مطالعه اثر دو نوع سرم هترولوگوس بر قابلیت بلوغ و لقاح برون‏تنی اووسیت های گوسفند

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

چکیده

هدف: در این مطالعه اثر سرم مادیان و سرم جنین گاوی بر بلوغ و لقاح برون‏تنی اووسیت گوسفند مورد مقایسه قرار گرفت.
مواد و روشها: در این مطالعه تجربی مجموعه اووسیت – کومولوس های پس از استحصال از تخمدان‏های جمع آوری شده از کشتارگاه بر اساس مورفولوژی انتخاب و در محیط کشت فاقد سرم شستشو شدند. اووسیت‏ها به طور تصادفی به 3 گروه تقسیم شدند، گروه اول اووسیت ها (170عدد) در محیط  TCM199بدون سرم کشت شدند. اووسیت‏های گروه دوم (169 عدد) و سوم (167 عدد) به‏ترتیب در محیط‏های حاوی 10 درصد سرم مادیان و 10 درصد سرم جنین گاوی کشت شدند. بخشی از اووسیت‏ها پس از بلوغ جهت ارزیابی قابلیت بلوغ رنگ آمیزی شدند و بخشی دیگر جهت بررسی قابیلت لقاح بارور شدند
نتایج: میزان بلوغ اووسیت‏ها در محیط بدون سرم، سرم مادیان و سرم جنین گاوی به‏ترتیب 82/59، 55/77 و 27/89 درصد بود (01/0>P). میزان باروری در این محیط‏ها به ترتیب 91/19، 64/39 و 50 درصد بود که در بین شاهد و سرم مادیان و سرم جنین گاوی تفاوت معنی داری وجود داشت (05/0>P).
نتیجه‏گیری: نتایج این مطالعه نشان می‏دهد که محیط کشت حاوی ده درصد سرم جنین گاوی دارای نرخ بلوغ و باروری بالاتری برای تخمک گوسفند نسبت به محیط کشت حاوی سرم مادیان است.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

آگاهی از شرایط مطلوب برای بلوغ برون‏تنی اووسیت سبب تولید اووسیت‏های مناسب برای استفاده در برنامه‏های لقاح برون‏تنی InVitro Fertilization) IVF)، همانند‏سازی و تولید حیوانات تراریخت را فراهم می‏آورد. بنابراین یکی از مهم‏ترین گامه‏ها در تولید جنین آزمایشگاهی، بلوغ اووسیت‏های نابالغ می‏باشد که در مرحله پروفاز میوز یک متوقف شده‏اند (1). توسعه هم‏زمان هسته و سیتوپلاسم اووسیت به‏عنوان ملاک بلوغ مطرح است (2). همچنین  بلوغ آزمایشگاهی اووسیت منجر به تولید جنین ارزان و فراوان می‏شود (3).

لزوم بالغ سازی تخمک‏ها در محیط آزمایشگاهی به منظور کاهش مشکلات ناشی از فزون تحریکی تخمدان در سال‏های اخیر مورد توجه متخصصین لقاح برون‏تنی قرار گرفته است (4) و بهبود و افزایش کارایی بلوغ تخمک در آزمایشگاه به طور گسترده‏ای موجب پیشرفت در تکنیک‏های جدید تولید مثل شده است. همچنین  بلوغ و لقاح برون‏تنی تخمک‏ها، در دام‏ها به‏منظور افزایش تولید و پیشرفت در تحقیقات علمی پایه، انتقال هسته، حذف ژن‏های معیوب و جایگزینی ژن‏های مطلوب، اضافه کردن ژن‏های مقاوم در برابر بیماری‏های خاص، ایجاد حیوانات تراریخت و ایجاد کلون به کمک مهندسی ژنتیک  صورت می‏گیرد (5).

اولین گوسفند حاصل از بلوغ و باروری برون‏تنی در ایران به‏نام رویانا در سال 1385 متولد شد. تخمدان‏های کشتارگاهی یکی از معمول ترین منبع استحصال تخمک‏های مورد نیاز برای بلوغ و باروری برون تنی در شرایط آزمایشگاه می‏باشند و دارای دو مزیت ارزانی و فراوانی هستند (5).

