افزایش تولید متابولیت‎های ثانوی گیاهی با استفاده از الیسیتورهای زیستی

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

-

چکیده

گیاهان گروه بزرگ و متنوعی از ترکیبات آلی به‎نام متابولیت‎های ثانوی را تولید می‎کنند که توسط انسان به‌‎عنوان ترکیب دارویی مصرف می‌شوند. طبق برآوردهای صورت گرفته در سال‌های اخیر، ارزش بازارهای جهانی داروهای گیاهی که شامل گیاهان دارویی و فرآورده‌های آن‎هاست، همواره با رشد قابل توجهی رو به افزایش بوده است. با توجه به اینکه بخش اعظم بازار گیاهان دارویی دنیا، به تولید و عرضه متابولیت‌های ثانوی مشتق از این گیاهان مربوط می‌شود، لذا متابولیت‌‌های ثانوی گیاهی از ارزش اقتصادی و همچنین ارزش افزوده بسیار بالایی برخوردار هستند و سنتز شیمیایی این متابولیت‎ها معمولا پیچیده و پرهزینه می‎باشد. بنابراین تولید متابولیت‎ها با روش‎های مختلف زیست فناوری از جمله کشت سلولی گیاه، راه جایگزین سودمندی است. دست ورزی محیط‎های کشت سلولی با استفاده از الیسیتورهای زیستی یکی از راهکارهای مهم جهت القای متابولیسم ثانوی و افزایش تولید متابولیت‎های ارزشمند می‎باشد. الیسیتورهای زیستی از طریق فعال کردن مکانیسم‎های دفاعی باعث القای تشکیل متابولیت‎های ثانوی و پاسخ های فوق حساسیتی می‎شوند. تشخیص مولکولی و برهمکنش بین الیسیتور و گیرنده‎های گیاه فرایند پیچیده ای است که برای انتقال پیام الیسیتور ضروری است. به‎دنبال درک الیسیتور پاسخ‎های دفاعی سریع در سلول گیاهی نظیر افزایش جریانات یونی از عرض غشای پلاسمایی، تولید انواع اکسیژن واکنش‎گر (ROS)، فعال سازی ژن‎های مربوط به دفاع، تغییرات ساختاری در دیواره سلولی و سنتز فیتوآلکسینها اتفاق می‎افتد. در این مطالعه جنبه های مختلف امکان افزایش تولید متابولیت‎های ثانوی در کشت سلول گیاهان با استفاده از الیسیتورهای زیستی مورد بررسی قرار گرفته است.    

کلیدواژه‌ها


مقدمه

گیاهان منبع بسیاری از مواد شیمیایی هستند که به‌عنوان ترکیب دارویی مصرف می‌شوند. فرآورده‌های حاصل از متابولیسم ثانوی گیاهی جز گرانبهاترین ترکیبات شیمیایی گیاهی می‎باشند. شناخت گیاهان دارویی و استفاده از آن‎ها از قدیم مورد توجه محققین کشور ما قرار گرفته است. شناسایی و بررسی ترکیبات شیمیایی آن‎ها، نه تنها به درمان آسان تر و ارزان تر بیماری‎ها کمک می نماید، بلکه از خارج شدن بخشی از ثروت کشور نیز برای وارد ساختن این گونه کالاها یا فرآورده‎های آن‎ها، جلوگیری به عمل می‎آید.

گیاهان گروه بزرگ و متنوعی از ترکیبات آلی به نام متابولیت‎های ثانوی را تولید می‎کنند که پراکنش محدودی در سلسله گیاهان دارند و میزان آن‎ها اغلب کم (کمتر از یک درصد وزن خشک) می‎باشد. این ترکیبات معمولا دارای وزن مولکولی پایینی (کمتر از 150 کیلودالتون) هستند و تاکنون بیش از 100000 متابولیت ثانوی شناسایی شده‎اند و هنوز هم تعداد بیشتری در حال اضافه شدن و بررسی هستند (1). متابولیت‎های ثانوی منحصر به گونه یا حتی نژاد و اغلب در طی یک دوره رشد و نموی خاص در گیاه تولید می‎شوند. متابولیت‎های ثانوی دارای عمل‎کردهای اکولوژیکی مهم در گیاهان هستند. این دسته از ترکیبات، در حفاظت گیاهان مقابل گیاهخواران و عوامل بیماریزای میکروبی، به عنوان جذب گرده افشان‎ها و جانوران منتشر کننده بذر، رقابت گیاه با گیاه و همزیستی گیاه با میکروب نقش دارند (2). متابولیت‎های ثانوی به عنوان دارو، علف کش‎های زیستی، عوامل طعم دهنده، رنگ‎های طبیعی، سم‎ها، مواد توهم زا (مانند کوکائین، هروئین، مورفین) و عطرها، آن‎ها را برای استفاده در زیست فناوری مورد توجه ساخته است (3). یکی از روش‎هایی که امروزه بیش از هر موضوع دیگر در زمینه بررسی متابولیت‎های گیاهی مورد توجه قرار دارد، روش کشت اندام، بافت و سلول گیاهی است (4). محققین با استفاده از این روش سعی می‎کنند تا شواهد بیشتری در رابطه با چگونگی بیوسنتز متابولیت ها و نیز مکانیسم تنظیمی آن به‎دست آورند و با این روش‎ها توانسته‎اند تولید متابولیت های ثانوی با ارزش در گیاهان را افزایش دهند. روش‎های مختلفی به منظور افزایش تولید متابولیت‎های ثانوی در کشت سلول گیاهی استفاده می‎شود که شامل استفاده از الیسیتورها، افزودن پیش سازها، بهینه سازی محیط کشت، کشت ریشه‎های موئین و مهندسی متابولیت می‎باشد (5). استفاده از الیسیتورها یکی از مهم‎ترین روش‎ها برای افزایش تولید متابولیت‎های ثانوی است. الیسیتورها مواد شیمیایی یا عوامل زیستی مختلفی هستند که می‎توانند تغییرات فیزیولوژیکی و تجمع فیتوآلکسین (phytoalexin) را القا کنند (6). الیسیتورهای زیستی به طور کارآمدی برای افزایش تولید متابولیت‎های ثانوی در کشت سلول گیاهان دارویی زیادی به کار رفته‎اند. در این مقاله افزایش تولید برخی متابولیت‎های ثانوی در کشت سلول گیاهی با استفاده از الیسیتورهای زیستی مورد بررسی قرار می‎گیرد.

