بررسی اثرحفاظتی نانواکسید روی بر پارامترهای هیستولوژیک بیضه در رت های تیمار شده با داکسوروبیسین

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

-

چکیده

هدف: داروی ضد سرطان داکسوروبیسین علی‏‏‏رغم کاربرد گسترده، دارای اثرات سمی بر قسمت‏های مختلف بدن از جمله اندام‏های جنسی دارد. هدف از این مطالعه بررسی اثر حفاظتی نانواکسید روی برسمیت تولیدمثلی القا شده توسط داکسوروبیسین بود. 
مواد و روشها: در این مطالعه تجربی رت‏های نر بالغ ویستار به طور تصادفی به چهار گروه شامل یک گروه کنترل و سه گروه تجربی تقسیم شدند. گروه کنترل سالین دریافت کرد، در حالی‏که گروه‏های تجربی به ترتیب داکسوروبیسین) 6 میلی‏گرم بر کیلوگرم)، نانواکسید روی (5 میلی‏گرم بر کیلوگرم)، و داکسوروبیسین همراه با نانواکسید روی دریافت نمودند. رت‏ها به مدت 3 روز تحت تیمار قرار گرفتند. 28 روز پس از پایان تیمار تغییرات بافتی سیستم تناسلی مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج: داکسوروبیسین در گروه تجربی1 سبب درهم ریختگی اپی‏تلیوم ژرمینال، دفرمه شدن سلول‏ها و افزایش فضای بینابینی شد. همچنین تعداد اسپرماتوسیت های اولیه، اسپرماتیدها و سلول‏های لایدیگ در این گروه نسبت به گروه کنترل کاهش معنی‏دار نشان داد. شاخص تمایز توبولی (TDI) و  شاخص اسپرمیوژنز  (SPI)نیز نسبت به گروه کنترل کاهش معنی دار پیدا کرد، درحالی‏که درصد توبول‏های تخریب شده افزایش نشان داد. استفاده مشترک نانواکسید و داکسوروبیسین توانست اختلالات فوق را بطور معنی‏داری بهبود بخشد.
نتیجه گیری: یافته‏های این مطالعه نقش نانواکسید روی را در ممانعت از سمیت القا شده توسط داکسوروبیسین در سیستم تولیدمثل نر نشان می‏دهد.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

اغلب داروهای ضد سرطان علاوه بر سلول­های سرطانی بر سایر سلول­های دارای سرعت تقسیم بالا مانند سلول‏های جنسی نیز اثر می­کنند. برآورد می‏شود بیش از90 درصد بیمارانی که دوزهای بالای عوامل شیمی درمانی از جمله داکسوروبیسین (Doxorubicin-Dox) دریافت می‏کنند دچار آزواسپرمی طولانی مدت خواهند شد. بنابراین ناباروری می‏تواند یک عارضه طولانی مدت مهم به‏دنبال شیمی درمانی باشد (1، 2 و3). DOX یکی از رایج‏ترین داروهایی است که بطور گسترده برای درمان انوع مختلف سرطان از جمله سرطان های خونی(هماتوپویتیک)، سرطان بیضه و سایر تومورهای جامد به کار می رود (4، 5 و 6).Manabe   و همکاران (2) نشان دادند که تزریق درون صفاقی داکسوروبیسین در رت‏های نر سبب کاهش وزن بیضه، آتروفی توبول‏ها و کاهش شدید تعداد سلول‏های جنسی می‏شود. در مطالعه دیگری که توسط  Zanetti و همکاران (4) انجام شد، DOX در بیضه رت‏های نر سبب کاهش قطر توبول‏ها و کاهش ضخامت لایه سلول‏های جنسی شده، توان تولیدمثلی را کاهش داد.Yeh  و همکاران (7) نشان دادند که DOX علاوه بر اختلال در اسپرماتوژنز و کاهش تعداد اسپرم سبب افزایش استرس اکسیداتیو و کاهش فعالیت آنتی اکسیدانتی می‏شود. سایر مطالعات نیز نشان داده‏اند که DOX یک القا کننده درون سلولی استرس اکسیداتیو است و اختلالات بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی ناشی از آن می‏تواند  نتیجه استرس اکسیداتیو باشد (6، 8 و9). به‏نظر می‏رسد ایجاد گونه‏های فعال اکسیژن(ROS) و سایر رادیکال‏های آزاد به‏طور کنترل نشده یکی از فاکتورهای اساسی باشد که از طریق استرس اکسیداتیو منجر به کاهش تحرک، قابلیت زیستی و اختلال در واکنش آکروزومی شده و در نهایت منجر به ناباروری می‏گردد (10). بنابراین ممکن است استفاده از یک آنتی اکسیدانت قوی همراه با DOX روش مناسبی برای کاهش عوارض جانبی آن  باشد.

روی یک عنصر کم مصرف (Trace element) می‏باشد که مقدار کم آن ضروری است (11)، درحالی که مقادیر بالاتر آن سمی بوده، قادر به القای آپوپتوزیس یا حتی نکروزیس می‏باشد (12). بسیاری از مطالعات نقش آنتی آپاپتوتیک و خواص آنتی اکسیدانتی روی را  به اثبات رسانده اند. روی یکی از کوفاکتورهای آنزیم سوپراکساید دیسموتاز (Cu-Zn SOD) می‏باشد که سبب دیسموتاسیون سوپراکساید می‏شود که به‏طور مداوم در طی متابولیسم هوازی ایجاد می‏گردد و آن را به اکسیژن و هیدروژن پراکساید تبدیل می‏کند. علاوه براین با القای سیگنال‏های پاسخ به استرس در مقابله با استرس اکسیداتیو نقش دارد (13). همچنین نقش آن در تولید اسپرم، افزایش قابلیت زیستی آن و ممانعت از تخریب اسپرماتوزوئید اثبات شده است (14). اخیرا نانواکسید روی (nano-ZnO) توجه زیادی را در مطالعات جانوری به خود معطوف نموده است (15). آزمایشات نشان داده اند که عناصر کم مصرف در مقیاس نانو دسترسی بالایی به سلول‏ها داشته (16 و 17)، سمیت آن‏ها با توجه به شاخص‏هایی مانند میانگین دوز سمی، آسیب حاد کبد، میزان بقا و سمیت کوتاه مدت بسیار کمتر است. این نتایج عناصر کم مصرف را در مقیاس نانو  به‏عنوان عوامل ضد سرطان و آنتی اکسیدانت‏های قوی با خطر سمیت پایین پیشنهاد می‏کند (18). در مطالعه حاضر اثر نانواکسید روی به‏عنوان یک آنتی اکسیدانت قوی در ممانعت یا کاهش عوارض جانبی ناشی از مصرف داکسوروبیسین از جمله القای استرس اکسیداتیو و اختلال در ساختار و عمل‏کرد بیضه مورد بررسی قرار گرفت.

