بررسی اثرات محافظتی Ephedra pachyclada بر مدل حیوانی بیماری حاد کبدی القا شده با تتراکلرید کربن

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

-

چکیده

هدف: هدف از پژوهش حاضر بررسی اثرات محافظتیEphedra pachycladaبر آسیب حاد کبدی ناشی از تتراکلریدکربن بود.
مواد و روشها: در این مطالعه ابتدا آزمایشی جهت دستیابی به مدل حیوانی استاندارد طراحی شد. در این آزمایش 30 سر موش به 3 گروه کنترل، شم و مدل تقسیم شدند. حیوانات گروه مدل 2 میلی‎لیتر بر کیلوگرم از تتراکلریدکربن50 درصد (1:1 در روغن زیتون استریل) را به صورت درون صفاقی دریافت کردند. 96 ساعت بعد نمونه‌های خون و کبد حیوانات جمع آوری و مورد بررسی‌های بیوشیمیایی و بافت‌شناسی قرار گرفت. پس از اطمینان از صحت القای مدل در آزمایش دوم40 سر از موش‌ها به 4 گروه تقسیم شدند، یک گروه به عنوان کنترل و 3 گروه دیگر به عنوان گروه‌های آزمایشی در نظر گرفته شدند. القای آسیب حاد کبدی به روش قبل در گروه‌های آزمایشی صورت گرفت با این تفاوت که دو گروه از آن‎ها روزانه با عصاره (140 و 1400 میلی‎گرم بر کیلوگرم) تیمار ‌شدند. نمونه‌های خون و کبد 96 ساعت بعد از تزریق تتراکلریدکربن جمع آوری شد. فعالیت سرمی آنزیم‌های آلانین ‌آمینوترانس فراز ALT)) و آسپارتات ‌آمینوترانس‌ فراز AST)) در سرم و میزان نکروز و التهاب در کبد مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج:تیمار با عصاره Ephedra pachyclada منجر به کاهش معنی‌داری در فعالیت سرمی ALT و AST ، نکروز و التهاب بافتی و افزایش درصد بقا در حیوانات دریافت کننده تتراکلریدکربن شده است.
نتیجه گیری: نتایج تحقیق حاضر پیشنهاد می‌کند که Ephedra pachyclada بامهار استرساکسیداتیو و سرکوب التهاب بافتی، کبد را در برابر آسیب حاد ناشی از تتراکلرید کربن محافظت می‌کند.
 
 

کلیدواژه‌ها


مقدمه

کبد ارگان مرکزی در متابولیسم و سم زدایی است. عملکردهای متابولیکی و موقعیت استراتژیک کبد سبب شده این عضو هدف توکسین‎های گوناگون و مستعد بیماری های بسیاری باشد (1). بیماری کبدی به هرگونه شرایطی اطلاق می شود که منجر به القای آسیب یا التهاب در بافت کبد شده و عملکرد کبد را متاثر نماید. این بیماری‎ها به دو دسته عمده­ی حاد و مزمن تقسیم می­شوند. بیماری­‎های حاد کبدی، فراوانی قابل توجهی ندارند به طوری که طبق آمار در ایالات متحده آمریکا میزان ابتلا به این دسته از بیماری‎ها 2000 مورد در سال است (2). آنچه پرداختن به این بیماری را حایز اهمیت می‎کند مرگ و میر 80 تا 94 درصد از افراد مبتلاست (3). بیماری حاد کبدی در نتیجه نکروز حاد جمعیت کثیری از هپاتوسیت­ها و یا به دنبال آسیب شدید عمل‎کرد هپاتوسلولار به طور کاملا ناگهانی ایجاد می­گردد (4و 5). عفونت‎ها،  توکسین‎ها، مواد شیمیایی و داروها، ایسکمی و هیپوکسی کبدی و اختلالات متابولیکی  مهمترین عوامل ایجاد این نوع از بیماری­های کبدی هستند (6). در این بیماری عمل‎کرد سینتتیک کبد همچون گلوکوژنز و تولید فاکتورهای انعقادی، عملکرد دفعی کبد مثل ترشح صفراوی بیلی‎روبین و اسید­­های صفراوی و همچنین عملکردهای متابولیک‎اش مثل متابولیسم اوره دچار اختلال می‎شوند (5). انسفالوپاتی کبدی (Hepatic encephalopathy) نیز یکی از مهم­ترین نشانه‎ها در تشخیص این دسته از بیماری‎ها است (7).همان طور که گفته شد بیماری حاد کبدی با مرگ و میر قابل توجهی همراه است، دارو­ها و درمان‎های معمول تنها حدود 10 درصد از بیماران مبتلا را از مرگ نجات می‎دهد(5)،همین موضوع سبب شده است تا برخی از دانشمندان علوم داروشناسی پتانسیل فعالیت هپاتوپروتکتیو را در گیاهان و بر پایه طب سنتی جستجو کنند (8 و 9).

Ephedra Pachyclada(EP)گیاهی از خانوادهEphedraceaeاست. این گیاه به صورت درختچه­ای با ساقه‎های سبز، بند بند، پر شاخه و معمولا قائم است. EP در اقلیم خشک و نیمه خشک، خصوصا در مناطق کویری و سنگلاخی جنوب و جنوب شرقی ایران می‎روید و به نام های محلی هوم و ارمک شناخته می‎شود. شهرت این خانواده از گیاهان به دلیل دارا بودن آلکالوئید های افدرینی فراوان است که مهم‎ترین آن‎ها افدرین و سودوافدرین هستند (10). گیاهان این خانواده دارای خواص درمانی بسیاری بوده و هزاران سال است که در طب سنتی آسیای شرقی در درمان بیماری‎های­ تنفسی و آلرژی‎­­­­­­­­­­­­­­­­ها کاربرد دارند. اخیرا نیز در پزشکی و در مقاصدی همچون تخفیف درد، کاهش تب و کنترل وزن بدن مورد استفاده قرار گرفته ­اند (11و 12). مطالعاتی که روی بسیاری از گیاهان خانواده افدراسه انجام شده موید خواص ضد التهابی(Anti-inflammatory) و آنتی‎اکسیدانتی آن‎ها است. در سال 2006 مطالعه عصاره Ephedra sinica روی مدل حیوانی رماتوئید مفصلی نشان داد این گیاه قادر است با سرکوب التهاب به طور قابل توجهی روند بیماری را مهار کند‌ (13). در مطالعه‎ای در سال 2008، محققان حیوانات دارای آسیب حاد کبدیِ القا شده با دی گالاکتوز آمین را با Mao  (ترکیبی از عصاره گیاهان این خانواده) تیمار نمودند و نتایج حاکی از کاهش قابل توجه علایم بیماری همچون نکروز بافتی، فاکتور­های سرمی و مرگ میر بود (14). مطالعه‎ای که روی تعدادی از گونه های این خانواده در سال 2010 انجام شد نشان داد که  Ephedra Pachyclada حاوی مقادیر قابل توجهی ترکیبات فنلی و واجد خاصیت آنتی­اکسیدانتی است (15). تحقیقات مولکولی که در کشف مکانیسم تاثیرات این گیاه صورت گرفته است، نشان داده­ که عصاره EP با کاهش واسطه‎گرهای التهابی مثل TNFα (Tumor necrosis factor α) باعث افزایش فعال ­سازی سیگنالینگ STAT3 (Signal transducer and transcription factor 3) و به دنبال آن سرکوب پاسخ‎های التهابی و کاهش آپوپتوزیس می­شود (16). با توجه به اینکه در آسیب‎های حاد کبد، التهاب بافتی و استرس اکسیداتیو زمینه ­ساز نکروز گسترده بافتی و پیشروی بیماری است، بر آن شدیم تاثیر عصاره این گیاه را بر بیماری حاد کبدی مورد مطالعه قرار دهیم.

