الیسیتورهای غیرزیستی و بیوتکنولوژی گیاهان دارویی

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانش‌‌آموخته کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات، تهران، ایران

2 دانشگاه بوعلی سینا، دانشکده کشاورزی، گروه علوم باغبانی، همدان، ایران

3 دانش‌آموخته اصلاح‌نباتات، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران، کرج، ایران

چکیده

گیاهان دارویی از هزاران سال پیش به‏عنوان یکی از مهم‏ترین منابع درمان بیماری­های مختلف کاربرد داشته­اند. این گیاهان، گروه بزرگ و متنوعی از ترکیبات آلی به‏نام متابولیت­های ثانویه را تولید می­کنند. متابولیت­های ثانویه ترکیباتی هستند که از متابولیت­های اولیه (متابولیت­های مربوط به تغذیه و بقا) که برای حفظ حیات گیاه ضروری هستند تولید می­شوند. دست­ورزی محیط­های کشت سلول گیاهی با استفاده از الیسیتورهای غیرزیستی یکی از راه‏کارهای مهم جهت القای تولید متابولیسم­های ثانویه و افزایش عملکرد این ترکیبات ارزشمند می­باشد، زیرا پتانسیل تولید این مواد در شرایط طبیعی بسیار محدود است. الیسیتورها از طریق فعال کردن مکانسیم­های دفاعی باعث القای تشکیل متابولیت­های ثانویه و پاسخ­های دفاعی سریع در سلول گیاهی نظیر افزایش جریانات یونی از عرض غشای پلاسمایی، تولید گونه­های اکسیژن واکنشگر، فعال­سازی ژن­های مربوط به دفاع، تغییرات ساختاری در دیواره سلولی و سنتز فیتوالکسین­ها می‏‏شوند. در این نوشتار جنبه­های مختلف امکان تولید متابولیت­های ثانویه در کشت سلول گیاهی با استفاده از الیسیتورهای غیرزیستی مرور گردیده است.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

گیاهان دارویی به‏عنوان سرمایه­های ژنتیکی ارزشمند در شمار میراث­های بومی کشورها محسوب می­شوند و دارای اهمیت جهانی هستند. این گیاهان در طول تاریخ جز منابع اصلی پزشکی و داروسازی در اکثر نقاط جهان بوده­اند. امروزه برای درمان و حفظ سلامتی انسان تأکید زیادی بر استفاده از داروهایی با منشا طبیعی می­شوند (1). داروهای گیاهی به‏دلیل نزدیکی و سازگاری با فیزیولوژی بدن انسان در مقایسه با داروهای شیمیایی خطرات و عوارض جانبی کمتری دارند. این ویژگی یکی از دلایل اصلی رویکرد و تمایل دوباره مردم جهان به گیاهان دارویی و استفاده از آن­ها در قیاس با داروهای شیمیایی و مرکب از مواد مصنوعی (Synthetic) شده است (2و3).

خواص دارویی این گیاهان، به ترکیباتی به‏نام متابولیت­­های ثانویه نسبت داده می­شود .متابولیت­های ثانویه ترکیباتی هستند که تنها از متابولیت­های اولیه (متابولیت­های مربوط به تغذیه و بقا) که برای حفظ حیات موجود ضروری هستند تولید می­شوند. نشان داده شده است که این محصولات ثانویه برای گیاهان و جانورانی که آنها را سنتز می­کنند بسیار مفیدند (4). متابولیت‏های ثانویه منحصر به گونه یا حتی نژاد خاص بوده و اغلب طی یک دوره خاص رشد و نمو در گیاه تولید می­شوند. این ترکیبات دارای عملکردهای اکولوژیکی مهم در گیاهان هستند و نقش حفاظتی در مقابل گیاه‏خواران و عوامل بیماری­زای میکروبی و همچنین جذب گرده افشان­ها ایفا می­کنند. این ترکیبات به گروه­های مختلفی از جمله آلکالوئیدها، آنتوسیانین­ها، فلاونوئیدها، کوئینون­ها، استروئیدها و ترپنوئیدها تقسیم می­شوند و کاربردهای تجاری متنوعی به‏عنوان دارو، رنگ، حشره­کش و چاشنی از نقطه ­نظر طعم، بو و غیره دارند (5).

بر اساس برخی از گزارش‏ها تاکنون حداقل 000/100 متابولیت ثانویه از 000/50 گونه گیاهی شناسایی شده است و هرسال نیز 4000 متابولیت جدید از گونه­ها و واریته­های مختلف گیاهی کشف می­شوند (6). برخی از این ترکیبات مانند دیجیتوکسین، شیکونین، عطر جاسمین و داروهای ضد سرطان مانند وین­بلاستین، وین­کریستین و تاکسول از ارزش اقتصادی بالایی برخوردارند و قیمت آنها از چند دلار تا چند هزار دلار به‏ازای هر کیلوگرم تغییر می­کند. تولید انبوه و سریع این مواد پیچیده در مقیاس زیاد از طریق روش­های طبیعی عمدتا مشکل و یا تقریبا غیرممکن است و از سوی دیگر محدودیت­های مختلف مانع تأمین این مواد از طبیعت می‏شوند. با توجه به این ­که به­طور طبیعی سرعت تولید متابولیت­های ثانویه غالبا بسیار کند بوده و مستلزم مدت زمان طولانی است، استفاده از روش­های بیوتکنولوژی برای تولید سریع و انبوه متابولیت­های ثانویه و مواد دارویی گیاهی امری ضروری به نظر می­رسد (7).

محصولات طبیعی گیاهان به‏عنوان منابع ارزشمندی از دارو در خدمت بشر می­باشند، به­طوری­که امروزه این محصولات و مشتقات و آنالوگ­های آن­ها بیش از 50 درصد از مواد اولیه داروها را در مصارف کلینیکی مهیا می­کنند. حدود 85 درصد از داروهای سنتی مورد استفاده شامل عصاره­های گیاهی می­شوند و محصولات طبیعی مشتق شده از گیاهان عالی 25 درصد از کل را تشکیل می­دهند. عامل ضد سرطان پاکلی­تاکسول (Taxol) و وین­کریستین (Oncovin) و مسکن اسکوپولامین و سست کننده عضلات توبوکورارین بعضی از داروهایی هستند که از متابولیت­های ثانویه مشتق شده­اند و مصرف کلینیکی دارند (8). در این نوشتار ضمن اشاره به مسیر­های اصلی بیوسنتزی متابولیت­های ثانویه، روش­های بیوتکنولوژی گیاهی در تولید این متابولیت­ها مرور می‏شوند.

مسیر­های بیوسنتزی متابولیت­های ثانویه

با وجود اینکه متابولیت­های ثانویه بسیار متنوعند، اما تعداد مسیرهای اصلی بیوسنتزی آنها محدود و مشخص است. پیش‏ماده‏های ساختاری متابولیت­های ثانویه به‏عنوان منابع تولید این متابولیت­ها در سه مسیر اصلی شامل مسیرهای استات ـ مالونات، استات ـ موالونات و اسید شیکمیک وارد می­شوند(9). سه گروه از محصولات ثانویه براساس ویژگی‌های بیوسنتزی وجود دارند که به ترپن­ها، ترکیبات فنولی و ترکیبات نیتروژن­دار تقسیم می­شوند.

الف) ترپن­ها: ترپن­ها یا ترپنوئیدها بزرگترین گروه محصولات ثانویه را شامل می­شوند. مواد متنوع این گروه معمولا در آب غیرمحلولند. ترپن­ها از پیوستن واحدهای پنج کربنی ساخته شده از طریق مسیر موالونیک اسید تشکیل می­شوند. بیشتر ترپن­ها اعمال مشخصی در رشد و نمو گیاه به عهده دارند. به‏عنوان مثال پیش ماده آبسزیک اسید، یک سزکوئی­ترپن است. استروئیدها مشتقات تری‌ترپن­ها بوده و از اجزای ضروری غشای پلاسمایی به‏حساب می­آیند. بدین ­ترتیب بعضی از ترپن­ها نقش­های اولیه مهمی در گیاه به عهده دارند. این مواد سمی بوده و در بسیاری از گیاهان

به‏عنوان ترکیبات دفاعی ضدگیاه­خواری ایفای نقش می‏کنند (10 و 11).

ب) ترکیبات نیتروژن­دار: در ساختمان بسیاری از محصولات ثانویه گیاهان نیتروژن وجود دارد. این ترکیبات شامل آلکالوئیدها و گلیکوزیدهای سیانوژنیک می­باشند. آلکالوئیدها محصولات طبیعی هستند که در ساختمان خود دارای نیتروژن بوده و معمولاً ساختار حلقوی دارند. بسیاری از داروهای رایج بر پایه ترکیبات آلکالوئیدی شکل گرفته­اند که از جمله آنها مسکالین (Mescaline)، نیکوتین (Nicotine)، کوکائین (Cocaine) و مورفین (Morphine) می­باشند. گلیکوزیدهای سیانوژنیک و گلیکوزینولیت­ها نیز گروهی دیگر از ترکیبات نیتروژن­دار را شامل می­شوند. آمیگدالین (Amygdaline) و پروناسین (Prunasin) از مهم‏ترین گلیکوزیدهای سیانوژنیکی هستند که در خانواده گندمیان (Poaceae) و گل­سرخ (Rosaceae) قرار دارند (12).

ج) ترکیبات فنولی: گیاهان طیف وسیعی از محصولات ثانویه را تولید می­کنند که دارای یک گروه فنولی بوده و به‏نام ترکیبات فنولی طبقه­بندی می­شوند و شامل فنول­های ساده، لیگنین­ها، فلاونوئیدها و تانن­های فشرده می­باشند. باتوجه به تنوع زیاد شیمیایی، ترکیبات فنولی نقش­های متفاوتی را در گیاهان بازی می­کنند. در گیاهان اکثر ترکیبات فنولی از فنیل­آلانین و تیروزین مشتق شده­اند. از متابولیت­های ثانویه این گروه می­توان به مشتقات فنیل­پروپان ساده مثل اسید فرولیک (Ferulic acid) و اسید کافئیک (Caffeic acid)، کومارین­ها مثل آمبلیفرون (Umbeliferon) و سورالن (Psoralen)) و مشتقات اسید بنزوئیک نظیر اسید سالیسیلیک و وانیلین (Vanillin) اشاره نمود (13).

بیوتکنولوژی گیاهان دارویی

امروزه بیوتکنولوژی گیاهان دارویی به‏عنوان ابزاری نوین برای افزایش تولید متابولیت­های ثانویه به­کار گرفته می­شود که از طریق انتخاب،­ ازدیاد در شرایط درون شیشه­ای (in vitro)، نگه‏داری ژنوتیپ­های ­در حال انقراض توسط روش­های حفاظت انجمادی (Cryopreservation) و تولید گیاهان تراریخت صورت می­گیرد. کشت سلول گیاهی (Plant cell culture) و کشت اندام (Organ culture) که شامل کشت جوانه، جنین، ساقه، ریشه و ریشه­های مویین می­باشد از جمله روش­های بیوتکنولوژی هستند که به‏منظور تولید متابولیت­های ثانویه مورد استفاده قرار گرفته­اند (14). با این حال، به‏دلیل عدم تمایز بافت­های کشت شده در اغلب کشت­های سوسپانسیون سلولی (کشت سلول­های معلق در محیط مایع)، مقدار تولید متابولیت‏های ثانویه در این سیستم کم است و برخی متابولیت­ها نیز فقط در بافت­های خاص دارای تمایز مورفولوژیکی تجمع می­یابند (15 و 16). لذا تولید متابولیت­های ثانویه با استفاده از تکنولوژی کشت بافت گیاهی هنوز دچار محدودیت­های بیولوژیکی و بیوتکنولوژیکی است. به‏همین منظور روش­های متعددی برای افزایش تولید متابولیت­های ثانویه در کشت بافت استفاده می‌شوند که عبارتند از:

بهینه­سازی ترکیبات محیط کشت

بسیاری از اجزای محیط کشت تعیین­کننده رشد سلول و تولید متابولیت­ها می­باشد. بهینه­کردن نوع و غلظت هورمون­های گیاهی غالبا موثر بوده و تغییر فاکتورهای محیطی چون سطوح موادغذایی، نور و منبع کربن نیز ممکن است در افزایش تولید تاثیرگذار باشند. همچنین منبع نیتروژن می­تواند در عملکرد محصول نقش با اهمیتی داشته باشد. برای نمونه کاهش سطح NH4 و افزایش میزان NO، تولید آرتمیزین را در ریشه­های موئین گیاه گندواش یا خاراگوش شیرین (Artemisia annua) تقویت کرده و مقادیر بالای نیتروژن نیز موجب بازدارندگی رشد و تولید این گیاه می­‏شوند (17).

