شاهد فتومیکروگراف تهیه شد که با افزایش دوز ماده­ی مصرفی، در بافت­های تخمدان کاهش قطر جسم زرد (شکل1، A) افزایش فولیکول آترتیک همچنین وجود فولیکول غیرطبیعی (وجود دو اووسیت در یک فولیکول) (شکل1، B)، کاهش قطر فولیکول گراف وجود فولیکول غیرطبیعی (سه اووسیت در یک فولیکول)، به‏هم­ریختگی لایه تک و به‏هم­ریختگی استرومای تخمدان نسبت به گروه کنترل و شاهد (شکل1، C و D) افزایش فولیکول بدوی (شکل 1، E) افزایش فولیکول درحال رشد و کاهش قطر فولیکول درحال رشد، کاهش جسم زرد، و بی‏نظمی سلول‏های جسم زرد در گروه تجربی نسبت به کنترل (شکل 1، F) مشاهده شد.

 

 

 

شکل 1: بافت تخمدان گروه تجربی دوم با تزریق 10 میلی‏گرم زولپیدم بر کیلوگرم وزن موش رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین 400X به افزایش فولیکول  آترتیک و تخریب فولیکول‏ها توجه شود. A: فولیکول بدوی،B : فولیکول اولیه،:C  فولیکول  آترتیک، D: فولیکول در حال رشد، E: فولیکول گراف، F: رگ خونی. شکل(B): بافت تخمدان گروه تجربی دوم با تزریق 10 میلی گرم زولپیدم بر کیلوگرم وزن موش رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین400X به کاهش جسم زرد و افزایش فولیکول آترتیک و تحلیل اووسیت فولیکول گرااف توجه شود. A: فولکول بدوی :Bفولیکول اولیه،:C فولیکول آترتیک، D: فولیکول غیر طبیعی وجود 2 اووسیت در یک فولیکول، E: فولیکول در حال رشد، F: فولیکول گراف، G: رگ خونی .شکل (C): بافت تخمدان گروه تجربی سوم با تزریق ‌20 میلی گرم زولپیدم بر کیلوگرم وزن موش، رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین400X  به (E) استرومای نامنظم وجود سه اووسیت در فولیکولF)) کاهش تعداد و اندازه جسم زرد ((CL توجه شود. شکل(D): بزرگنمایی بخشی از بافت تخمدان گروه تجربی سوم، سه اووسیت در یک فولیکول از نمای نزدیک. شکل(E): قسمتی ازبافت تخمدان گروه تجربی دوم افزایش تعداد فویکول‏های بدویPF )  ) رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین X400. شکل (F): بافت تخمدان گروه تجربی به کاهش  تعداد جسم زرد و افزایش فولیکول در حال رشد توجه شود A: فولیکول آترتیک  :Bفولیکول در حال رشد،:C فولیکول ثانویه،  : Dفولیکول اولیه  :Eرگ خونی، -F: فولیکول بدوی رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین 400X.

 

 

این بررسی نشان داد که در گروه­های تجربی بیشترسلول‏های فولیکول­ها روند تخریب را طی می‏کنند و تعداد جسم زرد در گروه تجربی نسبت به کنترل کاهش معنی‏داری داشته است. در مقایسه سلول­های گرانوزای لوتئینی در گروه کنترل بزرگ، چند وجهی، هسته بزرگ ریوکروماتین، هستک مشخص و ساختار سلول­های سنتزکننده هورمون استروژن و پروژسترون را نشان دادند. همین سلول­ها در گروه تجربی دارای هسته نامنظم می­باشد. در دوزهای بالا در بافت تخمدان، کاهش فولیکول­های گراف و ثانویه افزایش فولیکول­های اولیه وبدوی به‏هم­ریختگی در لایه سلول‏های گرانولوزا جداشدگی لایه­ی تاج شعاعی از اوسیت، تحلیل اووسیت فولیکول گراف کاهش قطر فولیکول­ گراف، افزایش رگ خونی وجود دو و سه اووسیت در یک فولیکول و به‏هم‏ریختگی استرومای تخمدان  دیده شد.

