بهینه‎سازی تولید کالوس و باززایی در گیاه Salsola arbuscula pall

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

-

چکیده

هدف: تولید گیاه از طریق کشت بافت از نظر مهندسی ژنتیک اهمیت زیادی دارد لذا در این تحقیق بهینه‎سازی شرایط کشت به‎منظور تولید کالوس و باززایی گیاه Salsola arbuscula بررسی گردید. مواد و روش‎ها: ابتدا بذر گیاه در محیط کشت MS کشت گردید و پس از دو ماه، جداکشت‎های ریشه، ساقه و برگ گیاهان تولید شده جهت تولید کالوس در محیط کشت MS حاوی غلظت‎های مختلف از هورمون‎های 2و4-دی کلرو فنوکسی استیک اسید (2,4-D) و کینتین (Kin) کشت گردیدند. باززایی گیاه نیز در محیط کشت‎های مختلف بررسی شد. نتایج: بررسی‎ها نشان داد که بهترین جداکشت در القا تولید کالوس، جداکشت ریشه و مناسب‎ترین محیط کشت mg/L) 1) mg/L) + Kin 1) MS + 2,4-D بود. همچنین در محیط mg/L Kin 5/0MS + وmg/L Kin  1MS + از ساقه باززایی مستقیم صورت گرفت. نتیجه‎گیری: با وجود تولید کالوس در محیط کشت حاوی فقط هورمون 2,4-D، ترکیب دو هورمون اکسین و سیتوکینین باعث افزایش قابل توجهی در میزان تولید کالوس گردید. باززایی مستقیم نیز فقط در محیط کشت فاقد اکسین رخ داد. بنابراین میزان تولید کالوس و باززایی به میزان تنظیم‎کننده‎های رشد خارجی وابسته است و میزان تنظیم کننده‏های رشد خارجی نیز به‏شدت به ژنوتیپ و مقدار هورمون داخلی گیاه بستگی دارد.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

گونه‎های یک‎ساله سالسولا از جمله Salsola arbuscula از گیاهان هالوفیت خانواده Chenopodiaceae می‎باشند که در مراحل بلوغ مقاومت بالایی نسبت به شوری و خشکی خاک، تغییرات pH و عدم ثبات شرایط آب‌و‌هوایی دارند (1 و 2). در نواحی خشک و نیمه خشک به‎علت کمبود آب و تعرق بالا نمک‎های محلول در خاک‎ زیاد شده و شوری خاک افزایش می‎یابد در نتیجه دسترسی گیاهان به آب محدود می‎گردد (3)، بنابراین به‎علت تحمل بالای نسبت به شوری، این گیاهان می‎توانند برای بهبود زمین‌های خشک و نیمه‌خشک مورد استفاده قرار گیرند (1 و 2). این گیاه در فصول بهار و پاییز از منابع علوفه حیوانی است و از جمله استفاده‌های دیگر از این نوع گیاهان، تزیین نواحی شهری، در شهرهایی با آب‌و‌هوای بیابانی است (4). شاخ و برگ گیاه دارای مقادیری از ایزوکونیولین آلکالوئید‌ها مانند سالسولین و سالسولیدین است. همچنین نمک‌های معدنی به طور ویژه پتاسیم، کلسیم، منگنز، آلومینیوم و آهن در بافت‌های این جنس گیاهی وجود دارد. سالسولین و سالسولیدین در کاهش فشار خون موثر است (5).