غیرمتحرک­سازی (تثبیت) سلول­ها

در بیشتر موارد محصولات تشکیل شده در سیستم سوسپانسیون سلولی در واکوئل سلول ذخیره می­شوند. برای این­که این محصولات از واکوئل سلول­های گیاهی خارج شوند باید از دو غشای پلاسمایی و تونوپلاست عبور کنند. کارهای زیادی انجام شده است تا سلول گیاهی را برای مدتی کوتاه نفوذپذیر کند، به گونه­ای که سلول توانایی خود را حفظ نموده و مقدار انتقال متابولیت­ها از سلول افزایش یابد. نفوذپذیری غشا به تشکیل منافذ در یک یا بیشتر سیستم­های غشایی سلول­های گیاهی که عبور مولکول­ها را به‏داخل و خارج سلول ممکن سازد بستگی دارد. نفوذپذیری سلول­ها را می­توان به وسیله اندازه­گرفتن آنزیم‏های متابولیسم اولیه شامل هگزوکیناز، گلوکز 6 فسفات دهیدروژناز، ایزوسیترات دهیدروژناز و مالیک و سیترات سینتتاز کنترل کرد. دامنه گسترده­ای از عوامل نفوذپذیرکننده برای افزایش تحریک­پذیری و رها سازی محصولات ذخیره شده در درون سلول به محیط کشت اضافه می­شود. انواع نمک­ها، حلال­های آلی مثل ایزوپروپانول و دی­متیل­سولفوکساید، پلی­ساکاریدهایی چون کیتوزان و سطح­دهنده­هایی نظیر توئین­20 به‏عنوان عوامل نفوذپذیرکننده استفاده شده­اند. روش­هایی مثل اولتراسونیک و الکتروپوریشن نیز برای القای نفوذپذیری سلول­ها به­کار گرفته شده­اند (18، 19 و 20).

کاربرد مهندسی متابولیک

مهندسی متابولیک به‏طور معمول به‏عنوان تکنیکی برای هدایت یک یا چند واکنش آنزیمی به‏منظور تولید ترکیبات جدید در سلول و بهبود تولید ترکیبات خروجی تعریف می­شود. مهندسی متابولیک همچنین به استفاده از تکنولوژی DNA نوترکیب برای اصلاح فعالیت­های درون سلولی از طریق دست­کاری عملکردهای آنزیمی و تنظیمات داخلی سلول اطلاق می­شود. قسمت اعظمی از تحقیقات در زمینه متابولیت­های ثانویه، روی شناسایی و دستکاری ژنتیکی آنزیم­های دخیل در مسیر متابولیکی سنتز یک متابولیت ثانویه، متمرکز شده است. ابزار طبیعی که در فرآیند مهندسی ژنتیک و در اکثر گونه­های گیاهی و بخصوص گیاهان دولپه به‏کار می­رود، یک باکتری خاکزی به‏نام آگروباکتریوم تیومفاسینس (Agrobacterium tumefacience) است. تولید متابولیتهای ثانویه عموما تحت کنترل بیش از یک ژن می­باشد. اگرچه تحقیقات فراوانی طی سی سال گذشته در زمینه تولید متابولیت‏های ثانویه انجام شده است، لیکن به‏دلیل فقدان اطلاعات پایه در رابطه با مسیرهای بیوسنتزی تولید مواد مذکور و کنترل چند آنزیمی این مسیرها و همچنین عدم آشنایی و دسترسی کافی به بیورآکتورها، تولید اقتصادی آن­ها به جز در موارد خاص امکان­پذیر نشده است (21).

در بیوسنتز مونوترپن­ها در گیاه آویشن (Thymus vulgaris) و نعناع فلفلی (Mentha piperita)، یک سیستم چندژنی با برهم­کنش اپیستاتیک (برهمکنش ژن­های غیرآلل) نقش دارد، اما در پونه آبی (Mentha aquatica) همه ژن­های دخیل در مسیرهای بیوشیمیایی مونوترپن­ها به صورت دو آللی با وراثت ساده غالب و مغلوبی است. بنابراین مهندسی ژنتیک می­تواند به‏عنوان ابزاری قدرتمند جهت تولید متابولیت­های ثانویه جدید و همچنین افزایش مقدار متابولیت­های ثانویه موجود در یک گیاه به کار گرفته شود.

استفاده از پلی­پلوئیدی

پلی­پلوئیدی به افزایش تعداد سری کروموزوم­های یک موجود تا چند برابر تعداد کروموزوم­های اصلی (X) آن گفته می­شود. پلی پلوئیدی مکانیسم هایی را در سلول فعال کرده و در نتیجه میزان DNA الگو و به‏دنبال آن نسخه برداری و ترجمه نیز تحت تاثیر قرار گرفته و منجر به افزایش، کاهش و حتی خاموشی برخی ژن‏ها می‏شود، و به این صورات بسیاری از صفات فیزیولوژیکی و ریخت شناسی گیاه را تحت تاثیر قرار می‏دهد (22).

اگرچه پلی­پلوئیدی مصنوعی به­عنوان روشی برای اصلاح گیاهان زراعی به­کاربرده شده است، اما در مورد گیاهان دارویی نیز برای افزایش متابولیت­های ثانویه در گیاهان اصلاح شده به‏کار می­رود. غالب گیاهان تتراپلوئید به­خاطر داشتن تعداد کروموزوم‏های دوبرابر، اندازه بزرگتری دارند و از آن­ها متابولیت ثانویه بیشتری به­دست می­آید. برای مثال در گیاه گندواش، ریشه­های موئین تتراپلوئید ایجاد شده در مقایسه با ریشه­های موئین دیپلوئید پنج برابر آرتمیزین تولید کرده­اند (23). با این‏حال افزایش سطح پلوئیدی در گیاهان همواره تولید متابولیت­های ثانویه را ارتقا نداده بلکه در مواردی باعث کاهش آن­ها نیز شده است. به­طور مثال این پدیده در یکی از گونه­های داتوره (Datura innoxia) دیده شده است (24).

کاربرد الیسیتورها

الیسیتور (Elicitor) از ریشه Elicit به‏معنای بیرون کشیدن یا استخراج کردن مشتق گردیده و معادل "استخراج­گر" یک واژه تعریف شده علمی برای فاکتورهایی است که به‏طور مستقیم یا غیر مستقیم تغییرات دفاعی قابل القا را در سیستم گیاهی مورد هدف قرار می­دهد و منجر به فعال سازی دسته­ای از مکانیزم­های دفاعی و بیوسنتز مواد شیمیایی مفیدی می­شود که در سازگاری گیاهان نسبت به شرایط پرتنش گیاه نقش اساسی دارند. به‏طور خلاصه الیسیتورها محرک­های فیزیکی یا ترکیبات شیمیایی با منشا زیستی و غیرزیستی هستند که می­توانند پاسخ­هایی را در گیاه القا کنند که باعث سنتز و تجمع متابولیت­های ثانویه مشابه و جدید در سلول­ها ­شوند. الیسیتورها برای گیاه یک‏سری از پیام­های شیمیایی را می­فرستند که سبب رها شدن پاسخ­های فیزیولوژیکی و مرفولوژیکی و تجمع فیتوالکسین می­شود. طی پاسخ به سیگنال الیسیتور، سیستم دفاعی گیاه فعال می­شود و در نتیجه بیان ژن­های دفاعی، متابولیت­های ثانویه تجمع می‏یابند )25(. کاربرد الیسیتورها به‏میزان محدود و در غلظت­های پایین، بیوسنتز ترکیبات خاصی را در سیستم سلولی زنده تحریک یا بهبود بخشیده و به­طور کلی زمان دستیابی به مقادیر بالای متابولیت­ها را کاهش می­دهد (26 و 27).

استخراج­گری (Elicitation) تقریبا موثرترین راه‏کار عملی برای افزایش تولید ترکیبات ثانویه مطلوب در سیستم­های گیاه، اندام و سلول است (26 و 27). الیسیتورها ممکن است ژن جدیدی را فعال کنند که می­تواند آنزیم­ها و در نهایت مسیرهای بیوسنتزی مختلفی را راه­اندازی نموده و باعث تشکیل متابولیت­های ثانویه شود (28 و 29). شروع پاسخ­های دفاعی در گیاه شبکه­ای از انتقال سیگنال (Signal transduction) را القا می­کند که با تشخیص الیسیتور توسط پذیرنده­ها­ی سطح سلول شروع می­شود (30). مسیر­های انتقال سیگنال در پاسخ­های دفاعی گیاه در شکل 1 نشان داده شده­اند.

 

 

شکل 1: مسیر­های انتقال سیگنال در پاسخ­های دفاعی گیاه (اژائو و همکاران (24))

 

استفاده از الیسیتورها در پژوهش­های مربوط به زیست فناوری متابولیت­های ثانوی گیاهی دو هدف اصلی را دنبال می­کند: نخست کسب یافته­هایی در زمینه مسیرهای بیوسنتزی که منجر به تشکیل و تنظیم متابولیت‏های ثانوی می­شود. دوم افزایش تولید متابولیت‏های ثانوی برای کاربرد تجاری.

در منابع مختلف تقسیم بندی­های متفاوتی برای الیسیتورها آمده است که در ادامه به آنها اشاره می­شود.

الیسیتورهای بیرونی: الیسیتورهایی هستند که از مواد ترشح شده به بیرون سلول مانند پلی­ساکاریدها، پلی‏آمین‏ها و اسیدهای چرب به‏دست می­آیند.

الیسیتورهای درونی: شامل مواد ترشح شده از درون سلول مانند گالاکتورونید و هپتا ـ بتا ـ گلوکوزید هستند.

الیسیتورها بر اساس برهم کنش الیسیتور-گیاه به دو گروه الیسیتورهای عمومی و الیسیتورهای ویژه نژادی تقسیم­بندی می‏‏شوند. الیسیتورهای عمومی باعث القا پاسخ­های دفاعی هم در گیاه میزبان و هم در گیاه غیرمیزبان می‏شوند، در حالی‏که الیسیتورهای ویژه نژادی پاسخ‏های دفاعی مقاومت به بیماری را تنها در میزبان­های ویژه بسته به حضور هم­زمان ژن­های غیربیماری­زا (Avirulence Genes “avr genes”) در پاتوژن و ژن‏های مقاومت (Resistance Genes “R genes”) در گیاه القا می­کنند (28 و 30).

در دیگر دسته­بندی رایج، الیسیتورها براساس طبیعت­شان به الیسیتورهای زیستی (Biotic) و الیسیتورهای غیرزیستی (Abiotic) طبقه­بندی می­شوند:

الف) الیسیتورهای زیستی

الیسیتورهای زیستی مولکول­هایی از پاتوژن­ها یا خود میزبان می­باشند که می­توانند باعث القای پاسخ­های دفاعی شوند. این مولکول­ها به ترکیباتی اطلاق می­شود که به‏وسیله عمل آنزیم­های گیاهی روی دیواره سلولی میکروارگانیسم­ها ساخته می­شوند. الیسیتورهای زیستی همچنین شامل ترکیبات طبیعی هستند که به‏وسیله سلول­های گیاهی در پاسخ به تحریک کننده­های مختلف تولید می­شوند. به‏عنوان نمونه می­توان از عصاره مخمر، ترکیبات پلی ساکاریدی دیواره سلولی، الیگوساکاریدها، پروتئین­ها، گلیکوپروتئین­ها و اسیدهای چرب نام برد (31).

ب) الیسیتورهای غیرزیستی

الیسیتورهای غیرزیستی شامل پرتو فرابنفش، فلزات سنگین، ترکیبات غیرضروری محیط کشت و بسیاری از موارد دیگر می‏گردند. الیسیتورهای غیرزیستی تحریک­کننده­های تولید فیتوآلکسین­ها بوده و از آن­ها در گیاهان زیادی به منظور افزایش متابولیت­های ثانویه استفاده گردیده است (25 و 31). در این مقاله افزایش تولید برخی از متابولیت­های ثانویه در کشت سلول گیاهی با استفاده از الیسیتورهای غیرزیستی مورد بررسی قرار می­گیرد.

مکانیسم تحریک در سلول­های گیاهی

الیسیتوربرای یک گیاه به‏عنوان محرک عمل می­کند که می­تواند پاسخ­های فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی و تجمع فیتوالکیسن­ها را در گیاه باعث شود. به‏خوبی معلوم شده است که تیمار گیاهان با الیسیتورهامشابه حمله پاتوژن­های ناسازگار موجب بروز آرایشی از عکس العمل­های دفاعی، از قبیل تجمع مجموعه­ای از متابولیت­های ثانویه دفاعی در گیاه سالم یا در کشت­های سلول گیاهی می‏شوند. مکانیسم دقیق تحریک هنوز به‏طور کامل شناخته نشده است، اما مکانسیم­های مختلفی در این خصوص مانند Ca+2 پیک، فاکتورهای موثر در پیوستگی غشا سلول، ممانعت یا فعالیت مسیرهای بین سلولی و تغییرات در استرس اسموتیکی پیشنهاد شده­اند. بعضی محققان فرض کرده­اند که الیسیتورهابه یک گیرنده غشای پلاسمایی برای فرآیند تحریک متصل می­شوند. کنش­های اصلی در تحریک سلول­ توسط الیسیتورها، اتصال به گیرنده­های پروتئینی خاص در غشای پلاسمایی، کاهش pH سیتوزول و تولید گونه­های اکسیژن­ واکنشگر و در نهایت فعال شدن رونویسی از ژن­های دخیل در فرآیندهای پاسخ دفاعی سلول است (32) .

