بررسی اثراتResveratrol بر تکثیر و شکل گیر ی کلنی سلول‌های بنیادی جنینی انسانی منفرد شده

نویسندگان

1 گروه علوم جانوری، دانشکده‌ی علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران

2 گروه سلولی و مولکولی، دانشکده‌ی علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران

3 گروه زیست شناسی، دانشکده‌ی علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد، شهرکرد، ایران

4 گروه زیست شناسی، دانشکده‌ی علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران

5 گروه بیوتکنولوژی سلولی، مرکز تحقیقات علوم سلولی، پژوهشکده‌ی زیست فناوری جهاد دانشگاهی، پژوهشگاه رویان، اصفهان، ایران

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی اثر  Resveratrol (RSV) به‫عنوان یک پلی‫فنول طبیعی دارای اثرات بیولوژیکی مختلف، بر تکثیر و توانایی تشکیل کلنی سلول­های بنیادی جنینی انسانی (hESCs)منفرد شده می­باشد.
مواد و روش­ها: در مطالعه­ی حاضر از رده­ی hESCsبه‫نام RH6 استفاده شد. سلول­ها بر ماتریژل و در محیط غنی شده­ی اختصاصی hESCs کشت شدند. میزان تکثیر سلولی با استفاده از روش شمارش سلولی و تکنیک الحاقی BrdU سنجیده شد. میزان بیان عوامل دخیل در تشکیل کلنی (E-cadherinو (β-catenin با استفاده از وسترن بلات مورد ارزیابی قرار گرفت و مکان قرار­گیری β-catenin نیز با رنگ آمیزی ایمنوسیتوشیمی بررسی شد.
نتایج: نتایج نشان دادند که RSV بدون تاثیر بر توانایی تشکیل کلنی موجب پیشبرد تکثیر hESCs منفرد شده می­‫شود.
نتیجه­گیری: با توجه به افزایش میزان تکثیر hESCs در حضور RSV می­توان این ترکیب را به‫عنوان مکمل جدیدی برای محیط کشت hESCs معرفی نمود.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

سلول­های بنیادی جنینی (ESCs) سلول­های پرتوانی هستند که از توده سلولی داخلی (ICM) بلاستوسیت منشا می­گیرند. این سلول­ها با دو ویژگی اصلی یعنی خود نوزایی و پرتوانی توصیف می­شوند (1، 2 و 3). سلول­های بنیادی جنینی انسانی (hESCs) بر خلاف همتای موشی خود (mESCs) در حالت منفرد قابلیت زیست ندارند و پس از منفرد شدن متحمل مرگ برنامه ریزی شده می‫شوند (4). در نتیجه این امر، hESCs بایستی جهت تکثیر و حتی تمایز به‫صورت کلنی و متصل به‫هم کشت داده شوند (5). در سال  2007 مولکول کوچکی به‫نام Y-27632 به‫عنوان مهار کننده آپوپتوز‫یسhESCs معرفی شد (4). این مولکول کوچک مهار کننده پروتئین کیناز وابسته به Rho(Rock) است. در سال 2010 مشخص شد که از دست رفتن مولکول‌های چسبنده سطحی E-cadherin در hESCs منفرد شده علت اصلی وقوع مرگ در این سلول­ها است. از دست رفتن این مولکول‌ موجبات تشکیل فرم فعال مولکول Rho را فراهم می­آورد (Rho- GTP).Rho فعال شده نیز فعال شدن Rock را میانجی‫گری می­کند. نتیجه فعال شدن این آبشار، فسفریلاسیون بیش از حد اجزای اسکلت داخل سلولی نظیر میوزین‌ها، انقباض بواسطه اکتین- میوزین و در نهایت blebbing غشایی و وقوع مرگ سلولی است (5). با توجه به اهمیت hESCs جهت فهم مراحل اولیه رشد و نمو جنین انسان و هم‫چنین کاربرد داشتن در زمینه­ی سلول درمانی، امروزه تلاش­ها جهت افزایش میزان خود نوزایی و پرتوانی (9-6) و هم­چنین بهبود شرایط کشت این سلول­ها در حالت منفرد (10 و 11) هم­چنان ادامه دارد. Resveratrol (RSV) یا trans-3,5,4'-trihydroxystibene یک فیتوآلکسین طبیعی با خاصیت ضد­قارچی و ساختار پلی­فنولی است که از منابع گیاهی از جمله پوست انگور قرمز مختلف استخراج می­‫شود (12). در سال 2003، RSV به‫عنوان فعال کننده SIRT1(silentinformation regulator 1) معرفی شد (13). در سال­های اخیر مطالعات زیادی به بررسی نقش RSV و SIRT1 در سلول­های بنیادی پرداخته­اند (19-14). به‫علاوه پاره­ای از مطالعات نیز نقش SIRT1 را در فرآیندهای مختلفی که مولکول E-cadherin در آن‫ها دخیل است را آشکار می­سازند. به‫طور مثال در سلول­های سرطان سینه با ویژگی­های مزانشیمی مانند رده سلولی MDA-MB-231 و هم‫چنین در رده سلول­های سرطان گاستریک نشان داده شده است که miRNAs ویژه­ای از طریق کاهش بیان SIRT1 موجب افزایش بیان E-cadherin و کاهش فرآیند گذر از اپی تلیوم به مزانشیم ((EMT می­‫شود (20 و 21). بر مبنای مطالعه­ی سیمیک و همکاران SIRT1 در سرطان سینه و فیبروز کلیوی با لوکالیزه نمودن E-cadherin در غشای سلولی موجب کاهش EMT می­‫شود (22). در مطالعه دیگری نیز که در سال 2012 انجام شد، اثبات شد که هم افزایش بیان SIRT1 و هم استفاده از RSV به‫عنوان فعال­کننده این داستیلاز موجب افزایش بیان E-cadherin می‫شود. در این مطالعه که محققین مراحل اولیه پذیرش اندومتری جنین را در in vitro شبیه سازی کرده­اند به‫علاوه اثبات شد که RSV علاوه بر این که می­تواند از طریق SIRT1 موجب افزایش بیان E-cadherin شود قادر است بر قرارگیری E-cadherin در غشای سلولی نیز مؤثر باشد (23). بر مبنای این یافته‫ها و با در نظر گرفتن این نکته که تاکنون گزارشی در مورد تاثیر RSV بر hESCs صورت نگرفته است. هدف از مطالعه­ی حاضر بررسی اثر RSV بر تکثیر و توان شکل‫گیری کلنی hESCs منفرد شده می­باشد.

