بررسی اثر ضدسرطان عصاره الکلی به‏لیمو Lippia citriodora: مهار متاستاز سلول‏های سرطان تخمدان A2780 از طریق بازیابی بیان E-کادهرین‬‬‬‬‬

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه سلولی مولکولی، تهران، ایران

2 دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، مشهد، ایران

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه، بررسی پتانسیل پروآپوپتوزی و ضد متاستازی عصاره الکلی برگ به­لیمو (Lippia citriodora) بر سلول‏های سرطان تخمدان A2780 و بررسی بیان E-کادهرین به‏عنوان یکی از مارکرهای مهم در متاستاز است.
مواد و روش­ها: در این پژوهش تجربی آزمایشگاهی، رده­ی سلولی A2780 از بانک سلولی پاستور تهیه و در محیط کشت RPMI1640 دارای FBS، 10 درصد به‏همراه 1 درصد آنتی بیوتیک در دمای 37 درجه سانتی‫گراد­ کشت ­شدند. پس از کشت سلول‏ها و تیمار با غلظت‏های مختلف عصاره (10 تا 400 میکروگرم بر میلی­لیتر) قابلیت حیات سلول‫ها توسط روش MTT، پتانسیل پروآپوپتوزی توسط آزمون اکریدین اورنج/پروپیدیوم ایوداید و کاسپاز 3 و اثر ضد تهاجمی توسط تست مهاجرت و ارزیابی بیان E-کادهرین اندازه­گیری شد. سپس از آزمون آماری آنالیز واریانس یک‫طرفه برای تحلیل نتایج کمی استفاده شد.
نتایج: داده­ها نشان داد عصاره الکلی برگ به­لیمو به‏صورت وابسته به دوز بقای سلول‏های A2780 را کاهش داد. نتایج آزمون اکریدین اورنج و کاسپاز-3 نشان داد این عصاره در غلظت میانه مهاری (100 میکروگرم) باعث القای آپوپتوز وابسته به کاسپاز در سلول‏های سرطان تخمدان می­شود. آزمون مهاجرت و  RT-PCRنشان داد که این عصاره دارای پتانسیل ضد تهاجمی بوده و با افزایش بیان E –کادهرین از سست شدن اتصالات بین سلول‏های سرطانی جلوگیری می­کند.
نتیجه گیری: نتایج این پژوهش نشان داد عصاره الکلی برگ به­لیمو با دارا بودن ظرفیت القای آپوپتوزیس و بازیابی بیان E-کادهرین در سلول‏های سرطانی A2780 قادر به مهار پتانسیل تهاجمی سلول‫های سرطان تخمدان است.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

سرطان تخمدان پنجمین سرطان شایع و در بین زنان دومین بدخیمی دستگاه تولیدمثلی محسوب می­شود. این نوع سرطان به­طور رایج به­دلیل تجمع فاکتورهای آسیب رسان از جمله عدم تحرک کافی، مصرف الکل، چاقی و افزایش استعمال دخانیات ایجاد می­شود (1،2). درمان سرطان تخمدان با هدف­های مختلفی مثل پیشگیری، درمان و کنترل صورت می­گیرد. به‫طور معمول چند راه برای درمان سرطان ازجمله: جراحی، شیمی درمانی، پرتو درمانی، هورمون درمانی، ایمونوتراپی و ژن درمانی وجود دارد. در این میان شیمی درمانی، جراحی و هورمون درمانی روش­های رایج­تر درمان سرطان تخمدان هستند. به‏علاوه استفاده توام این روش­ها بر علیه برخی از سرطان‏ها که به‏طور وسیع در بدن انتشار یافته­اند، به‏کار گرفته می­شود (3). متاستاز یکی از چالش­های عمده در درمان سرطان تخمدان به‏شمار می­رود. تبدیل حالت اپیتلیالی به‏حالت مزانشیمی (Epithelial Mesenchymal Transition: EMT) یک فرایند بیولوژیکی در متاستاز است که طی این فرایند سلول‏های اپی­تلیالی قطبی که در شرایط طبیعی از طریق سطح بازال خود با غشای پایه برهم کنش دارند، دستخوش تغییرات بیوشیمیایی شده و فنوتیپ مزانشیمی شبه فیبروبلاستی پیدا می­کنند (4). مطالعات نشان داده است که این تغییرات بیوشیمیایی باعث افزایش ظرفیت مهاجرت، تهاجم، مقاومت بالا به آپوپتوزیس و تا حد زیادی افزایش تولید اجزای ماتریکس خارج سلولی (ECM) می­شود (5). شواهد نشان می­دهد که سرطان‏های با منشا اپی­تلیالی از جمله سرطان تخمدان با دارا بودن مجموعه کوچکی از سلول‏های بنیادی سرطانی توانایی رشد تومور، متاستاز و مقاومت به درمان دارند (7، 6). از بین مهم­ترین نشانه­های‏ مولکولی EMT می­توان به‏ کاهش بیان مارکرهای اپی­تلیال (E-کادهرین، پلاکوگلوبین و دسموپلاکین)، افزایش بیان مارکرهای مزانشیمی (ویمنتین، N-کادهرین،α-SMA ) و افزایش بیان فاکتورهای رونویسی مانند Snail، Slug، Twist،  (Zinc Finger E-Box Binding Homeobox 1)ZEB1 ، ZEB2  (Zinc Finger E-Box Binding Homeobox 2)که می­توانند به پروموتر E-کادهرین متصل شده و فعالیت رونویسی و بیان E-کادهرین را متوقف کنند، اشاره کرد. مطالعات نشان داده ­است که از دست دادن و یا کاهش بیان E-کادهرین، اولین و مهم‏ترین مرحله EMT در نظر گرفته می­شود (8). دراغلب تومورهای اولیه که خاصیت تهاجم دارند چسبندگی بین سلولی کاهش می­یابدکه اغلب به‏دلیل از دست رفتن E-کادهرین است. از آن‏جایی‏که بازگشت و وخیم تر شدن بیماری پس از درمان در پی متاستاز یکی از چالش‏های مهم برای بیماران است، بنابراین پیشگیری از روند متاستاز می­تواند شاخص مهمی در روند درمان بیماران باشد (9).