انتقال الیسیتورها یا سیگنال­ها در سلول­های گیاهی می­تواند مکانیسم­های سودمندی در تولید متابولیت­های ثانویه را القا کند. در این مکانیسم­ها پیامبرهای ثانویه­ای تولید می­شوند که منجر به فعال­سازی آبشارهای پروتئین کیناز می‏شوند که آن­ها نیز به‏نوبه خود قادرند توانایی بیوسنتزی تولیدات گیاهی خاصی را فعال کنند. یک مکانیسم ممکن است برای تحریک زیستی در گیاهان براساس میان­کنش­های گیرنده الیسیتور خلاصه شود. زمانی‏که گیاه یا سلول گیاهی توسط الیسیتور تحریک می­شود، دسته­ای از واکنش­های بیوشیمیایی در چندین مرحله اتفاق می­افتند که در زیر اشاره می­شوند.

1- اتصال الیسیتور به گیرنده غشای پلاسمایی

2- تغییر در جریانات یونی در طول غشا: جریان یون­هایK+، Cl- و Ca+2 از فضای خارج سلول یا از ذخایر درون سلولی به سیتوپلاسم

3- تغییر سریع در الگوهای فسفریلاسیون پروتئینی، فعالیت پروتئین کیناز، فعالیت پروتئین G و تحریک پروتئین کیناز فعال شده میتوژن (Mitogen Activated Protein Kinase)

4- سنتز فسفولیپازهای A، C و D (PLA، PLCو PLD) و تولید پیامبرهای ثانویه، اینوسیتول 1 و4 و 5 تری فسفات (Inositol 1,4,5 triphosphate) و دی­اسیل­گلیسرول (Diacylglycerol) که از طریق آزادسازی Ca+2 درون سلولی و مسیر سیگنالی، اکتادکانوئید و نیتریک­اکساید را واسطه­گری می­کنند.

5- تولید گونه­های اکسیژن­ واکنشگر مانند یون سوپراکسید و پراکسید هیدروژن که ممکن است دارای اثرات مستقیم ضدمیکروبی باشند و نیز منجر به تولید مشتقات اسیدچرب فعال زیستی شوند و در اتصال عرضی پروتئین­های غنی از پرولین متصل به دیواره سلول شرکت کنند. پراکسید هیدروژنمی­تواند به‏عنوان یک پیام رسان ثانویه عمل کند و در فعال سازی رونویسی ژن­های دفاعی نقش داشته باشد.

6- اسیدی شدن سیتوپلاسم در اثر غیر فعال شدن H+-ATPase، کاهش در قطبیت غشا و افزایش pH خارج سلولی

7- فعال سازی NADPH اکسیداز که باعث تولید ROS و اسیدی شدن سیتوسول می­شود.

8- سازماندهی مجدد غشای سلولی

9- تجمع پروتئین­های مربوط به دفاع یا پروتئین­های مربوط به بیماری­زایی مانند کینازها، گلوکونازها، اندوپلی­گالاکتورونازهایی که منجر به آزاد سازی الیگومرهای پکتیکی پیام دهی می­شوند، گلیکوپروتئین­های غنی از هیدروکسی پرولین و بازدارندهای پروتئازی

10- واکنش حساسیت فوق­العاده (Hypersensitivity) و مرگ سلولی

11- تغییرات ساختمانی در دیواره سلولی (چوبی شدن دیواره سلولی، رسوب کالوس)

12- فعالیت رونویسی ژن­های مربوط به پاسخ دفاعی مانند فنیل­آلانین­ آمونیالاز (Phenylalanine Ammonialyase)، گلوتاتیون ترانسفراز (Glutathione S-transferase) و چالکون سنتاز (Chalcone Synthases). ضمناً مولکول­های دفاعی گیاه مانند تانن­ها و فیتوالکسین 4-2 بعد از تحریک توسط محرک کشف شده­اند.

13- سنتز اسید جاسمونیک و اسید سالیسیک به‏عنوان پیام­رسان­های ثانویه

14- مقاومت اکتسابی سیستمیک (Systemic Acquired Resistance)

آنچه مشخص شده این است که الیسیتورها از طریق گیرنده­های موجود در غشای پلاسمایی دریافت می­شوند و از طریق سیستم­های سیگنالینگ نسخه­برداری و ترجمه (بیان) ژن­های دخیل در بیوسنتز متابولیت­ها را تحت تاثیر قرار می­دهند (33).

نمونه­هایی از کاربرد الیسیتورهای غیرزیستی در تولید متابولیت­های ثانویه گیاهی

 عوامل مختلفی مانند غلظت الیسیتور، سن سلول­ها، نوع محیط کشت، زمان در معرض قراردهی یا افزودن الیسیتور به محیط کشت و مدت زمانی که محیط کشت در معرض الیسیتور قرار می­گیرد، بر تولید متابولیت­های ثانویه تاثیر می­گذارند (34). در بین الیسیتورهای غیرزیستی، الیسیتورهایی که در مقیاس نانو به‏منظور تولید متابولیت‌های ثانوی در کشت سلول­های گیاهی به­کار رفته‌اند دارای جایگاه ارزشمندی می­باشند.

به‏منظور تولید سنگوئینارین و تبائین در سوسپانسیون سلولی مریستم و ریشه گیاه خشخاش از نانو دی­اکسیدتیتانیوم استفاده شد که نتایج حاصل از آن طی 24 ساعت پس از اعمال تیمار افزایش دو آلکالوئید مزبور را تا 1/2 برابر نسبت به شاهد نشان داد (35). همچنین جهت تولید آلوئین در گیاه آلوئه­ورا از دو نانوالیسیتور نقره و دی­اکسیدتیتانیوم استفاده شد و نتایج حاکی از آن بود که دو نانوالیسیتور مذکور طی 48 ساعت پس از اعمال تیمار به­ترتیب باعث افزایش آلوئین به‏میزان 7/43 و 6/11 درصد شدند، اما پس از آن تولید آلوئین تا رسیدن به سطح کنترل کاهش نشان داد (36). اثر نانو نقره بر تقسیم سلولی و شاخص­های میتوزی که خود بر میزان تولید متابولیت­ها موثر می­باشد نیز مورد بررسی قرارگرفته است. در این رابطه محققین از گونه­های گیاهی جنس Allium استفاده کردند و دریافتند که نانونقره به‏صورت معنی­داری شاخص میتوزی را کاهش و دگرگونی ساختاری در کروموزوم را افزایش داد (34 و 35).

اگرچه نانو ذرات به‏راحتی به سیستم بافت گیاهی نفوذ کرده و روی میزان تولید متابولیت­های ثانویه تاثیر مثبت می­گذارند، اما در غلظت­های بالا و حضور طولانی مدت در محیط، به­واسطه کاهش شاخص میتوزی و آزاد کردن یون­های سمی باعث ایجاد مسمومیت سلولی (cytocyctic) می­شوند. چنانکه پیش­تر گفته شد، الیسیتورها در محیط کشت از طریق فعال کردن ژن­های مربوط به مکانیسم­های دفاعی باعث القای تشکیل متابولیت­های ثانویه می­شوند، اما پس از آن پاسخ سلولی نسبت به حضور الیسیتورها (نانوالیسیتورها) منفی بوده و با از بین رفتن نیروی محرک پروتون­ها (Proton-motive force) در عرض غشا، ناپایدار شدن غشا خارجی و آزاد کردن گونه­های اکسیژن­ واکنش‏گر همراه است. گونه­های اکسیژن­ واکنشگر تولید شده ممکن است جزئی از مکانیسم سمیت ژنی (Genotoxic) نانو الیسیتورها باشد که به صورت مستقیم پروتئین­ها را تخریب کرده و یا آنها را برای تجزیه حساس می­کند. در صورت حضور طولانی مدت نانوالیسیتورها در محیط، گونه­های اکسیژن­ واکنش‏گر روی DNA اثر مخرب داشته و منجر به کاهش تولید مواد موثره می­شود (37).

تابش پرتو فرابنفش به­طور معنی­داری باعث افزایش تولید رسوراترول در برگ و میوه و کالوس حاصل از آن­ها و همچنین سوسپانسیون سلولی تعدادی از ارقام انگور گردیده است (38  و 39).

استفاده از اسید سالیسیلیک و محرک­های قارچی روی تولید تاکسول در سوسپانسیون سلولی گیاه سرخدار (Taxus bacata) موثر بوده است. نتایج مطالعات در این خصوص نشان داده است که ترکیب اسید سالیسیک و محرک قارچی روی بیوماس سلول­های گیاه مزبور تاثیر نداشته، اما موجب تولید بیشترین میزان تاکسول شده­اند (40). همچنین در آزمایش دیگری با افزودن پیش­ماده­های موالونات و ان-بنزوئیل گلیسین به کشت سوسپانسیون سلولی گیاه سرخدار میزان تولید تاکسول تا 3 برابر افزایش یافت (41).

تولید 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین در کشت سلول یکی از گونه­های وحشی جنس کتان (Linum nodiflorum) تحت تاثیر متیل جاسمونات به‏میزان ده برابر افزایش یافت (36). کاربرد متیل جازمونات همچنین توانسته است تولید رسوراترول را در برگ و میوه و کالوس حاصل از آن­ها و همچنین سوسپانسیون سلولی تعدادی از ارقام انگور به‏میزان قابل توجهی افزایش دهد (42 و 43).

نیترات نقره (AgNO3) و کلرید کادمیوم (CdCl2) موجب تحریک تولید تروپان­آلکالوئید­­های اسکوپولامین و هیوسیامین از طریق کشت ریشه­های موئین گیاه تاتوره معطر (Bragmansia candida) شده و باعث افزایش تولید این آلکالوئید­ها شده­اند (44).

 در آزمایشی از سطوح مختلف نیتروژن و بنزیل آدنین به‏منظور تولید آلوئین از گیاه آلوئه­ورا استفاده شد و پس از 12 ماه میزان آلوئین نه تنها با کاربرد هر یک از دو الیسیتور فوق به‏تنهایی افزایش یافت، بلکه کاربرد هم‏زمان آن­ها نیز دارای اثرات متقابل مثبت بود و موجب افزایش بیشتر میزان آلوئین شد (45).

گزارش‏ها نشان داده­اند که با اضافه کردن قندها به‏منظور بهینه­سازی عناصر غذایی محیط کشت، میزان تولید متابولیت ثانویه بالا رفته است (46). در این رابطه، وقتی به­جای 5/2 درصد ساکارز در کشت سلولی گیاه حسن یوسف به‏میزان 5/7 درصد استفاده شد، عملکرد رزمارینیک اسید معادل 4 برابر افزایش یافت.

به‏دلیل اهمیت اقتصادی و افزایش تقاضا برای تولید متابولیت­های ثانویه، محققین به‏دنبال روش­هایی برای تولید هرچه بیشتر و با کیفیت­تر این ترکیبات هستند. بیوتکنولوژی قادر است کارآیی گیاهان دارویی را جهت تولید دارو افزایش دهد. کشت سلول، بافت و اندام­های گیاهی و بهره­گیری از الیسیتورها امکان تولید سریع و انبوه متابولیت­های با اهمیت را فراهم می­سازد. استفاده از الیسیتورها روش مناسبی به‏منظور تولید هر چه بیشتر متابولیت­های ثانوی در شرایط درون شیشه­ای می­باشد. به‏نظر می‏رسد ترکیبات فعال الیسیتورها نقش موثری در القای پاسخ­های دفاعی و افزایش تولید متابولیت­های ثانوی دارند. الیسیتورها بیان ژن را در گیاهان تحت تاثیر قرار داده و با از بین بردن سدهای مهارآنزیمی یا دست‏کاری مسیر آنزیم­ها باعث تغییر در سطح تولید متابولیت­ها می­گردند. همچنین از این طریق می­توان سطح آنزیم­های موثر در مسیر بیوسنتز را اندازه­گیری و جهت کنترل مسیرهای بیوسنتز آنها را شناسایی کرد و روش­های جدیدی در کنترل و تولید متابولیت­ها ارائه نمود.