 

مواد و روش‌ها

کشت سلول: در این بررسی از رده­ی سلول­های­بنیادی جنینی انسانی با نام RH6 استفاده شد (24). این سلول­ها در ظروف کوت شده با ماتریژل (ECM)(Sigma-Aldrich) و DMEM/F12 حاوی Knock-out Serum 20%،mM Non-Essential Amino Acids 1/0، Insulin-transferrin-selenite 1%، Penicillin/streptomycin 1%و ng/ml100 فاکتور رشد فیبروبلاستی پایه­ای (bFGF) (جهت جلوگیری از تمایز) کشت داده شدند. (تمامی اجزای محیط کشت از شرکت Gibco خریداری شد). محیط سلول­ها روزانه تعویض شده و سلول­ها در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‫گراد و رطوبت 95 درصد و CO25 درصد نگه­داری شدند. hESCs را می­توان به‫دو صورت کلنی یا منفرد کشت داد. با توجه به این که یکی از اهداف این پژوهش بررسی نقش RSV در بهینه سازی شرایط زیست hESCs بودکه تحت استرس منفرد شدن قرار گرفته­اند hESCs در تمامی مراحل به­صورت منفرد کشت داده شدند و در زمان پاساژ از مهار کننده­ی (Y-27632) ROCK استفاده شد.

شمارش سلولی: به‫منظور ارزیابی تاثیر RSV(Sigma-Aldrich-R5010) بر تعداد hESCs تست شمارش سلولی با استفاده از رنگ تریپان بلو انجام گرفت. بدین‫منظور 105×2 از سلول­های RH6 در هر یک از چاهک­های پلیت 6 خانه­ای کشت شدند پس از گذشت یک شب، سلول­ها به‫مدت 72 ساعت با غلظت­های مختلف RSV (1، 10، 25، 50 و µM 100) و یا با دی متیل سولفوکساید DMSO(Sigma-Aldrich) به­عنوان حلال RSV تیمار شدند. جهت شمارش سلولی سلول­های آنزیمه شده سانتریفیوژ شدند. پس از دور ریختن محیط رویی و تهیه سوسپانسیون سلولی با 1 میلی لیتر محیط کشت تازه،10 میکرولیتر از محلول حاوی سلول به یک میکروتیوب 500 میکرولیتری منتقل شد و 10 میکرولیتر تریپان بلو 4 درصد به آن اضافه شد. سپس 12 میکرولیتر از محلول فوق به زیر لامل قرار گرفته بر روی لام هموسایتومتر (نئوبار) تزریق شد. به‫منظور شمارش سلولی، سلول‫های زنده که در چهار مربع بزرگ اطراف لام که هر کدام از 16 مربع کوچکتر تشکیل شده‫اند و از هر طرف توسط خطوط سه تایی احاطه شده اند با بزرگنمایی ×200 شمارش شدند، پس از شمارش، میانگین سلول­های شمارش شده در چهار میدان دید محاسبه شد.

تست الحاق BrdU: تاثیر RSV بر میزان تکثیر hESCs با استفاده از تست الحاق BrdU سنجیده شد. جهت انجام این بررسی پس از اتمام زمان تیمار (72 ساعت) سلول­ها با نشان‫گر هسته‫ای BrdU(Sigma-Aldrich) با غلظت نهایی 10 میکرولیتر به‫مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‫گراد انکوبه شدند. در ادامه پس از حذف محیط رویی و آنزیمه کردن، سلول­ها سانتریفیوژ و سپس با پارافرمآلدهید 4 درصد (Sigma-Aldrich) به‫مدت 20 دقیقه در دمای اتاق فیکس شدند. پس از سانتریفیوژ و شست و شو با PBS، سلول­ها با تریتون 2/0 درصد(Sigma-Aldrich) به‫مدت 30 دقیقه در دمای اتاق نفوذپذیر شدند. بعد از سانتریفیوژ و شست و شو، نمونه­ها به‫مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‫گراد با اسید هیدروکلریک 2 نرمال انکوبه شدند و سپس بورات سدیم ((Merck1/0 مولار با5/8pH= به‫مدت 5 دقیقه به نمونه‫ها اضافه شد. پس از سانتریفیوژ و شست و شو، سلول­ها با محلول PBS/BSA به‫مدت 1 ساعت بلوک شدند و سپس به‫مدت یک شب با آنتی بادی مونوکلونال anti-BrdU((Sigma-Aldrich, B2531 و دو ساعت با آنتی بادی ثانویه کونژوگه با FITC(Millipore, AP 124F) انکوبه شدند. در پایان با اضافه نمودن 500 میکرولیتر PBS-، نمونه­ها جهت بررسی به دستگاه فلوسیتومتری منتقل شدند.