محیط‏های کشت حاوی مواد شیمیایی، اسید آمینه‏های مختلف، آنتی بیوتیک‏ها ، مواد بیولوژیکی و پروتئینی می‏باشند  و استفاده از محیط کشت‏های مختلف موجب نتایج متفاوتی در نتیجه کشت می‏شود .انواع مختلفی از سرم‏های خون به‏عنوان ماده مکمل به محیط کشت افزوده می‏شوند و نقش مهمی را در محیط کشت بازی می‏کنند، اما تا کنون نقش دقیق سرم در بهبود بلوغ و باروری اووسیت و مراحل تکاملی رویان به درستی شناخته نشده است. سرم حاوی پروتئین‏ها، پلی‏پپتیدها، هورمون‏ها، مواد غذایی و معدنی می‏باشد (6). مشخص شده است که مولکول‏های درشت از جمله پروتئین‏ها و عوامل رشد موجود در سرم برای کشت تخمک ضروری می‏باشند و به‏همین دلیل سرم‏های مختلفی برای کشت تخمک مورد استفاده قرار گرفته‏اند ( 7 و 8). گزارش‏های متفاوت و متناقضی از اثر انواع سرم‏های مورد استفاده در محیط کشت تخمک بیان شده است ( 9 و 10). حضور یک تا پنج درصد سرم در محیط کشت جهت ممانعت از سخت شدن زونا پلوسیدا و در نتیجه عدم نفوذ اسپرم به‏داخل اووسیت ضروری به نظر می‏رسد (11). میزان سخت شدن زونا پلوسیدا قبل از لقاح در اووسیت‏ها همبستگی مثبت با عدم لقاح دارد، اما سخت شدن آن پس از لقاح سبب ممانعت از پلی‏اسپرمی می‏شود. سرم ها به دو شکل همولوگوس و هترولوگوس در محیط کشت افزوده می‏شوند، سرم همولوگ، تخمک و سرم از یک دام است اما سرم هترولوگ از دو دام مختلف است. سرم جنین گاوی مهم‏ترین سرم هترولوگوس در همه گونه ها غیر از گاو می‏باشد. وجود سرم در محیط کشت سبب تسهیل مصرف فاکتورهای رشد می‏شود (12). مقایسه بین سرم فحلی حرارت دیده و حرارت ندیده در سطح 20 درصد نشان داده است که استفاده از سرم دست نخورده باعث بهبود نرخ بلوغ اووسیت می‏شود، شاید کاهش میزان هورمون‏های LH و FSH در سرم حرارت داده شده یکی از علت‏های پایین بودن درصد بلوغ اووسیت باشد (5)  از سال 1960 محیط کشت تجاریTCM199  به‏عنوان مهم‏ترین و معمول‏ترین محیط کشت جنین پستانداران بود که اگرچه در حال حاضر هم بعضی از آزمایشگاه‏ها‏ی تحقیقاتی تمایل به استفاده از این محیط کشت با افزودن سرم و سایر فاکتورهای رشد دارند ولی میزان تکوین بلاستوسیست‏های پستانداران در این محیط به‏ندرت بیش از 30 تا 40 درصد خواهد بود (13). یکی از معمول‏ترین افزودنی‏ها، سرم جنین گاو است که مقالات متعددی در زمینه اثرات آن وجود دارد .سرم‏های طبیعی اثرشان بسیار بیشتر از پلاسما در تحریک رشد سلول می‏باشند که شاید ناشی از فعال شدن و رها شدن پلی‏پپتیدهای معینی در طول فرایند لخته شدن باشد (14). از مزایای سرم جنین گوساله (FBS) این است که بسیاری از مواد لازم برای رشد و تکثیر سلول را دارا می‏باشد و مکمل رشد در بسیاری از گونه‏های حیوانی و انسان است. و هم‏چنین استفاده از این سرم سبب کاهش صرف زمان و تلاش برای فرموله کردن محیط کشت برای انواع سلول‏ها می شود.

با توجه به این که تاکنون هیچ پژوهشی در خصوص اثر سرم مادیان بر بلوغ و باروری آزمایشگاهی اووسیت گوسفند انجام نشده است لذا این پژوهش با هدف قیاس سرم مادیان با سرم جنین گاوی که به‏عنوان سرم هترولوگوس رایج در محیط کشت استفاده می‏شود بر روی بلوغ و لقاح برون‏تنی اووسیت گوسفند انجام شد.