پیش مادههای ساختاری متابولیت های ثانوی: پیش ماده‎های ساختاری متابولیت‎های ثانوی از متابولیت‎های اولیه حاصل می‎شوند. مسیرهای اصلی متابولیت‎های ثانوی در گیاه و ارتباط آن‎ها با متابولیسم اولیه به صورت شماتیک در شکل 1 نشان داده شده است (2). به استثنای فرایندهای اولیه بیوسنتز قند و آمینواسید، سه مسیر اصلی بیوسنتز متابولیت‎های ثانوی شامل مسیرهای استات – مالونات، استات – موالونات و اسید شیکمیک می‎باشد (7). متابولیت‎های ثانوی گیاهان معمولا بر اساس مسیر متابولیسمی آن‎ها طبقه‎بندی می‎‌شوند (8). معمولا متابولیت‎های ثانوی در سه خانواده مولکولی بزرگ، گروه ترکیبات نیتروژن دار، ترپن‎ها و فنول‎ها در نظر گرفته می‌شوند (9). گروه‎های مختلف متابولیت‎های ثانوی، منابع و فعالیت‎های زیستی این ترکیبات در جدول 1 نشان داده شده است. در ساختمان بسیاری از متابولیت‎های ثانوی گیاهان، ازت وجود دارد. ترکیباتی که در این گروه قرار دارند ترکیبات دفاعی ضد گیاهخواران هستند که آلکالوئید ها و گلیکوزیدهای سیانوژنی در این دسته از این ترکیبات قرار می‎گیرند. این ترکیبات به علت ایجاد مسمومیت در انسان و خواص دارویی به شدت مورد توجه قرار گرفته اند. بیشتر متابولیت‎های ثانوی نیتروژن دار از آمینو اسیدهای مشترکی ساخته می‎شوند (10).  آلکالوئیدها یک گروه متنوع از ترکیبات نیتروژن‎دار با وزن مولکولی کم هستند. تعداد آلکالوئید‌های شناخته شده حدود 15000 ذکر شده است و به طور تقریبی در 20 درصد از گیاهان آوندی یافت می‌شوند (11). آلکالوئیدها را بر اساس منبع، پاسخ‎های فیزیولوژیکی و پیش ماده‎های بیوسنتزی (از آمینو اسید مشتق شده باشند و یا حلقه هتروسایکلیک و یا هر دو) نام‎گذاری می کنند که شامل 1- آلکالوئیدهای بدون حلقه هتروسایکلیک و 2- آلکالوئیدهای دارای حلقه هتروسایکلیک می‎باشند. آلکالوئید‌های دارای حلقه هتروسایکلیک به عنوان متابولیت ثانوی نقش دفاعی در حفاظت گیاه در برابر علفخواران و عوامل بیماری زا به عهده دارند که خود این گروه بر اساس نوع حلقه به زیر گروه‎های مختلف تقسیم می شود. به نظر می‌آید که بیشتر آلکالوئیدها علاوه بر نقش زیستی، نقش داروئی، تحریک کننده و سمی دارند (12).


 

 

شکل 1: مسیرهای اصلی بیوسنتز متابولیتهای ثانوی و ارتباط آنها با متابولیسم اولیه (Wink, 2010).

G3P: Glyceraldehyde 3-phosphate; VOC: Volatile Organic Compounds;  2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate/1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate pathway (MEP/DOXP pathway).

 

 

جدول 1: گروه­های مختلف متابولیت‎های ثانوی، منابع و عملکردهای زیستی آن‎ها (برگرفته از (Saufi, 2007

گروه

واحد ساختمانی

منابع گیاهی

فعالیت زیستی

آلکالوئیدها

استات

آمینواسید

ترپنوئید

کلسترول

گیاهان، جلبک­ها،

قارچ­ها، باکتری­ها

منبع نیتروژن، سمیت­زدا، بازدارنده، آللوشیمی

ترپنوئیدها

ایزوپرن

گیاهان، قارچ­ها،

باکتری­های روده­ای

ضد میکروبی

فلاونوئیدها

مالونیل COA

سینامیل  COA

فنیل­پروپانوئید

بازدانگان، نهاندانگان، خزه­ها، باکتریها، سرخس­ها، جلبک­ها

آنتی بیوتیک،

رنگیزه

جذب کننده نور

لیگنین

فنیل پروپانوئیدها

بازدانگان، نهاندانگان، سرخس­ها

 

حفاظت ساختاری

سد دفاعی

لیگنان ها

فنیل پروپانوئیدها

بازدانگان، نهاندانگان، سرخس­ها

 

فیتوآلکسین، ضد قارچی، ضد میکروبی، ضد ویروسی

 