ایمونوسیتوشیمی: در ارزیابی اثر RSV بر تشکیل کلنی سلول­های بنیادی منفرد شده، جایگاه قرارگیری β-catenin به‫عنوان مارکر تشکیل اسکلت سلولی با تکنیک رنگ آمیزی بررسی شد. به این ترتیب که ابتدا محیط کشت رویی سلول­ها که در هر یک از چاهک­هایChamber slides کشت داده شده بودند خارج و سلول­ها 3 مرتبه با PBS شست و شو شدند. در مرحله بعد سلول­ها با پارافرمالدهید 4 درصد به‫مدت 20 دقیقه در دمای اتاق فیکس شدند. پس از شست و شو، سلول­ها با استفاده از تریتون 2/0 درصد به‫مدت 30 دقیقه در دمای اتاق نفوذپذیر شدند. سپس عمل بلوکه کردن توسط محلول BSA/PBS با غلظت mg/mL10 به‫مدت 1 ساعت انجام شد. در ادامه پس از خروج محلول بلوکه کننده ابتدا سلول­ها به‫مدت 2 ساعت در آنتی بادی اولیه β-catenin(Santa CruzBiotechnology, SC-7963) و پس از شست و شو به‫مدت 1 ساعت با آنتی بادی ثانویه کونژوگه با FITC انکوبه شدند پس از حذف آنتی بادی ثانویه و شست و شو به‫منظور رنگ‫آمیزی هسته به‫هر چاهک رنگ DAPI (با غلظت نهایی ng/mL3) اضافه شد و پس از 1 الی 2 دقیقه چاهک‫ها با PBS شست و شو شدند. دیواره‫های chamber slides به‫آرامی جدا و لامل بزرگ به‫کمک چسب انتلان بر روی لام چسبانده شد. پس از خشک شدن چسب، از لام­ها به‫کمک میکروسکوپ فلورسانس (Olympus) و با نرم افزاز Olysia عکس گرفته شد.

استخراج پروتئین: در این بررسی جهت استخراج پروتئین از محلول ترایزول(Thermo Scientific) استفاد شد. بدین‫منظور پس از هموژن نمودن سلول­ها در ترایزول، به‫هریک از نمونه ها 200 میکرو‫لیتر کلروفرم اضافه و نمونه­ها به‫مدت 15 دقیقه در دور g12000 در دمای 4 درجه سانتی‫گراد سانتریفیوژ شدند. در این مرحله 3 فاز تشکیل می شود: فاز رویی محتوی RNA، فاز وسط محتوی DNA و فاز زیرین محتوی پروتئین است. پس از انتقال محلول رویی حاوی RNA به یک ویال جدید، به ویال محتوی DNA و پروتئین 300 میکرولیتر اتانول 100 درصد اضافه و نمونه­ها به‫مدت 5 دقیقه در دور g2000 در دمای 4 درجه سانتی‫گراد سانتریفیوژ شدند. در این مرحله، فاز رویی که محتوی پروتئین بود به یک ویال جدید منتقل شد. به‫منظور رسوب پروتئین­ها، 1 میلی‫لیتر استون DTT به‫هر یک از ویال­ها اضافه و نمونه­ها به‫مدت 15 دقیقه در دمای 20- درجه سانتی‫گراد انکوبه شدند و سپس به‫مدت 15 دقیقه در دور g16000 در دمای 4 درجه سانتی‫گراد سانتریفیوژ شدند. در نهایت پس از دور ریختن فاز رویی، مقدار 30 تا 100 میکرولیتر بافر لیز کننده به‫هر یک از نمونه­ها افزوده شد. در نهایت نیز غلظت پروتئین­ها با استفاده از روش بردفورد محاسبه شد.

الکتروفورز به روش SDS-PAGE: در این تکنیک ژل مورد استفاده دارای دو بخش به‫نام‫های ژل بالایی (Stacking gel) و ژل پایینی (Running gel یا Resolving gel) است. این دو ژل در میزان خلل و فرج و pH با هم تفاوت دارند. مواد تشکیل دهنده­ی این دو ژل شامل محلول آکریل آمید-بیس آکریل آمید، SDS، باز تریس، آمونیوم پرسولفات و TEMED می­باشد. پس از آماده سازی ژل دو بخشی و قرار دادن آن در تانک حاوی بافر الکتروفورز 30 میکروگرم از نمونه­ی پروتئینی با حجم مناسبی از بافر بارگذاری مخلوط شده و پس از 4 دقیقه حرارت دادن در دمای 95 درجه سانتی‫گراد در هر یک از چاهک­های ژل بارگذاری شدند (علاوه بر نمونه­های مورد بررسی یک شناساگر اندازه­ی پروتئین نیز در یکی از چاهک­ها بارگذاری شد). تانک الکتروفورز به دستگاه مولد برق با ولتاژ 70 و 120 ولت (به‫ترتیب برای ژل بالایی و پایینی) متصل شد.