منابع

1. Sarin R. Useful Metabolites from plant tissue cultures. Biotechnol. 2005; (4): 79-93.

2. Patel H, Krishnamurthy R. Elicitors in plant tissue culture. J. Pharmacog & Phytochem. 2013; 2(2): 60-65.

3. Reynolds, T. Aloe chemistry. In Reynolds T(Ed), the genus Aloe, CRC Press, Boca Raton. Florida, USA. 2004; 39-74.

4. Facchini PJ, St-Pierre B. Synthesis and trafficking of alkaloid biosynthetic enzymes. Curropin in Plant Biol. 2005; 8: 657-666.

5. Zaho J, Davis LC, Verpoorte R. Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites. Biotech Advances. 2005; 23(4), 283-333.

6. Furze JM, Rhodes MJ, Parr AJ, Robins RJ, et al. Abiotic factors elicit sesquiterpenoid phytoalexin production but not alkaloid production in transformed root cultures of Datura stramonium. Plant Cell Reports. 1991; 10(3): 111-114.

7. Smetanska I. Production of secondary metabolites using plant cell culture. Advances in Biochem Eng Biotech. 2008; 111: 187-228.

8. Rao SR, Ravishankar GA. Plant cell cultures: chemical factories of secondary metabolites. Biotech Advances. 2002; 20 (2): 101-153.

9. Dewick PM.Medicinal natural products. A biosynthetic approach. Second edition,Wiley. 2002; 7: 121-140.

10. Taiz L, Zeiger E. Plant physiology, 4th Ed. Sinauer Associates Inc. Sunderland, Massachusetts.USA; 2006; 260-287.

11. Sangwan NS, Farooqi AH, Shabih F, Sangwan RS. Regulation of essential oil production in plants. Plant Growth Regul. 2011; 34:21-34.

12. Yin L, Cheng Ying w, Espinasse B, Colman A, et al. More than the Irons: The effects of silver nanoparticles on Lolium multiform. Environ Sci & Technol. 2011; 45(1): 2360-2367.

13. Anterola AM, Jeon JH, Davin LB.Transcriptional control of monolignol biosynthesis in Pinus taeda. J Biol Chem. 2002; 227(21): 18272-18280.

14. Zhao JL, Zhou LG, Wu JY. Effects of biotic and abiotic elicitors on cell growth and tanshinone accumulation in Salvia miltiorrhiza cell cultures. Applied Microb & Biotech. 2010; 87(1): 137-144.

15. Mulabagal V, Tsay HS. Plant cell cultures, an alternative and efficient source for the production of biologically important secondary metabolites. Int J of Applied Sci & Eng. 2004; 2(1): 29-48.

16. Bladi A, Dixit VK. Yield enhancement Strategies for artemisinin production by suspension culture of Artemisia annua. Bioresource Technol. 2008; (99): 4609-4614.

17. Roberts SC, Shuler ML. Large-scale plant cell culture. Current Opinion in Biotech. 1997; (8): 154-159.

18. Matkowski A. Plant in vitro culture for the production of antioxidants. A review. Biotech Advance. 2008; (26): 548-560.

19. Saadat SS, Piri Kh, Esna-Ashari M, Gholami M, et al. Production and Realease of Tropane Alkaloids from Deadly Nighushade (Atropa belladonna L.) in Hydroponic Condition. Plant Production Tech. 2011; (11): 25-32.

20.Dellapenna D. Plant Metabolic Engineering . Plant Physiol. 2000; 125:160-163.

21. Bourgaud F, Gravot A, Goniter E. Production of plant secondary metabolites. Plant Science. 2002; 161(5): 839-851.

 

22. Dhawan OP, Lavania UC. Enhancing the productivity of secondary metabolites via induced polyploidy: a review. Euphytica. 1996; 87: 81 - 9.

23. Jasus-Gonzalez LDE, Weathers PJ. Tetraploid Artemisia annua hairy roots produce more artemisinin than diploid. Plant Cell Reports. 2003; 21(8): 809-813.

 

24. Niimi  H, Watenabe M,  Serizawa  H, et al. Amiprophosmethyl- induced  efficient  in vitro production of polyploids in Raphano brassica with the aid of aminoethoxyvinylyglycine (AVG) in the culture medium. Breeding Science.2015; 65(5):396-402.

 

25. Zhao DX, Fu CX, Han YS, Lu DP. Effects of elicitation on jaceosidin and hispidulin production in cell suspension cultures of Saussurea medusa. Process Biochem. 2005; 40(2): 739-745.

26.  Radman R, Saez T, Bucke C, Keshavarz T. Elicitation of plants and microbial cell systems. Biotech & Applied Biochem. 2003; 37(1): 91-102.

27. Ramachandra CT, Srinivasa Rao P. Processing of Aloe vera Leaf Gel :A Review .Am J Agric & Bio Sci. 2008; 3(2): 502-51.

27. Zhang C, Yan Q, Cheuk WK, Wu J. Enhancement of tanshinone production in Salvia miltiorrhiza hairy root culture by Ag+ elicitation and nutrient feeding. Planta Medica. 2004; 70(2): 147-151.

 

28. Zhang C, Yan Q, Cheuk WK, Wu J. Enhancement of tanshinone production in Salvia miltiorrhiza hairy root culture by Ag+ elicitation and nutrient feeding. Planta Medica. 2004; 70(2): 147-151.

29. Howlett B. Secondary metabolites toxins and nutrition of plant pathogenic Fungi. Current Opinion in Biotech. 2006; 9(4): 371-375.

30. Zhang Y, Mian MR, Bouton JH. Recent Molecular and Genomics Studies on Stress Tolerance of Forage and Turf Grasses. Crop Science. 2006; 46: 497-511.

31. Choi HK, Yun JH, Kim SL, Son JS, et al. Enhanced production of paclitaxel by semi-continuous batch process (SCBP) in suspension culture of Taxus chinensis. Enzyme and Micro Tech. 2001; 29: 583-586.

32. Pitta-Alvarez SI, Spollansky TC, Giulietti AM. The influence of different biotic and abiotic nitrogen metabolism of growing spinach. Biol Trace Element Res. 2000; 110(2): 179-190.

33. Lee-Sae N, Kerdchoechuen O, Laohakunjit N. Effect of ammonium nitrate on cell growth and production of phenolic compounds in cell suspension cultures of Vitis vinifera. Aric Sci l. 2011; 42(2): 249-252.

34. Bota C, Deliu C. The effect of copper sulphate on the production of flavonoids in Digitalis lanata cell cultures. Farmacia. 2011; 59(1): 113-118.

35. Khodayari M, Omidi M, Boushehri AK, Yazdani D, et al. Effect of biotic and nano elicitors on enhancement of alkaloids in Papaver somniferum L. Iranian J Hort Sci. 2014; 14(45): 287-295.

36. Raei M, Angaji SAH, Omidi M, Khodayari M. Effect of abiotic elicitors on tissue culture of Aloe vera. Int J Biosci. 2014; 5(1): 74-81.

37. Lok CN, Ho C, Chen R, He QY, et al. Proteomics analysis of the mode of antibacterial action of silver nanoparticles. J Proteomic Res. 2007; 5(4): 916-24.

38. Esna-Ashari M, Mahmoudi Pour A. Ultra violet irradiation enhances resveratrol production in organs and cell suspension cultures of two Iranian grape cultivars. Food. 2010; 1: 23-26.

39. Esna-Ashari A, Mahmoudi Pour A, Karami O. The effect of UV irradiation on resveratrol production in leaf and fruit of two Iranian grape (Vitis vinifera L.) cultivars. Iranian J Hort Sci. 2008; 1: 2-10.

40. Long-Jiang Y, Wen-Zhi L, Wen-Min Q, Hui-Bi Xu. Effects of Salicylic acid on fungal elicitor-induced membrane-lipid peroxidation and Taxol production in cell suspension cultures of TaxusChinensis. J Process Biochem. 2010; 370: 477-482.

41. Cusido RM, Palazon J, Bonfill M, Navia Osorio A, et al. Improved paclitaxel and baccatin III production suspension culture of Taxus media. Biotech Progress. 2002; 18(3): 418-423.

42. Esna-Ashari M, Mahmoudi Pour A. Effect of methyl jasmonate on resveratrol production in organs and cell suspension cultures of two Iranian grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars. J Hort Sci & Biotech. 2011; 6(8): 557-562.

43. Esna-Ashari M, Mahmoudi Pour A, Karami O, Hesari M. Changes in the amount of resveratrol in leaf and fruit and the possible effect of methyl jasmonate on it in two Iranian grape (Vitis vinifera L.) cultivars. J Sci & Tech Agric & Nat Reso. 2008; (45): 571-579.

44. Radman R, Saez T, Bucke  C, Keshavarz T. Elicitation of plant and microbial systems. Biotech & Applied Biochem. 2003; 37: 91-102.

45. Hazrati S, Tahmasebi Z, Babaei A. Enhancaing yield and aloin concentration of Aloe vera plants by stimutaneous application of N and benzyladenine. J Med Plant Res. 2010; 6(10): 1834-1841.

46. Misava M. Production of useful plant metabolites. In: Flechter A, editors. Adv. Biochem.Eng.Biotechnol. Berlin:springer-verlag. 1985; 59-88.

مقدمه

گیاهان دارویی به‏عنوان سرمایه­های ژنتیکی ارزشمند در شمار میراث­های بومی کشورها محسوب می­شوند و دارای اهمیت جهانی هستند. این گیاهان در طول تاریخ جز منابع اصلی پزشکی و داروسازی در اکثر نقاط جهان بوده­اند. امروزه برای درمان و حفظ سلامتی انسان تأکید زیادی بر استفاده از داروهایی با منشا طبیعی می­شوند (1). داروهای گیاهی به‏دلیل نزدیکی و سازگاری با فیزیولوژی بدن انسان در مقایسه با داروهای شیمیایی خطرات و عوارض جانبی کمتری دارند. این ویژگی یکی از دلایل اصلی رویکرد و تمایل دوباره مردم جهان به گیاهان دارویی و استفاده از آن­ها در قیاس با داروهای شیمیایی و مرکب از مواد مصنوعی (Synthetic) شده است (2و3).

خواص دارویی این گیاهان، به ترکیباتی به‏نام متابولیت­­های ثانویه نسبت داده می­شود .متابولیت­های ثانویه ترکیباتی هستند که تنها از متابولیت­های اولیه (متابولیت­های مربوط به تغذیه و بقا) که برای حفظ حیات موجود ضروری هستند تولید می­شوند. نشان داده شده است که این محصولات ثانویه برای گیاهان و جانورانی که آنها را سنتز می­کنند بسیار مفیدند (4). متابولیت‏های ثانویه منحصر به گونه یا حتی نژاد خاص بوده و اغلب طی یک دوره خاص رشد و نمو در گیاه تولید می­شوند. این ترکیبات دارای عملکردهای اکولوژیکی مهم در گیاهان هستند و نقش حفاظتی در مقابل گیاه‏خواران و عوامل بیماری­زای میکروبی و همچنین جذب گرده افشان­ها ایفا می­کنند. این ترکیبات به گروه­های مختلفی از جمله آلکالوئیدها، آنتوسیانین­ها، فلاونوئیدها، کوئینون­ها، استروئیدها و ترپنوئیدها تقسیم می­شوند و کاربردهای تجاری متنوعی به‏عنوان دارو، رنگ، حشره­کش و چاشنی از نقطه ­نظر طعم، بو و غیره دارند (5).

بر اساس برخی از گزارش‏ها تاکنون حداقل 000/100 متابولیت ثانویه از 000/50 گونه گیاهی شناسایی شده است و هرسال نیز 4000 متابولیت جدید از گونه­ها و واریته­های مختلف گیاهی کشف می­شوند (6). برخی از این ترکیبات مانند دیجیتوکسین، شیکونین، عطر جاسمین و داروهای ضد سرطان مانند وین­بلاستین، وین­کریستین و تاکسول از ارزش اقتصادی بالایی برخوردارند و قیمت آنها از چند دلار تا چند هزار دلار به‏ازای هر کیلوگرم تغییر می­کند. تولید انبوه و سریع این مواد پیچیده در مقیاس زیاد از طریق روش­های طبیعی عمدتا مشکل و یا تقریبا غیرممکن است و از سوی دیگر محدودیت­های مختلف مانع تأمین این مواد از طبیعت می‏شوند. با توجه به این ­که به­طور طبیعی سرعت تولید متابولیت­های ثانویه غالبا بسیار کند بوده و مستلزم مدت زمان طولانی است، استفاده از روش­های بیوتکنولوژی برای تولید سریع و انبوه متابولیت­های ثانویه و مواد دارویی گیاهی امری ضروری به نظر می­رسد (7).