گیاهان تولیدکننده تعداد وسیعی متابولیت ثانویه هستند که خواص اغلب این ترکیبات هنوز شناسایی نشده­ است. به­علاوه خواص فیزیکی، شیمیایی و زیستی این ترکیبات به میزان زیادی با هم متفاوت است. مطالعات بسیاری ترکیبات طبیعی را به‏عنوان گزینه­های مناسب در درمان سرطان پیشنهاد کرده­اند (10). تحقیقات نشان داده ­است در بین ترکیبات طبیعی، گیاهان دارویی و عصاره آن­ها نقش مهمی در درمان بسیاری از انواع سرطان­­ها از جمله سرطان تخمدان ایفا می­کند (11).

Aloysia citrodora گونه­ای از گیاهان گلدار از خانواده شاهپسند، است. نام رایج آن lemon verbena و lemon beebrush است. برخی گونه­های این گیاه (Candida albicans) دارای فعالیت ضدقارچی و سیتوتوکسیک هستند (13، 12). تحقیقات نشان داده­اند که مکمل­های آنتی اکسیدانتی موجود در عصاره به­لیمو دارای اثر حفاظتی در برابر استرس اکسیداتیو القا شده توسط بیماری­ها است (14). تا به‏حال، در مورد خواص ضدسرطان گونه Lippia citrodora به‏عنوان یکی از گونه­های بومی شاه‫پسند در ایران مطالعه­ای صورت نگرفته است. با توجه به این­که کاهش بیان E-کادهرین به‏عنوان یک بیومارکر برای پیش­بینی سرطان­های با منشا اپی‫تلیالی در نظر گرفته می­شود، هدف از تحقیق حاضر بررسی اثر سمیت سلولی عصاره الکلی برگ­های به­لیمو (Lippia citriodora) بر سلول‏های سرطان تخمدان A2780 مقاوم به سیس پلاتین و بررسی اثر این عصاره بر مهاجرت سلول‏های A2780 و بیان E- کادهرین در این سلول‏ها است.

 

 

مواد و روش‌ها

تهیه عصاره الکلی گیاه به­لیمو: گیاه به­لیمو پس از تایید هرباریوم دانشکده علوم زیستی دانشگاه خوارزمی، به آزمایشگاه سلولی دانشکده منتقل شد. پس از خشک کردن گیاه در محل تاریک و بدون رطوبت، برگ­های به‏لیمو جدا و خرد گردید. 20 گرم از پودر برگ گیاه با 100 میلی­لیتر اتانول (Merck, Germany) مخلوط شد و به‏منظور استخراج به‏مدت 72 ساعت بر روی دستگاه شیکر (چرخاننده) قرار گرفت. سپس عصاره به‏دست آمده توسط کاغذ صافی فیلتر شد و جهت تغلیظ و عصاره گیری در دستگاه روتاری (Heidolph, Germany) قرار گرفت (15).

کشت سلول: برای انجام این پژوهش تجربی آزمایشگاهی، سلول‏های A2780 از انستیتو پاستور تهران خریداری شد. سلول‏ها در محیط کشت RPMI 1640 (شرکت ایده زیست، ایران) حاوی 10 درصدFBS   و 1 درصد آنتی بیوتیک (Gibco, USA) کشت داده­ شدند (16).

بررسی اثر سمیت سلولی: برای بررسی سمیت سلولی غلظت­های مختلف عصاره الکلی برگ به­لیمو بر سلول‏های سرطانیA2780 و تعیین دوز میانه مهاری (Inhibitory Concentration: IC50)، از روش رنگ سنجیMTT  (Sigma, USA) استفاده شد. برای این منظور سلول‏های A2780، به تعداد 10000 سلول در چاهک­های پلیت­ 96 خانه کشت داده شدند و 24 ساعت پس از کشت، توسط غلظت­های مختلف عصاره الکلی برگ گیاه به­لیمو (400 ،200، 50،100 ، 10 میکروگرم بر میلی‫لیتر) تیمار شدند. بنابراین یک گروه کنترل و پنج گروه تیماری برای این آزمون در نظر گرفته شد. پس از 24 و 48 ساعت از تیمار، MTT با غلظت 1 میلی­گرم بر میلی­لیتر به سلول‏ها اضافه شد و سلول‫ها به‏مدت 4 ساعت تحت تیمار با MTT انکوبه شدند. پس از 4 ساعت جهت حل­کردن کریستال‫های فورمازان (شاخص سلولهای زنده) به هر چاهک 80 میکرولیتر DMSO (دی متیل سولفوکساید) اضافه شد. سپس جذب نوری در طول موج 570 نانومتر با استفاده از دستگاه میکروپلیت اسپکتروفتومتر (BioTech, USA) اندازه‏گیری شد (17). در نهایت درصد سلول‏های زنده از فرمول زیر محاسبه شد:

جذب نوری سلول‏های کنترل/جذب نوری سلول‏های تیمارشده= میزان بقای سلولی×100

رنگ آمیزی اکریدین اورنج/پروپیدیوم ایوداید: رنگ‫آمیزی ایداید جهت تشخیص و تمایز سلول‏های زنده، آپوپتوزیس و نکروزیس به‏کار می­رود. جهت انجام آزمون، 24 ساعت پس از کشت، سلول‏های  A2780با غلظت‏های مختلف عصاره الکلی برگ به­لیمو به‏مدت 48 ساعت تیمار شدند. سپس سلول‏ها از کف پلیت جدا شده و با 10  میکرولیتر اکریدین اورنج و 10 میکرولیتر پروپودیوم ایداید با غلظت 100 میکروگرم بر میلی‏لیتر(Sigma, USA)تیمار شدند و پس از پیپتاژ در زیر میکروسکوپ فلورسانس(Olympus, Japan) توسط فیلتر آبی آبژکتیو 40 مورد بررسی قرار گرفتند (18).

تست کاسپاز 3: از این تست به‏منظور تعیین وابستگی آپوپتوزیس از مسیر کاسپاز استفاده می‏شود. برای انجام این تست، بعد از گذشت 48 ساعت از تیمار، سلول‏های A2780 (گروه کنترل و تحت تیمار) تریپسینه شدند و پس از اتمام سانتریفیوژ،  از کیت کاسپاز-3 (abcam 39401, Canada) جهت ارزیابی فعالیت کاسپاز-3 استفاده گردید. برای این منظور، به هر نمونه 50 میکرولیتر بافر لیزکننده (حاویHEPES ، NaCl، EDTA، CHAPS، Sucrose، DTT، Triton X-10، Glycerol،Protease inhibitor cocktail ) موجود در کیت اضافه شد و نمونه­ها 10 دقیقه روی یخ قرار گرفتند. پس از افزودن  µl50 از DDT (Dithiothreitol) و 2x buffer و lµ5 DEVD-p-NA(N-Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-p-Nitroanilide: سوبسترای کاسپاز 3) به هر نمونه و انکوباسیون 2 ساعته، بر طبق دستورالعمل کیت جذب هر نمونه در طول موج 450 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر (Bio Tech, USA) اندازه‏گیری شد (18).

تست مهاجرت: این آزمون برای ارزیابی اثر ضد متاستازی غلظتهای بازدارنده عصاره الکلی برگ به­لیمو به‏کار گرفته شد. برای بررسی میزان مهاجرت سلول‏های سرطانی A2780 تحت تیمار با غلظت­های بازدارنده تکثیر عصاره الکلی برگ به­لیمو (200، 100، 50، 10 میکروگرم بر میلی‏لیتر)، سلول‏ها در تراکم 105 سلول در هر چاهک پلیت 6 خانه کوت شده با ژلاتین کشت داده شدند. پس از تراکم 80 درصدی سلول‏های سرطانی در کف پلیت، توسط نوک پیپت خراشی در کف تمام چاهک­ها ایجاد شد و پس از آن سلول‏ها به‏مدت 24 ساعت تحت تیمار قرار گرفتند. پس از گذشت این زمان، تحرک و مهاجرت سلول‏ها به‏صورت کیفی توسط عکس‫برداری و مقایسه میزان پر شدن خراش در گروه­های کنترل و تیمار، در زیر میکروسکوپ معکوس (Olympus, Japan) مورد بررسی قرار گرفت (19).

RT-PCR جهت ارزیابی بیان E- کادهرین: RT-PCR به‏منظور ارزیابی بیان mRNAی E-کادهرین در سلول‏های سرطانی A2780 مورد استفاده قرار گرفت. برای این منظور پس از گذشت 24 ساعت از تیمار، RNA سلول‫ها توسط کیت پارس طوس (A101161, Pars tous biotechnology, Iran) از گروه کنترل و تیمار استخراج شد. در مرحله بعد توسط کیت سنتز cDNA (A101231, Pars tous biotechnology, Iran)، از روی RNA، cDNA سنتز شد و پس از افزودن پرایمرهای E-کادهرین، dNTP، بافر و Taq پلیمراز PCR انجام شد. B2M (Beta-2 microglobulin) نیز به‫عنوان ژن کنترل داخلی (housekeeper genes) به‏منظور نرمالیزاسیون مورد استفاده قرار گرفت (19).

 

آنالیز آماری

داده‏های آماری در بخش ارزیابی سمیت سلولی و آزمون کاسپاز توسط نرم افزار  SPSS شماره 20، آزمون آماری one way ANOVA، تست Tukey در سطح معنی­داری (05/0p≤) تجزیه و تحلیل شدند.