وسترن بلات: پس از انجام الکتروفورز جهت انتقال پروتئین­ها از ژل به غشای برگه­های واتمن، غشای PVDF(Bio Rad) و ژل درون کاست چیده شدند و ساندویچ حاصل در بانک حاوی بافر انتقال قرار داده شد. پس از اتمام فرآیند انتقال، غشا PVDF به‫مدت یک شب توسط محلول 10 درصد شیر خشک بدون چربی(Millipore)  بلوکه شد. غشا بعد از بلوکه شدن و شست و شو، به‫مدت 5/1 الی2 ساعت با آنتی ‌بادی­های اولیه β-catenin ((Santa Cruz, SC-7963، E-cadherinab76055)Abcam,)و GAPDH(Santa Cruz) سپس به‫مدت 1 ساعت با آنتی‌بادی­ ثانویه کونژوگه با HRP(HRP-conjugated goat anti-mouse IgG)(Dako,P0477) انکوبه شد. سوبسترای مورد استفاده برای آنزیم HRP در این بررسی، سوبسترای ECL شرکت Amersham بود که شامل دو محلول A و B است که به نسبت 1:1 با هم ترکیب و در تاریکی روی سطح غشا ریخته ‌شدند. در نهایت پس از ظهور باندها بر روی فیلم رادیولوژی، از فیلم ها عکس گرفته شد.

 

آنالیز آماری

نتایج به‫دست آمده در این مطالعه به‫طور نسبی با سه بار تکرار مستقل آزمایش­ها به‫دست آمده است. تعیین معنی‫داری اختلاف میانگین­های بیش از دو گروه با روش One way ANOVA و آزمون Tukey انجام گرفت. برای تعیین معنی­داری اختلاف میانگین­ها بین دو گروه از Student’s t test استفاده شد. آنالیزها با نرم افزار SPSS (version 17) و در سطح معنی­داری 05/0p< انجام گرفت. همه داده­ها به صورت میانگین ± خطای استاندارد میانگین گزارش شدند.

 

نتایج

نتایج حاصل از بررسی اثر RSV بر تعداد hESCs

به‫منظور ارزیابی تاثیر RSV بر تعداد hESCs تست شمارش سلولی با استفاده از رنگ تریپان بلو انجام گرفت. نتایج این بررسی نشان داد کهاز میان غلظت‫های مختلف RSV(1، 10، 25، 50 و 100 میکرومول) تعداد سلول­های RH6 تنها در حضور غلظت­های 50 و 100 میکرومول از RSV به­صورت معنی­داری نسبت به گروه کنترل (گروه تیمار شده با دی متیل سولفوکساید) افزایش یافت. با توجه به این که تفاوت معنی‫داری در تعداد سلول­های تیمار شده با دو غلظت 50 و 100 میکرومول،RSV مشاهده نشد، غلظت50 میکرومول به­عنوان غلظت بهینه­ی این ترکیب انتخاب شد و سایر بررسی­ها تنها با این غلظت RSV انجام گرفت (شکل1).

 

 

 

 

شکل 1: نتایج آزمون شمارش سلولی. اثر غلظت­های مختلف  (RSV) Resveratrolبر تعداد سلول­های RH6 پس از گذشت 72 ساعت از تیمار در مقایسه با گروه کنترل دی متیل سولفوکساید(DMSO). خط شاخص نشان دهنده­ی میانگین ± خطای استاندارد میانگین است و“**” نشان دهنده­ی اختلاف معنی­دار بین نمونه­ی تیمار شده و کنترل در سطح 01/0p<  می­باشد. NS به‫معنی عدم معنی‫داری است.

 

 

 

 

نتایج حاصل از بررسی اثر RSV بر میزان تکثیر hESCs

جهت انجام این بررسی سلول­های RH6 به‫مدت 72 ساعت با غلظت 50 میکرومول از RSV تیمار شدند. سلول­ها پس از اتمام زمان تیمار به‫مدت 1 ساعت در معرض BrdU قرار گرفتند و در نهایت پس از گذراندن مراحل تست الحاق BrdU، با دستگاه فلوسیتومتری بررسی شدند. همان‫گونه که در شکل 2 نشان داده شده است تعداد سلول­های  BrdU+در حضور RSV به صورت معنی داری افزایش یافته است.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 شکل 2: اثر   (RSV) Resveratrol بر میزان الحاق BrdU و تکثیر hESCs. درصد سلول­های BrdU+RH6 که به‫مدت 72 ساعت با غلظت 50 میکرومول از RSV تیمار شده­اند در مقایسه با گروه کنترل دی متیل سولفوکساید (DMSO). یک نمونه از سه تکرار به‫همراه نتایج کمی شده­ی سه تکرار نشان داده شده است. خط شاخص نشان دهنده­ی میانگین ± خطای استاندارد میانگین است و “**”نشان دهنده­ی اختلاف معنی­دار بین نمونه­ی تیمار شده و کنترل در سطح 01/0p<   می­باشد.