محصولات طبیعی گیاهان به‏عنوان منابع ارزشمندی از دارو در خدمت بشر می­باشند، به­طوری­که امروزه این محصولات و مشتقات و آنالوگ­های آن­ها بیش از 50 درصد از مواد اولیه داروها را در مصارف کلینیکی مهیا می­کنند. حدود 85 درصد از داروهای سنتی مورد استفاده شامل عصاره­های گیاهی می­شوند و محصولات طبیعی مشتق شده از گیاهان عالی 25 درصد از کل را تشکیل می­دهند. عامل ضد سرطان پاکلی­تاکسول (Taxol) و وین­کریستین (Oncovin) و مسکن اسکوپولامین و سست کننده عضلات توبوکورارین بعضی از داروهایی هستند که از متابولیت­های ثانویه مشتق شده­اند و مصرف کلینیکی دارند (8). در این نوشتار ضمن اشاره به مسیر­های اصلی بیوسنتزی متابولیت­های ثانویه، روش­های بیوتکنولوژی گیاهی در تولید این متابولیت­ها مرور می‏شوند.

مسیر­های بیوسنتزی متابولیت­های ثانویه

با وجود اینکه متابولیت­های ثانویه بسیار متنوعند، اما تعداد مسیرهای اصلی بیوسنتزی آنها محدود و مشخص است. پیش‏ماده‏های ساختاری متابولیت­های ثانویه به‏عنوان منابع تولید این متابولیت­ها در سه مسیر اصلی شامل مسیرهای استات ـ مالونات، استات ـ موالونات و اسید شیکمیک وارد می­شوند(9). سه گروه از محصولات ثانویه براساس ویژگی‌های بیوسنتزی وجود دارند که به ترپن­ها، ترکیبات فنولی و ترکیبات نیتروژن­دار تقسیم می­شوند.

الف) ترپن­ها: ترپن­ها یا ترپنوئیدها بزرگترین گروه محصولات ثانویه را شامل می­شوند. مواد متنوع این گروه معمولا در آب غیرمحلولند. ترپن­ها از پیوستن واحدهای پنج کربنی ساخته شده از طریق مسیر موالونیک اسید تشکیل می­شوند. بیشتر ترپن­ها اعمال مشخصی در رشد و نمو گیاه به عهده دارند. به‏عنوان مثال پیش ماده آبسزیک اسید، یک سزکوئی­ترپن است. استروئیدها مشتقات تری‌ترپن­ها بوده و از اجزای ضروری غشای پلاسمایی به‏حساب می­آیند. بدین ­ترتیب بعضی از ترپن­ها نقش­های اولیه مهمی در گیاه به عهده دارند. این مواد سمی بوده و در بسیاری از گیاهان

به‏عنوان ترکیبات دفاعی ضدگیاه­خواری ایفای نقش می‏کنند (10 و 11).

ب) ترکیبات نیتروژن­دار: در ساختمان بسیاری از محصولات ثانویه گیاهان نیتروژن وجود دارد. این ترکیبات شامل آلکالوئیدها و گلیکوزیدهای سیانوژنیک می­باشند. آلکالوئیدها محصولات طبیعی هستند که در ساختمان خود دارای نیتروژن بوده و معمولاً ساختار حلقوی دارند. بسیاری از داروهای رایج بر پایه ترکیبات آلکالوئیدی شکل گرفته­اند که از جمله آنها مسکالین (Mescaline)، نیکوتین (Nicotine)، کوکائین (Cocaine) و مورفین (Morphine) می­باشند. گلیکوزیدهای سیانوژنیک و گلیکوزینولیت­ها نیز گروهی دیگر از ترکیبات نیتروژن­دار را شامل می­شوند. آمیگدالین (Amygdaline) و پروناسین (Prunasin) از مهم‏ترین گلیکوزیدهای سیانوژنیکی هستند که در خانواده گندمیان (Poaceae) و گل­سرخ (Rosaceae) قرار دارند (12).

ج) ترکیبات فنولی: گیاهان طیف وسیعی از محصولات ثانویه را تولید می­کنند که دارای یک گروه فنولی بوده و به‏نام ترکیبات فنولی طبقه­بندی می­شوند و شامل فنول­های ساده، لیگنین­ها، فلاونوئیدها و تانن­های فشرده می­باشند. باتوجه به تنوع زیاد شیمیایی، ترکیبات فنولی نقش­های متفاوتی را در گیاهان بازی می­کنند. در گیاهان اکثر ترکیبات فنولی از فنیل­آلانین و تیروزین مشتق شده­اند. از متابولیت­های ثانویه این گروه می­توان به مشتقات فنیل­پروپان ساده مثل اسید فرولیک (Ferulic acid) و اسید کافئیک (Caffeic acid)، کومارین­ها مثل آمبلیفرون (Umbeliferon) و سورالن (Psoralen)) و مشتقات اسید بنزوئیک نظیر اسید سالیسیلیک و وانیلین (Vanillin) اشاره نمود (13).

بیوتکنولوژی گیاهان دارویی

امروزه بیوتکنولوژی گیاهان دارویی به‏عنوان ابزاری نوین برای افزایش تولید متابولیت­های ثانویه به­کار گرفته می­شود که از طریق انتخاب،­ ازدیاد در شرایط درون شیشه­ای (in vitro)، نگه‏داری ژنوتیپ­های ­در حال انقراض توسط روش­های حفاظت انجمادی (Cryopreservation) و تولید گیاهان تراریخت صورت می­گیرد. کشت سلول گیاهی (Plant cell culture) و کشت اندام (Organ culture) که شامل کشت جوانه، جنین، ساقه، ریشه و ریشه­های مویین می­باشد از جمله روش­های بیوتکنولوژی هستند که به‏منظور تولید متابولیت­های ثانویه مورد استفاده قرار گرفته­اند (14). با این حال، به‏دلیل عدم تمایز بافت­های کشت شده در اغلب کشت­های سوسپانسیون سلولی (کشت سلول­های معلق در محیط مایع)، مقدار تولید متابولیت‏های ثانویه در این سیستم کم است و برخی متابولیت­ها نیز فقط در بافت­های خاص دارای تمایز مورفولوژیکی تجمع می­یابند (15 و 16). لذا تولید متابولیت­های ثانویه با استفاده از تکنولوژی کشت بافت گیاهی هنوز دچار محدودیت­های بیولوژیکی و بیوتکنولوژیکی است. به‏همین منظور روش­های متعددی برای افزایش تولید متابولیت­های ثانویه در کشت بافت استفاده می‌شوند که عبارتند از:

بهینه­سازی ترکیبات محیط کشت

بسیاری از اجزای محیط کشت تعیین­کننده رشد سلول و تولید متابولیت­ها می­باشد. بهینه­کردن نوع و غلظت هورمون­های گیاهی غالبا موثر بوده و تغییر فاکتورهای محیطی چون سطوح موادغذایی، نور و منبع کربن نیز ممکن است در افزایش تولید تاثیرگذار باشند. همچنین منبع نیتروژن می­تواند در عملکرد محصول نقش با اهمیتی داشته باشد. برای نمونه کاهش سطح NH4 و افزایش میزان NO، تولید آرتمیزین را در ریشه­های موئین گیاه گندواش یا خاراگوش شیرین (Artemisia annua) تقویت کرده و مقادیر بالای نیتروژن نیز موجب بازدارندگی رشد و تولید این گیاه می­‏شوند (17).

غیرمتحرک­سازی (تثبیت) سلول­ها

در بیشتر موارد محصولات تشکیل شده در سیستم سوسپانسیون سلولی در واکوئل سلول ذخیره می­شوند. برای این­که این محصولات از واکوئل سلول­های گیاهی خارج شوند باید از دو غشای پلاسمایی و تونوپلاست عبور کنند. کارهای زیادی انجام شده است تا سلول گیاهی را برای مدتی کوتاه نفوذپذیر کند، به گونه­ای که سلول توانایی خود را حفظ نموده و مقدار انتقال متابولیت­ها از سلول افزایش یابد. نفوذپذیری غشا به تشکیل منافذ در یک یا بیشتر سیستم­های غشایی سلول­های گیاهی که عبور مولکول­ها را به‏داخل و خارج سلول ممکن سازد بستگی دارد. نفوذپذیری سلول­ها را می­توان به وسیله اندازه­گرفتن آنزیم‏های متابولیسم اولیه شامل هگزوکیناز، گلوکز 6 فسفات دهیدروژناز، ایزوسیترات دهیدروژناز و مالیک و سیترات سینتتاز کنترل کرد. دامنه گسترده­ای از عوامل نفوذپذیرکننده برای افزایش تحریک­پذیری و رها سازی محصولات ذخیره شده در درون سلول به محیط کشت اضافه می­شود. انواع نمک­ها، حلال­های آلی مثل ایزوپروپانول و دی­متیل­سولفوکساید، پلی­ساکاریدهایی چون کیتوزان و سطح­دهنده­هایی نظیر توئین­20 به‏عنوان عوامل نفوذپذیرکننده استفاده شده­اند. روش­هایی مثل اولتراسونیک و الکتروپوریشن نیز برای القای نفوذپذیری سلول­ها به­کار گرفته شده­اند (18، 19 و 20).

کاربرد مهندسی متابولیک

مهندسی متابولیک به‏طور معمول به‏عنوان تکنیکی برای هدایت یک یا چند واکنش آنزیمی به‏منظور تولید ترکیبات جدید در سلول و بهبود تولید ترکیبات خروجی تعریف می­شود. مهندسی متابولیک همچنین به استفاده از تکنولوژی DNA نوترکیب برای اصلاح فعالیت­های درون سلولی از طریق دست­کاری عملکردهای آنزیمی و تنظیمات داخلی سلول اطلاق می­شود. قسمت اعظمی از تحقیقات در زمینه متابولیت­های ثانویه، روی شناسایی و دستکاری ژنتیکی آنزیم­های دخیل در مسیر متابولیکی سنتز یک متابولیت ثانویه، متمرکز شده است. ابزار طبیعی که در فرآیند مهندسی ژنتیک و در اکثر گونه­های گیاهی و بخصوص گیاهان دولپه به‏کار می­رود، یک باکتری خاکزی به‏نام آگروباکتریوم تیومفاسینس (Agrobacterium tumefacience) است. تولید متابولیتهای ثانویه عموما تحت کنترل بیش از یک ژن می­باشد. اگرچه تحقیقات فراوانی طی سی سال گذشته در زمینه تولید متابولیت‏های ثانویه انجام شده است، لیکن به‏دلیل فقدان اطلاعات پایه در رابطه با مسیرهای بیوسنتزی تولید مواد مذکور و کنترل چند آنزیمی این مسیرها و همچنین عدم آشنایی و دسترسی کافی به بیورآکتورها، تولید اقتصادی آن­ها به جز در موارد خاص امکان­پذیر نشده است (21).

در بیوسنتز مونوترپن­ها در گیاه آویشن (Thymus vulgaris) و نعناع فلفلی (Mentha piperita)، یک سیستم چندژنی با برهم­کنش اپیستاتیک (برهمکنش ژن­های غیرآلل) نقش دارد، اما در پونه آبی (Mentha aquatica) همه ژن­های دخیل در مسیرهای بیوشیمیایی مونوترپن­ها به صورت دو آللی با وراثت ساده غالب و مغلوبی است. بنابراین مهندسی ژنتیک می­تواند به‏عنوان ابزاری قدرتمند جهت تولید متابولیت­های ثانویه جدید و همچنین افزایش مقدار متابولیت­های ثانویه موجود در یک گیاه به کار گرفته شود.

استفاده از پلی­پلوئیدی

پلی­پلوئیدی به افزایش تعداد سری کروموزوم­های یک موجود تا چند برابر تعداد کروموزوم­های اصلی (X) آن گفته می­شود. پلی پلوئیدی مکانیسم هایی را در سلول فعال کرده و در نتیجه میزان DNA الگو و به‏دنبال آن نسخه برداری و ترجمه نیز تحت تاثیر قرار گرفته و منجر به افزایش، کاهش و حتی خاموشی برخی ژن‏ها می‏شود، و به این صورات بسیاری از صفات فیزیولوژیکی و ریخت شناسی گیاه را تحت تاثیر قرار می‏دهد (22).

اگرچه پلی­پلوئیدی مصنوعی به­عنوان روشی برای اصلاح گیاهان زراعی به­کاربرده شده است، اما در مورد گیاهان دارویی نیز برای افزایش متابولیت­های ثانویه در گیاهان اصلاح شده به‏کار می­رود. غالب گیاهان تتراپلوئید به­خاطر داشتن تعداد کروموزوم‏های دوبرابر، اندازه بزرگتری دارند و از آن­ها متابولیت ثانویه بیشتری به­دست می­آید. برای مثال در گیاه گندواش، ریشه­های موئین تتراپلوئید ایجاد شده در مقایسه با ریشه­های موئین دیپلوئید پنج برابر آرتمیزین تولید کرده­اند (23). با این‏حال افزایش سطح پلوئیدی در گیاهان همواره تولید متابولیت­های ثانویه را ارتقا نداده بلکه در مواردی باعث کاهش آن­ها نیز شده است. به­طور مثال این پدیده در یکی از گونه­های داتوره (Datura innoxia) دیده شده است (24).