 

بحث

بسیاری از این مطالعات تاثیرات مختلف زولپیدم بر اندام‏های مورد نظر را گزارش دادند. با این وجود در زمینه­ی اثرات احتمالی این دارو بر باروری، مطالعاتی صورت نگرفته است، اثر این داروی پرمصرف  بر دستگاه تناسلی ماده تخمدان­ها، رشد تخمک­ها،  هورمون­های جنسی بررسی شد. در سه گروه تجربی که داروی زولپیدم را دریافت کرده­اند کاهش وزن نسبت به گروه­های کنترل و مشاهده دیده می­شود. با این حال با توجه به‏این‏که این میزان کمتر از حد معنی­دار بوده و می­توان گفت داروی زولپیدم در دوزهای مورد بررسی بر کاهش وزن موش­های ماده‏ی بالغ بی­تاثیر بوده است. وزن نسبی تخمدان­ها، در موش­های ماده­ی بالغ که زولپیدم را دریافت کرده­اند نسبت به گروه­های کنترل و شاهد کاهش پیدا کرده است. کاهش در دوز 10 و 20 بیشتر مشاهده شده و کمتر از حد معنی­دار بوده و مبنی بر عدم تاثیر زولپیدم بر نسبت وزن تخمدان به وزن بدن موش، در دوزهای مورد بررسی می­باشد. قطر تخمدان­ها نیز همانند وزن آن‏ها در گروه­های تجربی؛ نسبت به گروه­های کنترل و سم کاهش پیدا کرده و کمتر از حد معنی­دار می­باشد. بنابراین می­توان این‏گونه پیش­بینی کرد که درصورت افزایش دوز مصرفی به میزان بیشتر از 20 میلی‏گرم بر کیلوگرم وزن بدن، کاهش در وزن و اندازه­ی تخمدان­ها دیده می‏شود. Paik  Greschensonو همکاران (30) نشان دادند که استفاده از داروی خواب آور بر فولیکول­های بالغ بیشتر از فولیکول‏های ابتدایی اثر می‏گذارد که با نتایج حاصل از این تحقیق همخوانی دارد ،Chakrabrty و همکاران (31) در بررسی اثرات زوپیکلون بر روی دستگاه تناسلی موش ماده رت، در موش­هایی که تحت تیمار با داروی زوپیکلون به‏مدت 28 روز به‏صورت خوراکی قرار گرفتند. نشان دادند که سلول­ها روند تخریبی داشته و فولیکول­ها در حالت آتروفی هستند ، در مطالعه­ی حاضر تعداد فولیکول­های آترتیک افزایش یافته است. Clark و همکاران (32) در بررسی­های میکروسکوپی نشان دادند که ریتالین موجب می‏شود سلول­های لوتئینی جسم زرد، دارای هسته­ی نامنظم و تغییرات در این سلول­ها شود ، در تحقیق حاضر تغییرات و بی­نظمی­هایی در سلول‏های جسم زرد نیز مشاهده شد. در مطالعه­ای که توسط Ayolan و همکاران در سال 2014 انجام گرفت نشان دادند که داروی آرام بخش منجر به کاهش هورمون FSH و LH می­شود (33). در مطالعه­ی حاضر کاهش میزان هورمون LH مشاهده شد. احتمالا زولپیدم از طریق مهار ترشح دوپامین به‏عنوان عامل مهار کننده ترشح پرولاکتین باعث افزایش ترشح پرولاکتین و در نتیجه کاهش ترشح TRH  و به‏دنبال آن کاهش سطح سرمی هورمون‏های TSH,T4 می‏شود (19) مطالعاتی که بر روی داروهای ضدافسردگی (زولپیدم) با اثرات مرکزی و تاثیر بر روی محور هورمونی هیپوتالاموس-هیپوفیز-تیروئید باعث کاهش سطح سرمی هورمون­های این محور هورمونی و به‏ویژه T4 همراه است (34). در تحقیق حاضر از آن‏جایی‏که در میزان هورمون FSH و LH کاهش  ایجاد شد  می‏توان نتیجه گرفت که سبب اختلال در هورمون‏های جنسی میشود. افزایش آترزی در فولیکولهای تخمدان در گروه­های تحت درمان نشان از تاثیر زولپیدم بر تخمدان دارد و از طرفی کاهش معنی­دار جسم زرد در گروه­های دریافت کننده­ی دارو مشخص کننده‏ی این واقعیت است که تعداد اندکی فولیکول­ها توانسته­اند به مرحله بلوغ نهایی رسیده تا بتوانند تبدیل به جسم زرد شوند. به‏عبارتی کاهش میزان HL که نسبت گروه کنترل به‏شدت معنی­دار است موجب می­شود که تعداد بیشتری از فولیکول­ها در تخمدان باقی مانده و به جسم زرد تبدیل نشوند. همچنین وجود سلول‏های در حال تخریب در جسم زرد و تغییر در ساختار این سلول­ها که می­تواند به‏دلیل تاثیر زولپیدم بر محور و مغز، هیپوفیز- تخمدان باشد که منجر به کاهش هورمون باشد. در تعداد فولیکول­های بدوی و فولیکول­های اولیه گروههای تجربی نسبت به