انجام چنین مطالعاتی مستلزم ساخت مدل ­های حیوانی است که مقلد شرایط پاتوفیزیولوژیکیِ اختلالات کبدی باشند. طبق نظریه Terblanche  و Hickman در یک مدل حیوانی مناسب از بیماری حاد  کبدی، آسیب ایجاد شده باید به طور بالقوه برگشت پذیر بوده، قابل تکرار باشد، مانند آنچه در شرایط کلینیکی اتفاق می افتد به مرگ منجر شود و بین القای مدل و وقوع مرگ فرصت کافی جهت تست دارویی مورد نظر وجود داشته باشد (17). در این مطالعه سعی شده است  با استفاده از هپاتوتوکسینی شناخته شده به نام تتراکلریدکربن (CCl4)  ابتدا مدل تایید شده‎ای از بیماری حاد کبدی ساخته شود و سپس با تیمار حیوانات بیمار با عصاره EPچگونگی تاثیرات این گیاه بر روند بیماری حاد در کبد مورد بررسی قرار گیرد.

 

مواد و روشها

حیوانات: در این مطالعه تجربی، موش­های نر و بالغ نژادSW1 (8 هفته) از انستیتو پاستور ایران خریداری شدند. موش­هادراتاقحیواناتبادمای کنترلشده 2±23سانتــی­گرادودورهنوری12سـاعتروشناییو12ساعت تاریکینگهداریشدندوآبوغذایکافیهموارهدردسترسآن‎هاقرارداشت.آزمایش‎ها رویتمامیگروه‎هاموردبررسیدرشرایطکاملایکسان و مطابق اصول اخلاقیِ کار با حیوانات آزمایشگاهی صورت گرفت.

ساخت مدل حیوانی:جهت دستیابی به مدل حیوانی استاندارد، تعداد 30 سر موش به 3 گروه10 تایی کنترل، شم و مدل تقسیم شدند. برای القای آسیب حاد کبدی CCl4Merck- Schuchardt, 2221) )50 درصد (بهنسبت1:1باروغنزیتون استریل شده) بهمیزان2میلی‎لیتربرکیلوگرموزنبدن در یک دوز منفرد به صورت درون صفاقی به حیوانات گروه مدل تزریق شد. حیوانات گروه شم تنها 2 میلی‎لیتر بر کیلوگرمروغن زیتون دریافت کردند و گروه کنترل هیچ تیماری را دریافت نکرد. میزان زنده‎مانی یا بقای حیوانات تا 96 ساعت بعد از تزریق مورد بررسی قرار گرفت. 96 ساعت بعد از تزریق حیوانات پس از وزن شدن با تزریق محلول کتامین (Ketamin 10%-Alfasan, Woerden-Holland) وزایـلازین (Xylasine 2% Alfasan Woerden-Holland)  بی‎هوش شدند. تحت شرایط بی هوشی خونگیری از قلب انجام شد و سپس کبد جهت آزمایش‎ها بافت شناسی خارج و در فرمالین 10 درصد فیکس شد. آنالیز مارکرهای سرمی و مطالعات بافت شناسی جهت بررسی صحت القای مدل انجام شد. چگونگی انجام این بررسی‏ها در ادامه ذکر شده است.

تهیه عصاره EP: روش عصاره گیری انتخاب شده در این تحقیق بر اساس روش استفاده بومیانِ مناطق جنوبی و غربی ایران با اندکی تغییر می باشد؛ بدین ترتیب که سر شاخه‎های تازه گیاه از حاشیه شهرستان فسا در استان فارس جمع آوری و پس از کوبیدن در آب جوشانده شد. پس از جوشاندن اولیه عصاره خارج شده از صافی رد شده و سپس محلول صاف شده با جوشاندن بیشتر تغلیظ گردید (13). در این آزمایش جهت دستیابی به غلظت‎های مورد نظر، عصاره نیمه جامد بدست آمده به میزان مورد نیاز وزن و سپس در آب مقطر حل شد؛ آن گاه محلول نهایی با استفاده از فیلتر 2/0 میکرونی استریل گردید.

تیمار حیوانات دارای آسیب حاد کبدی با:EP  پس از اطمینان از صحت القای مدل، جهت بررسی تاثیر عصاره EP بر روند بیماری حاد کبدی 40 سر موش به 4 گروه 10 تایی تقسیم شدند. یک گروه بعنوان کنترل و 3 گروه دیگر بعنوان گروه‎های تجربی در نظر گرفته شدند. حیوانات هر 3 گروه تجربی CCl4را به همان اندازه آزموده شده در مدل سازی (2 میلی‎لیتر بر کیلوگرمCCl4) به صورت درون صفاقی دریافت کردند. از میان گروه‎های تجربی که القای بیماری در آن‎ها صورت گرفت، یک گروه به عنوان شاهد و دو گروه دیگر به عنوان گروه های تیماری در نظر گرفته شدند. به گروه‎های تیماری 2 ساعت بعد از دریافت CCl4به ترتیب 140 و 1400 میلی‎گرم از EP به ازای هر کیلوگرم وزن حیوان به صورت درون صفاقی تزریق شد. این تزریق هر 24 ساعت یک بار تکرار شد. وزن حیوانات در ابتدا و انتهای آزمایش به طور دقیق اندازه گیری و میزان مرگ و میر حیوانات در طول آزمایش ثبت شد. 96 ساعت بعد از تزریق CCl4 حیوانات با مخلوط کتامین- زایلازین بیهوش شدند و خون‎گیری از قلب تحت بیهوشی انجام گرفت. سپس کبد خارج شده و پس از اندازه گیری دقیق وزن در فرمالین 10 درصد فیکس شد.