تحقیقات نشان داده است که هالوفیت‎ها به دلیل مقاومت بالا نسبت به تنش شوری می‎توانند به عنوان منبعی مناسب جهت انتقال ژن مقاومت نسبت به تنش شوری به گیاهان گلیکوفیت غیر مقاوم جهت بهبود استفاده از زمین‎های شور و خشک باشند. تکنولوژی کشت بافت برای جمع‎آوری، ذخیره‎سازی و تکثیر ژرم‎پلاسم گیاهی بسیار مورد توجه است. به کمک تکنیک کشت بافت می‎توان ژنوتیپ‎هایی تولید کرد که خصوصیات بهتری دارند (6). لذا بهینه‎سازی تولید کالوس و باززایی گیاه در این ارتباط حائز اهمیت می‎باشد. از جمله عواملی که در تولید کالوس موثرند، ژنوتیپ، تنظیم‎کننده‎های رشد، محیط کشت، نوع کربوهیدرات، نوع جداکشت، سن جداکشت و شرایط محیطی می‎باشد. نتایج نشان داده است که وابستگی خاص القای کالوس و باززایی گیاه به ژنوتیپ اجتناب ناپذیر و کلی است  و القای کالوس و باززایی گیاه با ژنوتیپ گیاه تغییر می‎کند (7). میزان تنظیم‎کننده‎های خارجی و مواد مغذی موجود جهت القای کالوس به رقم گیاهی وابسته است بنابراین ترکیبات محیط کشت وابسته به ژنوتیپ گیاهی تغییر می‎کند (7). رشد کالوس در یک گونه گیاهی بر اساس نوع جداکشت آن گیاه متفاوت بوده و علت آن به درستی مشخص نشده ‎است (8)، بنابراین انتخاب جداکشت نیز وابسته به نوع گونه گیاهی است، به طوری‎که در گونه Salsola pestifer کالوس از جداکشت ساقه نسبت به جداکشت برگ بهتر نمو می‎یابد در حالی‎که جداکشت‎ برگ از گونه Salsola lanata در تشکیل کالوس مناسب‎تر است (6). قطعات میانی هر جداکشت، تولید کالوس و باززایی بیشتری دارند چون احتمالا قطعات وسط دو لبه بریده دارند و زخمی شدن و قطعه قطعه شدن می‎تواند ظرفیت القای کالوس و درنتیجه باززایی را افزایش دهد (8 و 9). توانایی القای کالوس و باززایی با سن برگ نیز تحت تاثیر قرار می‎گیرد. معمولا برگ‎های جوان برای باززایی مناسب‎ترند (8). در گیاه Salsola ferganica  بهترین جداکشت جهت تولید کالوس هیپوکوتیل می‎باشد (10). به‎هر‎حال، تاکنون اطلاعات کافی در مورد شرایط مناسب تولید کالوس و باززایی گیاه Salsola arbuscula وجود ندارد. از آنجایی‎که گیاه Salsola arbuscula یکی از گونه‎های هالوفیت‎ است که حامل ژن‎های مقاومت به شوری بالا می‎باشد و همچنین به‎دلیل اهمیت‎های دارویی این گیاه، این تحقیق با هدف بهینه سازی شرایط تولید کالوس و باززایی به‎منظور استفاده در مهندسی ژنتیک برای انتقال ژن‎های مقاوم به شوری وهمچنین افزایش تولید متابولیت‎های ثانویه در این گیاه انجام گردید.

مواد و روشها

بذر گیاه Salsola arbuscula از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه گردید. این بذر دارای باله می‎باشد که این باله‎ها علاوه بر این‎که حاوی آبسیزیک اسید می‎باشند یک سد مکانیکی در مقابل ظهور ریشه‎چه بوده و در نتیجه از جوانه‎زنی بذر جلوگیری می‎کنند (11) از این رو قبل از کشت بذر، باله‎ها جدا و سپس بذرها استریل شدند. جهت استریل، ابتدا بذرها به مدت 1 دقیقه در اتانول 70 درصد قرار گفته و پس از شستشوی کامل به مدت 20 دقیقه در آب ژاول 35 درصد (هیپوکلریت سدیم حاوی 5 درصد کلر فعال) قرار گفتند. در پایان3 تا 4بار شستشو در شرایط استریل در زیر ایرفلو و با استفاده از آب مقطر استریل انجام گرفت. سپس بذرهای استریل Salsola arbuscula به تعداد 10 تا 12 عدد در شیشه‎های حاوی محیط کشت MS (Murashing and Skoog) (12)کشت شدند. بذرهای کشت شده در اتاق کشت با نور حدود mmol photons.m-2.S-1 110 و فتوپریود 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت نور و دمای 24 تا 26درجه سانتی‎گراد نگه‎داری گردید (13). پس از جوانه‎زنی بذر و رشد گیاهان به مدت دو ماه، از جداکشت‎های ریشه، ساقه (میانگره) و برگ گیاهان دو ماهه در محیط کشت‎های مختلف (جدول 1) جهت تولید کالوس استفاده گردید. تمامی آزمایش‎ها در 5 تا 6 تکرار در هر تیمار انجام گرفت و در هر تکرار 6 تا 8 قطعه جداکشت، کشت گردید و در شرایط ذکر شده برای کشت گیاه نگه‎داری شدند و پس از 40 روز مورد بررسی‎های کمی و کیفی قرار گرفتند و بهترین محیط کشت و مناسب‎ترین جداکشت جهت تولید کالوس مشخص شد. سپس فراوانی کالوس‎زایی با شمارش تعداد جداکشت‎هایی که تولید کالوس داشتند به تعداد جداکشت‎های کشت شده اولیه به‎دست آمد و با توجه به این امر 5 درجه تشکیل کالوس درنظر گرفته شد. درجه صفر: کالوس تولید نشده و جداکشت‎ها نیز نکروزه شده و از بین رفتند. درجه1: کالوس تولید نشده اما جداکشت‎ها زنده بوده و تاحدی نیز رشد داشتند. درجه2: تا 25درصد تولید کالوس مشاهده شده. درجه3: 25 تا 50 درصد تولید کالوس مشاهده گردید. درجه 4: 50 تا 75 درصد تولید کالوس مشاهده شده. درجه 5: 75 تا 100 درصد تولید کالوس مشاهده گردید. وزن کالوس‎ها در پایان با ترازوی دیجیتالی مدل (CE N92 SER 14230642 AC ADAPTER DC 12V 0.3A) اندازه‎گیری شد. فراوانی باززایی نوساقه با شمارش تعداد نوساقه تولید شده به تعداد جداکشت کشت شده در هر شیشه به‎صورت درصد محاسبه گردید. طرح آماری مورد استفاده، طرح کاملا تصادفی در قالب آزمایش فاکتوریل با سه فاکتور A (فاکتور جداکشت) در 3سطح (ریشه، ساقه و برگ)، B (فاکتور هورمون 2,4-D ((2,4-dichlorophenoxy acetic acid) در سه سطح (0، 5/0، 1 میلی‎گرم در لیتر) و C (فاکتور هورمون Kin ((Kinetin) در سه سطح (0، 5/0، 1 میلی‎گرم در لیتر) بود. تجزیه و تحلیل داده‎ها با استفاده از نرم‎افزار16  SPSS انجام گردید و قبل از انجام آنالیز واریانس، نرمال بودن داده‎ها مورد بررسی قرار گرفت. برای انجام آزمون مقایسه میانگین‎ها از آزمون چند دامنه‎ای دانکن استفاده شد.