 

مواد و روشها

مواد: در این پژوهش داکسوروبیسین شرکت Ebewepharma و نانواکسید روی از شرکت  Sigma-Aldrich مورد استفاده قرار گرفت. اتانل، زایلین، پارافین، هماتوکسیلین، ائوزین، تولوئیدن بلو و کلروفرم از شرکت Merck تهیه شدند.

حیوانات: رت های نر بالغ نژاد ویستار به وزن تقریبی 250-220 گرم و سن تقریبی 12هفته از موسسه رازی (تهران) تهیه شدند. حیوانات در قفس‏های مخصوص با دسترسی راحت به آب و غذا در خانه حیوانات موسسه رازی (شعبه اراک) نگه‏داری شدند. روشنایی محیط به صورت 12 ساعت نور، 12 ساعت تاریکی و دما در محدوده 2 ±23 تنظیم شد. رت‏ها به‏طور تصادفی به چهار گروه 6 تایی (یک گروه کنترل و سه گروه تجربی) تقسیم شدند. گروه کنترل، تزریق درون صفاقی (i.p) سالین دریافت نمود. به گروه تجربی1، 6 میلی‏گرم بر کیلوگرم DOX  (i.p.) تزریق شد، گروه تجربی2، 5 میلی‏گرم بر کیلوگرم نانواکسید روی حل شده در سالین دریافت نمود و گروه تجربی3 ابتدا نانواکسید روی و یک ساعت بعد DOX دریافت کرد. هر چهار گروه به مدت 3 روز تحت تیمار قرار گرفتند. پس از 28 روز رت‏ها با استفاده از کلروفرم بی‏هوش شده، بیضه چپ آن‏ها  برداشته شد و پس از شستشو با سرم فیزیولوژیک جهت تثبیت در محلول بوئن قرار گرفت. سپس مراحل پاساژ بافتی، تهیه بلوک‏های پارافینی و تهیه برش‏های 5 میکرونی انجام شد. رنگ آمیزی لام‏ها با هماتوکسیلین- ائوزین (H&E) و تولوئیدن بلو (جهت مشاهده مست سل‏ها) صورت گرفت. در نهایت سلول‏های مختلف با بزرگ نمایی 100× میکروسکوپ نوری بررسی شدند. شمارش سلول‏ها  به‏طور تصادفی در 3 لام از هر نمونه و 6 توبول در هر لام انجام شد. همچنین در هر نمونه 100 لوله سمی نیفر بررسی شد و شاخص تمایز توبولی  Tubule Differentiation Index = TDI)) و شاخص اسپرمیوژنز (Spermiation index =SPI) محاسبه شد. TDI عبارت است از درصد لوله‏هایی که حداقل 3 سلول جنسی تمایز یافته (به شکل اسپرماتوگونی B یا مراحل بعدی) داشته باشند و SPI درصد توبول‏هایی است که اسپرمیوژنز طبیعی نشان می دهند (19 و 20).

آنالیز آماری: اطلاعات با استفاده از نرم افزار آماری SPSS-14 تحلیل شد. آزمون آماری ANOVA یک طرفه و تست تکمیلی scheffe مورد استفاده قرار گرفت. 05/0  P<مرز معنی‏دار بودن

داده‏ها درنظر گرفته شد.

نتایج

 در گروه کنترل و گروه تجربی 2 (نانواکسید روی) لوله های سمی نیفر به‏طور فشرده و منظم در کنار هم قرار داشتند و سلول‏های آن‏ها از تعدد و تنوع بیشتری برخوردار بودند. هسته سلول‏های سرتولی نیز در قاعده لوله‏های سمی نیفر‏ قرار داشت (شکل 1،A  و B)، اما در گروه تیمار شده با DOX (گروه تجربی1) فضای بین توبول‏ها افزایش یافته و در اکثر آن‏ها نوعی به‏هم ریختگی مشاهده شد. بین سلول‏های اپی‏تلیوم ژرمینال فضاهای خالی (واکوئل) زیادی مشاهده شد. سلول‏های سرتولی نیز دفرمه شده، هسته آن‏ها از حالت بیضوی تغییر شکل داده، حالت نامنظم به‏خود گرفته و به طرف لومن توبول‏ها کشیده شده بودند (شکل 1، C). در گروه تجربی 3 (نانواکسید روی+ DOX) اپی تلیوم توبول‏ها نسبت به گروه تجربی 1 (DOX) ضخامت بیشتری داشت و سلول ها انسجام و پیوستگی بیشتری داشتند و بین آن‏ها فضاهای خالی مشاهده نشد. تنوع سلولی نیز در توبول‏ها بیشتر بود ( شکل 1،D).

 

 

 

شکل 1: فتومیکروگراف لوله‏های اسپرم‏ساز بیضه رت های گروه: کنترلA ، نانواکسید روی B، داکسوروبیسینC ، داکسوروبیسین+ نانواکسید روی  D (رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی 100×)

اپی‏تلیوم لوله‏ها و بافت بینابینی در گروه کنترل و نانواکسید روی (A,B) ساختار طبیعی نشان می‏دهند. در گروه داکسوروبیسین (C) کاهش قطر لولهها، کاهش ضخامت و درهم ریختگی اپی‏تلیوم ژرمینال همراه با افزایش فضای بینابینی محسوس است. تیمار با داکسوروبیسین+ نانواکسید روی (D) تقریبا توانسته است ساختار طبیعی بافت را حفظ کند.