 

 

نتایج حاصل از بررسی اثر RSV بر بیان E-cadherinوβ-catenin

با توجه به این که یکی از علل شناخته شده­ی قدرت زیست پایین hESCs منفرد شده، کاهش بیان اجزای تشکیل دهنده­ی اسکلت سلولی در سطح پروتئین است (5)، باید تاثیر RSV بر بیان ژن­های مؤثر در شکل‫گیری کلنی نظیرE-cadherin و β-catenin در مدت زمان کوتاهی پس از منفرد شدن ارزیابی شوند. بدین‫منظور سلول­های RH6 بلافاصله پس از منفرد شدن به‫مدت 2و 4 ساعت با غلظت 50 میکرومول از RSV تیمار شدند و در ادامه پروتئین آنها جهت بررسی بیان دو فاکتور مذکور استخراج شد. بنابر داده­های حاصل از تکنیک وسترن بلات اثر RSV بر بیان E-cadherin و β-catenin معنی­دار نبود (شکل 3).

 

 

 

شکل 3: اثر Resveratrol (RSV) بر میزان بیان عوامل دخیل در تشکیل کلنی. الگوی بیان(A) E-Cadherinو (B)β-Catenin 2 و 4 ساعت پس از منفرد شدن سلول­های RH6 در حضور RSV در مقایسه با گروه کنترل دی متیل سولفوکساید (DMSO) توسط تکنیک وسترن بلات. یک نمونه از سه تکرار  به‫همراه نتایج کمی شده سه تکرار نشان داده شده است. اختلاف بین گروه تیمار شده و تیمار نشده معنی­دار نبود.

 

β-catenin بر اساس جایگاه قرارگیری در سلول (ناحیه­ی هسته­ای یا غشایی) ، نقش­های متفاوتی را ایفا می­کند. این نقش حیطه­ی گسترده‫ای از شرکت در مسیر سیگنالیگ Wnt/β-catenin تا برقراری ارتباط با E-cadherin را شامل می­شود (25). لذا اگرچه داده­های حاصل از مرحله­ی قبل عدم تغییر بیان β-catenin را نشان داد این احتمال داده شد که ممکن است RSV بدون تغییر در میزان بیان β-catenin تنها موجب افزایش قرار‫گیری این پروتئین در غشا شود. جهت بررسی این احتمال، جایگاه قرارگیری β-catenin با استفاده از رنگ‫آمیزی ایمنوفلوروسنت بر روی سلول­هایی که بلافاصله پس از منفرد شدن و به‫مدت 24 ساعت با RSV تیمار شده بودند مورد بررسی قرار گرفت. داده­های حاصل از این آزمایش عدم تغییر در میزان β-catenin استقرار یافته در غشاء را نشان داد (شکل 4).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 4: اثر Resveratrol  (RSV)بر جایگاه قرارگیری β-catenin در hESCs. محل قرار گیریβ-catenin در hESCs تیمار شده با RSV به‫مدت 24 ساعت پس از منفرد شدن با استفاده از تکنیک رنگ‫آمیزی ایمنوفلوروسنت. هسته­ها با رنگ DAPI رنگ آمیزی شده­اند. تصاویر به‫صورت منطبق بر هم (Merged) گرفته شده اند. یک نمونه ازسه تکرار نشان داده شده است. اختلاف بین گروه­های تیمار شده و تیمار نشده معنی­دار نبود. خط معیار: 100 میکرومتر.

 

 