 

جدول 1: ترکیبات محیط کشت مورد استفاده جهت القاء تولید کالوس گیاه Salsola arbuscula

 

ترکیبات محیط کشت

1

MS فاقد هورمون

2

mg/L 2,4-D  5/0MS +

3

mg/L 2,4-D  1MS +

4

mg/L Kin  5/0MS +

5

mg/L Kin  1MS +

6

mg/L)  5/0( mg/L) + Kin 5/0(  MS + 2,4D

7

mg/L)  1 ( mg/L) + Kin 5/0(  MS + 2,4D

8

mg/L)  5/0( mg/L) + Kin 1 (  MS + 2,4D

9

mg/L)  1 ( mg/L) + Kin 1 (  MS + 2,4D

 


نتایج

نتایج آنالیز واریانس برای صفات کالوس‎زایی و باززایی در جدول2 آورده شده است. نتایج حاصل از آنالیز واریانس داده‎های مربوط به درجه تشکیل کالوس و اندازه کالوس بر روی هر قطعه جداکشت نشان داد که اثر هریک از ترکیبات‎ تنظیم کننده‎ی رشد و جداکشت به‎تنهایی و همچنین اثر متقابل دو فاکتوردر سطح احتمال 1 درصد (01/0>(P معنی‎دار می‎باشد. این بدان مفهوم است که فاکتورهای مورد مطالعه از نظر تاثیر بر صفت مورد مطالعه به‎صورت مستقل از یکدیگر عمل نمی‎کنند و وابسته به یکدیگر می‎باشند.

زمان شروع تولید کالوس بسته به نوع جداکشت و نوع هورمون مورد استفاده در فاصله زمانی 8 تا 13 روز پس از کشت بود (جدول3). بین درجه تشکیل کالوس در تیمارهای مختلف تفاوت معنی‎دار (01/0>P) مشاهده گردید (جدول2). بیشترین درجه تشکیل کالوس 5 و کم ترین آن صفر بود. درجه صفر برای تمام جداکشت‎ها در محیط کشت MS فاقد هورمون و در محیط کشت 5/0MS + وmg/L Kin  1MS +  برای جداکشت‎های ریشه و برگ مشاهده گردید (جدول3، شکل A1 و B1). در تمام محیط کشت‎ها جداکشت ریشه 100درصد تولید کالوس داشت (جدول3) بنابراین ریشه به‎عنوان بهترین جدا کشت جهت تولید کالوس در نظر گرفته شد.

 

 

جدول 2: آنالیز واریانس برای صفات کالوسزایی و باززایی گیاه Salsola arbuscula

میانگین مربعات (MS)

Mean square

درجه آزادی

df

منابع تغییر

S.O.V

باززایی

وزن کالوس

درجه کالوسزایی

 

 

10800

2.639**

3.955**

2

فاکتور A (جداکشت)

10800

9.51**

520.115**

2

فاکتور B (2,4-D)

10800

0.964**

3.677**

4

فاکتور AB

2800

3.362**

9.152**

2

فاکتور C (Kin)

2800

1.982**

3.066**

4

فاکتور AC

2800

1.740**

4.060**

4

فاکتور BC

2800

0.572**

2.427**

8

فاکتور ABC

6.481

0.009

0.152

216

اشتباه آزمایشی Error

 

 

 

243

کل Total

ns عدم وجود اختلاف معنی‎دار، ** وجود اختلاف معنی‎دار در سطح 01/0

 

 

شکل1: مراحل تولید کالوس و باززایی گیاه (A, B. Salsola arbuscula نکروزه شدن بافتها و عدم تولید کالوس در محیط کشت‎‎های mg/L Kin 5/0MS + وmg/L Kin 1MS + مربوط به جداکشتهای به ترتیب ریشه و برگ؛ (C کالوس حاصل از جداکشت ریشه در محیط کشت mg/L)1) mg/L) + Kin1) MS + 2,4D؛ (D مقایسه تفاوت وزن دو توده کالوس حاصل از جداکشت ریشه در محیط mg/L) 1) mg/L) + Kin1) MS + 2,4D (سمت چپ) و محیط mg/L) 1) mg/L) + Kin5/0) MS + 2,4-D (سمت راست)؛ (E مرحله آغازی باززایی مستقیم حاصل از جداکشت ساقه در محیط کشت mg/L Kin5/0MS +؛ (F رشد گیاه باززایی شده .