گروه دیگر یعنی ترپن‎ها یا ترپنوئیدها بزرگترین گروه متابولیت ثانوی را در گیاهان شامل می شوند. ترکیبات متنوع این گروه معمولا در آب غیرمحلول بوده و کلیه ترپن‎ها از واحد های 5 کربنی ایزوپرن (2 و 5 بوتا دی ان )، مشتق می شوند (13). ترپن‎ها بر اساس تعداد واحدهای 5 کربنه‎ای که دارند طبقه بندی می‎شوند. ترپن‎های ده کربنی که شامل دو واحد ایزوپرن هستند، مونوترپن نامیده می‎شوند که از مشتقات مونوترپنی میتوان لیمونن، کامفور، لینالول و ژرانیول را نام برد. ترپن­های 15 کربنی، سزکوئی­ترپن­ها و ترپن­های 20 کربنه، دی­ترپن نامیده می­شوند. ترپن­های طویل­تر شامل تری­ترپن­ها، تتراترپن­ها و پلی­ترپنوئیدها می­باشند (10). بیوسنتز ترپن­ها، از استیل کوآنزیمA  و از طریق مسیر موالونیک اسید صورت می­گیرد. بیشتر ترپن­ها اعمال مشخصی در رشد و نمو گیاه به عهده دارند. به عنوان مثال پیش­ماده آبسیزیک اسید، یک سزکوئی­ترپن است. استروئیدها، مشتقات تری­ترپن­ها بوده و از اجزای ضروری غشای پلاسمایی به حساب می­آیند. بنابراین بعضی از ترپن­ها نقش­های اولیه مهمی در گیاه به عهده دارند، هر چند که قسمت عمده ترپن­های گیاهی، جز متابولیت ثانوی بوده و در سیستم دفاعی گیاه دخیل هستند. برخی از گیاهان دارای مخلوطی از مونوترپن­ها و سزکوئی­ترپن­های فرار می‎باشند که روغن­های فرار یا اسانس نامیده می‎شود (10 و 13). گروه آخر فنیل­پروپانوئیدها، مولکول­های کوچک فنلی هستند که دارای یک حلقه فنیلی و یک زنجیره سه کربنی هستند. این ترکیبات از مسیر بزرگ فنیل­پروپانوئیدی سنتر می­شوند (14)، عامل طعم، بو و مزه در اسانس هستند و نقش­های متفاوتی را در گیاهان بازی می­کنند. بسیاری از آن‎ها در دفاع بر علیه گیاهخواران و عوامل بیماری­زا نقش دارند و یا در حفاظت مکانیکی، در جذب عوامل گرده افشان و پراکنده کردن میوه یا در کاهش رشد گیاهان رقیب دخالت دارند (10). این ترکیبات در شرایط تنش در گیاه تولید می­شوند. عوامل تنش­زایی که محرک تولید فنیل­پروپانوئیدها هستند شامل کمبود آهن، نیترات و فسفات خاک، دمای پایین، عومل بیماری­زا، زخمی شدن گیاه و اشعه فرابنفش می­باشند (15). همچنین فاکتورهای رونویسی مانند R2R3-MYB در افزایش تولید ترکیبات فنیل­پروپانوئیدی دخالت دارند (16). مسیر بیوسنتز فنیل­پروپانوئیدها مسئول فراهم کردن پیش ماده‏های لازم برای سنتز لیگنین، لیگنان­ها، فلاوونوئیدها و برخی ترکیبات دیگر می­باشند. مسیر اصلی بیوسنتز فنیل­پروپانوئیدها، از مسیر شیکمیک اسید (مسیر بیوسنتزی آمینو­اسید­های حلقوی مانند فنیل آلانین و تیروزین) و مسیر مالونیک ­اسید شروع میشود. در ساخت بیشتر ترکیبات فنلی در گیاه مسیر شیکمیک اهمیت دارد. این در حالی است که مسیر مالونیک­اسید در ساخت محصولات فنلی در باکتری­ها و قارچ­ها اهمیت دارد (11). فنیل آلانین آمونیا لیاز (PAL) آنزیم حدواسط بین متابولیسم اولیه و ثانوی در گیاهان است. آنزیم PAL اولین آنزیم کلیدی و تعیین کننده در ابتدای مسیر تولید فنیل پروپانوئیدها است و عمل اصلی آن دآمینه کردن غیراکسیداتیو آمینواسید L-فنیل آلانین و تبدیل آن به یون آمونیوم و ترانس سینامیک اسید می‎باشد. سینامیک اسید به عنوان ماده اولیه، در مسیرهای بیوسنتزی متفاوتی مصرف می‎شود. در ادامه مسیر با فعالیت آنزیم‎های سینامات 4-هیدروکسیلاز (C4H)، 4-کومارات-کوآ لیگاز (4CL) و سینامول کوآ ردوکتاز (CCR)، متابولیت‎های دیگری از جمله p-کومارآلدئید، کونیفرآلدهید و سیناپالدئید تولید می‎شود که این ترکیبات توسط سینامیل الکل دهیدروژناز (CAD) به فرم الکلی خود تبدیل می‎شوند. این ترکیبات زیر واحدهای سازنده انواع فلاونوئیدها و لیگنان‎ها و لیگنین هستند (17 و 18). 