 

مواد و روشها

این مطالعه از نوع تجربی است که برروی تخمک‏های تخمدان گوسفندان ذبح شده در کشتارگاه کرج راک و طی یک سال انجام گرفته. تخمک‏ها پس از مراحل شستشو در محیط کشت داده شدند. محیط کشت پایه برای بلوغ تخمک‏های جمع آوری شده  TCM- 199 (شرکت گیبکو) بوده که به صورت تجاری در دسترس می‏باشد و متداول‏ترین محیط کشت مورد استفاده در بلوغ تخمک پستانداران است. این محیط حاوی املاح مختلف، قندها، اسیدهای امینه، ویتامین ها و اسیدهای نوکلئیک باشد.

تهیه سرم مادیان: خون مادیان از سیاهرگ وداج 2 راس اسب سالم در فصل جفت‏گیری پس از انجام توشه رکتال و سونوگرافی و اطمینان از فعال بودن تخمدان‏ها در مرحله دی‏استروس جمع آوری شد. سرم طبق دستورالعمل تفکیک شد (15 و 16).

جمع آوری و کشت تخمک‏‏ها :تعداد 200  تخمدان گوسفند بلافاصله پس از کشتار دام در کشتارگاه کرج راک جمع آوری شده و حداکثر در مدت 2 ساعت بعد از کشتار، در فلاسک حاوی سرم فیزیولوژی و آنتی بیوتیک در دمای سرم  37 درجه سانتی‏گراد به آزمایشگاه منتقل گردید.

تخمدان‏ها چند بار با سرم فیزیولوژی استریل شستشو و تخمک‏ها به روش برشی با اسکالپل از فولیکول‏های سطح تخمدان تخلیه شده و پس از انتقال به پتری دیش، توسط میکروسکوپ استریو جهت جمع آوری اووسیت‏ها مورد بررسی قرار گرفت.

تخمک‏های جمع‏آوری شده براساس تعداد لایه سلول‏های کومولوس اطرافشان دسته بندی شدند؛ دسته اول تخمک‏هایی که در اطرافشان چند لایه سلولی متراکم از سلول‏های کومولوس داشتند. دسته دوم، تخمک‏هایی که دو یا سه لایه از سلول‏های کومولوس را در اطراف خود داشتند و دسته سوم، تخمک‏های فاقد سلول‏های کومولوس بودند که به اصطلاح تخمک های لخت اطلاق می‏گردند. در این مطالعه از میان 1152 تخمک جمع آوری شده، 506 تخمک با کیفیت خوب ( و از دسته اول که حاوی بیش از سه لایه کومولوس متراکم به همراه سیتوپلاسم گرانوله یکنواخت بودند) برای بلوغ آزمایشگاهی انتخاب شدند.

محیط کشت پایه شستشو شامل مواد TCM199 (Gibco cat. No. 31100-027) و 25 میلی‏مول NaHCO350 میکروگرم پنی سیلین- استروپتومایسین (Gibco cat. No.15140-148)  5 میلی‏مول سدیم پیرووات (Sigma cat. No 4625) بود. محیط کشت شامل TCM199 به همراه آنتی بیوتیک و سدیم پیروواتLH  و FSH که در گروه شاهد و دو تیمار دارای سطوح 10 درصد سرم حرارت دیده مادیان و 10 درصد سرم جنین گاوی بود. تخمک‏ها درون قطره‏های 50 میکرولیتری محیط کشت درون انکوباتور حاوی پنج درصدCO2  رطوبت 95 درصد قرار گرفتند. پس از گذشت 24 ساعت سلول‏های اووسیت‏های کشت شده از انکوباتور خارج شده و بر اساس میزان پراکنده شدن سلول‏های کومولوس در سه گروه مختلف طبقه بندی شدند: گروه اول سلول‏های کومولوس به طور کامل پراکنده شدند. گروه دوم سلول‏های کومولوس نسبتا پراکنده شدند و گروه سوم سلول‏های کومولوس پراکنده نشدند.