جدول3: اثر محیط کشت MS همراه با غلظت‏های متفاوت هورمونهای 2,4-D و Kin بر القای تولید کالوس و ویژگیهای کالوس گیاه. Salsola arbuscula دادهها میانگین 6 تکرار ±خطای استاندارد‌(STDEV) و حروف غیر مشابه نشاندهنده معنیدار بودن در سطح 5 درصد بر اساس آزمون دانکن میباشد.

2,4D (mg/L)

Kin (mg/L)

نوع

جداکشت

شاخصهای رشد

زمان شروع تشکیل کالوس (روز)

بافت کالوس

رنگ کالوس

وزن کالوس (g)

درجه تشکیل کالوس

درصد باززایی مستقیم

0

0

ریشه

0

0

-

m0

g0

c0

0

0

برگ

0

0

-

m0

g0

c0

0

0

ساقه

0

0

-

m0

g0

c0

5/0

0

ریشه

13

نرم

کرم سبز

04/0± hi32/0

a5

c0

5/0

0

برگ

13

نرم

کرم‎قهوه‎ای

04/0± jk19/0

78/0± c11/4

c0

5/0

0

ساقه

13

نرم

کرم سبز

04/0± ij27/0

a5

c0

1

0

ریشه

13

نرم

کرم

04/0± ef54/0

a5

c0

1

0

برگ

8/11

متوسط

کرم سبز

05/0±lm09/0

71/0± e33/2

c0

1

0

ساقه

2/12

نرم

کرم

03/0± kl14/0

73/0± d44/3

c0

0

5/0

ریشه

0

0

-

m0

g0

c0

0

5/0

برگ

0

0

-

m0

g0

c0

0

5/0

ساقه

0

0

-

m0

f1

a100

5/0

5/0

ریشه

7/11

نرم

کرم

03/0±de62/0

a5

c0

5/0

5/0

برگ

11

نرم

کرم

10/0± c92/0

a5

c0

5/0

5/0

ساقه

11

نرم

کرم سبز

27/0± d67/0

71/0±ab67/4

c0

1

5/0

ریشه

75/8

نرم

کرم

03/0± fg49/0

a5

c0

1

5/0

برگ

8

متوسط

کرم سبز

05/0± d69/0

a5

c0

1

5/0

ساقه

8

نرم

کرم سبز

04/0± g44/0

a5

c0

0

1

ریشه

0

0

-

m0

g0

c0

0

1

برگ

0

0

-

m0

g0

c0

0

1

ساقه

0

0

-

m0

f1

2/13± b80

5/0

1

ریشه

5/11

نرم

کرم سبز

25/0b±19/1

a5

c0

5/0

1

برگ

5/11

متوسط

کرم

12/0±gh41/0

5/0±ab 67/4

c0

5/0

1

ساقه

5/11

نرم

کرم سبز

09/0± jk22/0

97/0± c22/4

c0

1

1

ریشه

11

نرم

کرم سبز

09/0± a11/2

a5

c0

1

1

برگ

11

متوسط

کرم سبز

07/0± c92/0

a5

c0

1

1

ساقه

11

متوسط

کرم

18/0± hi32/0

88/0± bc44/4

c0

                         

 

 

 

رنگ و بافت کالوس‎های حاصل از جداکشت‎های ساقه و برگ نیز بسته به هورمون‎های مورد استفاده متفاوت بود (جدول3). بافت کالوس‎های حاصل از ریشه در تمام محیط‎کشت‎های مورد استفاده نرم بود و همچنین کالوس‎ها بسته به ترکیبات محیط کشت رنگ کرم روشن و کرم سبز را نشان دادند (شکل C1). بهترین محیط کشت جهت تولید کالوس محیط کشت mg/L) 1) mg/L) + Kin 1) MS + 2,4D شناسایی شد و با وجود تولید کالوس در محیط کشت حاوی فقط هورمون 2,4-D، ترکیب دو هورمون اکسین و سیتوکینین میزان تولید کالوس را به میزان معنی‎داری افزایش دادند.

نتایج حاصل از آنالیز واریانس وزن کالوس (جدول2) نشان داد که کم‌ترین و بیشترین میانگین وزن کالوس به‎ترتیب برابر صفر و 11/2 گرم بود که کم‎ترین میانگین وزن کالوس‎ در محیط کشت MS فاقد هورمون، mg/L Kin 5/0MS + وmg/L Kin  1MS + برای تمام جداکشت‎ها بدست آمد و بیشترین میانگین وزن کالوس برای جداکشت ریشه در محیط کشت mg/L) 1) mg/L) + Kin 1) MS + 2,4-D مشاهده گردید (جدول3). جداکشت ریشه در محیط کشت mg/L) 1) mg/L) + Kin 1) MS + 2,4-D صددرصد افزایش وزن را نشان داد. ریشه در محیط کشت mg/L) 1) mg/L) + Kin 5/0) MS + 2,4-D با میانگین وزن کالوس برابر 19/1 گرم دومین گروه نشان‎دهنده بیشترین وزن کالوس بود. به طورکلی وزن کالوس‎های تشکیل شده از جداکشت ریشه بطور معنی‎داری (01/0>P) نسبت به کالوس‎های حاصل از برگ و ساقه بیشتر بود (جدول 3و 4، شکل D1).