 

نتایج

اثر عصاره الکلی برگ به­لیمو بر روی میزان بقای سلولی

یافته‏های آزمون MTT (شکل1) و ارزیابی مورفولوژیک سلول‏ها توسط میکروسکوپ معکوس (شکل2) نشان داد که درصد زنده بودن سلول‫های A2780 تحت تیمار با عصاره الکلی برگ به­لیمو در غلظت­های 10، 50، 100، 200 و 400 میکروگرم بر میلی­لیتر در مدت زمان 24 ساعت نسبت به گروه کنترل به‫ترتیب 5/29، 5/49، 3/64، 6/83، 5/94 درصد در 48 ساعت 7/17، 9/39، 7/50، 8/69، 7/80 درصد مشاهده ­شد. تحلیل آماری نشان داد که عصاره مورد نظر در غلظت 100 میکروگرم بر میلی‏لیتر در 24 ساعت با 05/0*p<، در 48 ساعت با 01/0**p<، در غلظت 200 میکروگرم بر میلی‏لیتر در 24 ساعت با 01/0**p<، در 48 ساعت با 001/0***p<، در غلظت 400 میکروگرم در بازه زمانی 24 و 48 ساعت با ***p<0.001 موجب کاهش معنی­دار بقای سلول‏های سرطانی در مقایسه با گروه کنترل شد. این نتایج نشان داد که اثر کشندگی سلولی عصاره الکلی برگ­های به­لیمو در 24 ساعت و 48 ساعت وابسته به دوز و زمان است.

 

 

 

شکل1: میزان درصد بقای سلول‌ها با استفاده از روش MTT پس از 24 و 48 ساعت تیمار با عصاره الکلی برگ به­لیمو. نمودار نشان می‌دهد که درصد بازدارندگی عصاره الکلی برگ‏های به­لیمو روی سلو­ل­های سرطان تخمدان A2780 وابسته به دوز و زمان می‌باشد. آزمون آماری SPSS, one way ANOVA***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05 .(n=3, Mean ±­ SD)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2: مقایسه تاثیر غلظت‌های مختلف عصاره الکلی برگ به­لیمو بر مورفولوژی سلول‌های سرطان تخمدانA2780  بعد از 24 ساعت تیمار (بزرگنمایی: x200). پیکان­های زرد نشان­دهنده سلول­های مرده هستند. A: کنترل، B: تیمار با غلظت 50 میکروگرم بر میلی­لیتر C: تیمار با غلظت 100 میکروگرم بر میلی­لیتر و D: تیمار با غلظت 200 میکروگرم بر میلی­لیتر

 

آزمون اکریدین اورنج/ پروپیدیوم ایوداید

در این آزمون کیفی، سلول‏های زنده به رنگ سبز، سلول‏های آپوپتوزیسی به‏رنگ زرد و نارنجی و سلول‏های نکروزه به‏رنگ قرمز قابل شناسایی هستند. همان‏طور که در شکل 3 مشاهده می‏شود سلول‏های A2780 گروه کنترل غالبا به‏رنگ سبز مشاهده می­شوند (پیکان­های سفید) که نشان­دهنده زنده بودن سلول‏های سرطانی است. در گروه B , C سلول‏های تیمار شده با غلظت­های بازدارنده تکثیر عصاره الکلی برگ به­لیمو (غلظت 50 و 100 میکروگرم بر میلی‏لیتر) غالبا به‏رنگ سبز مایل به زرد و زرد مایل به نارنجی (پیکان­های زرد) مشاهده می‏شوند که نشان­دهنده اثر القاکننده آپوپتوزیس عصاره برگ به­لیمو در این غلظت­ها بر روی سلول‏های سرطان تخمدان است؛ درحالی­که همان­طورکه در شکل 3 بخش D نشان داده شده ­است عصاره الکلی برگ به­لیمو در غلظت 200 میکروگرم بر میلی‏لیتر، قادر به القای آپوپتوزیس در سلول‫های A2780 نیست و از طریق القای نکروزیس موجب از بین رفتن سلول‏های سرطان تخمدان می­شود.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل3: اثر پیش برنده آپوپتوزیس غلظت­های مختلف عصاره الکلی برگ به­لیمو توسط رنگ­آمیزی اکریدین اورنج/پروپیدیوم ایوداید (بزرگنمایی: x400). پیکان­های سفید نشان­دهنده سلول­های زنده، پیکان­های زرد نشان­دهنده سلول­های آپوپتوزی و پیکان­های قرمز نشان­دهنده سلول­های نکروزه هستند.  A: کنترل، B: تیمار با غلظت 50 میکروگرم بر میلی­لیتر C: تیمار با غلظت 100 میکروگرم بر میلی­لیتر و D: تیمار با غلظت 200 میکروگرم بر میلی‏لیتر

 

 

آزمون کاسپاز 3

 

نتایج به‏دست آمده نشان داد تیمار با غلظت میانه مهاری عصاره الکلی برگ به­لیمو (غلظت 100 میکروگرم بر میلی‏لیتر) موجب افزایش بیان کاسپاز 3 در سلول‫های سرطان تخمدان A2780 می‫شود که موید القای آپوپتوزیس وابسته به کاسپاز در سلول‫های سرطان تخمدان تحت تیمار با غلظت موثره عصاره الکلی برگ به