مطالعات بافت شناسی: نمونه‎های بافتی مطابق روش­های معمول پردازش شده و پس از قالب­گیری با پارافین، برش‎هایی با ضخامت 4 تا 6 میکرون از آن‎ها تهیه شد. اسلایدهای تهیه شده با دو روش هماتوکسیلین و ائوزین  (H&E)(جهت بررسی میزان نکروز) و رتیکولین (جهت بررسی داربست کبد) رنگ آمیزی و مورد بررسی قرار گرفتند.  دراسلاید های H&E میزان نکروز بافتی با استفاده از استانداردهای تعیین شده در مطالعات قبلی مطابق با جدول شماره 1 کمی شد (18). تعداد سلول های آماسی همچون نوتروفیل و کوپفر و لنفوسیت در اسلایدهای H&E با میکروسکوپ نوری و با بزرگ­نمایی×400 مورد شمارش قرار گرفتند. این شمارش‎ها در دو میدان دید تصادفی از ده مقطعِ هر کبد صورت گرفت. لازم به ذکر است که از هر گروه اسلایدهای مربوط به کبد شش موش مورد بررسی قرار گرفت.

آزمون­های بیوشیمیایی سرم: خون گرفته شده از حیوانات به مدت یک ساعت در دمای اتاق نگهداری و سپس در g 1500با دمای 4 درجه سانتی‎گراد به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شد (19). از سرم بدست آمده، آنزیم­های آلانین ­آمینو ترانس‎فراز ALT)) و آسپارتات ­آمینوترانس‎فراز AST)) که از مهم­ترین مارکرهای سرمی آسیب کبدی هستند با استفاده از کیت‎های تولیدی شرکت پارس آزمون به وسیله اتوماتیک آنالیزر در طول موج 340 نانومتر اندازه گیری شدند.

آنالیزهای آماری:نتایج به دست آمده به وسیله نرم‎افزار 16SPSS و آزمون واریانس یک طرفه با تستPost Hoc Tukey با سطح معنی­داری (01/0P<) آنالیز و  به صورت میانگین ±SEM ارایه شدند.

 

جدول 1: نحوه امتیاز دهی به اسلاید­های بافتی برای تعیین میزان درجه نکروز (18):

درجه نکروز

 

0

نکروزی دیده نمی‏شود.

1

گروه­های کوچکی از هپاتوسیت درگیرنکروز مرکزی شده­اند.

2

نکروز سانتریلوبولار کامل در کمتر از 4/1 لوبول­های کبد دیده می‏شود.

3

نکروز سانتریلوبولار کامل در بیشتر از 4/1 لوبول‎های کبد ودر کمتر از نصف لوب­ها دیده می‏شود.

4

نکروز کامل تقریبا بیشتر از نصف لوبول­های کبد را در گیر کرده است.

 

‌‌

 

نتایج

بررسی صحت القای مدل حاد کبدی

مطالعات داروشناختی روی بیماری­های کبدی نیازمند دستیابی به مدل ­های حیوانی استانداردی است که مقلد شرایط پاتوفیزیولوِژیک بیماری باشند، از این رو در این مطالعه جهت اطمینان از صحت القای مدل، آزمایشی مطابق آنچه در روش کار ارایه شد طراحی گردید. نتایج نشان دادند که تیمار حیوانات با یک دوز 2 میلی‎لیتر بر کیلوگرم از CCl4باعث افزایش قابل توجه AST و ALT سرمی نسبت به گروه‎های شم و کنترل شده است (شکل 1، A و B). این نتایج حاکی از القای آسیب به غشای هپاتوسیت‎ها و آزادسازی این آنزیم­ها به خون است. مطالعات بافت شناسی کبد نیز حاکی از نکروز گسترده هپاتوسیت­ها و ارتشاح سلول­های التهابی حول رگ مرکزی و فضاهای بین لوبولی در حیوانات گروه مدل بود (شکل 1، E). در حالی که بافت کبد در دو گروه کنترل و شم کاملا طبیعی به نظر می‎رسید و هیچ نکروزی دیده نشد (شکل 1، C و D ). با توجه به مطالعات گذشته در القای مدل حاد کبدی، نتایج ما نشان دادند این میزان از CCl4می‎تواند مدل مناسبی از بیماری حاد کبدی را القا نمایند و به عبارتی یافته‎های ما موید صحت روند مدل­ سازی انجام شده بودند. از این رو با القای بیماری به روش آزموده شده در مدل­ سازی و تیمار حیوانات بیمار با EP تاثیر این گیاه بر بیماری حاد کبدی بررسی شد.

تاثیر تیمار با EP بر بقا و وزن نسبی کبد حیوانات بعد از تیمار با CCl4

 بیماری‏­های حاد کبدی با مرگ و میر بالایی همراه هستند و افزایش شانس بقا و به تاخیر انداختن مرگ در بیماران مبتلا به این آسیب‎ها می‎تواند احتمال بازسازی کبد با روش‎های درمانی مختلف را افزایش دهد (5)، از این رو بررسی  بقا و مرگ و میر حیوانات مورد آزمایش بسیار حایز اهمیت است. در این مطالعه با تزریق (2 میلی‎لیتر یر کیلوگرم(CCl4، تعدادی از موش‎­های گروه­های مورد آزمایش به دلیل نقص شدید و ناگهانی در عمل‎کرد کبدی مردند. میزان و زمان مرگ و میر موش‎ها در تمامی گروه‎ها مورد بررسی قرار گرفت. در حیواناتی که علاوه بر CCl4، EP را در دوزهای 140و 1400 میلی‎گرم بر کیلوگرم دریافت کردند مرگ و میر به طور وابسته به دوز کاهش یافت. بطوری که در گروه تیمار شده با  1400 میلی‎گرم بر کیلوگرمEP بیش از 50 درصد و در گروه تیمار شده با 140 میلی‎گرم بر کیلوگرم EP بیش از 60  درصدِ حیوانات زنده ماندند و این در حالی بود که هیچ یک از حیوانات گروهی که فقط CCl4 دریافت کردند تا پایان 96 ساعت زنده نماند (شکل 2، A). نتایج حاکی است که تیمار حیوانات مسموم با EP می‎تواند مرگ و میر ناشی از CCl4را به طور معنی‎داری کاهش و در نتیجه درصد بقا را افزایش دهند.افزایش وزن کبد و وزن نسبی کبد به دلیل تورم سیتوتوکسیک سلول‎ها از علایم بیماری‎های کبدی است. در این مطالعه وزن نسبی کبد با اندازه‎گیری دقیق وزن بدن و وزن کبد حیوانات در تمامی گروه‎ها محاسبه شد. نتایج نشان دادند که تیمار حیوانات با دوز بالاتر EP (1400 میلی‎گرم بر کیلوگرم) افزایش وزن نسبی القا شده با CCl4 در کبد را به طور قابل توجهی تخفیف داده است. کاهش وزن نسبی کبد در گروهی از حیوانات که با دوز پایین تر EP (‎140 میلی‎گرم بر کیلوگرم) تیمار شده بودند نیز مشاهده شد ولی این کاهش از نظر آماری معنی دار نبود (شکل 2، B).