بحث

با توجه به اهمیت hESCs در حوزه­های تحقیقاتی و بالینی مختلف، امروزه تلاش­های زیادی جهت بهبود شرایط کشت این سلول‫ها و فهم دقیق مکانیسم­های دخیل در خودنوزایی و پرتوانی این سلول‫ها در حال انجام است. در پژوهش حاضر به بررسی اثرات RSV بر تکثیر و کارایی شکل‫گیری کلنی hESCs منفرد شده پرداخته شد. در نخستین گام این پژوهش افزایش تعداد hESCs در حضورRSV نشان داده شد. در ادامه با استفاده از آزمون BrdU اثبات شد که افزایش مشاهده شده در تعداد سلول ناشی از افزایش میزان تکثیر hESCs بوده است. در تناقض با یافته‫های ما، Liu و همکاران (26) نشان دادند که RSV تاثیری بر توان تکثیری سلول­های پرتوان القا شده انسانی ندارد. در واقع این محققین بر پایه­ی روش رنگ سنجی که تحت تاثیر عوامل مختلفی مانند محتویات محیط، سرم آلبومین و اسیدهای چرب قرار می­گیرد (27 و 28) عدم تاثیر RSV بر تکثیر سلول‫های پرتوان انسانی را گزارش نموده­اند. فعالیت تکثیری RSV در مطالعات دیگر نیز اثبات شده است. لی و همکاران (29) به بررسی اثر RSV بر پرتوانی و خود نوزایی mESCs و سلول­های پر توان القا شده موشی (miPSCs) که با رتینوئیک اسید به‫سمت تمایز هدایت شده بودند پرداختند. بر مبنای یافته‫های این محقیقین، در حضور  غلظت­های 50 و 500 نانومول از RSV بیان مارکرهای پر توانی OCT4، NANOG و SOX2، بیان مارکرهای تنظیم کننده سیکل سلولی Pcna، Cyclin D،Cyclin A و میزان تکثیر سلولی در سلول­های مذکور افزایش می یابد. این دانشمندان اذعان داشتند که RSV اثرات مثبت خود بر پر توانی و خود نوزایی سلول­های پر توان موشی را از طریق فعال نمودن مسیر JAK/STAT3 و مهار مسیر mTOR اعمال می کند. کاربرد 10 میکرومول از RSV در محیط کشت پروژنیتورهای نورونی با فعال نمودن مسیرهای ERK و P38 موجب پیشبرد تکثیر این سلول­ها شده است (18). RSV هم‫چنین موجب پیشبرد تکثیر و تمایز استئوژنیکی در سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان موش و انسان به‫ترتیب از طریق مسیرهایER/NO/cGMP و ER/ERK می­‫شود (14، 15). در این پژوهش تاثیر RSV بر توانایی تشکیل کلنی hESCs که متحمل استرس منفرد شدن قرار گرفته بودند نیز بررسی شد. بر مبنای یافته­های ما بیان E-cadherin و β-catenin به‫عنوان عوامل اصلی دخیل در اتصالات سلولی درحضور RSV تغییر نمی­یابد. به‫علاوه بر اساس نتایج حاصل از رنگ آمیزی ایمنوفلوروسنت میزان β-catenin غشایی نیز به‫دنبال تیمار با RSV افزایش نمی‫یابد. یافته‫های ما در تناقض با مطالعاتی است که SIRT1 را به‫عنوان تنظیم کننده­ی مثبت بیان E-cadherin معرفی می­نمایند. به‫طور مثال در مطالعه­ای که در سال 2012 انجام شد (23) مشخص شد که RSV قادر است از طریق فعال نمودن SIRT1 موجب افزایش بیان E-cadherin در سلول­های کارسینومای اندومتر انسانی شود. بر مبنای یافته­های این مقاله، افزایش بیان E-cadherin ناشی از اتصال یافتن SIRT1 به نواحی E-box پروموتور ژن E-cadherin است. در سال 2013 نیز سیمیک و همکاران  (22) نشان دادند که SIRT1 از طریق داستیله نمودن Smad4 مانع از بیان ماتریکس متالوپروتئیناز 7 ((MMP7 می‫شود. به‫دنبال کاهش بیان MMP7، E-cadherin کلیواژ نشده و در اتصال به β–catenin در غشای سلول باقی می­ماند. بر مبنای این بررسی SIRT1 در سرطان سینه و فیبروز کلیوی با ممانعت نمودن از کلیواژ E-cadherin از یک سو و با لوکالیزه نمودن β–catenin در غشای سلول از سوی دیگر موجب کاهش EMT می­‫شود. تناقض مشاهده شده بین یافته­های پژوهش پیش رو با دو بررسی مذکور احتمالا ناشی از عملکرد وابسته به نوع سلول SIRT1 می­باشد.

 

نتیجه‫گیری

بر مبنای نتایج مطالعه­ی حاضر این گونه نتیجه‫گیری شد که اگرچهRSV نقش چشمگیری در تشکیل کلنی و بهبود شرایط زیست hESCs منفرد شده ندارد اما قادر به افزایش میزان تکثیر این سلول­ها است.  بر این اساس می‫توان RSV را به‫عنوان یکی از اجزای محیط کشت hESCs که قادر به بهبود شرایط رشد و تولید انبوه سلول­های مذکور در بازه زمانی کوتاه است معرفی نمود.

 

تشکر و قدردانی

این تحقیق در قالب پایان نامه دکتری در پژوهشکده رویان اصفهان  انجام گرفت لذا نویسندگان قدردان حمایت­های این مجموعه جهت فراهم نمودن امکانات اجرایی و مالی این طرح می­باشند.

 

منابع

1. Wobus AM, Boheler KR. Embryonic stem cells: prospects for developmental biology and cell therapy. Physiol. Rev. 2005; 85(2): 635-78.

2. Smith AG. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2001;17: 435-462.

3. YH YU, Zhang L, Wu DS, Zhang Z, et al. MiR-223 Regulates Human Embryonic Stem Cell Differentiation by Targeting the IGF-1R/Akt Signaling Pathway. Plos One. 2013;.8 :11.

4. Watanabe K, Ueno M, Kamiya D, NishiyamaA,et al. A ROCK inhibitor permits

 

survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 2007; 25: 681–686.

5. Ohgushi M, Matsumura M, Eiraku M, Murakami K, et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2010; 7(2): 225–239.

6. Ren-He X, Peck RM, Li DS, Feng X, et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nature methods. 2005; 2(3): 185.

7. Armstrong L, Hughes O, Yung S,Hyslop L,et al. The role of PI3K/AKT, MAPK/ERK and NFκβ signalling in the maintenance of human embryonic stem cell pluripotency and viability highlighted by transcriptional profiling and functional analysis. Human molecular genetics.2006; 15(11): 1894-1913.

8. Li J, Wang G, Wang C,Zhao Y,et al. MEK/ERK signaling contributes to the maintenance of human embryonic stem cell self-renewal. Differentiation. 2007; 75(4): 299-307.

9. Esmailpour T, Huang T. TBX3 promotes human embryonic stem cell proliferation and neuroepithelial Differentiation in a differentiation stage dependent manner. Stem Cells. 2012; 30(10): 2152-2163.

10. Xua T, Zhua X, Hahma H, Wei W, et al. Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules. PNAS.2010; 107(18): 8129–8134.