لیمو است (شکل 4).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 4: مقایسه فعالیت کاسپاز 3  گروه کنترل و گروه تحت تیمار با غلظت‫های بازدارنده تکثیر ( القاکننده آپوپتوزیس) عصاره الکلی برگ به­لیمو در سلول‫های سرطان تخمدان A2780. 0.001)>p ***Mean ± S.E)

 

 


آزمون مهاجرت

در این تست سلول‏های گروه کنترل (فاقد تیمار) توسط پر کردن ناحیه خراش مهاجرت و تهاجم سریع‫تری در مقایسه با سلول‏های سرطانی تحت تیمار با غلظت­های 50، 100، 200 میکروگرم بر میلی‏لیتر عصاره در مدت زمان 24 ساعت نشان دادند. سلول‏های سرطانی A2780 تحت تیمار با غلظت 10 میکروگرم بر میلی‏لیتر با پر کردن منطقه خراش در مدت 24 ساعت اثر کمی روی مهاجرت سلول‏های سرطانی نشان داد؛ درحالی­که تصاویر به‏دست آمده نشان داد غلظت­های 200، 100، 50 میکروگرم بر میلی‏لیتر عصاره الکلی برگ به­لیمو باعث کاهش تحرک سلول‏های سرطان تخمدان شد و با افزایش غلظت ماده تیماری میزان مهاجرت به‏طور چشم‫گیری کاهش یافت (شکل5).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل5: اثر غلظت­های مختلف عصاره الکلی برگ به­لیمو بر روی مهاجرت سلول­های سرطان تخمدان A2780 . (بزرگنمایی: x100). A: سلول­های A2780 در لحظه ایجاد خراش (ساعت صفر)، B: سلول­های گروه کنترل پس از 24 ساعت از ایجاد خراش بخش اعظم فضای خراش را پر کرده­اند (پیکان­ها سلولهای در حال مهاجرت را نشان می­دهند) C: پس از 24 ساعت، سلول­ها در گروه تیمار با غلظت 10 میکروگرم بر میلی‏لیتر عصاره الکلی برگ به­لیمو، در حال پرکردن فضای ایجاد­شده توسط خراش هستند. D, E, F : پس از 24 ساعت، تیمار با غلظت­های 200، 100، 50 میکروگرم بر میلی‏لیتر عصاره الکلی برگ به­لیمو به‏ترتیب موجب مهار مهاجرت سلول­های سرطان

تخمدان در ناحیه خراش شده­است.

 

ارزیابی بیان E-کادهرین

جهت بررسی اثر ضد تهاجمی غلظت­های بازدارنده عصاره برگ­های به­لیمو، سطح بیان E-کادهرین در سلول‏های A2780 فاقد تیمار (کنترل) و تیمارشده با غلظت­های بازدارنده تکثیر و القا کننده آپوپتوزیس توسط تکنیک RT-PCR مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که با افزایش غلظت تیماری عصاره الکلی برگ­های به­لیمو سطح بیان E-کادهرین در سلول‏های A2780 تحت تیمار افزایش یافت (شکل 6).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 6:  ارزیابی اثر غلظت میانه مهاری (غلظت 100 میکروگرم بر میلی­لیتر) و غلظت دارای اثر سمیت پایین (50 میکروگرم بر میلی­لیتر) عصاره الکلی برگ به­لیمو بر بیان E-کادهرین در سلول­های سرطان تخمدان A2780 توسط تکنیک RT-PCR . همان­طور که مشاهده می­کنید افزایش بیان E-کادهرین در سلول­های A2780 تحت تاثیر غلظت میانه مهاری نشان­دهنده پتانسیل ضدتهاجمی عصاره الکلی برگ به­لیمو در غلظت 100 میکروگرم بر میلی‏لیتر در سلول­های سرطان تخمدان است.

 

 

بحث

در دهه­های اخیر افزایش بروز سرطان­ها، مطالعات و تحقیقات بر روی سرطان و روش­های نوین درمانی را با دقت مورد ارزیابی قرار داده است (21، 20). با وجود پیشرفت‌های قابل‌توجه در طب مدرن، داروهای به‌دست‌آمده از گیاهان و منابع طبیعی به‏‏پیشگیری و درمان بسیاری از بیماری‌ها از جمله سرطان کمک شایانی کرده‌اند (22). حدود 75 درصد داروهای ضد سرطان مورد تائید در جهان از گیاهان، عصاره­های آن­ها و سایر منابع طبیعی مشتق شده­اند، این در حالی است که کمتر از 10 درصد گیاهان به‏منظور شناسایی ترکیبات ضد سرطان مورد بررسی قرار گرفته­اند (11). هدف از انجام این تحقیق آن بود که اثر سیتوتوکسیک و ضد تهاجمی عصاره الکلی برگ به­لیمو (Lippia citriodora) به‏عنوان یکی از گیاهان بومی ایران روی سلول‏های سرطان تخمدان مقاوم به داروی سیس پلاتین بررسی شود. جنس Lippia (شاه‏ پسندیان) شامل حدود 200 گونه از گیاهان، بوته­ها و درختان کوچک است. بیشتر آن­ها به‏طور سنتی در درمان­ بیماری­های تنفسی و دستگاه گوارش به‏کار گرفته شده­اند (23). مطالعات نشان داده­اند که بعضی از گونه­های Lippia دارای خصوصیات ضد مالاریا، ضد ویروسی و فعالیت­های سایتوتوکسیک هستند (24).