کنترل و شاهد افزایش وابسته به دوز دیده می­شود که این افزایش در دوزهای 01 و02 معنی­دار بوده است. برخلاف فولیکول­های بدوی و اولیه، تعداد فولیکول­های ثانویه و فولیکول­های گراف کاهش وابسته به دوز نشان داده است که این کاهش در دوز 01 و02 از نظر آماری، معنی­دار بوده است. دراین دوزها، فولیکول­ها در مراحل ابتدایی رشدشان باقی مانده‏اند و از تکوین آنها نیز ممانعت به‏عمل آمده است جلوگیری از تکوین سلولی در مطالعات پیشین در دیگر بافت­ها گزارش شده است (53). تعداد فولیکول­های آترتیک در گروه­های تجربی، افزایش وابسته به‏دوز و از نظر آماری بسیار معنیدار را داشته است. افزایش مرگ سلولی در سلول­های فولیکولی احاطه کننده­ی اووسیت در فولیکول­های آترتیک دیده شده در مطالعات گذشته مرگ سلولی گزارش شده است (36). با توجه به اینکه این دارو اثر خود را از طریق سیستم­های گاباارژیک اعمال می­کند و سیستم گابا ارژیک برای تکوین متناسب و تخصیص­یابی سلول­ها اهمیت دارند (73) بنابراین احتمالا اثر آگونیستی دارو باعث اختلال در عملکرد طبیعی سلول­ها شود. این اختلالات منجر به بروز ناهنجاری­های در تکامل طبیعی سلول­ها شود. تعداد جسم­های زرد در گروه­های تجربی، کاهش وابسته به دوز نشان داده است. که این کاهش در دوز 5، 01، 02 معنی‏دار بوده است. جسم زرد، نتایج حاصل از شمارش رگ­های خونی تخمدان، افزایش وابسته به دوز را نشان داده است. که این افزایش در دوزهای 02 معنی­دار بود. نتایج حاصل از اندازه­گیری طول فولیکولهای بدوی، افزایش که از نظر آماری معنی­دار باشد را نشان نداد. نتایج به‏دست آمده حاکی از افزایش طول فولیکول اولیه به‏صورت وابسته به‏دوز است که در دوزهای 02 این میزان از نظر آماری معنی­دار بوده است. این فولیکول­ها تنها بزرگ شده­اند لایه­ی سلول‏های فولیکولی آن‏ها هیچ تغییری نکرده و چند لایه نشده است و به‏نظر می­رسد این تکثیر سلول‏های فولیکولی ناشی از جذب آب می­باشد. افزایش اندازه بدون تکثیر و تمایز نتایج حاصل از اندازه‏گیری طول فولیکول­های گراف، حاکی از کاهش قطر فولیکول­گراف و فولیکول درحال رشد به‏صورت وابسته به‏دوز است که در دوز 01 و02 این میزان از نظر آماری معنی­دار بوده است. نتایج حاصل از اندازه­گیری طول جسم زرد، حاکی از کاهش قطر جسم زرد به‏صورت وابسته به‏دوز است که در دوز 5، ، 02 این میزان از نظر آماری معنی­دار بوده است. افزایش قطر و معنی­داری از نظر آماری در قطر فولیکول‏های در حال رشد، و آترتیک در گروه­های تجربی  نسبت به کنترل و شاهد دیده شد که نشان­دهنده­ی تاثیر زولپیدم براندازه­ی فولیکول­ها می‏باشد. نتایج نشان دهنده‏ی کاهش میزان هورمون FSH در گروه­های تجربی، دوز 01 و 02 معنی‏دار بوده در بررسی‏ها کاهش معنی‏داری فولیکول‏های گراف و به‏هم‏ریختگی سلول‏های آن و تحلیل اووسیت  فولیکول کاهش میزان هورمون FSH  را تایید می‏کند. و میزان هورمون LH در گروه­های تجربی 01 و 02 معنیدار می­باشد در بررسی‏ها کاهش معنی‏داری جسم زرد را در گروه‏های تجربی را مشاهده کردیم که کاهش میزان هورمون HL را تایید می‏کند. نتایج کلی این تحقیق نشان داد که داروی زولپیدم دارای اثرات منفی وابسته به‏دوز بر اوژنز بوده و در دوزهای بالا، همچنین موجب کاهش سرعت اوژنز، افزایش فولیکول­های آترتیک، کاهش میزان هورمون‏های جنسی منجر به بیماری‏های از قبیل ناباروری نیز می‏شود. با این حال در دوز پایین­تر این تاثیر کمتر بوده و تاثیر قابل توجه زیادی در استفاده از این مواد در دوز پایین مشاهده نشد. این موضوع نشان میدهد که تاثیرات منفی داروی زولپیدم وابسته به‏دوز مصرفی میباشد. درنتیجه مطالعه­ی اخیر پیشنهاد می­کند که با اینکه این دارو در دوزهای بالا مضر می­باشد، می­توان با مصرف کنترل شده و در دوز ایمن، مانع از ظهور اثرات منفی آن بر باروری جنس ماده شد.