11. Kajabadi NS, Ghoochani A, Peymani M, Ghaedi K, et al. The synergistic enhancement of cloning efficiency in individualizedhuman pluripotent stem cells by peroxisome proliferative-activated receptor-γ (PPARγ) activation and Rho-associated Kinase (ROCK) inhibition. JBC. 2015; 290(43): 26303-26313.

12. Burns J, Yokota T, Ashihara H, Lean ME, et al. Plant foods and herbal sources of resveratrol. Journal of agricultural and food chemistry. 2002; 50(11): 3337-3340.

13. Howitz KT, Bitterman KJ, Cohen HY,Lamming, DW,et al. Small molecule activators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan. Nature. 2003; 425: 191-196.

14. Song LH, Pan W, Yu YH, Quarles LD, et al. Resveratrol prevents CsA inhibition of proliferation and osteoblastic differentiation of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells through an ER/NO/cGMP pathway. Toxicology in Vitro. 2006; 20(6):915-922.

15. Dai Z, Li Y, Quarles L, Song T, et al.Resveratrol enhances proliferation and osteoblastic differentiation in human mesenchymal stem cells via ER-dependent ERK1/2activation. Howitz KT, Bitterman KJ, Cohen HY,Lamming, DW,et al. Small molecule activators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan. Nature.2003; 425: 191-196.

16. Jablonska B, Gierdalski M, Chew LJ, Hawley T,et al. Sirt1 regulates glial progenitor proliferation and regeneration.in white matter after neonatal brain injury. Nature communications 7. 2016; 13866: 1-16.

17. Wang L, Xue R, Sun C, Yang C, et al. SIRT1 regulates C2C12 myoblast cell proliferation by activating Wnt signaling pathway. IntJ Clin Exp Pathol. 2016; 9(3): 2857-2868.

18. Kumar V, Pandey A, Jahan S, Shukla RK,et al. Differential responses of Trans-Resveratrol on proliferation of neural progenitor cells and aged rat hippocampal neurogenesis. Scientific reports. 2016; 6: 28142.

19.Calvanesea V, Larab E, AlvarezcBS, AbuDawudd R, et al.Sirtuin 1 regulation of developmental genes during differentiation of stem cells. PNAS. 2010; 107(31): 1-6.

20. Tryndyak PV, Beland AF, Pogribny PI. E-cadherin transcriptional down-regulation by epigenetic and microRNA-200 family alterations is related to mesenchymal and drug-resistant phenotypes in human breast cancer cells. Int. J. Cancer. 2010; 126: 2575–2583.

21. Zhang L, Wang X, Chen P. MiR-204 down regulates SIRT1 and reverts SIRT1-induced epithelial- mesenchymal transition, anoikis resistance and invasion in gastric cancer cells. BMC.Cancer. 2013;14(13): 290.

22. Simic P, Williams OE, Bell LE, Gong J, et al. SIRT1 suppresses the epithelial-to-mesenchymal transition in cancer metastasis and organ fibrosis. Cell.Rep. 2013; 3(4): 1175–1186.

23. Shirane A, Wada-Hiraike O, Tanikawa M, Seikia T, et al. Regulation of SIRT1 determines initial step of endometrial receptivity by controlling E-cadherin expression.Biochem.Biophys. Res. Commun. 2012; 424(3): 604–610.

24. Baharvand H, Ashtiani SK,  Taee A,Massumi M,et al. Generation of new human embryonic stem cell lines with diploid and triploid karyotypes. Development, growth & differentiation. 2006; 48(2): 117-128.

25. Huang G, Ye S, Zhou X, Liu D, et al. Molecular basis of embryonic stem cell self-renewal: from signaling pathways to pluripotency network. Cellular and molecular life sciences. 2015; 72(9): 1741-1757.

26. Liu H, Zhang S, Zhao L, Zhang Y, et al. Resveratrol enhances cardiomyocyte differentiation of human induced pluripotent stem cells through inhibiting canonical WNT signal pathway and enhancing serum response factor-miR-1 axis. Stem cells international 2016; 1-11.

27. Huang KT, Chen YH, Walker AM. Inaccuraciesin MTS assays: major distorting effects of medium, serum albumin, and fatty acids. Biotechniques. 2004; 37(406): 410-402.

28.Wang P, Henning SM, Heber D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS one.2010; 5(4): e10202.

29. Li N, Du Z, Shen Q, Lei Q,et al. Resveratrol enhances self Renewal of mouse embryonic stem cells. JCB. 2017; 118(7): 1928-1935.

1. Wobus AM, Boheler KR. Embryonic stem cells: prospects for developmental biology and cell therapy. Physiol. Rev. 2005; 85(2): 635-78.

2. Smith AG. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2001;17: 435-462.

3. YH YU, Zhang L, Wu DS, Zhang Z, et al. MiR-223 Regulates Human Embryonic Stem Cell Differentiation by Targeting the IGF-1R/Akt Signaling Pathway. Plos One. 2013;.8 :11.

4. Watanabe K, Ueno M, Kamiya D, NishiyamaA,et al. A ROCK inhibitor permits

 

survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 2007; 25: 681–686.

5. Ohgushi M, Matsumura M, Eiraku M, Murakami K, et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2010; 7(2): 225–239.

6. Ren-He X, Peck RM, Li DS, Feng X, et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nature methods. 2005; 2(3): 185.