 

 

نتایج حاصل از شمارش سلولی نشان داد که تعداد سلول‏های اسپرماتوگونی نوع A و B در هیچ یک از گروه‏ها تفاوت معنی‏داری ایجاد نکرد (05/0 (P>(جدول 1). تعداد اسپرماتوسیت‏های اولیه در گروه تجربی 1 ((DOX نسبت به گروه کنترل کاهش معنی‏دار 001/0 P<نشان داد. تیمار با نانواکسید روی در گروه های تجربی 2 (نانواکسید روی) و3 (نانواکسید روی+ DOX) سبب افزایش معنی‏دار 001/0>P تعداد این سلول‏ها نسبت به گروه تجربی ((DOX 1 شد (جدول 1). تعداد اسپرماتیدها (گرد و دراز) و اسپرماتوزوئیدها نیز در گروه تجربی 1 ((DOX نسبت به گروه کنترل کاهش معنی‏دار نشان داد (001/0( P< . در گروه های تجربی2 و 3 افزایش معنی‏دار (01/0 > P) تعداد این سلول ها نسبت به گروه تجربی 1 مشاهده شد (جدول 1). در این بررسی DOX سبب کاهش معنی‏دار (001/0 > P) سلول‏های لایدیگ نسبت به گروه کنترل شد. در گروه های تجربی 2 و 3 افزایش معنی‏دار (01/0>P) سلول‏های لایدیگ نسبت به گروه تجربی 1 مشاهده شد (جدول 1). تعداد ماستوسیت‏ها در گروه تجربی 1 نسبت به شاهد افزایش معنی دار (001/0>P) داشت. در گروه های تجربی 2 و 3 تعداد ماستوسیت‏ها نسبت به گروه تجربی 1 بطور معنی‏داری (001/0( P< کاهش یافت (جدول 1). تغییر تعداد سلول‏های سرتولی در هیچ یک از گروه ها معنی‏دار نبود (05/0>P) (جدول 1).

شاخص های تمایز توبولی(TDI) و اسپرمیوژنز  (SPI)در گروه تجربی 1 نسبت به گروه کنترل کاهش معنی‏دار (01/0>P) نشان دادند. استفاده از نانواکسید روی در گروه های تجربی 2 و 3 افزایش معنی‏دار (001/0>P) این شاخص‏ها را نسبت به گروه تجربی 1به دنبال داشت (جدول 2). همچنین DOX درصد توبول‏های تخریب شده را بطور معنی‏داری (001/0>P) نسبت به گروه کنترل افزایش داد. در گروه‏های تجربی 2 و 3 تعداد توبول‏های تخریب شده بطور معنی‏داری (01/0>P) کاهش یافت (جدول 2).

 

 

جدول 1: نتایج حاصل از شمارش سلول های مختلف بیضه در گروه‏های مورد مطالعه.

گروه

کنترل

--

تجربی 1

(DOX)

تجربی 2

(nZnO)

تجربی 3

(DOX + nZnO)

اسپرماتوگونی A

16/7±88/0

75/5±91/0

03/1±33/7

17/6±01/1

اسپرماتوگونی B

         91/0±08/12

62/10±35/1

12/1±03/12

30/11±21/4

اسپرماتوسیت اولیه

72/41±77/3

52/19±99/1a

b20/2±74/45

65/37±23/3b

اسپرماتید

98/99±95/7

18/51±40/2a

b76/8±88/110

34/89±05/3b

اسپرماتوزوئید

86/143±04/5

71/66±94/7a

b18/7±63/154

44/120±38/5ab

سرتولی

88/13±92/0

83/12±24/1

96/0±41/14

35/13±16/1

لیدیگ

63/11±01/1

61/7±82/0a

b75/1±84/12

13/10±85/0b

ماستوسیت

09/3±08/1

49/6±97/0a

b69/0±39/3

81/4±65/0ab

یافته‏ها به صورت میانگین±انحراف معیار نشان داده شده‏اند (سطح معنی‏داری: 05/0P <). aمعنی‏دار نسبت به گروه کنترل، b معنی‏دار نسبت به گروه تجربی 1 (داکسوروبیسین). DOX: داکسوروبیسین، nZnO: نانواکسید روی.

 

جدول 2: نتایج حاصل از مطالعات هیستوپاتولوژیک بیضه در گروه‏های مورد مطالعه.

گروه

کنترل

--

تجربی 1

(DOX)

تجربی 2

(nZnO)

تجربی 3

(DOX + nZnO)

شاخص تمایز توبولی(%)

67/89±01/3

83/81±40/2a

ab05/1±50/97

17/90±23/2b

شاخص اسپرمیوژنز(%)

50/93±51/3

67/59±88/4a

b62/4±83/94

50/82±37/4ab

توبول های تخریب شده(%)

50/2±50/1

67/17±26/3a

b82/0±67/1

00/5±89/0b

یافته‏ها به صورت میانگین±انحراف معیار نشان داده شده اند (سطح معنی‏داری: 05/0P <). aمعنی‏دار نسبت به گروه کنترل، b معنی‏دار نسبت به گروه تجربی 1 (داکسوروبیسین). DOX: داکسوروبیسین، nZnO: نانواکسید روی.