پژوهشگران با استفاده از روش GC-MS حضور 16 تا 20 ترکیب فعال زیستی را درعصاره گیاه به­لیمو نشان دادندکه بیشترین ترکیبات آن را  Geranial (8/36 درصد)، Neral (3/28 درصد) و Limonene (27/7 درصد) به‏خود اختصاص می­دهد (25). در سال 2012 نشان داده شد که عصاره Aloysia citriodora دارای خواص آنتی اکسیدانتی است که می­تواند نقش مهمی در تنظیم فعالیت GSH ردوکتاز در لنفوسیت­ها و گلبول‫های قرمز ایفا کند و از پلاسما در برابر آسیب­های اکسیداتیو محافظت نماید (26).

در این پژوهش نتایج حاصل از سنجش MTT نشان داد که عصاره الکلی برگ به­لیمو تکثیر سلولی را در یک الگوی وابسته به دوز در سلول‫هایA2780 مهارمی‌کند. نتایج حاصل از سنجش درصد بقای سلولی نشان داد که غلظت 100 میکروگرم بر میلی­لیتر عصاره الکلی برگ به‏لیمو پس از گذشت 24 ساعت از تیمار، موجب القای پنجاه ‌درصد مرگ سلولی در این سلول‏ها شد. تصاویر رنگ‫آمیزی اکریدین اورنج/ پروپیدیوم ایوداید ثابت کرد عصاره برگ به­لیمو در غلظت میانه مهاری القا کننده مرگ سلولی آپوپتوزیس در رده­ی سلولی A2780 سرطان تخمدان است. ارزیابی میزان فعالیت کاسپاز 3 در سلول‏های گروه کنترل و تیمار شده با غلظت میانه مهاری عصاره برگ گیاه به­لیمو نیز مبین این مطلب است که عصاره برگ به­لیمو از طریق مسیر وابسته به کاسپاز قادر به القای آپوپتوزیس در سلول‏های سرطانی A2780 است.

سلول‏های سرطانی با تنش­های محیطی، از جمله فقدان اکسیژن و یا مواد مغذی، pH پایین، گونه­های فعال اکسیژن (ROS) و واسطه­های پاسخ التهابی همراه است. چنین فشارهایی می­تواند سلول‫های توموری دارای قابلیت رشد بالا را انتخاب کند و سبب کسب یک فنوتیپ تهاجمی شود. به‏عنوان مثال، هیپوکسی، فاکتور قابل القای هیپوکسی (HIF) را تثبیت می­کند که منجر به تغییرات در متابولیسم بی هوازی، رگ زایی، تهاجم، و بقا می­شود (27) .E-کادهرین یک گلیکوپروتئین درگیر در چسبندگی سلول-سلول است. ازدست رفتن عملکرد  E-کادهرین برای تبدیل اپی­تلیال به مزانشیم ضروری است اماکافی نیست؛ دراین تبدیل، ازآن­جایی‏که سلول اپیتلیال قادربه تبدیل به سلول‏های اجدادی فنوتیپی مزانشیمی است تهاجم ومتاستاز تومور به‏خوبی رخ می‏دهد و در این راستا ماتریکس خارج سلولی به‏عنوان یک داربست عمل می­کند (9).

Melo Jo و همکارانش (28) اثرات سمیت سلولی عصاره‏ی گیاه Aloysia gracilis را برروی رده­های سلولی سرطان دهانه رحم HeLa، ملانوما B-16  و سرطان پستان  MCF-7با تست MTT مورد بررسی قرار دادند. درمطالعه آن‏ها مهم­ترین ترکیبات فیتوشیمیایی این گیاه تیمول (٤٠ درصد) شناخته شد و مشخص شد که این ترکیب اصلی­ترین عامل از بین برنده سلول‏های سرطانی است.

 Ferrazو همکارانش (29)،اثرات سمیت سلولی عصاره گیاه  Lippia gracilisرا بر روی رده سلولی کبدی Hep-G2 موردمطالعه قرار دادند. نتایج پژوهش آن‏ها نشان داد که عصاره­ی این گیاه دارای اثر توکسیک بر رده سرطانی  Hep-G2است. مطالعه آن‏ها نشان داد که این عصاره باعث تغییرشکل ظاهری درسلول‫های سرطانی می‏شود و آپوپتوزیس را از مسیرکاسپاز ٣ فعال می­کند  که هم راستا با نتایج به‏دست آمده در این پژوهش نشان‫دهنده اثر عصاره الکلی برگ به­لیمو بر القای آپوپتوزیس از طریق مسیر وابسته به کاسپاز بر سلول‫های سرطانی A2780 است.

در پژوهش دیگری توسط  Mesa-Arangoو همکارانش (30)، جهت بررسی اثرات سمیت سلولی عصاره گونه­ای دیگر از خانواده شاه‫پسند به‏نام  Lippia alba بر رده سلولی سرطانی دهانه رحم HeLa، نتایج نشان داد که عصاره این گیاه به­صورت وابسته به دوز توانایی القای سمیت بالایی بر روی سلول‏های سرطانی دهانه رحم دارد.