 

نتیجه­گیری

داروی زولپیدم (Ambien)، در دوزهای بالا دارای تاثیر منفی بر اووژنزو هورمون­های جنسی بوده که می­تواند موجب کاهش باروری شود. با اینحال در دوز پایین­تر این تأثیر کمتر بوده و تاثیر قابل توجه زیادی در استفاده از این مواد در دوز پایین مشاهده نشد. این موضوع نشان می­دهد که تاثیرات منفی داروی زولپیدم وابسته به دوز مصرفی می­باشد.

 

 

تشکر و قدردانی

نویسندگان مقاله لازم می‏دانند که از حمایت اجرایی مجتمع آزمایشگاهی زکریای رازی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات صمیمانه تقدیر و تشکر کنند.

1. Benke D, Zemoura K, Maier PJ. Modulation of cell surface GABA(B) receptors by desensitization, trafficking and regulated degradation. World J BiolChem.  2012; 3(4): 61-72.

2. Nutt DJ, Stahl SM. Searching for perfect sleep:the continuing evolution of GABA A receptor modulators ashypnotic. J Psychopharmacol. 2012; 24(11): 1601-1612.

3.Du B,Shan A, Zhang Y, Zhong X, et al. Zolpidem Arouses Patient in Vegetative State After Brain Injury. AJMS. 2014; 347(3): 178-82.

4. Bachleda p, Vrzal R, Pivnicka J, Cvek B, et al. Examination of zolpidem effects on ahR-andPXR-dependent expression of drug-metabolizinng cytochromes P450 in primary cultures of human hepatocytes.Toxicol. 2009; 191(1): 74-78.

5. Du B, ShanA, ZhangY, ZhongX, et al. Zolpidem Arouses Patient in Vegetative State After Brain Injury.The American Journal of the Medical Sciences. 2014; (3): 178-82.

6. Macdonald RL, Botzolakise J. Chapter14-GABA A receptor channels. In:Alvarez-leefmansFJ, DelpireE, editors. physiology and pathology of chloride transporters and channels in the nervous system. 2010; 257-82.

7. Luscher B, Fuchs T, Kilpatrick CL.GABA A receptor trafficking-mediated plasticity of inhibitory synapses. Neuron. 2011; 70(3): 385-409.

8. Rudolph U, Mohler H. GABAA receptor subtypes: Therapeutic potential in Down syndrome, affective disorders, schizophrenia, and autism. Annu Rev Pharmacol Toxicol. (2014); 54: 483-507.

9. Drover DR. Comparative pharmacokinetics and pharmacodynamics of short-acting hypnosedatives: zaleplon, zolpidem and zopiclone. Clin Pharmacokinet. 2004; 43(4): 227-38.

10. Licatta SC, Lowen SB, Trksak GH, Maclean RR, et al. Zolpidem reduces the blood oxygen level dependent signal during visual system stimulation. Prog Neuro-Psychopharmacol Biol Psychiatry. 2011; 35(7): 1645-1652.

 

11. Lu E, Wang bW, Guimond C, Synnes A,Sadovnick,k,a.D.,Dahlgren,L.,Traboulsee,A.Tremlett,H. Safety of disease-modifying drugs for multiple sclerosis in pregnancy:current challenges and future considerations for effective pharmacovigilance. Expert Rev Neurother. 2013; 13(3):251-60.

12. Froestl W. An historical perspective on GABAergic drugs. Future Med Chem. 2011; 3(2): 163-75.

13. Najjar M. Zolpidem and Amnestic Sleep Related Eating Disorder. J  Clin Sleep Med. 2007; 3(6): 637-638.

14. Huang CY, Cho FH, Huang YS. The association between zolpidem and infection in patient with sleep disturbance. J Psychatr Res. 2014; 54; 116-120.

15. Ahmed OM, El-Gareib AW, El-Bakry AM, Abd El-Tawab SM, et al. Thyroid hormones states and brain development interactions.Int J Dev Neurosci. 2008; 26(2): 147-209.