کاربرد الیسیتورها

الیسیتور (Elicitor) از ریشه Elicit به‏معنای بیرون کشیدن یا استخراج کردن مشتق گردیده و معادل "استخراج­گر" یک واژه تعریف شده علمی برای فاکتورهایی است که به‏طور مستقیم یا غیر مستقیم تغییرات دفاعی قابل القا را در سیستم گیاهی مورد هدف قرار می­دهد و منجر به فعال سازی دسته­ای از مکانیزم­های دفاعی و بیوسنتز مواد شیمیایی مفیدی می­شود که در سازگاری گیاهان نسبت به شرایط پرتنش گیاه نقش اساسی دارند. به‏طور خلاصه الیسیتورها محرک­های فیزیکی یا ترکیبات شیمیایی با منشا زیستی و غیرزیستی هستند که می­توانند پاسخ­هایی را در گیاه القا کنند که باعث سنتز و تجمع متابولیت­های ثانویه مشابه و جدید در سلول­ها ­شوند. الیسیتورها برای گیاه یک‏سری از پیام­های شیمیایی را می­فرستند که سبب رها شدن پاسخ­های فیزیولوژیکی و مرفولوژیکی و تجمع فیتوالکسین می­شود. طی پاسخ به سیگنال الیسیتور، سیستم دفاعی گیاه فعال می­شود و در نتیجه بیان ژن­های دفاعی، متابولیت­های ثانویه تجمع می‏یابند )25(. کاربرد الیسیتورها به‏میزان محدود و در غلظت­های پایین، بیوسنتز ترکیبات خاصی را در سیستم سلولی زنده تحریک یا بهبود بخشیده و به­طور کلی زمان دستیابی به مقادیر بالای متابولیت­ها را کاهش می­دهد (26 و 27).

استخراج­گری (Elicitation) تقریبا موثرترین راه‏کار عملی برای افزایش تولید ترکیبات ثانویه مطلوب در سیستم­های گیاه، اندام و سلول است (26 و 27). الیسیتورها ممکن است ژن جدیدی را فعال کنند که می­تواند آنزیم­ها و در نهایت مسیرهای بیوسنتزی مختلفی را راه­اندازی نموده و باعث تشکیل متابولیت­های ثانویه شود (28 و 29). شروع پاسخ­های دفاعی در گیاه شبکه­ای از انتقال سیگنال (Signal transduction) را القا می­کند که با تشخیص الیسیتور توسط پذیرنده­ها­ی سطح سلول شروع می­شود (30). مسیر­های انتقال سیگنال در پاسخ­های دفاعی گیاه در شکل 1 نشان داده شده­اند.

 

 

شکل 1: مسیر­های انتقال سیگنال در پاسخ­های دفاعی گیاه (اژائو و همکاران (24))

 

استفاده از الیسیتورها در پژوهش­های مربوط به زیست فناوری متابولیت­های ثانوی گیاهی دو هدف اصلی را دنبال می­کند: نخست کسب یافته­هایی در زمینه مسیرهای بیوسنتزی که منجر به تشکیل و تنظیم متابولیت‏های ثانوی می­شود. دوم افزایش تولید متابولیت‏های ثانوی برای کاربرد تجاری.

در منابع مختلف تقسیم بندی­های متفاوتی برای الیسیتورها آمده است که در ادامه به آنها اشاره می­شود.

الیسیتورهای بیرونی: الیسیتورهایی هستند که از مواد ترشح شده به بیرون سلول مانند پلی­ساکاریدها، پلی‏آمین‏ها و اسیدهای چرب به‏دست می­آیند.

الیسیتورهای درونی: شامل مواد ترشح شده از درون سلول مانند گالاکتورونید و هپتا ـ بتا ـ گلوکوزید هستند.

الیسیتورها بر اساس برهم کنش الیسیتور-گیاه به دو گروه الیسیتورهای عمومی و الیسیتورهای ویژه نژادی تقسیم­بندی می‏‏شوند. الیسیتورهای عمومی باعث القا پاسخ­های دفاعی هم در گیاه میزبان و هم در گیاه غیرمیزبان می‏شوند، در حالی‏که الیسیتورهای ویژه نژادی پاسخ‏های دفاعی مقاومت به بیماری را تنها در میزبان­های ویژه بسته به حضور هم­زمان ژن­های غیربیماری­زا (Avirulence Genes “avr genes”) در پاتوژن و ژن‏های مقاومت (Resistance Genes “R genes”) در گیاه القا می­کنند (28 و 30).

در دیگر دسته­بندی رایج، الیسیتورها براساس طبیعت­شان به الیسیتورهای زیستی (Biotic) و الیسیتورهای غیرزیستی (Abiotic) طبقه­بندی می­شوند:

الف) الیسیتورهای زیستی

الیسیتورهای زیستی مولکول­هایی از پاتوژن­ها یا خود میزبان می­باشند که می­توانند باعث القای پاسخ­های دفاعی شوند. این مولکول­ها به ترکیباتی اطلاق می­شود که به‏وسیله عمل آنزیم­های گیاهی روی دیواره سلولی میکروارگانیسم­ها ساخته می­شوند. الیسیتورهای زیستی همچنین شامل ترکیبات طبیعی هستند که به‏وسیله سلول­های گیاهی در پاسخ به تحریک کننده­های مختلف تولید می­شوند. به‏عنوان نمونه می­توان از عصاره مخمر، ترکیبات پلی ساکاریدی دیواره سلولی، الیگوساکاریدها، پروتئین­ها، گلیکوپروتئین­ها و اسیدهای چرب نام برد (31).

ب) الیسیتورهای غیرزیستی

الیسیتورهای غیرزیستی شامل پرتو فرابنفش، فلزات سنگین، ترکیبات غیرضروری محیط کشت و بسیاری از موارد دیگر می‏گردند. الیسیتورهای غیرزیستی تحریک­کننده­های تولید فیتوآلکسین­ها بوده و از آن­ها در گیاهان زیادی به منظور افزایش متابولیت­های ثانویه استفاده گردیده است (25 و 31). در این مقاله افزایش تولید برخی از متابولیت­های ثانویه در کشت سلول گیاهی با استفاده از الیسیتورهای غیرزیستی مورد بررسی قرار می­گیرد.

مکانیسم تحریک در سلول­های گیاهی

الیسیتوربرای یک گیاه به‏عنوان محرک عمل می­کند که می­تواند پاسخ­های فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی و تجمع فیتوالکیسن­ها را در گیاه باعث شود. به‏خوبی معلوم شده است که تیمار گیاهان با الیسیتورهامشابه حمله پاتوژن­های ناسازگار موجب بروز آرایشی از عکس العمل­های دفاعی، از قبیل تجمع مجموعه­ای از متابولیت­های ثانویه دفاعی در گیاه سالم یا در کشت­های سلول گیاهی می‏شوند. مکانیسم دقیق تحریک هنوز به‏طور کامل شناخته نشده است، اما مکانسیم­های مختلفی در این خصوص مانند Ca+2 پیک، فاکتورهای موثر در پیوستگی غشا سلول، ممانعت یا فعالیت مسیرهای بین سلولی و تغییرات در استرس اسموتیکی پیشنهاد شده­اند. بعضی محققان فرض کرده­اند که الیسیتورهابه یک گیرنده غشای پلاسمایی برای فرآیند تحریک متصل می­شوند. کنش­های اصلی در تحریک سلول­ توسط الیسیتورها، اتصال به گیرنده­های پروتئینی خاص در غشای پلاسمایی، کاهش pH سیتوزول و تولید گونه­های اکسیژن­ واکنشگر و در نهایت فعال شدن رونویسی از ژن­های دخیل در فرآیندهای پاسخ دفاعی سلول است (32) .

انتقال الیسیتورها یا سیگنال­ها در سلول­های گیاهی می­تواند مکانیسم­های سودمندی در تولید متابولیت­های ثانویه را القا کند. در این مکانیسم­ها پیامبرهای ثانویه­ای تولید می­شوند که منجر به فعال­سازی آبشارهای پروتئین کیناز می‏شوند که آن­ها نیز به‏نوبه خود قادرند توانایی بیوسنتزی تولیدات گیاهی خاصی را فعال کنند. یک مکانیسم ممکن است برای تحریک زیستی در گیاهان براساس میان­کنش­های گیرنده الیسیتور خلاصه شود. زمانی‏که گیاه یا سلول گیاهی توسط الیسیتور تحریک می­شود، دسته­ای از واکنش­های بیوشیمیایی در چندین مرحله اتفاق می­افتند که در زیر اشاره می­شوند.

1- اتصال الیسیتور به گیرنده غشای پلاسمایی

2- تغییر در جریانات یونی در طول غشا: جریان یون­هایK+، Cl- و Ca+2 از فضای خارج سلول یا از ذخایر درون سلولی به سیتوپلاسم

3- تغییر سریع در الگوهای فسفریلاسیون پروتئینی، فعالیت پروتئین کیناز، فعالیت پروتئین G و تحریک پروتئین کیناز فعال شده میتوژن (Mitogen Activated Protein Kinase)

4- سنتز فسفولیپازهای A، C و D (PLA، PLCو PLD) و تولید پیامبرهای ثانویه، اینوسیتول 1 و4 و 5 تری فسفات (Inositol 1,4,5 triphosphate) و دی­اسیل­گلیسرول (Diacylglycerol) که از طریق آزادسازی Ca+2 درون سلولی و مسیر سیگنالی، اکتادکانوئید و نیتریک­اکساید را واسطه­گری می­کنند.

5- تولید گونه­های اکسیژن­ واکنشگر مانند یون سوپراکسید و پراکسید هیدروژن که ممکن است دارای اثرات مستقیم ضدمیکروبی باشند و نیز منجر به تولید مشتقات اسیدچرب فعال زیستی شوند و در اتصال عرضی پروتئین­های غنی از پرولین متصل به دیواره سلول شرکت کنند. پراکسید هیدروژنمی­تواند به‏عنوان یک پیام رسان ثانویه عمل کند و در فعال سازی رونویسی ژن­های دفاعی نقش داشته باشد.

6- اسیدی شدن سیتوپلاسم در اثر غیر فعال شدن H+-ATPase، کاهش در قطبیت غشا و افزایش pH خارج سلولی

7- فعال سازی NADPH اکسیداز که باعث تولید ROS و اسیدی شدن سیتوسول می­شود.

8- سازماندهی مجدد غشای سلولی

9- تجمع پروتئین­های مربوط به دفاع یا پروتئین­های مربوط به بیماری­زایی مانند کینازها، گلوکونازها، اندوپلی­گالاکتورونازهایی که منجر به آزاد سازی الیگومرهای پکتیکی پیام دهی می­شوند، گلیکوپروتئین­های غنی از هیدروکسی پرولین و بازدارندهای پروتئازی

10- واکنش حساسیت فوق­العاده (Hypersensitivity) و مرگ سلولی

11- تغییرات ساختمانی در دیواره سلولی (چوبی شدن دیواره سلولی، رسوب کالوس)

12- فعالیت رونویسی ژن­های مربوط به پاسخ دفاعی مانند فنیل­آلانین­ آمونیالاز (Phenylalanine Ammonialyase)، گلوتاتیون ترانسفراز (Glutathione S-transferase) و چالکون سنتاز (Chalcone Synthases). ضمناً مولکول­های دفاعی گیاه مانند تانن­ها و فیتوالکسین 4-2 بعد از تحریک توسط محرک کشف شده­اند.

13- سنتز اسید جاسمونیک و اسید سالیسیک به‏عنوان پیام­رسان­های ثانویه

14- مقاومت اکتسابی سیستمیک (Systemic Acquired Resistance)

آنچه مشخص شده این است که الیسیتورها از طریق گیرنده­های موجود در غشای پلاسمایی دریافت می­شوند و از طریق سیستم­های سیگنالینگ نسخه­برداری و ترجمه (بیان) ژن­های دخیل در بیوسنتز متابولیت­ها را تحت تاثیر قرار می­دهند (33).

نمونه­هایی از کاربرد الیسیتورهای غیرزیستی در تولید متابولیت­های ثانویه گیاهی

 عوامل مختلفی مانند غلظت الیسیتور، سن سلول­ها، نوع محیط کشت، زمان در معرض قراردهی یا افزودن الیسیتور به محیط کشت و مدت زمانی که محیط کشت در معرض الیسیتور قرار می­گیرد، بر تولید متابولیت­های ثانویه تاثیر می­گذارند (34). در بین الیسیتورهای غیرزیستی، الیسیتورهایی که در مقیاس نانو به‏منظور تولید متابولیت‌های ثانوی در کشت سلول­های گیاهی به­کار رفته‌اند دارای جایگاه ارزشمندی می­باشند.