نتایج این تحقیق همچنین نشان داد که در محیط کشتmg/L Kin 5/0MS + وmg/L Kin  1MS + کالوس تولید نشد اما جداکشت ساقه در این محیط کشت‎ها باززایی مستقیم داشتند و گیاهان باززایی شده به صورت گوشتی و شکننده بودند (شکل ٍE1 و F1). محیط کشت mg/L Kin 5/0MS + نسبت به mg/L Kin  1MS + در باززایی مستقیم کارایی بیشتری را نشان داد (جدول2). باززایی در این محیط کشت‎ها در فاصله 20 روز پس از کشت شروع گردید. در بقیه محیط کشت‎ها باززایی مستقیم مشاهده نشد. بنابراین نتیجه‏گیری می‏شود که بهترین محیط کشت جهت باززایی این گیاه محیط کشت فاقد اکسین بوده و تنها جداکشت مناسب باززایی مستقیم نیز ساقه (میان‏گره) می‏باشد.

 

 

جدول 4: اثر محیط کشت MS همراه با غلظت‏های متفاوت هورمونهای 2,4-D و Kin بر القای تولید کالوس و ویژگیهای کالوس گیاه Salsola arbuscula، دادهها میانگین 6 تکرار ±خطای استاندارد‌(STDEV) و حروف غیر مشابه نشاندهنده معنیدار بودن در سطح 5 درصد بر اساس آزمون دانکن میباشد.

2,4D (mg/L)

Kin (mg/L)

نوع جداکشت

میانگین وزن کالوس (g)

افزایش یا کاهش نسبت به شاهد

0

0

ریشه

m0

-

0

0

برگ

m0

-

0

0

ساقه

m0

-

5/0

0

ریشه

04/0± hi32/0

15% افزایش

5/0

0

برگ

04/0± jk19/0

9% افزایش

5/0

0

ساقه

04/0± ij27/0

13% افزایش

1

0

ریشه

04/0± ef54/0

26% افزایش

1

0

برگ

05/0±lm09/0

4% افزایش

1

0

ساقه

03/0± kl14/0

7% افزایش

0

5/0

ریشه

m0

0

0

5/0

برگ

m0

0

0

5/0

ساقه

m0

0

5/0

5/0

ریشه

03/0±de62/0

29% افزایش

5/0

5/0

برگ

10/0± c92/0

44% افزایش

5/0

5/0

ساقه

27/0± d67/0

32% افزایش

1

5/0

ریشه

03/0± fg49/0

23% افزایش

1

5/0

برگ

05/0± d69/0

33% افزایش

1

5/0

ساقه

04/0± g44/0

21% افزایش

0

1

ریشه

m0

0

0

1

برگ

m0

0

0

1

ساقه

m0

0

5/0

1

ریشه

25/0b±19/1

56% افزایش

5/0

1

برگ

12/0±gh41/0

19% افزایش

5/0

1

ساقه

09/0± jk22/0

10% افزایش

1

1

ریشه

09/0± a11/2

100% افزایش

1

1

برگ

07/0± c92/0

43% افزایش

1

1

ساقه

18/0± hi32/0

15% افزایش

 

 

بحث

نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد بهترین محیط کشت و جداکشت در القا تولید کالوس، محیط کشت mg/L) 1) mg/L) + Kin 1) MS + 2,4-D و جداکشت ریشه بود (جدول 3 و 4). نتایج نشان دادند که جهت تولید کالوس وجود هورمون ضروری است و در محیط کشت فاقد هورمون کالوس تولید ‏نگردید. نتایج مشابهی نیز در این رابطه توسط دانشمندان دیگر در چند گونه گیاهی ثبت شده است (14، 15، 16و 17). تحقیقات نشان داده است که در محیط کشت دارای اکسین و فاقد سیتوکینین، کالوس تولید می‏گردد اما بدون حضور اکسین کالوس تولید نمی‏شود (18). در لپه‎های گیاه گردو نیز بدون وجود اکسین در محیط کشت، کالوس تولید نمی‎گردد (19). معمولا محیط کشت حاوی 2,4-D به‏تنهایی نیز برای تولید کالوس موثر نیست و بهترین کالوس‏زایی در محیط کشت با ترکیب 2,4-D و Kin mg/L) 1:mg/L 5-1) مشاهده شده است و تشکیل کالوس ترد و تازه در دوره زمانی کوتاه 20 تا 25 روز شروع می‏شود (20). تحقیقات در گیاه داوودی نشان داد که افزایش تراکم Kin و 2,4-D در حد 1 میلی‎گرم در لیتر تولید کالوس را افزایش داده است (21). در گیاه Stevia rebaudiana با اضافه‎کردن بنزیل آدنین به محیط کشت‎های حاوی اکسین تولید کالوس افزایش پیدا کرد (14). همچنین گزارش شده‎است که جنس داتوره جهت تولید کالوس به حضور هم‎زمان اکسین و سیتوکینین نیازمند است (22). بنابراین میزان تولید کالوس بستگی به ترکیب هورمون‎های رشد به‎کار رفته در محیط کشت دارد و تعادل بین هورمون‎‎های اکسین و سیتوکینین یک فاکتور مورفوژنتیکی تعیین‎کننده و مهم به‎شمار می‎رود (23). همچنین گزارش شده ‎است که ترکیب هورمون 2,4-D و سیتوکینین در تسهیل القای کالوس و حفظ آن موثر است (17). در گیاه Allium chinense مشخص شد که بیشترین میزان تولید کالوس در محیط کشت همراه با هورمون‎های 2,4-D و BA (mg/L) 1:mg/L 1) بوده و با افزایش غلظت اکسین و یا سیتوکینین اثرات عکسی مشاهده گردید (24). نتایج پژوهش‎های انجام شده جهت تولید کالوس از گیاه Paspallum vaginatum نیز نشان داد که نوع و غلظت تنظیم‎کننده‎های رشد مانند اکسین و سیتوکینین به‎عنوان اجزا حیاتی در القای کالوس و باززایی گیاه هستند (9). ‍