 

 


بحث

DOX که یک داروی ضد سرطان شناخته شده می‏باشد، یک آنتی بیوتیک آنتراسایکلین است که توسط قارچ Streptomyces peucetius تولید می شود (4 و 21). بسیاری از گزارش‏ها نشان داده‏اند که DOX سبب ناباروری در نرها می‏شود (1، 4 و 21). بنابراین عوارض جانبی این دارو فاکتور محدود کننده‏ای برای استفاده از آن می‏باشد (5). در مطالعه حاضر اثر DOX بر ساختار بافتی بیضه و نقش نانواکسید روی در ممانعت از سمیت این دارو بررسی شد. در این مطالعه استفاده از داکسوروبیسین سبب کاهش معنی‏دار تعداد اسپرماتوسیت‏های اولیه، اسپرماتیدها و اسپرماتوزوئیدها شد. اثر گنادوتوکسیک DOX در رت‏های نر اسپراگ دالی توسط Manabe  و همکاران (2) نیز مورد مطالعه قرار گرفت. در این مطالعه تزریق DOX به‏صورت داخل صفاقی علاوه بر کاهش وزن بدن و وزن بیضه سبب کاهش شدید تعداد سلول‏های جنسی شد. Zanetti و همکاران (4) نیز اثر DOX را در کاهش تعداد سلول‏های اسپرماتوژنیک گزارش نمودند. بررسی این گروه نشان داد که در پاسخ به عوامل شیمی درمانی مختلف از جمله آنتراسایکلین ها تعداد سلول‏های جنسی که دچار آپوپتوزیس می‏شوند، چندین برابر افزایش می‏یابد. در این بین سلول‏های اسپرماتوژنیک اولیه، اسپرماتوگونی نوع A، و اسپرماتوسیت‏های اولیه در حال تقسیم میوز حساس‏ترین سلول‏ها هستند. سایر مطالعات نیز نشان داده‏اند که DOX موجب اختلال در اسپرماتوژنز و کاهش تعداد اسپرم همراه با افزایش شاخص‏های آپوپتوزیس می‏شود (7). اثر دژنراتیو ترکیبات مورد استفاده به‏عنوان داروهای ضد سرطان بیشتر روی سلول‏هایی می‏باشد که سنتز سریع RNA (اسپرماتوسیت‏های پاکی تن) و تقسیم میوز دارند (22). بنابراین استفاده از DOX می‏تواند منجر به از بین رفتن سلول‏های جنسی غیر بالغ در حال تکثیر و بالاخره اسپرماتوزوئید بالغ شود (1).

برخلاف مطالعه Zanetti و همکاران (4)که کاهش تعداد اسپرماتوگونی را با مصرف داکسوروبیسین نشان می‏دهد، در مطالعه ما کاهش معنی‏داری در تعداد اسپرماتوگونی ها مشاهده نشد. سایر بررسی‏ها نشان می‏دهد که استفاده از دوزهای بالای دارو نیز نمی‏تواند همه اسپرماتوگونی ها را از بین ببرد (23). در لوله‏های سمی نیفر دو نوع اسپرماتوگونی اصلی وجود دارد. نوع اول سلول‏های تمایز نیافته بنیادی هستند که به‏عنوان منبع و پشتوانه برای ادامه اسپرماتوژنز عمل می‏کنند. این سلول‏ها به‏ندرت تقسیم شده و نسبت به بسیاری از ترکیبات سمی که روی سایر سلول‏های اسپرماتوژنیک موثرند، مقاوم می‏باشند (24). برخی عوامل که باعث کاهش بسیاری از سلول‏های ژرمینال می شود تکثیر این سلول ها را تحریک می کند (25). بنابراین به‏نظر می‏رسد این سلول‏ها پس از مدتی می توانند با تقسیم خود سلول هایی زایا در توبول‏ها ایجاد کنند (23 و 26).در موش‏ها سلول‏های اسپرماتوگونی باقی مانده می‏توانند مجموعه ای از سلول ها را تشکیل دهند اما نمی‏توانند به سلول‏های دیگر تمایز یابند (23 و 27).

سلول‏های سرتولی 3 درصد سلول های توبول‏های سمی نیفر بیضه بالغ را تشکیل می‏دهند و تنها سلول‏های سوماتیک موجود در لوله‏ها هستند. این سلول‏ها در ارتباط نزدیک با سلول‏های ژرمینال محیط مناسبی برای اسپرماتوژنز فراهم می سازند و همچنین نقش مهمی در حفظ خاصیت پرتوانی سلول‏های بنیادی اسپرماتوگونی دارند (28).در این مطالعه سلول‏های سرتولی تحت تاثیر DOX  تغییرات مورفولوژیک نشان داده و دچار تحلیل شدند، اما تعداد آن‏ها کاهش معنی‏داری نداشت. این موضوع می‏تواند معرف مقاوم بودن این سلول ها باشد که با نتایج مطالعات Aich و Vecino مطابقت دارد (29و 30). Zanetti و همکاران نیز در سال 2007 مشاهده کردند که 9 هفته بعد از تیمار رت های نر با داکسوروبیسین تنها سلول های باقی مانده در توبول‏های باریک و نازک، سلول‏های سرتولی می باشند (4). البته برخی مطالعات دیگر که بصورت in vivo و in vitro صورت گرفته‏اند نشان دهنده کاهش معنی‏دار سلول‏های سرتولی تحت تاثیر DOX می باشند (31و32). تفاوت این نتایج می‏تواند به علت تفاوت فاکتورهایی نظیر دوز داروی مصرفی و مدت زمان طی شده پس از مصرف دارو باشد.