Mirzaei و همکارانش) 15) در تحقیقات خود بر روی سلول‏های کولون رده­ی HT-29 نشان دادند که عصاره­ی الکلی گیاه  Aloysia citrodoraبا افزایش بیان ژن پرواپوپتوتیک Bax و کاهش بیان ژن ضد آپوپتوزیسی Bcl-2 قادر به‏القای آپوپتوزیس بر سلول‏های سرطان کولون است که هم راستا با نتایج به‏دست آمده در این پژوهش مبین اثر پروآپوپتوزی و ضدسرطانی عصاره برگ به­لیمو گونه Lippia citriodora  بر سلول‏های سرطانی تخمدان A2780 است.

داده‏های حاصل از تست مهاجرت با استفاده از ژلاتین به‏عنوان ماتریکس و بستری برای مهاجرت سلول‏ها در این پژوهش نشان داد که عصاره الکلی برگ به­لیمو در غلظت­ میانه مهاری باعث مهار مهاجرت سلول‏های سرطانی A2780 روی ماتریکس شده و از این رو دارای اثر آنتی متاستاتیک است. یافته­های حاصل از ارزیابی بیان E-کادهرین نیز نشان داد که عصاره الکلی برگ به­لیمو Lippia citriodora با افزایش بیان E-کادهرین قادر به مهار عود سلول‏های سرطانی A2780 و مهار تهاجم این سلول‏ها است. در مورد نقش ضد تهاجمی E-کادهرین و نقش مواد فعال زیستی در این رابطه مطالعات نشان دادهاند که فروارده­های طبیعی مثل سیلیبینین به‏عنوان یک فلاونوئید از طریق افزایش بیان E-کادهرین در سلول‫های سرطانی پروستات PCA (Prostate Cancer Antigen 3) توانسته است پتانسیل تحرک و تهاجم سلول‏های سرطانی پروستات را مهار نماید (31). این پژوهش نیز در راستای پژوهش حاضر از نقش موثر فروارده­های طبیعی در پیشگیری از حالت متاستاتیک سرطان حمایت می­کند.

 

نتیجه گیری

در پایان می‌توان با توجه به نتایج حاصل از این پژوهش چنین نتیجه گرفت که عصاره الکلی برگ به­لیمو دارای خواص ضد سرطانی است و در غلظت‌های مناسب می‌تواند موجب کاهش تکثیر، القای آپوپتوزیس از طریق مسیر وابسته به کاسپاز و مهار متاستاز از طریق افزایش بیان E-کادهرین در سلول‏های سرطانی A2780 شود. با توجه به اثرات سیتوتوکسیک و ضدتهاجمی عصاره برگ به­لیمو پیشنهاد می­شود که اثر ضد سرطان مواد موثره موجود در این عصاره در مدل­های حیوانی نیز مورد ارزیابی قرار گیرد تا فواید بالقوه آن در حالت­های متاستاتیک در شرایط in vivo و بالینی نیز تائید شود.

 

تشکر و قدردانی

از همکاران گرامی در دانشکده علوم زیستی دانشگاه خوارزمی و پژوهشکده بیولوژی کاربردی که در اجرای پژوهش همکاری داشتند، سپاسگزاریم.

  1. Choi Y, Park J, Han JW, Kim E, et al. Differential cytotoxic potential of silver nanoparticles in human ovarian cancer cells and ovarian cancer stem cells. Int J Mol Sci. 2016; 17 (2077): 1-17.

2. Nakayama K, Nakayama N, Katagiri H, Miyazaki K. Mechanisms of ovarian cancer metastasis: biochemical pathways. Int J Mol Sci. 2012; 13(9): 11705-11717.

3. Chen WL, Ren Y, Ren J, Erxleben C, et al. Strebloside-Induced Cytotoxicity in Ovarian Cancer Cells Is Mediated through Cardiac Glycoside Signaling Networks. J Nat Prod. 2017; 80(3): 659-669.

4. Lengyel E. Ovarian cancer development and metastasis. Am J Pathol. 2010; 177(3): 1053-1064.

5. Fang D, Chen H, Zhu JY, Wang A, et al. Epithelial-mesenchymal transition of ovarian cancer cells is sustained by Rac1 through simultaneous activation of MEK1/2 and Src signaling pathways. Oncogene. 2017; 36(11): 1546-1558.

6. Deng J, Wang L, Chen H, Hao J, et al. Targeting epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cells for chemoresistant ovarian cancer. Oncotarget. 2016; 7(34): 55771-55788.

7. Telleria CM. Repopulation of ovarian cancer cells after chemotherapy. Cancer Growth Metastasis. 2013; 6(1): 15-21.

8. Bristow RG, Hill RP. Hypoxia and metabolism: hypoxia, DNA repair and genetic instability. Nat Rev Cancer. 2008; 8 (3): 180-192.

9. Gheldof A, Berx G. Cadherins and epithelial-to-mesenchymal transition. Prog Mol Biol Transl Sci. 2013; 116: 317-336.

10. Rajesh E, Sankari LS, Malathi L, Krupaa JR. Naturally occurring products in cancer therapy. J Pharm Bioallied Sci. 2015; 7(Suppl 1): 181-183.