کشت بافت و استفاده آن در بررسی متابولیتهای گیاهی: در زیست فناوری همواره بر بررسی مسیرهای جایگزین برای تولید ترکیبات طبیعی توجه می‎شود. یکی از روش­هایی که امروزه بیش از هر موضوع دیگر در زمینه بررسی متابولیت‎های گیاهی مورد توجه قرار دارد، روش کشت اندام، بافت و سلول گیاهی است. ازلحاظ تاریخی، اگرچه " کشت بافت " برای اولین بار، در سال‌های 1940-1939 در مورد گیاهان به‌کار گرفته‌ شد، ولی در سال 1956 بود که یک شرکت دارویی در کشور آمریکا (Pfizer Inc) اولین اختراع ثبت شده را در مورد تولید متابولیت‌ها با استفاده از کشت توده‌ای سلول‌ها منتشر کرد. در سال‎های 1967-1968 نیز دانشمندان توانستند مقادیر بیشتری از ترکیبات ویسناجین (visnagin)و دیوسجنین (diosgenin) را با استفاده از کشت بافت نسبت به حالت طبیعی (استخراج از گیاه کامل) به‌‌دست آورند. کشت سلول گیاهی یک منبع مناسب و مهم برای تولید متابولیت‎های ثانوی با ارزش می‎باشد. یکی از مزیت‎های روش کشت سلول مستقل بودن از تغییرات جغرافیایی و عوامل محیطی و در عین حال با سرعت بالای رشد می‎باشد. در این روش ممکن است ترکیبات جدیدی تولید شود که در شرایط طبیعی در گیاه مادری وجود نداشته باشند. محققین با استفاده از این روش سعی می­کنند تا شواهد بیشتری در رابطه با چگونگی بیوسنتز آن‎ها و نیز مکانیسم تنظیمی آن به‎دست آورند و با این روش‎ها توانسته­اند تولید متابولیت‎های ثانوی با ارزش در گیاهان را افزایش دهند (19). با توجه به اهمیت اقتصادی متابولیتهای ثانوی و نیز محدود بودن گونه های گیاهی در رویشگاهای طبیعی آن‎ها، روش کشت سلول راه مناسبی برای تولید ترکیبات شیمیایی ارزشمند می‎باشد (20). پیشرفت در زمینه زیست فناوری گیاهی امکان تولید متابولیت‎های ثانوی مهم مانند آلکالوئیدها، ترپنوئیدها، لیگنان‎ها را فراهم کرده است. تولید متابولیت‎های گیاهی با ارزش، در ابتدا از طریق کشت سلول، بافت و اندام گیاهی و همچنین کشت ریشه‎های موئین، ازنظر تجاری موفقیت آمیز نبود اما امروزه محققین با بکار بردن روش هایی که به نوعی موجب تحریک مسیر بیوسنتزی این ترکیبات می‎شوند به موفقیت های قابل توجهی دست یافته‎اند. یکی از این روش‎ها که به منظور افزایش تولید متابولیت‎های ثانوی در کشت درون شیشه (in vitro) به کار می‎رود، استفاده از الیسیتورهای زیستی می‎باشد.

الیسیتورهای زیستی: الیسیتورها ترکیباتی با منشا زیستی و یا غیر زیستی هستند که از طریق القای پاسخ‎های دفاعی باعث بیوسنتز و انباشت متابولیت‎های ثانوی می‎شوند (6). الیسیتورهای زیستی شامل پلی‎ساکاریدها، پروتئین ها، گلیکوپروتئین ها و یا قطعات دیواره سلول قارچ‎ها، گیاهان (سلولز و پکتین) و میکرو‎ارگانیسم ها (کیتین و گلوکان) می باشد (21). الیسیتورهای زیستی ممکن است دارای ترکیب مشخص باشند مانند کیتین و کیتوزان و یا مانند همگنای قارچ و عصاره مخمر مجموعه‎ای از ترکیبات زیستی باشند.

به طور کلی استفاده از الیسیتورها در مطالعات مربوط به زیست فناوری متابولیت‎های گیاهی دو هدف اصلی را دنبال می کند: 1- به دست آوردن اطلاعاتی در زمینه مسیرهای بیوسنتزی که منجر به تشکیل و تنظیم متابولیت‎های ثانوی می‎شود. 2- افزایش تولید متابولیت‎های ثانوی برای کاربرد تجاری (22). در این میان، الیسیتورهای قارچی به طور گسترده به منظور تولید متابولیت‎های ثانوی در کشت سلول گیاهان به کار گرفته می‎شوند و در تحریک تولید بسیاری از متابولیت‎های ثانوی مانند ترپنوئیدها، مشتقات کومارین، آلکالوئیدها، فلاونوئیدها موثر می‎باشند (23 و 24). کیتین و کیتوزان (ترکیبی مشابه کیتین بدون بنیان‎های استیل) از ترکیبات اصلی دیواره سلول بسیاری از گونه های قارچی می‎باشند. کیتوزان، یک پلی‎ساکارید پلی‎کاتیونی، به عنوان یکی از الیسیتورهای زیستی کارآمد برای بهبود بخشیدن تولید متابولیتهای ثانوی در کشت سلول گیاهان دارویی زیادی تایید شده است (25). الیسیتورهای غیر زیستی یا عوامل تنشی مانند اشعه ماورا بنفش، نمک فلزات سنگین و بعضی از ترکیبات شیمیایی با مکانیسم‎های عمل متفاوت (مانند: جاسمونیک اسید، سالیسیلیک اسید، نیترات و..) نیز به منظور افزایش تولید این ترکیبات درکشت بافت مورد بررسی قرار گرفته‎اند. به‎عنوان مثال سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات بیوسنتز بسیاری از متابولیت های ثانوی از جمله اندول آلکالوئیدها، سزکوئی ترپن‎ها و فنل‎ها را تحریک می‎کند (26 و 27). الیسیتورها بر اساس برهم‎کنش الیسیتور-گیاه به دو گروه الیسیتورهای عمومی و الیسیتورهای ویژه نژادی تقسیم بندی می‎شوند. الیسیتورهای عمومی باعث القای پاسخ های دفاعی در هر دو گیاهان میزبان و غیر میزبان می شوند در حالی‎که الیسیتورهای ویژه نژادی پاسخ‎های دفاعی مقاومت به بیماری را تنها در میزبان های ویژه بسته به حضور هم‎زمان ژن‎های غیر بیماری­زا (avr)( avirulence) در پاتوژن و ژنهای مقاومت (R)(Resistance) در گیاه القا می کنند (28). در طبیعت گیاهان به حمله پاتوژن‎ها، حشرات، علفخواران و دیگر تنش‎های زیستی و غیر زیستی از طریق فعال کردن مکانیسم‎های دفاعی شامل القای تشکیل متابولیت‎های ثانوی نظیر فیتوالکسین‎ها، پاسخ های فوق حساسیتی و سدهای دفاعی ساختاری مانند رسوب لیگنین در دیواره سلول پاسخ می‎دهند (21). الیسیتورها ممکن است ژن های جدیدی را فعال کنند که آنزیم‎ها و در نهایت مسیرهای بیوسنتزی مختلفی را راه اندازی کنند و باعث تشکیل متابولیت‎های ثانوی شوند (28 و 29). شروع پاسخ­های دفاعی در گیاه شبکه‎ای از ترارسانی علامت (signal transduction) را القا می‎کند که با تشخیص مولکول‎های الیسیتور توسط پذیرنده‎ها شروع می‎شود. از مهم‎ترین ترکیباتی که باعث القا تعداد زیادی از ژن های وابسته به دفاع می‎شود تنظیم کننده‎های جاسمونات، اتیلن و سالسیلیک اسید می‎باشند (30).