در مطالعه حاضراستفاده از DOX تعداد سلول‏های لایدیگ را به‏طور معنی‏دار کاهش داد. این موضوع با یافته‏های سایر محققین مبنی براین‏که داروهای ضد سرطان می‏توانند روی سلول های لایدیگ اثر گذاشته و سبب کاهش تعداد و بلوغ غیرطبیعی آن‏ها شوند مطابقت دارد (33و34). این امر خود می‏تواند توضیح دیگری باشد برای شکست اسپرماتوژنز تحت تاثیر DOX ، چرا که با کاهش تعداد سلول‏های لایدیگ میزان تستوسترون نیز کاهش می‏یابد و این عدم تعادل هورمونی سبب اختلال در اتصال وابسته به تستوسترون اسپرماتیدهای گرد به سلول های سرتولی می‏گردد و بدین ترتیب بلوغ اسپرماتوزوئیدها دچار اختلال می‏شود (19و35). ﻫﻤﭽﻨﻴﻦ گزارش‏های ‏‏ﻣﻮﺟﻮد اﺳﺖ ﻣﺒﻨﻲ ﺑﺮ اﻳﻦ‏ﻛﻪﺳﻠﻮل‏های ﻻﻳﺪﻳﮓ به‏عنوان ﺳﻠﻮل ﻫﺪف ﻓﺎﻛﺘﻮرﻫﺎی ﻣﺨﺘﻠﻔﻲ از ﺟﻤﻠﻪ وازوﭘﺮﺳﻴﻦ، اﻳﻨﺘﺮﻟﻮﻛﻴﻦ - IGF) 1) و ﻓﺎﻛﺘﻮر ﻣﺤﺮک سلول‏های ﺳﺮﺗﻮﻟﻲ  ﻣﻲ‏ﺑﺎﺷﺪ. ﺑﻨﺎﺑﺮاﻳﻦ ﺗﺨﺮﻳﺐ سلول‏هایﻻﻳﺪﻳﮓﻫﻢ ﺑﺎﻋﺚاﺧﺘﻼل در ﺗﺮﺷﺢ ﺗﺴﺘﻮﺳﺘﺮون (مهم‏ترین ﻫﻮرﻣﻮن ﺟﻨﺴﻲ) و ﻫﻢ ﺑﺎﻋﺚ اﺧﺘﻼل در ﺑﺴﻴﺎریاز ﻋﻤﻠﻜﺮدﻫﺎی دﻳﮕﺮ ﺑﻴﻀﻪ ﻣﻲ ﺷﻮد (36). سلول‏های لایدیگ دربرابر عوامل سمی نسبت به سلول‏های ژرمینال بیضه مقاوم‏تر می‏باشند. معمولا آسیب این سلول‏ها بعد از تخریب اپی‏تلیوم ژرمینال رخ می دهد. مکانیسم  آسیب سلول‏های لایدیگ پس از شیمی درمانی به درستی مشخص نیست. این تخریب ممکن است به‏طور مستقیم رخ دهد اما شواهدی نیز وجود دارد که نشان می‏دهد آسیب اپی‏تلیوم ژرمینال، کاهش جریان خون بیضه و تغییر کنترل پاراکرین این سلول‏ها به‏طور غیر مستقیم منجر به آسیب آن ها می شود (37).

در این مطالعه همچنین تعداد ماستوسیت‏های بیضه با مصرف DOX افزایش معنی‏دار نشان داد. برخی از مطالعات اخیر افزایش تعداد ماستوسیت‏ها را در بیضه مردان نابارور نشان داده‏اند و تیمار بیماران با داروهای مهار کننده ماستوسیت ها نظیر کتوتیفن موجب بهبود معنی‏دار تعداد اسپرم ها و تحرک آن‏ها شده است (19و38). بنابراین نقش مست‏سل‏ها در اندام‏های تناسلی مهم به‏نظر می‏رسد. مست سل‏ها هیستامین و فاکتورهای التهابی مختلفی تولید می‏کنند (39و40) که بعضی شواهد افزایش آن‏ها را با اختلال عمل‏کرد سد خونی- بیضه ای مرتبط می‏دانند (41). همچنین افزایش تعداد مست سل‏ها با اختلال در اسپرماتوژنز، فعال شدن فیبروبلاست‏ها و افزایش سنتز کلاژن همراه بوده، می‏تواند منجر به فیبروزه شدن بیضه شود. در حقیقت افزایش تعداد مست‏سل ها با افزایش تعداد توبول‏های فیبروزه و اسکلروزه (38) و همچنین کاهش تعداد اسپرم همراه است (41و42). در سال 2003 Weidinger  (43) Cincik (44) در دو مطالعه جداگانه نشان دادند که علاوه بر اثرات مستقیم بر بافت بیضه تریپتاز ناشی از مست‏سل‏ها به‏طور غیرمستقیم بر تحرک اسپرم‏ها نیز تاثیر دارد (43و44). Oliva و همکاران (45) نیز نشان دادند که افزایش هیستامین مترشحه از مست سل‏ها می‏تواند باعث کاهش تحرک اسپرم‏ها شود. مکانیسم اثر DOX در افزایش تعداد مست‏سل‏ها مشخص نشده است اما بررسی‏های متعددی تاثیر رادیکال‏های آزاد را بر آزاد سازی هیستامین از مست سل‏ها نشان داده اند (46).

همچنین در مطالعه حاضر کاهش معنی‏دار شاخص‏های تمایز توبولی (TDI) و اسپرمیوژنز (SPI)، و افزایش درصد توبول‏های تخریب شده تحت تاثیر DOX مشاهده شد.‏ Vendramini و همکاران (47) نشان دادند که DOX پس از 30 و 60 روز سبب کاهش درصد تمایز توبولی در رت‏ها می شود.Brilhante  و همکاران (33) نیز نشان دادند که تیمار با DOX پس از 40 روز موجب نقصان اسپرمیوژنز در توبول‏ها می‏شود. پارامترهای بافتی نظیر شاخص تمایز توبولی و شاخص اسپرمیوژنز می‏توانند در مورد میزان آسیب بیضه به دلیل مرگ سلول‏های زایا اطلاعات مفیدی در اختیار قرار دهند. به‏طور کلی تکامل ساختاری و بلوغ این سلول‏ها و اسپرمیوژنز اعمال اصلی سلول‏های سرتولی می‏باشد (48). بنابراین هرگونه تغییر در سلول‏های سرتولی می‏تواند منجر به القای ناهنجاری در اسپرماتوژنز و اسپرمیوژنز شود (49). هورمون استروئیدی تستوسترون نیز که نقش مهمی در تکامل و تمایز سلول‏های اسپرم ایفا می‏کند ، توسط سلول‏های لایدیگ ترشح می‏شود. بنابراین با کاهش و آتروفی شدن این سلول‏ها میزان تستوسترون نیز کاهش یافته، اسپرمیوژنز نیز مختل می‏شود (49و50). آسیب‏های اکسیداتیو ناشی از داروهای ضدسرطان موجب اختلال در استروئیدوژنز توسط سلول‏های لایدیگ می شود (51). با کاهش تستوسترون اسپرماتوژنز (25 و 32) و تمایز سلول‏های زایا هم دچار نقصان شده و در نهایت منجر به کاهش رده‏های سلولی  (TDI)و اسپرماتوزوئیدها (SPI) می‏گردد (52). به این ترتیب توبول‏های سمی نیفر بخش اعظم جمعیت سلولی خود را از دست داده و درصد توبول‏های تخریب شده افزایش می‏یابد.