11. Jamalzadeh L, Ghafoori H, Sariri R. Evaluation of anti-proliferative activity of a semi-synthetic derivative of artemisinin- artesunate in MCF-7 human breast cancer cell line. Journal of Cell & Tissue (JCT) 2016; 7(1): 45-57.

12. Lasagni Vitar RM, Reides CG, Ferreira SM, Llesuy SF. The protective effect of Aloysia triphylla aqueous extracts against brain lipid-peroxidation. Food Funct. 2014; 5(3): 557-563.

 

13. Shafiee F, Moghadamnia A, Shahandeh Z, Sadighian F, et al. Evaluation of the antibacterial effects of aqueous and ethanolic leaf extracts of Aloysia Citriodora (Lemon verbena) on Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus. Electron Physician. 2016; 8(12): 3363-3368.

14. Funes L, Carrera-Quintanar L, Cerdán-Calero M, Ferrer MD, et al. Effect of lemon verbena supplementation on muscular damage markers, proinflammatory cytokines release and neutrophils’ oxidative stress in chronic exercise. Eur J Appl Physiol. 2011; 111(4): 695-705.

15. Mirzaie A, Shandiz S, Ataollah S, Noorbazargan H, et al. Evaluation of chemical composition, antioxidant, antibacterial, cytotoxic and apoptotic effects of Aloysia citrodora extract on colon cancer cell line. Tehran University Medical Journal (TUMJ) 2016; 74)3): 168-176.

16. Amini E, Baharara J, Nikdel N, Salek Abdollahi F. cytotoxic and pro-apoptotic effects of honey bee venom and chrysin on human ovarian cancer cells. Asia Pacific Journal of Medical Toxicology (APJMT) 2015; 4(2): 68-73.

17. Sayyad Delshadpour F, Salehzadeh A, Sadat Shandiz SA. Cytotoxicity effect and changes in the expression of caspase-9 gene in breast cancer cell line (MCF-7) treated with the extract of Oscillatoria cyanobacteria. Qom Univ Med Sci J. 2018; 12(1): 26-34

18. Najmuddin S,  Romli M, Hamid M, Alitheen N,  et al. Anti-cancer effect of Annona muricata Linn leaves crude Extract (AMCE) on breast cancer cell line. BMC Complement Altern Med. 2016; 16(1): 311-317.

19. Lee KS, Shin JS, Nam KS. Cancer chemopreventive effects of starfish polysaccharide in human breast cancer cells. Biotech Bioprocess Eng. 2011; 16(5): 987-991.

20. Biemar F, Foti M. Global progress against cancer-challenges and opportunities. Cancer Biol Med. 2013; 10(4): 183-186.

21. Zugazagoitia J, Guedes C, Ponce S, Ferrer I, et al. Current challenges in cancer treatment. Clin Ther. 2016; 38(7): 1551-1566.

22. Shokri A, Baharara J, Amini E. Evaluation of the antioxidant effect of crocin on neonate Balb/C mouse spermatogonial stem cells. Journal of Cell & Tissue (JCT) 2017; 7(3): 219-229.

23. Portmann E, Nigro MM, Reides CG, Llesuy S, et al. Aqueous extracts of Lippia turbinata and Aloysia citriodora (Verbenaceae): assessment of antioxidant capacity and DNA damage. Int J Toxicol. 2012; 31(2): 192-202.

24. Santos N,  Pascon R, Vallim M,  Figueiredo C, et al. Cytotoxic and antimicrobial constituents from the essential oil of Lippia alba (Verbenaceae). Medicines 2016; 3(3): 22; 1-9.

25. Shahhoseini H, Ghorbani H, Saleh R. Omidbaigi R, Identification of essential oil content and composition of Lippia citriodora seed. J Plant Prod. 2012; 18(4): 91-96.

26. Carrera‐Quintanar L, Funes L, Viudes E, Tur J, et al. Antioxidant effect of lemon verbena extracts in lymphocytes of university students performing aerobic training program. Scand J Med Sci Sports. 2012; 22(4): 454-461.

27.  Sullivan LB,  Chandel NS. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer Metab. 2014; 2(17): 1-12.

28. Melo JO, Fachin AL, Rizo WF, Jesus HC, et al. Cytotoxic effects of essential oils from three Lippia gracilis Schauer genotypes on HeLa, B16, and MCF-7 cells and normal human fibroblasts. Genet Mol Res 2014; 13(2): 2691-2697.

29. Ferraz RP, Bomfim DS, Carvalho NC, Soares MB, et al. Cytotoxic effect of leaf essential oil of Lippia gracilis Schauer (Verbenaceae). Phytomedicine. 2013; 20(7): 615-621.

30. Mesa-Arango AC, Montiel-Ramos J, Zapata B, Durán C, et al. Citral and carvone chemotypes from the essential oils of Colombian Lippia alba (Mill.) NE Brown: composition, cytotoxicity and antifungal activity. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2009; 104(6): 878-884.

31. Deep G, Gangar S, Agarwal C, Agarwal R. Role of E-cadherin in Anti migratory and anti invasive efficacy of silibinin in prostate cancer cells. Cancer Prev Res. 2011; 4(8): 1222-1233.