اثرات الیسیتورهای زیستی در سلولهای گیاهی: مکانیسم اثر الیسیتورهای زیستی بر تولید متابولیت‎های ثانوی در گیاه به خوبی شناخته نشده است. مکانیسم اثر الیسیتورهای زیستی در گیاه بر اساس برهم‎کنش الیسیتور-گیرنده خلاصه می‎شود. هنگامی که گیاه یا کشت سلول تحت تاثیر الیسیتور قرار می‎گیرند پاسخ‎های بیوشیمیایی سریع به شرح زیر اتفاق می‎افتد (شکل2) (31).

 

 

شکل2: مسیر ترارسانی علامت در پاسخ های دفاعی گیاه (برگرفته از Zhao et al., 2005).

AC: AMP cyclase; DAG, diacylglycerol; GC: GMP cyclase; IP3: Inositol-1,4,5-trisphosphate; JA: jasmonic acid; NOS: nitric oxide synthase; NR: Nitrate reductase; PLA: phospholipase A; PLC: phospholipase C; PLD, phospholipase D; ROS, reactive oxygen species; SA: salicylic acid.

 

 

  • اتصال الیسیتور به پذیرنده غشا پلاسمایی
  • القای جریان خروجی Cl-وK+.
  • تغییرات سریع در الگوی فسفریلاسیون پروتئین، فعال شدن پروتئین کیناز، ﭘﺮوﺗﺌﻴﻦ ﮐﻴﻨﺎز ﻓﻌﺎل ﺷﺪﻩ ﺗﻮﺳﻂ ﻣﻴﺘﻮژن (MAPK) و G- پروتئین
  • · سنتز فسفولیپازهای A،C  و D (PLA، PLC و PLD) و تولید پیام برهای ثانوی مانند اینوزیتول-5،4،1 تریس فسفات (IP3)و دی اسیل-گلیسرول (DAG) که تنظیم کننده مسیر ترارسانی علامت Ca2+داخل سلول و نیتریک اکساید می باشد.
  • اسیدی شدن سیتوپلاسم در اثر غیر فعال شدن H+-ATPase، کاهش قطبیت غشا و افزایش pH خارج سلول
  • فعال شدن NADPH اکسیداز مسئول تولید اکسیژن  واکنش‎گر
  • سازمان دهی مجدد اسکلت سلول
  • تولید گونه‎های فعال اکسیژن مانند سوپر اکسید و پراکسید هیدروژن
  • · تولید پروتئین‎های مرتبط با پاتوژن (PR)                       ( (pathogenesis-relatedمانند کیتیناز، گلوکوناز به منظور آزاد کردن پلی‎ساکاریدها از دیواره سلول (الیسیتورهای داخلی)، گلیکو پروتئین‎های غنی از هیدروکسی پرولین و مهار کننده‎های پروتئیناز
  • مرگ سلول در محل آلودگی (پاسخ فوق حساسیت)
  • تغییرات ساختاری در دیواره سلول (لیگنینی شدن دیواره سلول)
  • تولید جاسمونات و سالیسیلیک اسید به عنوان پیام بر های ثانوی
  • · فعال شدن ژن‎های دفاعی مانند فنیل آلانین آمونیا لیاز (phenylalanine ammonia-lyase)(PAL)، گلوتاتیون S-ترانسفراز (GST)( glutathione S-transferase ) و چالکون سنتاز (CHS)(chalcone synthases)
  • تولید مولکولهای دفاعی مانند تانن و فیتو آلکسین ها
  • مقاومت اکتسابی سیستمیک (SAR)( systemic acquired resistance)

به هر حال مطالعه ترتیب این وقایع و برهم‎کنش بین آن‎ها پیچیده و هنوز در حال بررسی است.