روی یک آنتی اکسیدانت شناخته شده است و به‏عنوان هسته مرکزی آنزیم‏های پاک سازی کننده رادیکال‏های آزاد نظیر سوپراکساید دیسموتاز (SOD) عمل می‏کند. برخی آزمایشات نشان داده‏اندکه در موش‏ها و رت‏های دچار کمبود روی، آسیب اکسیداتیو پروتئین‏ها، لیپیدها و DNA مشاهده می‏شود و نمک‏های روی می‏توانند از آسیب اکسیداتیو و نقصان گلوتاتیون در موش جلوگیری نمایند (11). روی به‏عنوان کوفاکتور بیش از300 متالوآنزیم شرکت کننده در متابولیسم پروتئین ها، لیپیدها، کربوهیدرات‏ها، رونویسی DNA و سنتز پروتئین عمل می‏کند (11 و 13). به دلیل اینکه  اهمیت رونویسی DNA در تکوین سلول‏های جنسی، روی عنصری حیاتی برای تولیدمثل محسوب می‏ شود (53). مقادیر روی در دستگاه تناسلی نر به ویژه در غده پروستات و مایع منی پستانداران در مقایسه با سایر بافت‏ها و مایعات بدن بسیار بالا می باشد (11). این مقدار بالا ممکن است بخاطر اثر حفاظتی این عنصر و آنزیم‏های مربوط به آن در طی اسپرماتوژنز باشد. علاوه بر آن نیاز بیضه به روی در طی بلوغ جنسی و شروع اسپرماتوژنز بیشتر می‏شود. میزان بالای میتوز و مراحل مختلف میوز در لوله‏های منی ساز ممکن است کروموزوم‏ها را نسبت به اثر رادیکال‏های آزاد آسیب پذیرتر کند، بنابراین نیاز به یک سیستم قوی آنتی اکسیدانتی می باشد (54). میانگین روی سمن ارتباط بسیار مستقیم با تحرک، زیستایی و مورفولوژی طبیعی اسپرم ها، و همچنین میزان کاتالاز دارد (55). کمبود روی سبب آتروفی لوله‏های اسپرم ساز شده و باعث اختلال اسپرماتوژنز در رت‏ها می شود (14). سایر آزمایشات نیز تایید نموده‏اند که سطح پایین روی در مایع منی با کاهش باروری ارتباط دارد (11 و 14). Dawei و همکاران (15) اثر نانواکسید روی را برای محافظت سلول‏ها در برابر آسیب ناشی از اکسیداسیون توسط رادیکال‏های آزاد به‏صورت  In vitro بررسی نمودند. در این مطالعه از کشت سلول‏های اپی‏تلیوم روده موش استفاده شد. نتایج نشان داد که استفاده از اکسید روی در مقیاس نانو سبب کاهش معنی‏دار مالون دی آلدئید و افزایش معنی دار سوپراکساید دیسموتاز و کاتالاز شد. بنابراین در این مطالعه نانواکسید روی بعنوان یک آنتی اکسیدان قوی توانست سلول‏ها را از آسیب اکسیداتیو محافظت نماید. مطالعه حاضر نیز نشان داد که نانواکسید روی کارایی کافی برای حفاظت ساختار بیضه در برابر آسیب اکسیداتیو DOX داشته، قادر است پارامترهای هیستولوژیک و مورفولوژیک بیضه را بهبود بخشد.

 

نتیجه گیری

عوامل شیمی درمانی اختلالات زیادی در روند اسپرماتوژنز ایجاد می‏کنند. امروزه رژیم‏های شیمی درمانی موفق به‏میزان زیادی بقای بیمارانی را که از سرطان‏های مختلف مانند سرطان بیضه یا لوسمی رنج می‏برند، افزایش داده است و عمده این افراد بخصوص افراد جوان پس از بهبودی خواهان داشتن فرزند هستند (56). بنابراین اختلالات باروری پس از شیمی درمانی از نظر بالینی اهمیت زیادی دارد. در این مطالعه داروی ضدسرطان DOX موجب کاهش سلول‏های ژرمینال بیضه رت‏های نر شد. همچنین پارامترهای هیستوپاتولوژیک بیضه نظیر شاخص تمایز توبولی و شاخص اسپرمیوژنز کاهش معنی‏دار نشان دادند. استفاده از نانواکسید روی به عنوان آنتی اکسیدانتی با توان حفاظتی بالا توانست کاهش سلول‏ها را جبران نموده، پارامترهای بافتی بیضه را بهبود بخشد. این نتایج می‏تواند زمینه‏ای برای بررسی‏ها و مطالعات جامع تر با دوزها و زمان‏های متفاوت باشد که هدف همه آن ها در نهایت حل مشکلات ناباروری ناشی از شیمی درمانی در مردان است.