بافت کالوس‎های حاصل از ریشه در تمام محیط‎کشت‎های مورد استفاده نرم بود و بسته به محیط کشت مورد استفاده کالوس‎های حاصل از ریشه رنگ کرم روشن و کرم سبز را نشان دادند (شکل C1، جدول 2). رنگ و بافت کالوس‎های حاصل از جداکشت‎های ساقه و برگ نیز بسته به هورمون‎های مورد استفاده متفاوت بودند، بنابراین درصد کشت‏های نمویافته به کالوس، بافت، رنگ و درجه تشکیل کالوس به ترکیبات محیط کشت وابسته است (17).

بنابر نتایج حاصله از این تحقیق نوع جداکشت در تولید کالوس بسیار موثر می‎باشد. به طور مشابه اثر نوع جداکشت در تولید کالوس توسط محققین دیگر به اثبات رسیده است، به طوری‎که در گونه Salsola pestifer تولید کالوس از جداکشت‎های ساقه نسبت به جداکشت برگ‎ بهتر انجام گرفت در حالی‎که جداکشت‎های برگ از گونه Salsola lanata در تشکیل کالوس مناسب‎تر بودند (6). انتخاب یک ریزنمونه در مرحله رشد مطلوب نقش اساسی در موفقیت‎آمیز بودن کشت بافت در شرایط در شیشه بازی می‎کند. پیچیدگی مورفولوژیکی یک ریزنمونه به‎همراه انتخاب تنظیم‎کننده‎های رشد گیاهی مناسب تاثیر چشمگیری بر القا کالوس و باززایی نوساقه‎ها دارد (25)، هرچند که سن گیاهچه و نحوه قرارگرفتن آن‎ها روی محیط کشت نیز در برخی از گیاهان حائز اهمیت است (9).

در تمام محیط کشت‎های بررسی شده در این تحقیق میزان تولید کالوس حاصل از جداکشت ریشه نسبت به جداکشت برگ بیشتر بود اما در محیط کشت‎های با ترکیبmg/L)  5/0) mg/L) + Kin 1) MS + 2,4-D وmg/L)  5/0) mg/L) + Kin 5/0) MS + 2,4-D میزان تولید کالوس حاصل از جداکشت برگ نسبت به ریشه بیشتر گزارش شد.

داده‎های به‎دست آمده برای ریزنمونه‎های مختلف در واکنش به کالوس‎زایی نشان داد که بسته به نوع ریزنمونه، غلظت تنظیم‎کننده‎های رشد گیاهی تغییر کرده و این امر تفاوت چشمگیری در روند کالوس‎زایی و باززایی نوساقه‎ها اعمال می‎کند. در این رابطه مطالعات متعددی وجود دارند که صحت این نتیجه را تایید می‎کنند (26، 27 و 28).