استفاده از الیسیتورهای زیستی در تولید متابولیتهای ثانوی گیاهی: در بین الیسیتورهای زیستی، الیسیتورهای قارچی و ترکیبات اصلی دیواره سلول بسیاری از گونه‎های قارچی مانند کیتین و کیتوزان به طور گسترده به منظور تولید متابولیت‎های ثانوی در کشت سلول گیاهان به کار می روند (32 و 33). عوامل مختلفی مانند غلظت الیسیتور، سن محیط کشت، زمان افزودن الیسیتور به محیط کشت و مدت زمانی که محیط در معرض الیستور قرار می‎گیرد، بر افزایش تولید متابولیت‎های ثانوی تاثیر می گذارد (21). غلظت الیسیتور نقش مهمی در فرآیند تحریک دارد و عامل موثری بر شدت پاسخ است. غلظت موثر الیسیتور بر حسب گونه گیاهی فرق می کند، به طوری که غلظتی از الیسیتور که در یک گیاه اثر تحریکی دارد، ممکن است در گیاه دیگر اثر نداشته باشد. به‎عنوان مثال، غلظت بالای الیسیتور قارچیRhizopus stolonifer (50 میلی گرم در لیتر) در کشت سلول سرخدار (Taxus baccata) منجر به بیشترین میزان مرگ سلول‎ها و کم‎ترین میزان تاکسول (taxol) شده است، در حالی‎که غلظت پایین آن (25 میلی‎گرم در لیتر) منجر به تولید بیشترین میزان تاکسول و کمترین میزان مرگ و میر سلول‎ها شده است (34). غلظت 1 درصد (v/v) الیسیتور های قارچی در کشت سلول کتان سفید (Linum album) بیشترین تاثیر افزایشی بر میزان لیگنان‎های پودوفیلوتوکسین (podophyllotoxin) و لاریسی رزینول (lariciresinol) داشت (35). همچنین بیشترین میزان لیگنان‎ها در غلظت 100 میلی‎گرم بر لیتر کیتوزان و کیتین مشاهده شد (36). مدت زمانی که سلول‎ها در معرض الیسیتور قرار می‎گیرند نیز نقش مهمی در میزان تولید متابولیت‎های ثانوی دارد. در کشت سلولی L. album حضور الیسیتورهای قارچی در زمان‎های مختلف اثر متفاوتی بر میزان لیگنان دارد، به گونه‎ای که بیشترین میزان پودوفیلوتوکسین و لاریسی رزینول در سلول های L. album تیمار شده با الیسیتورهای قارچی Fusarium graminearum، Rhizoctonia solani،  Rhizopus stoloniferو Trichoderma viride در روز پنجم بعد از تیمار و عصاره قارچ Sclerontinia sclerotiorum در روز سوم بعد از تیمار مشاهده شد (37). بیشترین میزان آلکالوئید اجمالیسین (ajmalicine) در کشت سلول و ریشه موئین گیاه  Catharanthus roseus تحت تاثیر الیسیتورهای قارچی بعد از گذشت یک روز از اعمال تیمار مشاهده شد و با گذشت زمان میزان آن کاهش می‎یابد (38). الیسیتور‎های قارچی مختلف اثرات منحصر به فردی نیز در تولید لیگنان‎ها دارند، به‎طوری‎که در بین الیسیتورهای قارچی، بیشترین میزان تولید پودوفیلوتوکسین در سلول‎های تیمار شده با F. graminearum می‎باشد که میزان شش برابر نمونه‎های شاهد می‎رسد. در حالی‎کهR. stolonifer  بیشترین اثر القایی را روی لیگنان دیگر به نام لاریسی رزینول دارد که به‎میزان هفت برابر موجب افزایش تولید آن در کشت سلولی  L. album شده است. الیسیتورهای قارچی Botrytis cinerea، Phoma exigua و F. oxysporum به طور متمایزی باعث القای تولید ترکیبات مونولیگنولی در سلول‎های کتان زراعی (L. usitatissimum) شدند (39). کاربرد الیسیتورهای قارچی در القای تولید آلکالوئیدها نیز در کشت سلول گزارش شده است (40). به عنوان مثال قارچ‎هایی مانندPenicillium citrium  و P. spimulorum باعث افزایش تولید اجمالیسین در کشت سلول  C.roseus شده اند و عصاره قارچ Absidia cristata باعث افزایش تولید سرپنتین (serpentine) می‎شود (41).

قارچ‎هایی مانند Aspergillus niger و Ustilaginodia vernes باعث افزایش تولید کاتارانتین (catarantine) می‎شوند. علاوه‎براین، عصاره قارچPythium  بیشترین تاثیر را در افزایش هر سه نوع آلکالوئید داشت در حالی‎که عصاره قارچ Mucor تاثیر ضعیفی دارد. در دیواره سلول‎های قارچ‎ها ترکیبات الیسیتوری متعددی وجود دارند. پروتئین‎ها، اولیگو ساکاریدها، گلیکوپروتئین ها، پپتید‎ها، کیتین و کیتوزان از جمله این ترکیبات به حساب می آیند (42). به نظر می رسد این ترکیبات در القای متابولیت‎های ثانوی نقش داشته باشند. اثرات خاص و متنوع الیسیتور های قارچی در ارتباط با بر هم‎کنش ویژه هر قارچ با سلول گیاهی و مسیر ترارسانی علامت مربوطه و بنابر‎این پاسخ‎های دفاعی سلول گیاهی متناسب با هر قارچ می‎باشد (43). شناسایی ترکیبات فعال عصاره‎های قارچی در درک مکانیسم برهم‎کنش سلول‎های گیاهی-الیسیتورهای قارچی و پاسخ‎های دفاعی کمک خواهد کرد. مطالعات کمی نیز در زمینه استفاده از باکتری‎ها به منظور افزایش تولید متابولیت‎های ثانوی انجام شده است. افزایش تولید متابولیت‎های ثانوی مانند اندول گلیکوزیلات‎ها در کشت سلول گیاهی تحت تاثیر باکتری Erwinia carotovora گزارش شده است (44). قطعات جدا شده از دیواره سلول‎های گیاهی نیز به عنوان الیسیتور زیستی در کشت سلول به منظور تولید متابولیت‎های ثانوی کاربرد دارند (45). پلی ساکارید های دیواره سلول‎های گیاهی باعث افزایش تولید شیکونین‎ها ((shikonin در کشت سلول Onosma paniculatum (46) وLithospermum erythrorhizon (47) گردید. افزایش تولید ساپونین‎ها (saponin) در کشت سلول notoginseng Panax (48) و ریشه‎های موئین P. japonicus (49) و P. ginseng (50) تحت تاثیر اولیگوساکارید‎های جدا شده از دیواره سلول‎های گیاهی گزارش شده است.