  1. Hou M, Chrysis D, Nurmio M, Parvinen M, et al. Doxorubicin Induces Apoptosis in Germ Line Stem Cells in the Immature  Rat Testis and Amifostine Cannot Protect against This Cytotoxicity. Cancer Res. 2005; 65(21): 9999-10005.
  2. Manabe F, Takeshima H, Akaza H. Protecting Spermatogenesis from Damage Induced by Doxorubicin Using the Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Agonist Leuprorelin: An Image Analysis Study of a Rat Experimental Model. Cancer. 1997; 79: 1014–21.
  3. Brougham FH, Kelnar JH, Sharpe M, Wallace B. Male fertility following childhood cancer: current concepts and future therapies. Asian J Androl. 2003; 5: 325-337.
  4. Zanetti SR, Maldonado EN, Aveldano MI. Doxorubicin Affects Testicular Lipids with Long-Chain (C18-C22) and Very Long-Chain (C24-C32) Polyunsaturated Fatty Acids. Cancer Res. 2007; 67(14): 6973–80.
  5. Ichihara S, Yamada Y, Kawai Y, Osawa T, et al. Roles of oxidative stress and Akt signaling in doxorubicin cardiotoxicity .Biochem&Biophys Res Com. 2007; 359: 27–33.
  6. Asmis R, Qiao M, Rossi RR, Cholewa J, et al. Adriamycin promotes macrophage dysfunction in mice. Free Radical Biology & Medicine. 2006; 41(1): 165–174.
  7. Yeh Y, Lai H, Ting C, Lee W,et al. Protection by doxycycline against doxorubicin-induced oxidative stress and apoptosis in mouse testes. BiochemPharmacol. 2007; 7: 969-980.
  8. Gewirtz DA. A critical evaluation of the mechanisms of action proposed for the antitumor effects of the anthracycline antibiotics adriamycin and daunorubicin. BiochemPharmacol. 1999; 57: 727-741.
  9. Horenstein MS, Vander Heide RS, L'Ecuyer TJ. Molecular basis of anthracycline-induced cardiotoxicity and its prevention. Mol Genet Metab. 2000; 71(1-2): 436–444.

10. Agarwal A, Saleh RA. Role of oxidants in male infertility: rationale, significance, and treatment. UrolClin North Am. 2002; 29: 817– 27.

 

11. Ebisch I, Thomas C, Peters W, Braat D, et al. The importance of folate, zinc and antioxidants in the pathogenesis and prevention of subfertility.Hum Reprod.2007; 13(2): 163-174.

  1. 12.  Truong-Tran AQ, Ho LH, Chai F, Zalewski PD. Cellular zinc fluxes and the regulation of apoptosis/gene-directed cell death. J Nutr. 2000;  130: 1459–1466.
  2. 13.  Klotz LO, Kröncke K, Buchczyk DP, Sies H. Role of Copper, Zinc, Selenium and Tellurium in the Cellular Defense against Oxidative and Nitrosative Stress. J Nutr. 2003; 133:1448-1451.
14. Hammadeh M, Filippos A, Hamad M. Reactive Oxygen Species and Antioxidant in Seminal Plasma and Their Impact on Male Fertility. IJFS. 2009; 3(3): 87-110.

15. Dawei A, Zhisheng W, Anguo Z. Protective Effects of Nano-ZnO on the Primary Culture Mice Intestinal Epithelial Cells in in vitro Against Oxidative Injury. Int J Nanotech Appli. 2009; 3:1–6.

16. Griffiths NM, Stewart RD, Robinson MF. The metabolism of [75Se] selenomethionine in four women. Br J Nutr. 1976; 35:373–382.

17. Schrauzer GN. Selenomethionine and selenium yeast: appropriate forms of selenium for use in infant formulas and nutritional supplements. J Med Foods. 1998; 1:201–206.

18. Zhang J, Wang X, Xu T. Elemental selenium at nano size (Nano-Se) as a potential chemopreventive agent with reduced risk of selenium toxicity: comparison with se-methylselenocysteine in mice. Toxicol Sci. 2008; 101(1):22-31.

19. Rezvanfar MA, Sadrkhanlou RA, Ahmadi A, Shojaei-Sadee H, et al. Protection of cyclophosphamide-induced toxicity in reproductive tract histology, sperm characteristics, and DNA damage by an herbal source; evidence for role of free-radical toxic stress.Human & Experimental Toxicology. 2008; 27: 901–910.

20. Porter KL, Shetty G, Shuttlesworth GA, Weng CCY. Estrogenenhancesrecoveryfromradiation-induced spermatogonialarrestinrattestes. J Androl. 2009; 30(4): 440–451.

  1. 21.  Baumgartner A, Schmid TE, emeli1 EC, Anderson D. Parallel evaluation of doxorubicin-induced genetic damage in human lymphocytes and sperm using the comet assay and spectral karyotyping. Mutagenesis. 2004; 19: 313-318.
22. Parvinen LM, Ehdetie J, Parvinen M. Disease, metabolism, and reproduction in the toxic response to drugs and other chemicals. ArchToxicol. 1987; 7: 128-139.

  1. 23.  Van Keulen CJ, de Rooij DG. Spermatogenetic clones developing from repopulating stem cells surviving a high dose of an alkylating agent. Cell Tissue Kinet. 1975; 8(6): 543-51.
  2. 24.  Lee K, Frame SR, Sykes GP, Valentin R. Testicular degeneration and spermatid retention in young male rats.Toxicologic Pathology. 1993; 3: 290-302.
  3. 25.  Clermont Y, Hermo L. Spermatogonial stem cells in the albino rat. Am J Anat. 1975; 142(2):159-75.
26. Akhondi MM, AkbarzadehNajar R, Jeddi-Tehrani M, Sadeghi MR,  et al. The Effect of Human Chorionic Gonadotropin Treatment on Recipient Mouse Germ Cell Proliferation Following Spermatogonial Stem Cell Transplantation of Neonatal Donor Mice. Avicenna J of Med Biotech. 2010; 2 (1).

  1. 27.  Marvin L, Shetty M, Shetty G. Inhibition of Spermatogonial Differentiation by Testosterone.  J Androl. 2003; 24(2).
  2. 28.  Shinohara T, Orwig KE, Avarbock MR, Brinster RL. Restoration of spermatogenesis in infertile mice by sertoli cell transplantation. Biol Reprod.2003;68(3): 1064-71.
29. Vecino P, Uranga JA, Arechaga J. Suppression of spermatogenesis for cell transplantation in adult mice. Protoplasma.2001; 217(4): 191-8.