7. Armstrong L, Hughes O, Yung S,Hyslop L,et al. The role of PI3K/AKT, MAPK/ERK and NFκβ signalling in the maintenance of human embryonic stem cell pluripotency and viability highlighted by transcriptional profiling and functional analysis. Human molecular genetics.2006; 15(11): 1894-1913.

8. Li J, Wang G, Wang C,Zhao Y,et al. MEK/ERK signaling contributes to the maintenance of human embryonic stem cell self-renewal. Differentiation. 2007; 75(4): 299-307.

9. Esmailpour T, Huang T. TBX3 promotes human embryonic stem cell proliferation and neuroepithelial Differentiation in a differentiation stage dependent manner. Stem Cells. 2012; 30(10): 2152-2163.

10. Xua T, Zhua X, Hahma H, Wei W, et al. Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules. PNAS.2010; 107(18): 8129–8134.

11. Kajabadi NS, Ghoochani A, Peymani M, Ghaedi K, et al. The synergistic enhancement of cloning efficiency in individualizedhuman pluripotent stem cells by peroxisome proliferative-activated receptor-γ (PPARγ) activation and Rho-associated Kinase (ROCK) inhibition. JBC. 2015; 290(43): 26303-26313.

12. Burns J, Yokota T, Ashihara H, Lean ME, et al. Plant foods and herbal sources of resveratrol. Journal of agricultural and food chemistry. 2002; 50(11): 3337-3340.

13. Howitz KT, Bitterman KJ, Cohen HY,Lamming, DW,et al. Small molecule activators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan. Nature. 2003; 425: 191-196.

14. Song LH, Pan W, Yu YH, Quarles LD, et al. Resveratrol prevents CsA inhibition of proliferation and osteoblastic differentiation of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells through an ER/NO/cGMP pathway. Toxicology in Vitro. 2006; 20(6):915-922.

15. Dai Z, Li Y, Quarles L, Song T, et al.Resveratrol enhances proliferation and osteoblastic differentiation in human mesenchymal stem cells via ER-dependent ERK1/2activation. Howitz KT, Bitterman KJ, Cohen HY,Lamming, DW,et al. Small molecule activators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan. Nature.2003; 425: 191-196.

16. Jablonska B, Gierdalski M, Chew LJ, Hawley T,et al. Sirt1 regulates glial progenitor proliferation and regeneration.in white matter after neonatal brain injury. Nature communications 7. 2016; 13866: 1-16.

17. Wang L, Xue R, Sun C, Yang C, et al. SIRT1 regulates C2C12 myoblast cell proliferation by activating Wnt signaling pathway. IntJ Clin Exp Pathol. 2016; 9(3): 2857-2868.

18. Kumar V, Pandey A, Jahan S, Shukla RK,et al. Differential responses of Trans-Resveratrol on proliferation of neural progenitor cells and aged rat hippocampal neurogenesis. Scientific reports. 2016; 6: 28142.

19.Calvanesea V, Larab E, AlvarezcBS, AbuDawudd R, et al.Sirtuin 1 regulation of developmental genes during differentiation of stem cells. PNAS. 2010; 107(31): 1-6.

20. Tryndyak PV, Beland AF, Pogribny PI. E-cadherin transcriptional down-regulation by epigenetic and microRNA-200 family alterations is related to mesenchymal and drug-resistant phenotypes in human breast cancer cells. Int. J. Cancer. 2010; 126: 2575–2583.

21. Zhang L, Wang X, Chen P. MiR-204 down regulates SIRT1 and reverts SIRT1-induced epithelial- mesenchymal transition, anoikis resistance and invasion in gastric cancer cells. BMC.Cancer. 2013;14(13): 290.

22. Simic P, Williams OE, Bell LE, Gong J, et al. SIRT1 suppresses the epithelial-to-mesenchymal transition in cancer metastasis and organ fibrosis. Cell.Rep. 2013; 3(4): 1175–1186.

23. Shirane A, Wada-Hiraike O, Tanikawa M, Seikia T, et al. Regulation of SIRT1 determines initial step of endometrial receptivity by controlling E-cadherin expression.Biochem.Biophys. Res. Commun. 2012; 424(3): 604–610.

24. Baharvand H, Ashtiani SK,  Taee A,Massumi M,et al. Generation of new human embryonic stem cell lines with diploid and triploid karyotypes. Development, growth & differentiation. 2006; 48(2): 117-128.

25. Huang G, Ye S, Zhou X, Liu D, et al. Molecular basis of embryonic stem cell self-renewal: from signaling pathways to pluripotency network. Cellular and molecular life sciences. 2015; 72(9): 1741-1757.

26. Liu H, Zhang S, Zhao L, Zhang Y, et al. Resveratrol enhances cardiomyocyte differentiation of human induced pluripotent stem cells through inhibiting canonical WNT signal pathway and enhancing serum response factor-miR-1 axis. Stem cells international 2016; 1-11.

27. Huang KT, Chen YH, Walker AM. Inaccuraciesin MTS assays: major distorting effects of medium, serum albumin, and fatty acids. Biotechniques. 2004; 37(406): 410-402.

28.Wang P, Henning SM, Heber D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS one.2010; 5(4): e10202.

29. Li N, Du Z, Shen Q, Lei Q,et al. Resveratrol enhances self Renewal of mouse embryonic stem cells. JCB. 2017; 118(7): 1928-1935.