مدل سازی سرطان پستان با استفاده از مواد شیمیایی و بررسی تاثیر رادیوداروی P32 بر سلول‎های سرطان حاصل

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

-

چکیده

هدف‎: توانایی داروی رادیواکتیو P32 برای درمان و کنترل سرطان پستان و بررسی توزیع این رادیو دارو در موش‎های مبتلا مورد بررسی این مقاله می‎باشد.
مواد و روش‎ها: 10تا20 میلی‎گرم بر کیلوگرم وزن بدن از کارسینوژن DMBA به رت‎های نژاد SD تحت آزمایش خورانده شد. تومورهای به قطر 10 تا 15میلی‎متر برای آزمایش انتخاب شدند. رادیو دارو بر اساس الگوی تهیه شده به تومورهای به فاصله 3 و 5 و 7 روز تزریق گردید. در این فاصله توزیع رادیودارو در بدن موش، توسط دستگاه دتکتوریدورسدیم مورد ارزیابی قرار گرفت. پس از پایان دوره‏ی تیمار حیوان بیهوش و در شرایط استریل تومور را بطور کامل خارج و ودر فرمالین10 درصد قرار داده شد. برش‏هایی از تومورها با استفاده از دستگاه تیشو پروسسور مورد پردازش و تهیه قرار گرفتند. پس از مراحل پاساژ بافتی و برش‌گیری، نمونه ها از طریق رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین  مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج: بررسی هیستولوژیک مقاطع تهیه شده از بافت‎های توموری موید این مطلب بود که پاتولوژی تومورهای القایی ایجاد شده توسط DMBA در موش‎های صحرائی مورد استفاده در این تحقیق، شباهت زیادی با تومورهای پستانی در انسان داشت. 5 روز بعد از تزریق رادیوفسفر مجاری و غدد تومورال توسط باقیمانده‎های سلول‎های اپی‎تلیال پوشانیده شده بود. بسیاری از سلول‎ها از غشای پایه جدا شده و به داخل حفره‎های غددی ریزش پیدا کرده بودند. سلول‎های باقیمانده دارای هسته کوچک  و کروماتینی متراکم و سیتوپلاسم نیز حالت فشرده و متراکم  داشت. مناطق اطراف محل تزریق دارو به شعاع حدود 7 تا 8 میلی‎متر تمامی سلول‎ها نکروزه شده و تشکیل حفره ای در داخل تومور داده بودند.
نتیجه گیری: این مشاهدات نفوذ و تاثیر بیشتر تشعشعات ساطع شده از فسفر 32 در بافت توموری را نشان می‏دهد و چنانچه نقاط تزریق با فاصله مناسب در تومور صورت گیرد توانایی نابودی تومور در زمان کوتاه تری را خواهد داشت.
 

کلیدواژه‌ها


مقدمه

یکی از بیماری‎های مهلک دامنگیر انسان سرطان است لذا مطالعه در خصوص روش‎های مبارزه با سرطان یکی از عناوین مهم تحقیقات در دنیا محسوب می گردد. استفاده از رادیوداروها در مبارزه با سرطان دارای تاریخچه طولانی است و هم اکنون نیز از این روش برای کنترل و یا درمان سرطان استفاده گسترده‎ای در دنیا و همچنین کشور ایران می گردد. توانائی P32 برای درمان سرطان پستان و بررسی چگونگی توزیع این رادیودارو در موش‎های مبتلا مورد بررسی این مقاله می باشد. از پرکاربردترین رادیوداروها می توان به P32 Chromic اشاره نمود (1). P32 یکی از داروهای رادیواکتیو است که دارای تابش 100 درصد بتا با انرژی ماگزیمم1710 کیلو الکترون ولت (متوسط 7/694 کیلو الکترون ولت) و نیمه عمر 3/14 روز و عمق نفوذ 8 میلی‎متر می باشد. ذرات این رادیو دارو 600 تا 1300 نانومتر می باشد (2) و از آن دارو بصورت تزریق برای کنترل تومورهای سرطانی استفاده می‎گردد. عمق نفوذ اشعه بتا حاصل از P32 در بافت‎های بدن معادل 6/7 میلی‎متر می باشد (3). جذب بالای فسفر در بافت‎های استخوانی رادیوداروهای فسفات P32 را به گزینه‌ای بسیار مناسب در تسکین و درمان مبتلایان به سرطان استخوان تبدیل کرده است. از جمله علل استفاده این رادیودارو انتشار کم آن به بافت‎های مجاور تومور و همچنین به سایر اندام‎های بدن

است که مربوط به اندازه ذرات آن می‎باشد (4).

بررسی چگونگی تاثیر این دارو در تومورهای القایی ایجاد شده توسط DMBA (7,12-Dimethylbenz(a)anthracene) (2) در حیوانات خانگی مانند موش صحرائی (رت) و خرگوش می‎تواند راهنمای مناسبی برای کاربرد بهینه آن در انسان باشد. ایجاد تومورهای سطحی و localize به منظور امکان تزریق فسفر رادیواکتیو و سپس مطالعه روند بهبود موش‎های مبتلا، بیوپسی و مطالعه تغییرات حاصله در مراحل مختلف، بررسی میزان تجمع دارو در اندام ها و بافت های مختلف موش های مبتلا و تعیین تغییرات بافتی در محل تزریق و نواحی اطراف آن و از بین رفتن احتمال تومورها از اهداف این تحقیق بوده است.