 

 

شکل 1: بررسی صحت القای مدل حاد کبدی با تزریق 2 میلیلیتر بر کیلوگرم تتراکلریدکربن (CCl4). A، B: اندازه­گیری ALT و AST سرمی؛ CCl4 باعث افزایش معنیدار سطوح این آنزیمها در خون شده است.01/0P<# میزان معنیداری اختلاف از گروه کنترل و 01/0P<* میزانمعنی داری اختلاف از گروه CCl4 را نشان می دهند. C وD : فتومیکروگراف از بافت کبد به ترتیب در گروه های کنترل و شم. بافت کبد در این گروه­ها کامل طبیعی است، طناب­های کبدی کاملا منظم هستند؛ E: فتومیکروگراف از بافت کبد در گروه CCl4، نکروز حاد هپاتوسیتی و تجمع سلولهای التهابی (پیکان سیاه) و القای بی نظمی در طناب های کبدی مشهود است. (رنگآمیزی هماتوکسیلین و ائوزین بزرگ­نمایی ×200، CV: سیاهرگ مرکزی.CCl4:: تتراکلرید کربن؛ ALT: آلانین آمینوترانس فراز؛ AST: آسپارتات آمینوترانس فراز).

 

شکل2:A: تاثیر EP‌ بر درصد بقای حیوانات بعد از تیمار با تتراکلریدکربن ((CCl4؛ EP منجر به افزایش بقای حیوانات در گروههای تحت تیمار شده است. B: تاثیر EP‌ بر وزن نسبی کبد (وزن کبد/ 100 گرم وزن بدن) در حیوانات تیمار شده با CCl4؛ EP‌ منجر به کاهش معنی دار وزن نسبی کبد در حیوانات تحت تیمار با دوز 140 میلیگرم بر کیلوگرم شده است. 001/0P<# میزان معنی داری اختلاف از گروه کنترل و 001/0P<* میزانمعنی داری اختلاف از گروه CCl4را نشان میدهند. تعداد حیوانات در هر گروه 10 سر است (EP: Ephedra pachyclada،Low EP : غلظت پایین عصاره  EP‌ معادل 140 میلیگرم بر کیلوگرم ، High EP: غلظت بالای عصاره EP معادل 1400 میلیگرم بر کیلوگرم ، CCl4: تتراکلرید کربن).

 


تاثیر EP بر فعالیت AST و  ALT سرمی بعد از تیمار با CCl4

AST و ALT از مهم‎ترین شاخص­های پاتولوژیک مرگ سلولی و آسیب در کبد هستند (20). در این مطالعه آنالیز بیوشیمیایی این آنزیم ها در سرم جمع آوری شده از حیوانات انجام گرفت. نتایج نشان دادند که تزریق درون صفاقی 2 میلی‎لیتر بر کیلوگرم CCl4 باعث افزایش قابل توجهی در فعالیت سرمی آنزیم‎های AST و ALT شده است، ولی تیمار حیوانات دریافت کننده همین میزان CCl4 با دوز های 140و 1400 میلی‎گرم بر کیلوگرم EP میزان فعالیت سرمی این آنزیم­ها را به طور معنی‎داری کاهش داده است (01/0p<) (شکل3). لازم به ذکر است که میانگین سطوح AST در گروه‎های تیمار شده با EP بطور وابسته به دوز کاهش یافت در حالی که در مورد ALT حیوانات تیمار شده با دوز 140 میلی‎گرم بر کیلوگرم EP کاهش بیشتری در سطوح این آنزیم نشان دادند، اگرچه تفاوت بین دو گروه تیمار شده با EP در مورد هیچ‎کدام از دو آنزیم معنی­دار نبود. نتایج حاکی از این است که EP مرگ سلولی و آسیب کبدی القا شده با CCl4 را به طور قابل توجهی کاهش داده است.

 

 

 

شکل3: تاثیر EP بر فعالیت سرمی AST و ALT در موش های تیمار شده با CCl4. 001/0P<# میزان معنی داری اختلاف از گروه کنترل و 001/0P<* میزانمعنی داری اختلاف از گروه CCl4را نشان می دهند. تفاوت بین دو گروه تحت تیمار با EP معنی دار نیست. تعداد حیوانات در هر گروه 6 سر است. (EP: Ephedra pachyclada ؛Low EP : غلظت پایین عصاره  EP‌معادل 140 میلیگرم بر کیلوگرم ؛ High EP: غلظت بالای عصاره EP معادل 1400 میلیگرم بر کیلوگرم؛ CCl4  : تتراکلرید کربن؛ ALT: آلانین آمینوترانس فراز؛ AST: آسپارتات آمینوترانس فراز).

 


تاثیر EP برتغییرات بافتی کبد بعد از تیمار با CCl4

دریافت دوز بالای CCl4 قادر است در مدت کوتاهی آسیب حاد کبدی را که با نکروز هپاتوسلولار و تجمع سلول­های التهابی در نواحی مرکز لوبولی همراه است القا نماید (21). جهت بررسی تاثیرات محافظتی EP بر مدل حاد کبدی دو گروه از حیوانات پس از دریافت CCl4 با دوزهای مختلف EP تیمار شدند و پس از 96 ساعت کبد حیوانات خارج و مورد بررسی­های بافت شناسی قرار گرفت. تصاویری از مقاطع بافتی رنگ آمیزی شده به روش های H&E و رتیکولین در شکل 4 ارائه شده است. نتایج بررسی‎های بافت شناسی نشان دادند که کبد حیوانات کنترل کاملا طبیعی بوده، طناب‎های سلولی به طور منظم در اطراف سیاهرگ مرکزی قرار گرفته و هیج نکروزی به چشم نخورد (شکل 4، A1) و همچنین این طناب‎ها با داربستی رتیکولینی حمایت می­شدند (شکل 4، A2).  در عین‎حال چنانچه تصاویر نشان می­دهند دریافت 2 میلی‎گرم بر کیلوگرم  CCl4 موجب القای نکروز گسترده هپاتوسلولار و تجمع قابل توجه سلول‎های التهابی حول رگ مرکزی و فضاهای پورت را موجب شده بود (شکل 4، B1). در حیوانات تیمار  شده با دوز 140 میلی‎گرم بر کیلوگرمEP ناحیه نکروزه به میزان قابل توجهی کوچک تر شده و نیز از انبوه سلول­های التهابی ارتشاح یافته در این ناحیه  تا حدی کاسته شد (شکل 4، C1). در حالی که  در گروه تیمار شده با دوز 1400 میلی‎گرم بر کیلوگرم EP تنها تعداد اندکی از سلول‎ها در اطراف سیاهرگ مرکزی و فضاهای پورت دچار نکروز شده و ارتشاح سلول‎های التهابی بسیار کاهش یافته است (شکل4، D1). اسلایدهای رنگ آمیزی شده به روش رتیکولین نیز، از هم پاشیدن داربست و نظم طناب‎های کبدی در گروه  CCl4 نسبت به گروه کنترل کاملا مشهود بود (شکل4، B2). تصاویر نشان می­دهند که تیمار با 140 میلی‎گرم بر کیلوگرمEP تا حدی به بازگشت نظم طناب‏ها و بازسازی داربست کبد کمک کرده بود (شکل 4، C2)، در حالی که در گروه تیمار شده با 1400 میلی‎گرم بر کیلوگرمEP  نظم طناب ها و داربست رتیکولینی کبد کاملا مشهود بوده و به حالت طبیعی شباهت بیشتری داشت (شکل4، D2).