به‏منظور تولید سنگوئینارین و تبائین در سوسپانسیون سلولی مریستم و ریشه گیاه خشخاش از نانو دی­اکسیدتیتانیوم استفاده شد که نتایج حاصل از آن طی 24 ساعت پس از اعمال تیمار افزایش دو آلکالوئید مزبور را تا 1/2 برابر نسبت به شاهد نشان داد (35). همچنین جهت تولید آلوئین در گیاه آلوئه­ورا از دو نانوالیسیتور نقره و دی­اکسیدتیتانیوم استفاده شد و نتایج حاکی از آن بود که دو نانوالیسیتور مذکور طی 48 ساعت پس از اعمال تیمار به­ترتیب باعث افزایش آلوئین به‏میزان 7/43 و 6/11 درصد شدند، اما پس از آن تولید آلوئین تا رسیدن به سطح کنترل کاهش نشان داد (36). اثر نانو نقره بر تقسیم سلولی و شاخص­های میتوزی که خود بر میزان تولید متابولیت­ها موثر می­باشد نیز مورد بررسی قرارگرفته است. در این رابطه محققین از گونه­های گیاهی جنس Allium استفاده کردند و دریافتند که نانونقره به‏صورت معنی­داری شاخص میتوزی را کاهش و دگرگونی ساختاری در کروموزوم را افزایش داد (34 و 35).

اگرچه نانو ذرات به‏راحتی به سیستم بافت گیاهی نفوذ کرده و روی میزان تولید متابولیت­های ثانویه تاثیر مثبت می­گذارند، اما در غلظت­های بالا و حضور طولانی مدت در محیط، به­واسطه کاهش شاخص میتوزی و آزاد کردن یون­های سمی باعث ایجاد مسمومیت سلولی (cytocyctic) می­شوند. چنانکه پیش­تر گفته شد، الیسیتورها در محیط کشت از طریق فعال کردن ژن­های مربوط به مکانیسم­های دفاعی باعث القای تشکیل متابولیت­های ثانویه می­شوند، اما پس از آن پاسخ سلولی نسبت به حضور الیسیتورها (نانوالیسیتورها) منفی بوده و با از بین رفتن نیروی محرک پروتون­ها (Proton-motive force) در عرض غشا، ناپایدار شدن غشا خارجی و آزاد کردن گونه­های اکسیژن­ واکنش‏گر همراه است. گونه­های اکسیژن­ واکنشگر تولید شده ممکن است جزئی از مکانیسم سمیت ژنی (Genotoxic) نانو الیسیتورها باشد که به صورت مستقیم پروتئین­ها را تخریب کرده و یا آنها را برای تجزیه حساس می­کند. در صورت حضور طولانی مدت نانوالیسیتورها در محیط، گونه­های اکسیژن­ واکنش‏گر روی DNA اثر مخرب داشته و منجر به کاهش تولید مواد موثره می­شود (37).

تابش پرتو فرابنفش به­طور معنی­داری باعث افزایش تولید رسوراترول در برگ و میوه و کالوس حاصل از آن­ها و همچنین سوسپانسیون سلولی تعدادی از ارقام انگور گردیده است (38  و 39).

استفاده از اسید سالیسیلیک و محرک­های قارچی روی تولید تاکسول در سوسپانسیون سلولی گیاه سرخدار (Taxus bacata) موثر بوده است. نتایج مطالعات در این خصوص نشان داده است که ترکیب اسید سالیسیک و محرک قارچی روی بیوماس سلول­های گیاه مزبور تاثیر نداشته، اما موجب تولید بیشترین میزان تاکسول شده­اند (40). همچنین در آزمایش دیگری با افزودن پیش­ماده­های موالونات و ان-بنزوئیل گلیسین به کشت سوسپانسیون سلولی گیاه سرخدار میزان تولید تاکسول تا 3 برابر افزایش یافت (41).

تولید 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین در کشت سلول یکی از گونه­های وحشی جنس کتان (Linum nodiflorum) تحت تاثیر متیل جاسمونات به‏میزان ده برابر افزایش یافت (36). کاربرد متیل جازمونات همچنین توانسته است تولید رسوراترول را در برگ و میوه و کالوس حاصل از آن­ها و همچنین سوسپانسیون سلولی تعدادی از ارقام انگور به‏میزان قابل توجهی افزایش دهد (42 و 43).

نیترات نقره (AgNO3) و کلرید کادمیوم (CdCl2) موجب تحریک تولید تروپان­آلکالوئید­­های اسکوپولامین و هیوسیامین از طریق کشت ریشه­های موئین گیاه تاتوره معطر (Bragmansia candida) شده و باعث افزایش تولید این آلکالوئید­ها شده­اند (44).

 در آزمایشی از سطوح مختلف نیتروژن و بنزیل آدنین به‏منظور تولید آلوئین از گیاه آلوئه­ورا استفاده شد و پس از 12 ماه میزان آلوئین نه تنها با کاربرد هر یک از دو الیسیتور فوق به‏تنهایی افزایش یافت، بلکه کاربرد هم‏زمان آن­ها نیز دارای اثرات متقابل مثبت بود و موجب افزایش بیشتر میزان آلوئین شد (45).

گزارش‏ها نشان داده­اند که با اضافه کردن قندها به‏منظور بهینه­سازی عناصر غذایی محیط کشت، میزان تولید متابولیت ثانویه بالا رفته است (46). در این رابطه، وقتی به­جای 5/2 درصد ساکارز در کشت سلولی گیاه حسن یوسف به‏میزان 5/7 درصد استفاده شد، عملکرد رزمارینیک اسید معادل 4 برابر افزایش یافت.

به‏دلیل اهمیت اقتصادی و افزایش تقاضا برای تولید متابولیت­های ثانویه، محققین به‏دنبال روش­هایی برای تولید هرچه بیشتر و با کیفیت­تر این ترکیبات هستند. بیوتکنولوژی قادر است کارآیی گیاهان دارویی را جهت تولید دارو افزایش دهد. کشت سلول، بافت و اندام­های گیاهی و بهره­گیری از الیسیتورها امکان تولید سریع و انبوه متابولیت­های با اهمیت را فراهم می­سازد. استفاده از الیسیتورها روش مناسبی به‏منظور تولید هر چه بیشتر متابولیت­های ثانوی در شرایط درون شیشه­ای می­باشد. به‏نظر می‏رسد ترکیبات فعال الیسیتورها نقش موثری در القای پاسخ­های دفاعی و افزایش تولید متابولیت­های ثانوی دارند. الیسیتورها بیان ژن را در گیاهان تحت تاثیر قرار داده و با از بین بردن سدهای مهارآنزیمی یا دست‏کاری مسیر آنزیم­ها باعث تغییر در سطح تولید متابولیت­ها می­گردند. همچنین از این طریق می­توان سطح آنزیم­های موثر در مسیر بیوسنتز را اندازه­گیری و جهت کنترل مسیرهای بیوسنتز آنها را شناسایی کرد و روش­های جدیدی در کنترل و تولید متابولیت­ها ارائه نمود.

منابع

1. Sarin R. Useful Metabolites from plant tissue cultures. Biotechnol. 2005; (4): 79-93.

2. Patel H, Krishnamurthy R. Elicitors in plant tissue culture. J. Pharmacog & Phytochem. 2013; 2(2): 60-65.

3. Reynolds, T. Aloe chemistry. In Reynolds T(Ed), the genus Aloe, CRC Press, Boca Raton. Florida, USA. 2004; 39-74.

4. Facchini PJ, St-Pierre B. Synthesis and trafficking of alkaloid biosynthetic enzymes. Curropin in Plant Biol. 2005; 8: 657-666.

5. Zaho J, Davis LC, Verpoorte R. Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites. Biotech Advances. 2005; 23(4), 283-333.

6. Furze JM, Rhodes MJ, Parr AJ, Robins RJ, et al. Abiotic factors elicit sesquiterpenoid phytoalexin production but not alkaloid production in transformed root cultures of Datura stramonium. Plant Cell Reports. 1991; 10(3): 111-114.

7. Smetanska I. Production of secondary metabolites using plant cell culture. Advances in Biochem Eng Biotech. 2008; 111: 187-228.

8. Rao SR, Ravishankar GA. Plant cell cultures: chemical factories of secondary metabolites. Biotech Advances. 2002; 20 (2): 101-153.

9. Dewick PM.Medicinal natural products. A biosynthetic approach. Second edition,Wiley. 2002; 7: 121-140.

10. Taiz L, Zeiger E. Plant physiology, 4th Ed. Sinauer Associates Inc. Sunderland, Massachusetts.USA; 2006; 260-287.

11. Sangwan NS, Farooqi AH, Shabih F, Sangwan RS. Regulation of essential oil production in plants. Plant Growth Regul. 2011; 34:21-34.

12. Yin L, Cheng Ying w, Espinasse B, Colman A, et al. More than the Irons: The effects of silver nanoparticles on Lolium multiform. Environ Sci & Technol. 2011; 45(1): 2360-2367.

13. Anterola AM, Jeon JH, Davin LB.Transcriptional control of monolignol biosynthesis in Pinus taeda. J Biol Chem. 2002; 227(21): 18272-18280.

14. Zhao JL, Zhou LG, Wu JY. Effects of biotic and abiotic elicitors on cell growth and tanshinone accumulation in Salvia miltiorrhiza cell cultures. Applied Microb & Biotech. 2010; 87(1): 137-144.

15. Mulabagal V, Tsay HS. Plant cell cultures, an alternative and efficient source for the production of biologically important secondary metabolites. Int J of Applied Sci & Eng. 2004; 2(1): 29-48.

16. Bladi A, Dixit VK. Yield enhancement Strategies for artemisinin production by suspension culture of Artemisia annua. Bioresource Technol. 2008; (99): 4609-4614.

17. Roberts SC, Shuler ML. Large-scale plant cell culture. Current Opinion in Biotech. 1997; (8): 154-159.

18. Matkowski A. Plant in vitro culture for the production of antioxidants. A review. Biotech Advance. 2008; (26): 548-560.

19. Saadat SS, Piri Kh, Esna-Ashari M, Gholami M, et al. Production and Realease of Tropane Alkaloids from Deadly Nighushade (Atropa belladonna L.) in Hydroponic Condition. Plant Production Tech. 2011; (11): 25-32.

20.Dellapenna D. Plant Metabolic Engineering . Plant Physiol. 2000; 125:160-163.

21. Bourgaud F, Gravot A, Goniter E. Production of plant secondary metabolites. Plant Science. 2002; 161(5): 839-851.

 

22. Dhawan OP, Lavania UC. Enhancing the productivity of secondary metabolites via induced polyploidy: a review. Euphytica. 1996; 87: 81 - 9.

23. Jasus-Gonzalez LDE, Weathers PJ. Tetraploid Artemisia annua hairy roots produce more artemisinin than diploid. Plant Cell Reports. 2003; 21(8): 809-813.

 

24. Niimi  H, Watenabe M,  Serizawa  H, et al. Amiprophosmethyl- induced  efficient  in vitro production of polyploids in Raphano brassica with the aid of aminoethoxyvinylyglycine (AVG) in the culture medium. Breeding Science.2015; 65(5):396-402.

 

25. Zhao DX, Fu CX, Han YS, Lu DP. Effects of elicitation on jaceosidin and hispidulin production in cell suspension cultures of Saussurea medusa. Process Biochem. 2005; 40(2): 739-745.

26.  Radman R, Saez T, Bucke C, Keshavarz T. Elicitation of plants and microbial cell systems. Biotech & Applied Biochem. 2003; 37(1): 91-102.

27. Ramachandra CT, Srinivasa Rao P. Processing of Aloe vera Leaf Gel :A Review .Am J Agric & Bio Sci. 2008; 3(2): 502-51.

27. Zhang C, Yan Q, Cheuk WK, Wu J. Enhancement of tanshinone production in Salvia miltiorrhiza hairy root culture by Ag+ elicitation and nutrient feeding. Planta Medica. 2004; 70(2): 147-151.

 

28. Zhang C, Yan Q, Cheuk WK, Wu J. Enhancement of tanshinone production in Salvia miltiorrhiza hairy root culture by Ag+ elicitation and nutrient feeding. Planta Medica. 2004; 70(2): 147-151.

29. Howlett B. Secondary metabolites toxins and nutrition of plant pathogenic Fungi. Current Opinion in Biotech. 2006; 9(4): 371-375.

30. Zhang Y, Mian MR, Bouton JH. Recent Molecular and Genomics Studies on Stress Tolerance of Forage and Turf Grasses. Crop Science. 2006; 46: 497-511.