نتیجه گیری

با توجه به اهمیت اقتصادی متابولیت‎های گیاهی و افزایش تقاضا، محققین به‎دنبال روش‎هایی به منظور تولید هر چه بیشتر این ترکیبات هستند. با استفاده از روش کشت بافت شواهد بیشتری در رابطه با چگونگی بیوسنتز متابولیتهای ثانوی و نیز مکانیسم تنظیمی آن بدست می آید و با استفاده از روش‎های زیست فناوری تولید متابولیت‎های با ارزش در گیاهان را می‎توان افزایش داد. استفاده از الیسیتورهای زیستی روش مناسبی به منظور تولید هر چه بیشتر متابولیت های  ثانوی در شرایط کشت درون شیشه (in vitro) می باشد. به نظر میرسد ترکیبات فعال الیسیتورهای زیستی نقش موثری در القای پاسخهای دفاعی و افزایش تولید متابولیتهای ثانوی دارند

 

  1. Oksman-Caldentey KM, Inzé D. Plant cell factories in the post-genomic era: new ways to produce designer secondary metabolites. Trends Plant Sci. 2004; 9(9): 433-440.
  2. Wink M. Functions and Biotechnology of Plant Secondary Metabolites. second edition. Inc. New Delhi, India. 2010: 20-30.
  3. Mazid M, Khan T, Mohammad F. Role of secondary metabolites in defense mechanisms of plants. Biol Medicine. 2011; 3 (2): 232-249.
  4. Zhoua LG, Wu JU. Development and application of medicinal plant tissue cultures for production of drugs and herbal medicinals in China. Nat Prod Rep. 2006; 23: 789–810.
  5. Raoa SR, Ravishankar GA. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotech Adv. 2002; 20: 101–153.
  6. Zhao J, Davis LC, Verpoorte R. Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites. Biotechnol Adv. 2005; 23(4): 283–333.
  7. Dewick PM. Medicinal Natural Products. A biosynthetic approach. Second Edition, Wiley. 2002; 7: 121-140.
  8. Christen P. Tropane alkaloids: old drugs used in modern medicine: Studies in natural products. Chemistry. 2000; 22: 717-749.
  9. Bourgaud F, Gravot A, Miles S. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Sci. 2001; 161(5): 839–851.

10. Taiz L, Zeiger E. Plant Physiology, 4th Edition. Sinauer Associates Inc. Sunderland, Massachusetts. USA. 2006; 260-287.

11. Saufi A. Lignans in Phaleria macrocarpa and in Linum flavum var. compactum L. Doctoral Thesis. Heinrich-Heine-Dusseldorf University, Germany. 2007; 300-316.

12. Facchini PJ, St-Pierre B. Synthesis and trafficking of alkaloid biosynthetic enzymes. Curr Opin in Plant Biol. 2005; 8: 657-666.

13. Sangwan NS, Farooqi AH, Shabih F, Sangwan RS. Regulation of essential oil production in plants, Plant Growth Regul. 2001; 34: 21-34.

14. Dixon RA, Sumner LW. Legume natural products. Understanding and manipulating complex pathways for human and animal health. Plant Physiol. 2003; 131(3): 878-885.

15. Dixon RA, Paiva NL. Stress-lnduced Phenylpropanoid Metabolism. Plant Cell. 1995; 7(7): 1085-1097.

16. Vom Endt D, Kijne J, Memelink J. Transcription factors controlling plant secondary metabolism: what regulates the regulators? Phytochem. 2002; 61(2): 107–114.

17. Anterola AM, Jeon JH, Davin LB, et al. Transcriptional control of monolignol biosynthesis in Pinus taeda. J Biol Chem. 2002; 277(21): 18272-18280.

 

18. Humphreys JM, Chapple C. Re writing the lignin roadmap. Curr Opin in Plant Biol. 2002; 5: 224-229.

19. Kartal M, Konuklugil B, IndrayantoG, Alfermann AW. Comparison of different extraction methods for the determination of podophyllotoxin and 6-methoxypodophyllotoxin in Linum species. Pharmaco Biomed. 2004; 35: 441-447.

20. Farkya S, Bisaria V, Sirvastava A. Biotechnological aspects of the production of the anticancer drug podophyllotoxin. Appl Microbiol Biotechnol. 2004; 65(5): 504–519.

21. Vasconsuelo A, Boland, R. Molecular aspects of the early stages of elicitation of secondary metabolites in plants. Plant Sci. 2007; 172: 861-875.

22. Roberts SC, Shuler ML. Large-scale plant cell culture. Curr Opin Biotechnol. 1997; 8: 154–159.

23. Namdeo A. Plant cell elicitation for production of secondary metabolites: A review. Phcog Rev. 2007; 1: 320-345.

24. Ionkova  I. Biotechnological Approaches for the Production of Lignans. Phcog Rev. 2007; 1: 427-443.

25. Cheng X, Zhou U, Cui X. Improvement of phenylethanoid glycosides biosynthesis in Cistanche deserticola cell suspension cultures by chitosan elicitor. Biotechnol J. 2006; 121: 253–260.