30. Aich S, Manna CK. Histophysiological changes of the testicular tissue due to busulphan administration in the wild Indian house rat. ActaBiol Hung.2001; 52 (1): 105-16.

  1. 31.   Takahashi H, Tainakav H, Umezawa M, Takeda K et al. Evaluation of testicular toxicology of doxorubicin based on microarray analysis of testicular specific gene expression. J Toxicol sciences. 2011;36(5): 559-567.
32. Nambu AKumamoto YMikuma N. Effects of anti-cancer agents on cultured rat Sertoli cells. Nihon HinyokikaGakkai Zasshi.1995; 86(6): 1132-6.

33. Brilhante O, Stumpp T, Miraglia SM. Long-term testicular toxicity caused by doxorubicin treatment during pre-pubertal phase. Int J Medicine and Medical Sciences. 2011; 3(2): 52-60.

  1. 34.  Howell SJ, shalet SM. Testicular function after chemotharpy. Hum reprod update. 2001; 7(4): 363-369.
  2. 35.  Al-hazmi E, Shaker S, Al-sagaff S, Koraium S. Histological changes of testis in mice after administration of Doxorubicin HCL (Adriblastina) cytotoxic drug. Proc 2nd Saudi sci conf. 2005; 1425: 99-117.
36. Benahmad ME, Tabone  J, Zaes JM. Role of sertoli cells in leydig cell function. InsermColloqu. 2004; 123: 363-385.

37. Howell SJ, Radford JA, Ryder WDJ, Shalet SM. Testicular Function after Cytotoxic Chemotherapy: Evidence of Leydig Cell Insufficiency. J Clinical Oncology. 1999; 17(5):1493-1498.

  1. 38.  Yamanaka K, Fujisawa M, Tanaka H, Okada H et al.  Significance of human testicular mast cells and their subtypes in male infertility. Hum reprod. 2000; 15(7): 1543-1547.
39. Gaytan F, Carrera G, Pinilla F, Aguilar R, et al. Mast cells in the testis, epididymis and accessory glands of the rat: effects of neonatal steroid treatment. J Androl. 1989; 10(5): 350-358.

  1. 40.  Han JY, Horie Y, Miura S, Akiba Y. Compound Danshen injection improves endotoxin-induced microcirculatory disturbance in rat mesentery. World J Gastroenterol.  2007; 13(26): 3581-3591.
  2. 41.  Hashimoto J, Nagai T, Takaba H, Yamamoto M, et al. Increased mast cells in the limiting membrane of seminiferous tubules in testes of patients with idiopathic infertility. Urol Int. 1988; 43:129–132.
42. Roaiah MMF, Khatab H, Mostafa T. Mast cells in testicular biopsies of azoospermic men. Androl. 2007; 39(5): 185–189. 

44. Cincik M, SezenSC. The mast cells in semen: their effects on sperm motility.Androl. 2003; 49(4): 307-11.

45. Oliva A, Multigner L. Ketotifen improves sperm motility and sperm morphology in male patients with leukocytospermia and unexplained infertility. FertilSteril. 2006; 85: 240–243.

46. Mannaioni PF, Di Bello MG, Raspanti S, Mugnai L, et al. Activation of xenobiotics into free radicals by prostaglandin-H-synthase and by rat liver microsomes. Adv Prostaglandin Thromboxane Leukot Res. 1995; 23: 215-7.

47. Vendramini V, Sasso-Cerri E, Miraglia SM. Amifostine reduces the seminiferous epithelium damage in doxorubicin-treated prepubertal rats without improving the fertility status. ReprodBiol&Endocrin. 2010; 8:3.

48. ShalizarJalali A, Hassanzadeh Sh, Malekinejad  H. Chemoprotective effect of Crataegusmonogyna aqueous extract against cyclophosphamide-induced reproductive toxicity. Veter Res Forum. 2011; 2(4) 266 – 273.

49. Hosseini A, Ahmadi A, GhaderiPakdel F, Zare S. Effects of chronic low- dose treatment with cyclophosphamide on the rat testis. PhysiolPharmacol. 2011; 15(3): 351-360.

  1. 50.  Cao L, Leers-Sucheta S, Azhar S. Aging alters the functional expression of enzymatic and non-enzymatic anti-oxidant defense systems in testicular rat Leydig cells. J Steroid BiochemMol Biol. 2004; 88(1): 61-7.
51. Lindi L, Haolin C, Michael A, Trush MD, et al. Aging and the Brown Norway Rat Leydig Cell Antioxidant  Defense System. J Androl. 2005; 22: 32-37.

52. Debnath D, Mandal TK. Study of quinalphos (an environmental oestrogenic insecticide) formulation (Ekalux 25 E.C)-induced damage of the testicular tissues and antioxidant defense system in Sprague-Dawleyalbino rats. J ApplToxicol. 2000; 20: 197–204.

53. Favier AE. The role of zinc in reproduction: Hormonal mechanisms. Biol Trace Elem Res. 1992; 32: 363–382.

54. Oldereid NB, Thomassen Y, Purvis K. Selenium in human male reproductive organs. Hum Reprod. 1998; 13: 2172–2176.

55. Alavi-Shoushtari SM, AsriRezai S, Ansari MH, Khaki A. Effects of the Seminal Plasma Zinc Content and Catalase Activity on the Semen Quality of Water Buffalo (Bubalusbubalis) Bulls. Pak J Biol Sci. 2009; 12: 134-139.

Mohamadghasemi F, Faghani M, Fallahkarkan M. The Protective Effect of Melatonin on Sperm Parameters, Epididymis and Seminal Vesicle Morphology in Adult Mouse Treated with Busulfan. J Iranian Anatomical Sciences. 2010; 8: 25-36