 

 

شکل4: تاثیر EP برتغییرات بافتی کبد بعد از تیمار با CCl4. A1: بافت کبد طبیعی در گروه کنترل. B1: بافت کبد در گروه CCl4 تیمار نشده با EP، نکروز حاد هپاتوسیتی (پیکان سیاه) و تجمع سلول­های التهابی (پیکان قرمز) در نواحی اطراف سیاهرگ مرکزی (CV) و فضای پورت مشهود است. C1 و D1: بافت کبد در گروه­هایی که بعد از دریافت CCl4 به ترتیب با دوز هایEP (140 و 1400میلیگرم بر کیلوگرم) تیمار شدند، محدوده نکروز و تجمع سلول­های التهابی در این گروه­ها به طور چشم­گیری کاهش یافته است. (رنگ آمیزی H&E، بزرگ نمایی ×100). A2: رنگ آمیزی رتیکولین از بافت کبد در گروه کنترل به سلامت داربست کبد در در اطراف سینوزوئیدها دقت شود (پیکان های سیاه). B2: رنگ آمیزی رتیکولین از بافت کبد در گروه CCl4 تیمار نشده با EP، داربست کبد خصوصا در نواحی اطراف CV به شدت تخریب شده است (پیکان سیاه). C1 و D1: بافت کبد در گروه­هایی که بعد از دریافت CCl4 به ترتیب با دوز هایEP (140 و 1400میلیگرم بر کیلوگرم) تیمار شدند،EP   به صورت وابسته به دوز به ترمیم داربست از دست رفته کبد کمک کرده است. (رنگ آمیزی رتیکولین بزرگنمایی×200)EP): Ephedra pachyclada ؛ CCl4  : تتراکلرید کربن؛ H&E:  هماتوکسیلین و ائوزین)

 


تاثیر  EP‌بر تعداد سلول­های التهابی و درصد نکروز در حیوانات تیمار شده با CCl4

بیماری‎های حاد کبدی اغلب با التهاب بافتی همراه هستند (5)، این پاسخ‎های التهابی به وسیله سلول‎های کوپفر، سلول­های ستاره‎ای (Hepatic satellite cell) حاضر در بافت کبد و سلول‏های التهابی وارد شده به بافت میانجیگری می‎شوند (22). در این مطالعه تعداد سلول‎های کوپفر، نوتروفیل و لنفوسیت که از مهم‎ترین سلول‎های درگیر در التهاب کبدی هستند در اسلایدهای H&E مورد شمارش قرار گرفت. نتایج آنالیز داده‎های کمی حاصل از این شمارش در شکل 5، A ارائه شده است. نتایج نشان دادند که CCl4 منجر به افزایش قابل توجه تعداد این سلول‎ها در کبد شده است، در حالی که که تیمار حیوانات با 140 میلی‎گرم بر کیلوگرمEP تعداد سلول‎های التهابی القا شده با CCl4 را به طور معنی‎داری کاهش داده است. این کاهشِ تعداد سلول‎های التهابی در گروه تیمار شده با 1400 میلی‎گرم بر کیلوگرم EPبه مراتب بیشتر بوده است. بنابراین می‎توان گفت EPالتهاب بافتی القا شده توسط CCl4 را تا حد زیادی سرکوب نموده است.  در این مطالعه میزان نکروز بافتی نیز در اسلایدهای H&E با استفاده از جدول شماره 1 کمی شد. نتایج گویای کاهش معنی دار نکروز مرکز لوبولی در حیوانات تیمار شده با دوز بالای EP (1400 میلی‎گرم بر کیلوگرم) در مقایسه با حیواناتی بود که فقط  CCl4دریافت کرده بودند (شکل5، B). چنین کاهشی در میزان نکروز مرکز لوبولی در حیواتی که با دوز پایین EP تیمار شده بودند نیز مشاهده شد ولی از نظر آماری معنی‏دار نبود.

 

 

شکل5: A) تاثیر  EP‌بر میانگین سلول­های التهابی  در کبد حیوانات تیمار شده با CCl4؛ تیمار با EP به طور وابسته به دوز تعداد سلولهای نوتورفیل، کوپفر و لنفوسیت موجود در کبد را کاهش داده است.B ) تاثیر EP بر درجه نکروز بافتی در حیوانات تیمار شده با CCl4؛ تیمار با دوز بالای EP موجب کاهش معنی دار نکروز بافتی در مقایسه با گروه CCl4 شده است (امتیاز دهی به نکروز در اسلایدهای H&E‌ بر اساس جدول شماره1).  001/0P<# میزان معنی داری اختلاف از گروه کنترل و 001/0P<* میزانمعنی داری اختلاف از گروه CCl4را نشان می دهند. تعداد حیوانات در هر گروه 6 سر است (EP: Ephedra pachyclada ؛ Low EP: غلظت پایین عصاره  EP‌معادل(140 میلیگرم بر کیلوگرم)، High EP: غلظت بالای عصاره EP معادل (1400 میلیگرم بر کیلوگرم)؛CCl4  : تتراکلرید کربن؛ H&E:  هماتوکسیلین و ائوزین).