16. Saler Tw. Langmanembriologiamedica 011.ed.Rio de janerio: Guanabara Koogan,2010.230 p.

17. Sgado P, Dunleavy M, Genovesi S, Provenzano G, et al. The role of GABAergic system in neurodevelopmental disorders: a focus on autism and epilepsy. Int J Physiol Pathophysiol Pharmaco. 2011; 3(3): 223–235.

18. Drover D, Lemmens H, Naidu S, Cevallos W, et al. pharmacokinetics,Pharmacodynamic,and relative pharmacokinetic, Pharmacodynamic profiles of zaleplone and zolpidem. J Clinical Therapeutics. 2000; 22(12): 1443-61.

19. Hosseini E, Khatamsaz S, Goodarzi A. The effect of zolpidem medicine on thyroid plasmic hormones of T3,T4 and TSH in mail mature rats. J Jahrom Univ Med Sci. 2011; 9(1): 1-6.

20. Joya FL, Kripke DF, Loving RT. Meta analyses of hypnotics and infections: eszopiclone,rameltcon,zaleplone,and zolpidem. J Cline Sleep Med. 2009; 5(4): 377-383.

 

21. Juric S, Newport DJ, Ritchie JC, Galanti M, et al. Zolpidem Ambien in pregnancy;placental passage and  outcome. Archive of Womans Mental Health. 2009; 2(6): 441-6.

22. Joya FL, KripkeDF, Loving RT. Meta –analyses of hypnotics and infections: eszopiclone,rameltcon,zaleplone,andzolpidem. J Cline Sleep Med. 2009; 5(4):377-383.

23. Sharma A, sayeed N, Khess CR, Akhtar S. high dose zolpidem induced fetal neural tube defects.Current drug safety. 2011; 6(2):128-129.

24. . Greenblatt DJ, Roth T. Zolpidem for insomnia. Expert Opin Pharma cother. 2012; 13(6): 879-893.

25. Roth T, Krystal A, Steinberg FJ. Novel subling low-dose zolpidem tablet reduces latency to sleep onset following spontaneous middle-of-the night awakening in insomnia in a randomized,double-blind,placebo-controlled. Out patient study sleep. 2013; 36(2): 189-196. 

26. . Smith S, Pfeifer SM, Collins JA .Diagnosis and management of female infertility.290,no. 2003; 290(13): 1767-70.

27. Wang L, Lin H, Lin C, Chen Y. Increaased risk of adverse pregnancy outcomes in women receiving zolpidem during pregnancy. Clin Pharmacol Ther. 2010; 88(3): 369-374.

  1. Mohler H, Monti JM, Pandi-Perumal SR. Physiology and pharmacology of the GABA system: focus on GABA receptors. In: GABA and Sleep: Molecular, Functional and Clinical Aspects. 2010; 3-23.
29. Najjar M. Zolpidem and amnestic sleep related aetingdisorder. JClin. 5Sleep,ed,American Academy of Sleep Medicine. 2007; 3(6): 637-638.

30. Greschenson M, Paik CY, Gaukler EL, Diwan BA, et al. Cisplatin exposure induces mitochondrial toxicity in pregnant rats and their fetuses. Report Toxicol 2001; 15(5): 525-531.

31. Chatterjee-Chakrabarty S, Miller BT, Collins TJ, Nagamani M. Adverse effects of methylphenidate on the reproductiveaxis of adolescent female rats. FertilSteril 2005; 84: 1131-1138.

32. Clark AS, 5Kelton MC, Whitney AC. Chronic administration of anabolic steroids disrupts pubertal onset and estrous cyclicity in rats. Bio Reprod. 2003;68: 465-471.

33. Ayolan D, Nir I, Cordova T, Bauminger S, et al. Acute effects of delta1-tetrahydrocannabinol on the hypothalamo-pituitary-ovarian axis in the rats. Neuroendocrinology. 2014; 42: 23-31.

34. Zhang L, Blomgren K, Kuhn HG, Cooper-Kuhn CM. Effects of postnatal thyroid hormone deficiency on neurogenesis in the juvenile and adult rat. Neurobiol Dis. 2009; 34(2):366-74.

35. Liu XF, Chang HS, Chmiesing RJ, Wesolowski SS, et al. Developing dual functional allosteric modulators of GABA A receptors. BioorgMed Chem. 2010; 18(23): 8374-8382.

36.  McGavin MD, Carlton WW, Zachary JF. Thomson,s Special veterinary pathology. firstindian ed. delhi: published by s.kjain for cbs publishers and distrusters. 2000; 229-268.

37. Saler Tw. Langmanembriologiamedica 011.ed.Rio de janerio: Guanabara Koogan. 2010.230 p.