26. Yu Z, Fu CX, Han YC, Li YX, et al. Salicylic acid enhances jaceosidin and syringin production in cell cultures of Saussurea medusa. Biotechnol Lett. 2006;  8:1027–1031.

27. Matkowski A. Plant in vitro culture for the production of antioxidants  A review. Biotech. Adv. 2008; 26: 548–560.

28. Zhang Y, Mian MR, Bouton J. H. Recent Molecular and Genomic Studies on Stress Tolerance of Forage and Turf Grasses. Crop Sci. 2006; 46:497–511.

29. Howlett B. Secondary metabolite toxins and nutrition of plant pathogenic Fungi.Curr Opin in Plant Biol. 2006; 9:371–375.

30. Furden BV, Humburg A, Fuss E. Influence of methyl jasmonate on podophyllotoxin and 6-methoxypodophyllotoxin accumulation in Linum album cell suspension cultures. Plant Cell Rep. 2005; 24: 312–317.

31. Shilpa K, Varun K, Lakshmi B. An alternate method of natural drug production: eliciting secondary metabolite production using plant cell culture. J plant sci. 2010; 5: 222-247.

32. Kang SM, Jung HY, Kang YM, Yu DJ, et al. Effects of methyl jasmonate and salicylic acid on the production of tropane alkaloids and the expression of PMT and H6H in adventitious root cultures of Scopolia parviflora. Plant Sci. 2004; 166: 745-751.

33. Pu GB, Dong-Ming M, Chen JL, Ma LQ, et al. Salicylic acid activates artemisinin biosynthesis in Artemisia annua L. Plant Cell Rep. 2009; 28(7): 1127–1135.

34. Khosroushahi A, Valizadeh M, Ghasempour M. Naghdibadi  H, et al. Improved Taxol production by combination of inducing factors in suspension cell culture of Taxus baccata. Cell Biol International. 2005; 30: 262-269.

35. Esmaeilzadeh S, Sharifi M, Safaei N, Murata J, et al. Increased lignan biosynthesis in the suspension cultures of Linum album by fungal extracts. Plant Biotechnol Rep. 2011; 5:367–73.

36. Esmaeilzadeh S, Sharifi M, Safaei N, Behmanesh M. Enhancement of lignan and phenylpropanoid compounds production by chitosan  and chitin in Linum album cell culture. Iranian J Plant Biol. 2012; 4 (11):13-26.

37. Esmaeilzadeh S, Sharifi M, Behmanesh M, Safaei N, et al. Time-course changes in fungal elicitor-induced lignan synthesis and expression of the relevant genes in cell cultures of Linum album. J Plant Physiol. 2011; 169(5):487-91.

38. Namdeo A. Influence of Fungal Elicitors on Production of Ajmalicine by Cell Cultures of Catharanthus roseus. Biotechnol Prog. 2002 ; 18: 159-162.

39. Hano C, Addi M, Bensaddek L, Baltora-Rosset S, et al. Differential accumulation of monolignol-derived compounds in elicited flax (Linum usitatissimum) cell suspension cultures. Planta. 2006; 223(4): 975–989.

40. Zhao J, Zhu, W, Hu Q. Selection of fungal elicitors to increase indole alkaloid accumulation in Catharanthus roseus suspension cell culture. Enzyme and Microbiol Technol. 2001; 28(7-8): 666–672.

41. Tang Z, Rao R, Peng G, et al. Effects of endophytic fungus and its elicitors on cell status and alkaloid synthesis in cell suspension cultures of Catharanthus roseus. J Med Plants Res. 2011; 5(11): 2192-2200.

42. Scheel D, Parker JE. Elicitor recognition and signal transduction in plant defense gene activation. Zeitschrift für Naturforschung C. 1990; 45(6): 569-75.

43. Imre E, Somssich IE, Hahlbrok K. Pathogen defence in plant-a paradigm of biological complexity. Trends Plant Sci. 1998; 3:86–90.

44. Liu Y, Cui Y, Mukherjee A. Characterization of a novel RNA regulator of Erwinia carotovora spp. Carotovora that controls production of extracellular enzymes and secondary metabolites. Mol Microbiol. 1998; 29(1): 219-34.

45. Creelman RA, Mullet JE. Oligosaccharins, brassinolides, and jasmonates: non traditional regulators of plant growth, development, and gene expression. Plant Cell. 2009; 9: 1211_/1223.

46. Zhou LG, Zheng GZ, Wang SL. Effects of polysaccharides on cultures cells of Onosma paniculatum. Cell Res. 1991; 2: 83-88.

47. Fukui H, Tani M, Tabata M. Induction of shikonin biosynthesis by endogenous

polysaccharides in Lithospermum erythrorhizon cell suspension cultures. Plant cell Rep. 1990; 9: 73-76.

48. Zhou L, Zheng G, Wang S, Gan F. Effects of oligosaccharins on callus growth and saponin content of Panax notoginseng. Cell Res. 1992; 2:83–87.

49. Zhou L, Yang C, Li J, Wang S. Heptasaccharide and octasaccharide isolated from Paris polyphylla var. yunnanensis and their plant growth-regulatory activity. Plant Sci. 2003; 165: 571–575.

50. Zhou L, Cao X, Zhang R, et al. Stimulation of saponin production in Panax ginseng hairy roots by two oligosaccharides from Paris polyphylla var. yunnanensis. Biotechnol Lett. 2007; 29: 631–634