از هر دسته از اووسیت‏ها پس از کشت به صورت تصادفی کومولوس اطراف آن‏ها با TCM199 حاوی یک درصد هیالورونیداز زدوده شد و در زیر میکروسکوپ جهت تعیین مراحل رشد و بلوغ مورد ارزیابی قرار گرفتند. در گروه اول بیش از 95 درصد از اووسیت‏های رنگ شده مراحل بلوغ را به طور کامل طی کرده و در مرحله متافاز میوز دو بودند، در حالی‏که در گروه دوم و سوم این عدد بسیار پایین بود. بنابراین حدود 95 درصد از اووسیت‏های گروه اول به عنوان اووسیت‏های بالغ در نظر گرفته شدند و در مراحل بعدی ملاک بلوغ پراکنده شدن کامل سلول های کومولوس در نظر گرفته شد و پس از 24 ساعت کشت، اووسیت‏ها (در محیط کشت بلوغ) شستشو شده و به درون قطرات محیط باروری شامل: تی. ال. بیس 10 میلی‏لیتر، هپارین 100میلی‏لیتر، سدیم پیرووات 12/1 میلی‏گرم، بی‏کربنات سدیم 20 میلی‏گرم و آلبومین سرم گاوی 60 میلی‏گرم منتقل شدند. در این مرحله اسپرم‏های ظرفیت‏دار شده (در محیط.(TL. Sperm قطرات افزوده شدند و پس از 24 ساعت کشت، اووسیت مابین لام و لامل فیکس شده و مورد بررسی قرار گرفت. حضور دو پرونوکلئوس در درون اووسیت نشان از بارور شدنشان بود و مورد شمارش قرار گرفتند.

آنالیز آماری: داده‏ها به وسیله نرم افزاز SAS با رویه  GLM آنالیز شدند و مقایسه میانگین‏ها توسط آزمون توکی انجام شد.

 

نتایج

در مطالعه حاضر از 200 تخمدان جمع‏آوری شده در مجموع 1152 تخمک حاصل و تعداد 506 تخمک با کیفیت خوب (دارای بیش از سه لایه سلول کومولوس) انتخاب و در سه محیط مختلف، کشت داده شد. میزان بلوغ تخمک‏ها با استفاده از میزان پراکندگی سلول‏های کومولوس و مشاهده جسم قطبی مورد بررسی و مطالعه قرار گرفت. محیط‏های کشت حاوی تخمک 24 ساعت در انکوباتور در شرایطی که توضیح داده شد قرار گرفته و پس از آن با استفاده از میکروسکوپ نوری تخمک‏ها از نظر پراکندگی سلول‏های کومولوس (شکل 1) مورد ارزیابی قرار گرفتند .همان‏طور که در جدول 1 آمده است میزان بلوغ اووسیت‏ها در محیط عاری از سرم، سرم مادیان و سرم جنین گاوی به ترتیب 82/59، 55/77 و 27/89 درصد بود که دارای تفاوت معنی داری بودند (01/0>P).

میزان باروری در این محیط‏ها (جدول و شکل 2) به ترتیب 91/19، 64/39 و 50 درصد بود که در بین شاهد و سرم مادیان و سرم جنین گاوی تفاوت معنی داری داشت (05/0>P).

 

 

A

B

C

شکل 1: پراکنده شدن سلول‏های کومولوس از اطراف اووسیت: بدون پراکندگی (A) پراکندگی متوسط (B) و پراکندگی کامل (C).

 

جدول1: مقایسه اثر سرم مادیان و سرم جنین گاوی بر بلوغ اووسیت های گوسفند در محیط  TCM-199

نوع سرم

تعداد کل اووسیت

بالغ شده

سطح احتمال

بدون سرم

170

12/2±82/59

01/0

سرم مادیان

169

12/2±55/77

01/0

سرم جنین گاوی

167

12/2±27/89

01/0

 

 

شکل 2: اووسیت بارور شده که پرونوکلئوس‏های آن به وضوح قابل مشاهده هستند.

جدول2: مقایسه اثر سرم مادیان و سرم جنین گاوی بر باروری اووسیت های گوسفند در محیط  TCM-199

نوع سرم

تعداد کل اووسیت

بارور شده

سطح احتمال

بدون سرم

102

68/2±91/19

05/0

سرم مادیان

131

68/2±64/39

05/0

سرم جنین گاوی

149

68/2±51

05/0

 


بحث

در این تحقیق پراکندگی سلول‏های کومولوس به‏عنوان فاکتوری برای تعیین بلوغ تخمک‏ها در نظر گرفته شد. سلول‏های کومولوس در اثر افزایش ترشح گنادوتروبین قبل از تخمک‏گذاری پراکندگی پیدا می‏کنند و شکاف‏های اتصالی بین سلول‏های کومولوس مجاور و بین سلول‏های کومولوس و تخمک شکسته می‏شود. نتایج این مطالعه نشان داد که افزودن سرم مادیان همانند سرم جنینی گاو بر بلوغ تخمک‏های گوسفند موثر بود و افزودن هر دو سرم هترولوگوس به‏صورت دو تیمار جداگانه اثراتی بهتر از گروه کنترل ایجاد نمود.