 

 

 

بحث

با توجه به ناشناخته بودن اثرات روش‎های جدید درمانی، مدل‏سازی بیماری‎های گوناگون در حیوانات پیش از شروع  آزمایشات بالینی بسیار حائز اهمیت است. از این رو در این مطالعه سعی شد ابتدا مدل تایید شده‎ای از بیماری حاد کبدی در موش القا شود. برای این منظور از هپاتوتوکسینی به نام CCl4 استفاده شد. با توجه به نتایج بدست آمده مشخص گردید که تزریق 2 میلی‎لیتر بر کیلوگرم از CCl4 منجر به نکروز گسترده و تجمع سلول‏های التهابی حول رگ مرکزی و همچنین افزایش فعالیت سرمی AST‌ وALT  در حیوانات خواهد شد. نتایج این مدل سازی با یافته­های مطالعات پیشین مطابقت داشته (19، 23، 24 و25) و صحت القای مدل مورد نظر را تایید نمود. تحقیقات نشان داده‎اند که CCl4 بعد از جذب و ورود به خون وارد کبد شده و در میکروزوم‎های کبدی توسط سیتوکروم P450 به رادیکال‎های آزاد تری‎کلرومتیل و پراکسی‎کلرومتیل متابولیزه می­شود (26).این رادیکال‎هابا حمله به غشای سلولی سببپراکسیداسیونلیپیدی آن شد و سپسمنجر به هضم غشای سلولی و القای نکروز در سلول‎های پارانشیمی کبد می‏شود (27). فعالیت آنزیماتیک سرمی با آسیب‎های پارانشیمی کبد در ارتباط است. این آسیب‎ها  موجب آزاد­سازی AST و ALT از مواضع شان در میتوکندری و سیتوزولِ هپاتوسیت‎ها و راه یافتن این آنزیم ها ازd-GTP غشایی و گسیختگی­های سلولی به خون شده و فعالیت سرمی آن‎ها را افزایش می‎دهند (28). از طرف دیگر هپاتوسیت هایی که تحت تاثیر نکروز قرار گرفته‎اند شروع واکنش‎های التهابی را در کبد تحریک می­کنند. مشخصه التهاب در کبد تهاجم سلول‎های التهابی است، این سلول‎ها با ترشح سایتوکین­های التهابی مثل IL-6 و  TNFα باعث پیشروی بیماری و آسیب بیشتر کبد می‏شوند (29).

در این مطالعه جهت بررسی تاثیرات EP بر آسیب حاد کبدی، القای بیماری به روش آزموده شده قبل درسه گروه از موش ها صورت گرفت و دو گروه از موش‏ها روزانه با دوزهای مختلف EP تیمار شدند. نتایج این آزمایش نشان داد که تیمار با EP قادر به افزایش قابل­ توجه شانس بقا و کاهش وزن نسبی کبد در حیوانات دارای آسیب حاد کبدی است. همچنین EP می‎تواند فعالیت سرمی آنزیم‎های AST و ALT را کاهش دهد که خود به معنای کاهش مرگ سلولی و آسیب در بافت کبد است. مطالعات بافت‎شناسی کبد حیوانات مورد آزمایش نیز نشان داد که تیمار با EP، نکروز هپاتوسیتی و تجمع سلول های التهابی القا شده توسط CCl4 را کاهش داده و به بازسازی داربست کبد کمک می­کند. با توجه به نتایج به دست آمده می‎توان گفت EP کبد را در برابر آسیب حاد القا شده توسط CCl4 حفاظت می‏کند.

از آنجا که استرس اکسیداتیو و التهاب القا شده توسط آن عامل آسیب زننده به بافت کبدی‎اند و در ایجاد بسیاری از بیماری‎های حاد کبدی نقش مهمی دارند، از این رو آنتی اکسیدانت‎ها قادرند با کاهش پراکسیداسیون لیپیدی و نکروز هپاتوسیتی تا حد زیادی کبد را در مقابل آسیب‎ها محافظت کنند. به هم دلیل است که اهمیت جستجوی آنتی اکسیدانت‎های طبیعی در سال‎های اخیر افزایش قابل توجهی یافته است (30). امروزه با وجود پیشرفت­های زیاد داروهای مدرن، دارویی که قادر به تحریک کبد آسیب دیده و بازسازی آن باشد وجود ندارد (9 و 31). همین موضوع سبب شده است تا برخی از دانشمندان علوم داروشناسی پتانسیل فعالیت هپاتوپروتکتیو را در گیاهان و بر پایه طب سنتی جستجو کنند(8 و 9)، چرا که بسیاریازترکیبات ‌‌گیاهیازجملهپلی‎فنل‎هادارایخواص آنتیاکسیدانتیهستند (32).ترکیباتپلی‎فنلیخصوصافلاونوئیدها دارای اثرحفاظتیدربرابرآسیب‎هایناشیازسمومکبدیورادیکال‏هایآزادهستند (33 و 34).

Parsaeimehr   و همکارانش (15) نشان دادند که EP واجد خاصیت آنتی‎اکسیدانتی است آن‎ها همچنین ثابت کردند که این گیاه حاوی مقادیر قابل توجهی ترکیبات فنلی است بنابراین به نظر می رسد EP ‌به دلیل دارا بودن ترکیبات فنلی و خاصیت آنتی‎اکسیدانتی ناشی از حضور این ترکیبات، منجر به غیر فعال ساختن رادیکال­های آزاد تولید شده توسط CCl4 شده و از آسیب به غشای سلول‎ها و القای نکروز در آن‎ها جلوگیری نموده است. با کاهش آسیب‎های پارانشیمی کبد توسط EP فعالیت سرمی آنزیم‎­های کبدی نیز به طبع آن کاهش یافته است. این نتایج با یافته‎های سایر محققان در مورد تاثیرات آنتی‎اکسیدانت‎ها در محافظت کبدی مطابقت دارد (35، 36، 37 و 38). همچنینافزایشوزنکبدووزننسبیکبددر گروهتیمارشدهبا CCl4  می‎تواندناشیازتجمع لیپیدوبروزتورم سیتوتوکسیکدرسلول­هایکبدی در اثر نشتروبهخارجپتاسیمو ورودهمزمانسدیموآببهدرونسلول باشد که به عنوان یکیازمهم‎تریناثراتپراکسیداسیونلیپیدیدرنظرگرفته می شود وتیمار حیوانات با دوز بالای EP با جلوگیری از پراکسیداسیون لیپیدی تا حد زیادی افزایش وزن نسبی کبد در اثر CCl4 را جبران نموده است (39 و 40). از آنجا که حیوانات در یک فاصله زمانی 2 ساعته بعد از دریافت CCl4 با EP تیمار شدند تعدادی از هپاتوسیت‎ها خصوصا در نواحی مرکز لوبولی که بیشترین میزان سیتوکرومP450 را دارا هستند (41) دچار نکروز شده و پاسخ‎های التهابی را در کبد تحریک نموده­اند. همان طور که گفته شد پاسخ‎های التهابی و ارتشاح سلول‎های التهابی به بافت کبد، خود مرحله بسیار آسیب زننده در پروسه بیماری زایی کبد است و می تواند به اختلال شدید در عملکرد کبد منجر گردد (29 و 42). در این مطالعه نشان داده شد که در گروه‎های تیمار شده با EP تعداد سلول‎های التهابی در بافت کبد به طور قابل توجهی کاهش یافته بود. از این رو می‎توان گفت مکانسیم فعالیت محافظت کبدی EP علاوه بر خواص آنتی‎اکسیدانتی­اش در خاصیت ضد التهابی آن نیز هست که احتمالا به دلیل حضور ترکیبات افدرینی موجود در این گیاه است (11). با توجه به یافته­ هایYeom  (13) و Yamada و همکارانشان (14)، EP احتمالا با کاهش ترشح سایتوکین­ التهابی موجب مهار التهاب بافتی می‎شود. آن‎ها همچنین نشان دادند که تیمار با EP  باعث افزایش سطح پروتینی IL-10 و STAT3 در کبد می­شود. تحقیقات نشان داده‎اند واکنش­های ضد ­التهابی در کبد با فعال سازی مسیر STAT3 در سلول ­های کوپفر توسط IL-10 که یک سایتوکین ضد التهابی است در ارتباط می ‎باشد (43). از این رو‌EP  احتمالا با سرکوب ترشح سایتوکین­های التهابی و تحریک ترشح سایتوکین‎های ضد ­التهابی و فعال­ سازی مسیر STAT3 روند التهاب در کبد را مهار می‎کند. مهار پراکسیداسیون لیپیدی و نکروز هپاتوسیتی و همچنین سرکوب التهاب، منجر به بازگشت عمل‎کرد از دست رفته کبد و بازسازی سلول‎های آسیب دیده می شود. این نتایج در مطالعات بسیاری دیده شده اند (44، 45، 46، 47 و 48). بازگشت نسبی عمل­کرد کبد و کاهش مارکر­های سرمی آسیب کبدی از انسفالوپاتی کبدی و مرگ در اثر آن جلوگیری می‎کند از این روست که درصد بیشتری از حیوانات بیمار تیمار شده با EP زنده ماندند.