31. Choi HK, Yun JH, Kim SL, Son JS, et al. Enhanced production of paclitaxel by semi-continuous batch process (SCBP) in suspension culture of Taxus chinensis. Enzyme and Micro Tech. 2001; 29: 583-586.

32. Pitta-Alvarez SI, Spollansky TC, Giulietti AM. The influence of different biotic and abiotic nitrogen metabolism of growing spinach. Biol Trace Element Res. 2000; 110(2): 179-190.

33. Lee-Sae N, Kerdchoechuen O, Laohakunjit N. Effect of ammonium nitrate on cell growth and production of phenolic compounds in cell suspension cultures of Vitis vinifera. Aric Sci l. 2011; 42(2): 249-252.

34. Bota C, Deliu C. The effect of copper sulphate on the production of flavonoids in Digitalis lanata cell cultures. Farmacia. 2011; 59(1): 113-118.

35. Khodayari M, Omidi M, Boushehri AK, Yazdani D, et al. Effect of biotic and nano elicitors on enhancement of alkaloids in Papaver somniferum L. Iranian J Hort Sci. 2014; 14(45): 287-295.

36. Raei M, Angaji SAH, Omidi M, Khodayari M. Effect of abiotic elicitors on tissue culture of Aloe vera. Int J Biosci. 2014; 5(1): 74-81.

37. Lok CN, Ho C, Chen R, He QY, et al. Proteomics analysis of the mode of antibacterial action of silver nanoparticles. J Proteomic Res. 2007; 5(4): 916-24.

38. Esna-Ashari M, Mahmoudi Pour A. Ultra violet irradiation enhances resveratrol production in organs and cell suspension cultures of two Iranian grape cultivars. Food. 2010; 1: 23-26.

39. Esna-Ashari A, Mahmoudi Pour A, Karami O. The effect of UV irradiation on resveratrol production in leaf and fruit of two Iranian grape (Vitis vinifera L.) cultivars. Iranian J Hort Sci. 2008; 1: 2-10.

40. Long-Jiang Y, Wen-Zhi L, Wen-Min Q, Hui-Bi Xu. Effects of Salicylic acid on fungal elicitor-induced membrane-lipid peroxidation and Taxol production in cell suspension cultures of TaxusChinensis. J Process Biochem. 2010; 370: 477-482.

41. Cusido RM, Palazon J, Bonfill M, Navia Osorio A, et al. Improved paclitaxel and baccatin III production suspension culture of Taxus media. Biotech Progress. 2002; 18(3): 418-423.

42. Esna-Ashari M, Mahmoudi Pour A. Effect of methyl jasmonate on resveratrol production in organs and cell suspension cultures of two Iranian grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars. J Hort Sci & Biotech. 2011; 6(8): 557-562.

43. Esna-Ashari M, Mahmoudi Pour A, Karami O, Hesari M. Changes in the amount of resveratrol in leaf and fruit and the possible effect of methyl jasmonate on it in two Iranian grape (Vitis vinifera L.) cultivars. J Sci & Tech Agric & Nat Reso. 2008; (45): 571-579.

44. Radman R, Saez T, Bucke  C, Keshavarz T. Elicitation of plant and microbial systems. Biotech & Applied Biochem. 2003; 37: 91-102.

45. Hazrati S, Tahmasebi Z, Babaei A. Enhancaing yield and aloin concentration of Aloe vera plants by stimutaneous application of N and benzyladenine. J Med Plant Res. 2010; 6(10): 1834-1841.

46. Misava M. Production of useful plant metabolites. In: Flechter A, editors. Adv. Biochem.Eng.Biotechnol. Berlin:springer-verlag. 1985; 59-88.

Sarin R. Useful Metabolites from plant tissue cultures. Biotechnol. 2005; (4): 79-93.

2. Patel H, Krishnamurthy R. Elicitors in plant tissue culture. J. Pharmacog & Phytochem. 2013; 2(2): 60-65.

3. Reynolds, T. Aloe chemistry. In Reynolds T(Ed), the genus Aloe, CRC Press, Boca Raton. Florida, USA. 2004; 39-74.

4. Facchini PJ, St-Pierre B. Synthesis and trafficking of alkaloid biosynthetic enzymes. Curropin in Plant Biol. 2005; 8: 657-666.

5. Zaho J, Davis LC, Verpoorte R. Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites. Biotech Advances. 2005; 23(4), 283-333.

6. Furze JM, Rhodes MJ, Parr AJ, Robins RJ, et al. Abiotic factors elicit sesquiterpenoid phytoalexin production but not alkaloid production in transformed root cultures of Datura stramonium. Plant Cell Reports. 1991; 10(3): 111-114.

7. Smetanska I. Production of secondary metabolites using plant cell culture. Advances in Biochem Eng Biotech. 2008; 111: 187-228.

8. Rao SR, Ravishankar GA. Plant cell cultures: chemical factories of secondary metabolites. Biotech Advances. 2002; 20 (2): 101-153.

9. Dewick PM.Medicinal natural products. A biosynthetic approach. Second edition,Wiley. 2002; 7: 121-140.

10. Taiz L, Zeiger E. Plant physiology, 4th Ed. Sinauer Associates Inc. Sunderland, Massachusetts.USA; 2006; 260-287.

11. Sangwan NS, Farooqi AH, Shabih F, Sangwan RS. Regulation of essential oil production in plants. Plant Growth Regul. 2011; 34:21-34.

12. Yin L, Cheng Ying w, Espinasse B, Colman A, et al. More than the Irons: The effects of silver nanoparticles on Lolium multiform. Environ Sci & Technol. 2011; 45(1): 2360-2367.

13. Anterola AM, Jeon JH, Davin LB.Transcriptional control of monolignol biosynthesis in Pinus taeda. J Biol Chem. 2002; 227(21): 18272-18280.

14. Zhao JL, Zhou LG, Wu JY. Effects of biotic and abiotic elicitors on cell growth and tanshinone accumulation in Salvia miltiorrhiza cell cultures. Applied Microb & Biotech. 2010; 87(1): 137-144.

15. Mulabagal V, Tsay HS. Plant cell cultures, an alternative and efficient source for the production of biologically important secondary metabolites. Int J of Applied Sci & Eng. 2004; 2(1): 29-48.

16. Bladi A, Dixit VK. Yield enhancement Strategies for artemisinin production by suspension culture of Artemisia annua. Bioresource Technol. 2008; (99): 4609-4614.

17. Roberts SC, Shuler ML. Large-scale plant cell culture. Current Opinion in Biotech. 1997; (8): 154-159.

18. Matkowski A. Plant in vitro culture for the production of antioxidants. A review. Biotech Advance. 2008; (26): 548-560.

19. Saadat SS, Piri Kh, Esna-Ashari M, Gholami M, et al. Production and Realease of Tropane Alkaloids from Deadly Nighushade (Atropa belladonna L.) in Hydroponic Condition. Plant Production Tech. 2011; (11): 25-32.

20.Dellapenna D. Plant Metabolic Engineering . Plant Physiol. 2000; 125:160-163.

21. Bourgaud F, Gravot A, Goniter E. Production of plant secondary metabolites. Plant Science. 2002; 161(5): 839-851.

 

22. Dhawan OP, Lavania UC. Enhancing the productivity of secondary metabolites via induced polyploidy: a review. Euphytica. 1996; 87: 81 - 9.

23. Jasus-Gonzalez LDE, Weathers PJ. Tetraploid Artemisia annua hairy roots produce more artemisinin than diploid. Plant Cell Reports. 2003; 21(8): 809-813.

 

24. Niimi  H, Watenabe M,  Serizawa  H, et al. Amiprophosmethyl- induced  efficient  in vitro production of polyploids in Raphano brassica with the aid of aminoethoxyvinylyglycine (AVG) in the culture medium. Breeding Science.2015; 65(5):396-402.

 

25. Zhao DX, Fu CX, Han YS, Lu DP. Effects of elicitation on jaceosidin and hispidulin production in cell suspension cultures of Saussurea medusa. Process Biochem. 2005; 40(2): 739-745.

26.  Radman R, Saez T, Bucke C, Keshavarz T. Elicitation of plants and microbial cell systems. Biotech & Applied Biochem. 2003; 37(1): 91-102.

27. Ramachandra CT, Srinivasa Rao P. Processing of Aloe vera Leaf Gel :A Review .Am J Agric & Bio Sci. 2008; 3(2): 502-51.

27. Zhang C, Yan Q, Cheuk WK, Wu J. Enhancement of tanshinone production in Salvia miltiorrhiza hairy root culture by Ag+ elicitation and nutrient feeding. Planta Medica. 2004; 70(2): 147-151.

 

28. Zhang C, Yan Q, Cheuk WK, Wu J. Enhancement of tanshinone production in Salvia miltiorrhiza hairy root culture by Ag+ elicitation and nutrient feeding. Planta Medica. 2004; 70(2): 147-151.

29. Howlett B. Secondary metabolites toxins and nutrition of plant pathogenic Fungi. Current Opinion in Biotech. 2006; 9(4): 371-375.

30. Zhang Y, Mian MR, Bouton JH. Recent Molecular and Genomics Studies on Stress Tolerance of Forage and Turf Grasses. Crop Science. 2006; 46: 497-511.

31. Choi HK, Yun JH, Kim SL, Son JS, et al. Enhanced production of paclitaxel by semi-continuous batch process (SCBP) in suspension culture of Taxus chinensis. Enzyme and Micro Tech. 2001; 29: 583-586.

32. Pitta-Alvarez SI, Spollansky TC, Giulietti AM. The influence of different biotic and abiotic nitrogen metabolism of growing spinach. Biol Trace Element Res. 2000; 110(2): 179-190.

33. Lee-Sae N, Kerdchoechuen O, Laohakunjit N. Effect of ammonium nitrate on cell growth and production of phenolic compounds in cell suspension cultures of Vitis vinifera. Aric Sci l. 2011; 42(2): 249-252.

34. Bota C, Deliu C. The effect of copper sulphate on the production of flavonoids in Digitalis lanata cell cultures. Farmacia. 2011; 59(1): 113-118.

35. Khodayari M, Omidi M, Boushehri AK, Yazdani D, et al. Effect of biotic and nano elicitors on enhancement of alkaloids in Papaver somniferum L. Iranian J Hort Sci. 2014; 14(45): 287-295.

36. Raei M, Angaji SAH, Omidi M, Khodayari M. Effect of abiotic elicitors on tissue culture of Aloe vera. Int J Biosci. 2014; 5(1): 74-81.

37. Lok CN, Ho C, Chen R, He QY, et al. Proteomics analysis of the mode of antibacterial action of silver nanoparticles. J Proteomic Res. 2007; 5(4): 916-24.

38. Esna-Ashari M, Mahmoudi Pour A. Ultra violet irradiation enhances resveratrol production in organs and cell suspension cultures of two Iranian grape cultivars. Food. 2010; 1: 23-26.

39. Esna-Ashari A, Mahmoudi Pour A, Karami O. The effect of UV irradiation on resveratrol production in leaf and fruit of two Iranian grape (Vitis vinifera L.) cultivars. Iranian J Hort Sci. 2008; 1: 2-10.

40. Long-Jiang Y, Wen-Zhi L, Wen-Min Q, Hui-Bi Xu. Effects of Salicylic acid on fungal elicitor-induced membrane-lipid peroxidation and Taxol production in cell suspension cultures of TaxusChinensis. J Process Biochem. 2010; 370: 477-482.

41. Cusido RM, Palazon J, Bonfill M, Navia Osorio A, et al. Improved paclitaxel and baccatin III production suspension culture of Taxus media. Biotech Progress. 2002; 18(3): 418-423.

42. Esna-Ashari M, Mahmoudi Pour A. Effect of methyl jasmonate on resveratrol production in organs and cell suspension cultures of two Iranian grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars. J Hort Sci & Biotech. 2011; 6(8): 557-562.

43. Esna-Ashari M, Mahmoudi Pour A, Karami O, Hesari M. Changes in the amount of resveratrol in leaf and fruit and the possible effect of methyl jasmonate on it in two Iranian grape (Vitis vinifera L.) cultivars. J Sci & Tech Agric & Nat Reso. 2008; (45): 571-579.

44. Radman R, Saez T, Bucke  C, Keshavarz T. Elicitation of plant and microbial systems. Biotech & Applied Biochem. 2003; 37: 91-102.

45. Hazrati S, Tahmasebi Z, Babaei A. Enhancaing yield and aloin concentration of Aloe vera plants by stimutaneous application of N and benzyladenine. J Med Plant Res. 2010; 6(10): 1834-1841.

46. Misava M. Production of useful plant metabolites. In: Flechter A, editors. Adv. Biochem.Eng.Biotechnol. Berlin:springer-verlag. 1985; 59-88.