بسیاری از محققین افزودن سرم را به‏عنوان یک ماده مکمل به محیط کشت تخمک، سبب بهبودکیفیت این محیط‏ها می‏دانند. مشخص شده است که مولکول‏های درشت موجود در سرم برای کشت تخمک ضروری می‏باشند و به همین دلیل سرم‏هایی مختلفی از جمله سرم گوسفند، سرم گوساله جنینی، سرم گاومیش فحل و سرم بز فحل در محیط کشت تخمک مورد استفاده قرار گرفته‏اند (3 و 17). سرم حاوی انواع مختلفی از مواد از جمله هورمون‏ها، عوامل رشد، ویتامین ها، مواد شلاته کننده، یون‏های فلز سنگین، پپتیدها، پروتئین‏ها و یک سری از مولکول‏های مشخص و نامشخص است (17 و 18). با این وجود مواد موثر این سرم‏‏ها هنوز ناشناخته مانده‏اند و نقش دقیق سرم در حمایت از بلوغ و باروری تخمک به درستی شناخته نشده است، هر چند که محققین بر این باورند که پروتئین‏ها و عوامل رشد موجود در سرم در موفقیت کشت آزمایشگاهی سهیم هستند. گزارش‏های مختلف بیانگر نتایج متفاوت و بعضا متناقض از اثر انواع سرم‏های مورد استفاده در محیط کشت تخمک می‏باشد. گزارش تاجیک و اسفندآبادی (10) تاثیر محیط های کشت مختلف بر بالغ سازی تخمک‏های بز نشان داد که بلوغ تخمک‏ها در محیط‏های حاوی سرم میش فحل(FBS)  و سرم جنین گاو اختلاف معنی‏داری نداشت اما در سرم بز فحل (ESS)            در مقایسه با محیط بدون سرم میزان بلوغ به طور معنی‏داری افزایش یافت. نتایج حاصل از این تحقیق نیز نشان داد که میزان بلوغ تخمک در گروه کنترل (بدون سرم) در مقایسه با گروه‏های حاوی سرم از نظر آماری به طور معنی‏داری کمتر بوده است.

در این تحقیق سرم مادیان مورد استفاده قرار گرفت و در مقایسه با گروه کنترل اثرات مثبتی بر بلوغ تخمک‏ها ایجاد نمود. ترکیبات موجود در سرم در مراحل مختلف سیکل استروس، دایم در حال تغییر هستند و حتی مشخص شده است که در زمان‏های مختلف مرحله فحلی هم اجزای مولکولی سرم همگام با تغییرات اندوکرینی متغیر هستند. امکان دارد که دریافت و مورد استفاده قرار دادن انواع خاصی از مواد موجود در سرم توسط تخمک در زمان خاصی که با روند طبیعی بلوغ و باروری آنها هم‏خوانی دارد از ضروریات بسیار مهم بلوغ تخمک باشد. شاید به همین دلیل است که گزارش‏های مختلف، نتایج متفاوت و بعضا متناقض از انواع سرم‏های مورد استفاده درمحیط کشت تخمک به چشم میخورد. برخی از پژوهشگران استفاده از سرم گوساله جنینی ((FCS را بر سایر انواع سرم‏ها ترجیح می‏دهند. اغلب این محققین اعتقاد دارند برخی مواد محرک رشد ناشناخته است که در سرم حیوانات بالغ وجود ندارد یا این سرم فاقد اجزایی همچون هورمون‏ها و ایمونوگلوبین‏هایی است که وجود آن‏ها درسرم حیوانات بالغ موجب تاخیر در تکامل سلول‏ها در آزم ایشگاه می‏شوند. برخی دیگر استفاده از سرم حیوانات فحل را به‏دلیل از سرگیری میوز و بلوغ تخمک در زمان فحلی در محیط کشت تخمک توصیه می‏کنند (19).