 

نتیجه گیری

نتایجتحقیقحاضرنشاندادکهتیمارباعصاره Ephedra pachycladaموجبتخفیفآسیبکبدیالقاشدهتوسط تتراکلریدکربنشده وبهصورتمعنی­داریتمامی شاخص‏هایآسیببافتیرا بهبودمی­بخشد.EP‌ احتمالابامهاربرهمکنش‏هایشیمیاییرادیکال­های آزاد ناشی از CCl4 که آغاز ‌‌‌کنندهاسترساکسیداتیو،پراکسیداسیونلیپیدو تغییراتمولکولیهستند و همچنین سرکوب التهاب بافتی اثرحفاظتکنندگیکبدرااعمال میکند.

 

تشکر و قدردانی

مولفینمراتبسپاسخودرااز زحمات فراوان آقای دکتر یاسر تهمتنی و خانم سیده غدیره میرابوالقاسمی در انجام این پروژه ابراز می‏دارند.

  1. Meyer, S.A, Kulkarni, A.P. Hepatotoxicity. In: Hodgson E,Smart RC, editors, Introduction to biochemical toxicology, 3thEd. New York: A. John Wiley & Sons, Inc; 2001; p. 487-90.
  2. Zakim, D, Boyer, T.D. Hepatology: A Textbook of Liver Disease. 2thEd. the University of Michigan: Saunders, Inc; 1990; p.750.
  3. Trey C, Davidson CS. The management of fulminant hepaticfailure. Prog Liver Dis.1970; 3: 282-298.
  4. Rakela J, Lange SM, Ludwig J, et al. fulminate hepatitis: Mayo clinic experience with cases. Mayo clin proc. 1985; 60(5): 289-292.
  5. Shakil AO, Kramer D, Mazariegos GV, Fung JJ, et al. Acuteliver failure: clinical features, outcome analysis, and applicability ofprognostic criteria. Liver Transplant. 2000; 6:163-169.
  6. Plevris JN, Schina M, Hayes PC. Review article: The managementof acute liver failure. Aliment Pharmacol Ther. 1998; 12:405-418.
  7. Fong BM, Siu TS, Sidney T. Persistently Increased Acetaminophen Concentrations in a Patient with Acute Liver Failure. Clinical Chem. 2011; 57:13-19.
  8. Shanmugasundaram P, Venkataraman S.Hepatoprotective and antioxidant effects of Hygrophilaauriculta Heine. Root extract. J. Ethanopharmacology.2006; 104:124-128.
  9.  Witte I, Berlin J, Wray V, Schubert W, et al. Mono-und diterpenes from cell cultures orThuja occidenalis. Planta Medica. 1983; 49(12): 216-221.
  10.  Soni MG, Carabin IG, Griffiths JC, Burdock GA. Safety ofephedra: lessons learned. Toxicol Lett. 2004; 150:97-110.
  11.  Hikino H, Konno C, Takata H, Tamada M. Anti-inflammatoryprinciple of Ephedra Herbs. Chem Pharm Bull. 1980; 28:2900-2904.
  12. Shekelle PG, Hardy ML, Morton SC, Maglione M, et al. Efficacy and safety of ephedra and ephedrine forweight loss and athletic performance: a meta-analysis. J Am MedAssoc. 2003; 289:1537–45.
  13. Yeom MJ, Lee HC, Kim GH, Lee HJ, et al. Antiarthritic effects of ephedra sinica Stapf herb-acupuncture: inhibition of lipopolysaccharide-induced inflammation and adjuvant-induced polyarthritis. J Pharmacol Sci. 2006; 100:41-50.
  14. Yamada I, Goto T, Takeuchi S, Ohshima S, et al.Mao Ephedra sinica Stapf protects against D-
 

galactosamineandlipopolysaccharide-induced hepatic failure. Cytokine. 2008; 41:293-301.

  1. Parsaeimehr A, Sargsyan E, Javidnia K. A Comparative Study of the Antibacterial, Antifungal and Antioxidant Activity and Total Content of Phenolic Compounds of Cell Cultures and Wild Plants of Three Endemic Species of Ephedra. Molecules. 2010; 15:1668-1678.
  2. Munoz RH, Munoz MD, Lopez VN, Barrera FLP, et al. Balance between oxidative damage and proliferative potential inan experimental rat model of CCl4–induced cirrhosis: protectiverole of adenosine administration. Hepatol. 1997; 26:1100-1110.
  3. Terblanche J, Hickman R. Animal models of fulminant hepaticfailure. Dig Dis Sci. 1991; 36: 770-774.
  4. Arezzini B, Lunghi B, Lungarella G, et al. Iron overload enhances the development of experimental liver cirrhosis in mice. Inter J of biochemistry and cell biology. 2003;35: 486-95.
  5. Gutierrez R, Alvarado JL, Presno M, Veyna OP, et al. Oxidative Stress Modulation by Rosmarinus officinalis in CCl4-induced Liver Cirrhosis. Phytother. Res. 2009; 80:399-348.
20. Fu Y, Zheng Sh, Lin J, Ryerse J, et al. Curcumin Protects the Rat Liver from CCl4-Caused Injury and Fibrogenesis by Attenuating Oxidative Stress and Suppressing Inflammation. Mol Pharmacol. 2008;73(2):399–409.