نتایج حاصل از این بررسی نشان داد که با وجود عدم تولید کالوس در محیط کشت mg/L Kin 5/0MS + وmg/L Kin  1MS +، جداکشت ساقه در این محیط کشت‎ها باززایی مستقیم را نشان داد. محیط کشت mg/L Kin 5/0MS + نسبت به mg/L Kin  1MS + در باززایی مستقیم کارایی بیشتری را نشان داد. در بقیه محیط کشت‎ها باززایی مستقیم مشاهده نشد. سیتوکینین‎ها به‎عنوان مهم‎ترین فاکتور موثر در باززایی ساقه به اثبات رسیده‎اند و اثرات چشمگیر آن‎ها شاید با تغییرات بافت‎شناسی در بافت‎های القا شده مرتبط باشد (9). در گیاه Taxus wallichiana گزارش شده است که با افزایش سیتوکینین و کاهش اکسین، باززایی افزایش می‏یابد (29). این نتایج در گیاه هالوفیت Leymus chinensis نیز به اثبات رسید (30). غلظت‏های‏ کم سیتوکینین در داوودی می‏تواند درصد جوانه‏زنی از برگ را افزایش دهد (31). بررسی‏ها نشان می‏دهد حذف اکسین از محیط کشت پیش‏نیاز خاموش شدن چند ژن و یا سنتز محصولات جدید ژنی می‏باشد که برای نمو رویان لازم است (21). همچنین نوع و غلظت سیتوکینین بکاررفته بطور چشمگیری باززایی ساقه را در ژنوتیپ‏های متفاوت سیب تحت تاثیر قرار می‏دهد (8). در گیاه Passiflora suberosa استفاده از هورمون بنزیل آدنین میزان باززایی از این گیاه را افزایش داد (32). در گونه‎ای دیگر از این گیاه نیز استفاده از سیتوکینین جهت افزایش باززایی بخوبی به اثبات رسید و نتایج نشان داد که توازن هورمونی لازم جهت فرآیند تمایز به میزان اکسین‎های داخلی در بافت‎ وابسته است (33). بنابراین اندام‎زایی در شرایط در شیشه به استفاده از هورمون‎های گیاهی و همچنین به توانایی بافت‎ها برای پاسخ به این تغییرات هورمونی در طول کشت وابسته است (34). به‎طورکلی کنترل فرایندهای تمایزیابی بستگی به حضور اکسین و سیتوکینین داشته و توازن بین آن‏‏ها تولید اندام هوایی و ریشه‏ها را از کالوس سبب می‏شود. گرچه میزان تنظیم کننده‏های خارجی به‏شدت به ژنوتیپ و مقدار هورمون داخلی گیاه بستگی دارد (35).

 

نتیجهگیری

نتایج حاصله بیانگر این مطلب است که محیط کشت mg/L) 1) mg/L) + Kin 1) MS + 2,4-D، بهترین محیط کشت جهت القای کالوس بوده و با وجود تولید کالوس در محیط کشت حاوی فقط هورمون 2,4-D ، ترکیب دو هورمون اکسین و سیتوکینین میزان تولید کالوس را افزایش داد. جداکشت ریشه نیز جهت تولید کالوس بهترین جداکشت شناخته شد. باززایی مستقیم از میانگره و فقط در محیط کشت mg/L Kin 5/0MS + وmg/L Kin  1MS + رخ داد. بنابراین نتیجه‎گیری می‎شود که بهترین محیط کشت جهت باززایی این گیاه محیط فاقد اکسین بوده و تنها جداکشت نشان دهنده باززایی نیز ساقه می‎باشد.

تشکر و قدردانی

از حوزه معاونت محترم پژوهش و فناوری دانشگاه اراک که حمایت مالی این تحقیق را به‎عهده داشتند صمیمانه تشکر و قدردانی می‎شود. نویسندگان مقاله از قطب تنش‎های گیاهی دانشگاه اصفهان نیز تشکر می نمایند.

  1. Heidari-Sharifabadi H, Mirzaie-Nodoushan H. Salinity-induced growth and some metabolic changes in three Salsola species. J. Arid Environ. 2006; 67: 715–720.
  2. Malcolm CV, Lindley VA, O’Leary JW, Runciman HV, et al., Halophyte and glycophyte salt tolerance at germination and the establishment of halophyte shrubs in saline environments. Plant Soil. 2003; 253: 171–185.
  3. Mudgal V, Madaan N, Mudgal A. biochemical mechanism of salt tolerance in plants: a review. Int. J. Botany. 2010; 6(2): 136-143
  4. Ryan FJ, Mosyakin SL, Pitcairin MJ. Molecular comparisons of Salsola tragus from California and Ukraine. Canadian J. Botany. 2007; 85(2): 224-229.
  5. Kaufman TS. Synthetic pathways to salsolidine. Asymmetry. 2004; 15: 1203–1237.
  6. Stefaniak B, Wozny A, Li V. Plant micropropagation and callus induction of some annual Salsola species. Biologia plantarum. 2003; 46(2): 305-308.
  7. Han Y, Jin X, Wu F, Zhang G. Genotypic differences in callus induction and plant regeneration from mature embryos of barley (Hordeum vulgare L.). JZUS. 2011; 12(5): 399-407.
  8. Magyar-Tabori K, Dobranszki J, Teixeira da, Silva JA, et al. The role of cytokinins in shoot organogenesis in apple. Plant Cell Tiss Organ Cult. 2010; 101: 251–267.
  9. Neibaur I, Gallo M, Altpeter F. The effect of auxin type and cytokinin concentration on callus induction and plant regeneration frequency from immature inflorescence segments of seashore paspalum (Paspalum vaginatum Swartz). In Vitro Cell Dev Biol-Plant. 2008; 44(6): 480-486.

10. Gao HB, Zeng YL, Zhang FC. Callus induction, differentiation and establishment of plantlet regeneration system of Salsola ferganica. J. Wuhan Bot. Res. 2008; 26(6): 634-638.

11. Wei Y, Dong M, Huang Z, Tan D. Factors influencing seed germination of Salsola affinis (Chenopodiaceaea dominant annual halophyte)

 

inhabiting the deserts of Xinjiang. China. Flora. 2008; 203(2): 134–140.

12. Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tabacco tissue cultures. Plant Physiol. 1962; 15: 473-479.

13. Ajmal Khan M, Gul B, Weber DJ. Seed germination in the Great Basin halophyte Salsola iberica. Canadian J. Bot. 2002; 80: 650–655.

14. Ahmad N, Fazal H, Zamir R. Callogenesis and shoot organogenesis from flowers of Stevia rebaudiana (Bert.). Sugar Tech. 2011; 13(2): 174-177.

15. Jayasree T, Pavan U, Ramesh M, Rao AV, et al. Somatic embryogenesis from leaf culture of potato. Plant Cell Tiss Organ Cult. 2001; 64: 13-17.

16. Yasmin S, Nasiruddin KM, Begum R, Talukder SK. Regeneration and establishment of potato plantlets through callus formation with BAP and NAA. Asian J. Plant Sci. 2003; 2(12): 936-940.

17. Abd Elaleem KG, Modawi RS, Khalafalla MM. Effect of plant growth regulators on callus induction and plant regeneration in tuber segment culture of potato (Solanum tuberosum L.) cultivar Diamant. African J. Biotech. 2009; 8 (11): 2529-2534.

18. Hohtola A. Seasonal changes in explant viability and contamination of tissue culture from mature scot pine. Plant Cell Tiss Organ Cult. 1988; 15: 211-222.

19. Rodriguez R. Callus initiation and root formation from in vitro culture of walnut cotyledon. Hort sci. 1982; 17(2): 195-196.

20. Roy A, Ghosh S, Chaudhuri M, Saha PK. Effect of different plant hormones on callus induction in Gymnema sylvestris R.BR. (Asclepiadaceae). African J. Biotech. 2008; 7(13) 2209-2211.

21. Shinoyama H, Nomura Y, Tsuchiya T, Kazuma T. A simple and efficient method for somatic embryogenesis and plant regeneration from leaves of Chrysanthemum (dendranthema× grandiflorum (Ramat.) Kitamura). Plant Bio Tech. 2004; 21(1): 25-33.

22. Dessouky M, Taha H, El-Bahr M. Enhancement of alkaloids production in suspension cultures of Datura stramonium L. and Datura metel L. Biotech. 2001; 4: 23-30.

23. Abbasi B, Saxena PK, Murch SJ, Liu CZ. Echinacea biotechnology: Challenges and opportunities. In Vitro Cell. Dev. Biol-Plant. 2007; 43: 481-492.

24. Yan MM, Xu C, Kim CH, Um YC, et al. Effects of explant type, culture media and growth regulators on callus induction and plant regeneration of Chines jiaotou (Allium Chinense). Scientia Hort. 2009; 123: 124-128.

25. Khawar KM, Sarýhan E, Sevimay C, Cocu S, et al. Adventitious shoot regeneration and micropropagation of Plantago lanceolata L. Period Biol. 2005; 107: 113-116.

26. Mandal AKH, Gupta SD. Direct shoot organogenesis and plant regeneration in safflower. In Vitro Cell. Dev. Bio-Plant. 2001; 37: 50-54.

27. Sujatha M, Dinesh Kumar V. In vitro bud regeneration of Carthamus tinctorius and wild Carthamus species from leaf explants and axillary bud. Biologia Plantarum. 2007; 51(4): 782-786.

28. Basalma D, Uranbey S, Mirici S, Kolsarici O. TDZ×IBA induced shoot regeneration from cotyledonary leaves and in vitro multiplication in safflower (Carthamus tinctorius L.). African J. Biotech. 2008; 7(8): 960-966.

29. Datta MM, Jha S. Embryo culture of Taxus wallichiana (Zucc.). J. Plant Biotech. 2004; 6(4): 213-219.

30. Sun YL, Hong SK. Effects of plant growth regulators and L-glutamic acid on shoot organogenesis in the halophyte Leymus chinensis (Trin.). Plant Cell Tiss Organ Cult. 2010; 100: 317-328.

31. Rout G, Mohapatra A, Mohan S, Tissue culture of ornamental pot plant: A critical review on present scenario and future prospects. Biotech. Advance. 2006; 24: 531-560.

32. Garcia R, Pacheco G, Falcao E, Borges G, et al. Influence of type explant, plant regulators, salt composition of basal medium, and light on callogenesis in Passiflora subersoa L. (Passifloraceae). Plant Cell Tiss Organ Cult. 2011; 106: 47-45.

33. Lombardi SP, Passos IRS, Nogueira MCS, Appezzato-da-Gloria B. In vitro shoot regeneration from root and leaf discs of Passiflora cincinnata Mast. Braz Arch Bio Technol. 2007; 50: 239-247.

34. Akbas F, Isikalan C, Namli S. Callus induction and plant regeneration from different explants of Actinidia deliciosa. Appl Biochem Biotechnol. 2009; 158: 470-475.

Bhaskaran S, Smith RH. Regeneration in cereal tissue culture: A review. Crop Sci. 1990; 30: 1329–1336