روا و همکاران (1) با افزودن ده درصد سرم میش فحل و مایع فولیکولی به محیط کشت، نرخ بلوغ 86 و 76 درصد را گزارش کردند که در مقایسه با سرم مادیان درصد بلوغ بالاتر است. تاجیک و شمس اسفندآبادی (10) با افزودن سه سطح 10، 15 و 20 درصد سرم فحلی میش به محیط کشت در بلوغ اووسیت بز تفاوت معنی‏داری در نرخ بلوغ اووسیت مشاهده نکردند. نتایج آزمایش خارچی و همکاران (17) با نتایج آزمایش حاضر تفاوت داشت. در مطالعه آنها با افزایش سطوح سرم بز فحل به محیط کشت اووسیت بز افزایش معنی‏داری در بلوغ اووسیت مشاهده شد. افزودن سرم انسانی به محیط کشت اووسیت گوسفند در مقایسه با سرم گوسفندی نتایج بهتری بر بلوغ داشت. سرم روز 16 چرخه فحلی گوسفند نسبت به سرم سایر روزهای چرخه فحلی (روزهای غیرفحلی) و آبستنی تاثیر زیادی بر بلوغ اووسیت‏های گوسفند داشته است (1).

سرم جنین گاوی نسبت به سرم حرارت دیده مادیان دارای عمل‏کرد بهتری بر بلوغ اووسیت داشت، شاید به دلیل ساختار خاص میکروسکوپی جفت در گاو (اپیتلیوکوریال) که از عوامل مهم در اثرات مثبت سرم جنین گاوی در محیط‏های کشت سلولی می‏باشد زیرا با توجه به فاصله شش لایه مابین مادر و جنین سبب ممانعت از عبور ایمونوگلوبولین ها از خون مادر به جنین می‏شود و ایمونوگلوبولین‏های مورد نیاز جنین در ساعات اولیه پس از تولد از طریق مصرف آغوز جذب سیستم گوارش گوساله می‏گردد. در سرم جنین گاو فاکتورهای فعال کننده آبشار کمپلمان (ایمونوگلوبولین‏ها) حضور ندارند، لذا سرم جنین گاوی به‏عنوان سرم هترولوگوس عمومی در کشت اووسیت همه گونه‏ها با موفقیت به کار گرفته شده است. از طرف دیگر ایزوله بودن فضای زندگی جنین نسبت به دام‏های بزرگسال دارای سرم عاری از هر نوع آنتی بادی و عوامل مضر می باشد. همچنین به‏دلیل این‏که جنین در مراحل رشد واقع شده است سرم آن حاوی فاکتورهای متعدد رشد می باشد که می تواند رشد و بلوغ اووسیت را تسریع نماید (20).

میزان باروری در محیط کشت حاوی سرم جنین گاوی بالاتر از محیط کشت حاوی سرم مادیان می‏باشد. یکی دیگر از دلایل احتمالی در این تفاوت را می‏توان به میزان زیاد پروتئین فیتوئین در سرم جنین گاوی نسبت داد. در حیوانات بزرگسال میزان فیتوئین کمتر از حیوانات نابالغ و به‏خصوص جنین می‏باشد. هنگام بلوغ اووسیت گرانول‏های غشایی، پروتئازهایی آزاد می‏نماید که این پروتئاز‏ها با تاثیر بر اجزای مولکول‌های گلیکوپروتئینی غشا زونا پلوسیدا سبب فسفریلاسیون ZP2 بهZP2f می‏شود که پس از این فسفریلاسیون زونا پلوسیدا سخت می‏شود. فیتوئین گلیکوپروتئین اصلی سرم بوده که 45 درصد بخش پروتئینی سرم را به خود اختصاص داده است که با فعالیت آنتی پروتئازیش سبب ممانعت از فسفریلاسیون ZP2 می‏شود(21) همان‏طور که قبلا عنوان شد فیتوئین سرم جنین گاوی بیش از فیتوئین دام‏های بزرگسال بوده و لذا سخت شدن زونا پلوسیدا در محیط حاوی سرم جنین گاوی نسبت به سرم مادیان حرارت دیده کمتر اتفاق می‏افتد بنابراین میزان باروری بالاتری مشاهده می‏شود. در محیط بدون سرم میزان باروری بسیار پایین بود که احتمالا عدم حضور سرم در این محیط سبب سخت شدن زوناپلوسیدا شده و از نفوذ اسپرم به داخل اووسیت ممانعت شده و میزان باروری کاهش یافته است (20).