21. Weber LW, Boll M, Stampfl A.  Hepatotoxicity and mechanism of action of haloalkanes: carbon tetrachloride as a toxicological model. Crit Rev Toxicol. 2003; 33(2): 105-114.

22. Lowes KN, Croager EJ, Olynyk JK, Abraham LJ, et al. Oval cell-mediated liver regeneration: Role of cytokines and growth factors. J of Gastroenterol and Hepatol. 2003; 18: 4-12.

23. Wu Y, Li L, Wen T, Li YQ. Protective effects of echinacoside on carbon tetrachloride induced hepatotoxicity in rats. Toxicology. 2007; 232(1-2): 50-6.

24. Kodai S, Takemura S, Minamiyama Y, Hai S, et al. S-allyl cysteine prevents CCl(4)-induced acute liver injury in rats. Free Radic Res. 2007; 41(4): 489-97.

25. Ohta Y, Nishida K, Sasaki E, Kongo M, et al. Attenuation of disrupted hepatic active oxygen metabolism with the recovery of acute liver injury in rats intoxicated with carbon tetrachloride. Res. Commun. Mol. Pathol. Pharamcol. 1997; 95: 191-207.

26. Recknagel RO, Glinde JR, Dolak JA. Mechanisms of carbon tetrachloride toxicity. Pharmacol. Ther. 1989; 43: 139-154.

27. Lliwell B. Reactive oxygen species in living systems: source, biochemistry and role in human disease. American J of Medicine. 1991; 91(3): 14–22.

28. Gressner OA, Weiskirchen R, Gressner AM. Biomarkers ofliver fibrosis: Clinical translation of molecular pathogenesisor based on liver-dependent malfunction tests. Clin ChimActa. 2007; 381(2): 107-113.

29. Choi I, Kang HS, Yang Y, Pyun KH. IL-6 induces hepatic inflammation and collagen synthesis in vivo. Clin Exp Immunol. 1994; 95: 530-535.

30. Wojdylo, A, Oszmianski, J, Czemerys R. Antioxidant activity and phenolic compounds in 32 selected herbs. Food Chem. 2007; 105: 940-949.

31. Chattopadhyay RR. Possible mechanism ofhepatoprotective activity of Azadirachta indica leafextract. J of Ethanopharmacol. 2003; 89(2-3): 217-219.

32. Areias FM, Valentao P, Andrade PB, Ferreres F, et al. Phenolic fingerprint of peppermint leaves. Food Chem. 2001; 73: 307-11.

33. Carreon JP, Iimenez GC, Vega JI. Genotoxic and antigenotoxic properties of Calendula officinalis extract in rat liver cell cultures tread with diethy initrosamin. Toxicol in vitro. 2002; 16: 235-58.

34. Friedman WE. Introduction to biology and evolution of the Gnetales. Int. J. Plant Sci. 1996; 157: S1-S2.

35. Naik SR, Panda VS. Hepatoprotective effect of Ginkgoselect Phytosome in rifampicin induced liver injurym in rats: Evidence of antioxidant activity. Fitoterapia. 2008; 79(6): 439-45.

36. Buettener GR. The pecking order of free radicals and antioxidant: lipid peroxidation, alpha– tocopheral and ascorbat. Arch Biophysic. 1993; 300: 535-43.

37. Hinneburg I, Damien Dorman HJ, Hiltunen R. Antioxidant activities of extracts from selected culinary herbs and spices. Food Chem. 2006; 97(11): 122-29.

38. Cos P, Rajan P, Vedernikova I, Calomme M, et al. In vitro antioxidant profile of phenolic acid derivatives. Free Radic Res. 2002; 36: 711-16.

39. Seyer JM, Hutcheson ET, Kang AH. Collagen polymorphism in normal and cirrhotic human liver. J Clin Invest. 1977; 59(2): 241- 8.

  1. 40.  Hazarika A, Sarkar SN, Hajare S, Kataria M, et al. Influence of Malathion pretreatment on the toxicity of anilofos in male rats: a biochemical interaction study. Toxicol. 2003; 1851-2):1-8.
41. Hau DK, Gambari R, Wong RS, Yuen MC, et al. Phyllanthus urinaria extract attenuates acetaminophen induced hepatotoxicity, Involvement of cytochrome P450 CYP2E1. Phytomed. 2009; 16(8): 751-760.

42. Berasain C, Castillo J, Perugorria MJ, Latasa MU. Inflammation and Liver Cancer. In: Steroid Enzymes and Cancer: Ann. N.Y. Acad. Sci. 2009; 1155: 206-221.

43. Wang H, Lafdil F, Kong X, Gao B. Signal Transducer and Activator of Transcription 3 in Liver Diseases: A Novel Therapeutic Target. Inter J of Biol Sci tertilrlfiliclcieces. 2011; 7(5):536-550.

44. Horiguchi N, Lafdil F, Miller AM, Park O, et al. Dissociation between liver inflammation and hepatocellular damage induced by carbon tetrachloride in myeloid cell-specific signal transducer and activator of transcription 3 gene knockout mice. Hepatol. 2010; 51:1724-1734.

45. Zenewicz LA, Yancopoulos GD, Valenzuela DM, Murphy AJ, et al. Interleukin-22 but not interleukin-17 provides protection to hepatocytes during acute liver inflammation. Immunity. 2007; 27:647-659.

46. Horiguchi N, Wang L, Mukhopadhyay P, Park O, et al. Cell type-dependent pro- and anti-inflammatory role of signal transducer and activator of transcription 3 in alcoholic liver injury. Gastroenterology. 2008; 134:1148-1158.

47. FengY, Siu KW, Ye X, WangN, et al. Hepatoprotective effects of berberine on carbon tetrachloride-induced acut hepatotoxicity in rats. Chinese Medicine. 2010; 5:33-9.

48. Reyes-Gordillo K, Segovia J, Shibayama M, Vergara P, et al. Curcumin protects against acute liver damage in the rat by inhibiting NF-κB, proinflammatory cytokines production and oxidative stress. Biochimica and Biophysica Acta. 2007; 1770(6):989-996.