 

نتیجه گیری

نتایج این تحقیق نشان داد که وجود سرم در محیط کشت بلوغ و باروری تخمک ضروری است و استفاده از سرم مادیان در محیط کشت باروری و بلوغ تخمک، نمی‏تواند جایگزین مناسبی برای سرم جنین گاوی باشد

  1. Roa BS, Naidu KS, Amarnath D, Vagdevi R, et al. In vitro maturation of sheep oocytes in different media during breeding and non-breeding seasons. Smal. Rumin. Research. 2002; 43: 31-36.
  2. Sun Q, Nagai T. Molecular mechanisms underlying pig oocyte maturation and fertilization. J. of Reprod and Develop. 2003; 49: 347-359.
  3. Nadi S, Ravindranatha BM, Gupta PSP, Sarma PV. Timing of sequential changes in cumulus cells and first polar body extrusion during in vitro maturation of buffalo oocytes." Theriogenology 2002; 57: 1151 – 1159.
  4. Hreinsson JR, Friden B, Levkov L. Recombinant LH is equally effective as recombinant hCG in promoting oocyte maturation in clinical invitro maturation programme: a randomized study. Hum. Repro, 2003; 18: 2131-2136.
  5. Gordon I. Reproductive technology in farm animals, CABI publication. 2005.
  6. Saeki K, Hoshi M, Leibfried L, First NL. In vitro fertilization and development of bovine oocytes matured in seum-free medium. Biol Reprod 1991;44: 256-260.
  7. Sanbuissho A, Threlfall WR. The effect of estrouse cow serum on the in vitro maturation and fertilization of the bovine follicular oocyte. Theriogenology, 1989; 31: 693-699.
  8. Takagi Y. Development of bovine oocytes matured, fertilized and cultured in a serum-free, chemically defined medium. Theriogenology, 1991; 35: 1197- 1205.
  9. Fukui Y, Ono H. Effects of sera, hormones and granulosa cells added to culture medium for in-vitro maturation, fertilization, cleavage and development of bovine oocytes. Reprod. Fertil.1989; 86: 501-506.
 

10. Tajik P, Shams Esfandabadi E. In vitro maturation of caprine oocytes in different culture media. Smal. Rumin. Research. 2003; 47: 155-158.

11. Wani NA. In vitro maturation and in vitro fertilization of sheep oocytes." Small Ruminant Research. 2002; 44: 90 – 95.

12. Palasz AT, Thundathil J, Verralland RE, Mapletoft RJ. The effect of macromolecular supplementation on the surface tension of TCM-199 and the utilization of growth factors by bovine oocytes and embryos in culture. Anim Reprod Sci. 2000; 58: 229 – 240.

13. Moulavi FHS, Ashtiani SK, Shahverdi A, et al. Can Vero cell co-culture improve in-vitro maturation of bovine oocytes?" Reprod Biomed. 2006; 13(3): 404-411.

14. Gospodarowicz, D, Ill CR. Do plasma and serum  have different abilities to promote cell growth? Proc. Natl. Acad. Sci. 1980;. 77(5): 2726-2730.

15. Balk SD, Levine SP, Young LL, LaFleur MM, et al. Mitogenic factors present in serum but not in plasma. Proc Natl Acad Sci. 1981; 78(9): 5656-5660.

16. Willis P, Caudal AB, Fayrer-Hosken RA. Equine oocyte in vitro maturation : influences of sera, time, and hormones. Molecular Reproduction and Development 1991; 30: 360 – 368.

17. Kharche SD, Sharma GT, Majumdar AC, In vitro maturation and fertilization of goat oocytes vitrified at germinal vesicle stage. Small Ruminant. Smal. Rumin. Research. 2005; 57: 81–84.

18. Gordon I. controlled reproduction in sheep and goats., CAB International publishing, Wallingford. 1997.

19. Isachenko VV, Ostashko FI, Isachenko EF, Soler C, et al. Effect of heat-inactived and non-inactivated estrous cow sera on maturation of bovine oocyte " J.of Endocrin 1994; (supplement) 140: 212.

20. Allen CS, Richard MS, Gregory SK, Frederick RT, et al. Fetuin Inhibits Zona Pellucida Hardening and Conversion of ZP2 to ZPZ during Spontaneous Mouse Oocyte Maturation In Vitro in the Absence of Serum. Biol Reprod. 1990; 43: 891-897.

21. Vanderhyden BC, Armstrong DT. Role of cumulus cells and serum on the in vitro maturation, fertilization, and subsequent development of rat oocytes. Biol Reprod. 1989; 40: 720-728.