 

مواد و روش‌ها

108 موش صحرائی از نژاد Sprague Dawley از انستیتو پاستور تهیه گردید (در تمامی مراحل این تحقیق اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی رعایت شده است). بعد از تطبیق پذیری با شرایط محیط (12 ساعت روشنائی و 12 ساعت تاریکی) و رسیدن به وزن حدود 150 گرم، و سن50 تا 54 روزگی حیوانات بطور اتفاقی به 3 گروه به شرح جدول 1 تقسیم گردیدند.

 

جدول 1: گروه بندی رت های مورد استفاده در این تحقیق و مشخصات هر یک از گروه‎ها

گروه‎ها

تعداد رت

گروه بندی داخلی

دوز تزریقی

موارد استفاده

قطر تومور

کنترل

36

سه گروه 12 تائی

روغن کنجد 1 میلی‎گرم

 

 

دریافت

کننده

 DMBA

36

سه گروه 12 تائی

دوز اولیه (12 سر)

 دوز ثانویه (12 سر)

بدون دریافت رادیودارو (12 سر)

2 نمونه برای مطالعه هیستوپاتولوژی

 

دریافت

کننده

DMBA

و رادیو دارو

36

سه گروه 12 تائی

دوز اولیه (12 سر)

دوز ثانویه (12 سر)

همراه با دریافت رادیودارو(12 سر)

2نمونه برای مطالعه هیستوپاتولوژی و‌ اندازه گیری روند بهبود سنجش رادیودارو در اندام‎های مختلف

شروع تزریق دارو، قطر تومورحدود 20 میلی‎متر

 

 

به گروه دوم و سوم یک دوز 5 میلی‎گرم از DMBA مخلوط با1 میلی‎گرم روغن کنجد از راه خوراکی (به عنوان دوز اولیه) داده شد این کار را در طی 1 هفتۀ بعدی تکرار شد (دوز ثانویه). به گروه های کنترل 1 میلی‎گرم روغن کنجد خورانده شد.

رادیودارو P32  از مرکز پزشکی هسته‎ای تهیه و با توجه به نیم عمر 14 روزه آن در زمانی که قطر تومور در نمونه‎های گروه سوم به 20 میلی‎متر رسیدند از مرکز تومور به سمت حاشیه آن به فاصله 7 میلی‎متر تزریق گردید. جهت بررسی اندام‎های دریافت کننده رادیودارو به یک گروه موش به تعداد 8 سر  به روش درون صفاقی و به یک گروه موش به تعداد 8 سر  به روش درون رگی رادیودارو  تزریق گردید و با استفاده از دستگاه دتکتور یدورسدیم (NaI)  تجمع رادیودارو در اندام‎های مختلف اندازه گیری گردید (نمودار1). با استفاده از سیستم اندازه‎گیری، میزان تابش تومورهای موش زنده در 3 ، 5 و 7 روز پس از تزریق فسفر 32  اندازه گیری که در نمودار 2 نمایش داده شده است. همانطور که در نمودار2 مشخص است فقط موش شماره 3 تا آخرین مرحله اندازه گیری زنده بوده است.

 

 

نمودار1: نتایج اندازه گیری تجمع فسفر 32 در اندام های مختلف موش در تزریق داخل رگی  ( IV) و داخل صفاقی (IP) با استفاده از آشکار ساز یدور سدیم

 

 

 

نمودار 2: اندازه گیری تابش تومورهای موش زنده در 3 ، 5 و 7 روز پس از تزریق فسفر 32

 

 

پس از پایان دوره‏ی تیمار (رسیدن تومور به اندازه‎ی نشان داده شده در شکل 1)، حیوان توسط دی‌اتیل‌ اتر بی‎هوش شد  و ناحیه‎ی اطراف تومور را تراشیدهو پس از شکافتن ناحیه اطراف تومور و در شرایط استریل تومور را بطور کامل خارج کرده و  یک قسمت از سه قسمت تومور حاصل در فرمالین 10 درصد قرار داده شد.

 

شکل1: محل ایجاد تومر بعد از تزریق DMBA                            (7-12 Dimethylbenz(a)anthracene)

 

مراحل پاساژ بافتی: تومورها با استفاده از دستگاه اتوتکنیکوم (Leica Histokinette) مورد پردازش قرار گرفتند. مراحل با اصلاحات جزئی بر طبق روش کار شرکت سازنده انجام پذیرفت که بطور خلاصه در ادامه بیان می‎گردد. پس از آب‌گیری بافت توسط الکل با درجات صعودی شفاف سازی نمونه‌ها از الکل با جایگزینی توسط زایلن و سپس آغشته سازی با پارافین صورت گرفت و در انتها نمونه‌ها با حفظ جهت و نظم و ترتیب اولیه در پارافین قالب‌گیری شدند. دو قطعه قالب بر روی سطح صاف شیشه‌ای یا سنگی قرارداده شد و پارافین مذاب به داخل قالب ریخته شد، نمونه‌ها با حفظ جهت در قالب حاوی پارافین قرارداده شدند و مشخصات هر برش نیز روی کاغذ یادداشت و به وسیله‎ی پارافین داخل قالب بلوک به پارافین چسبانیده شد. بعد از سرد و سفت شدن پارافین، قالب ها با ضربه‎ی مختصری از پارافین جامد حاوی نمونه جدا گردید و قالب ها تا زمان برش‌گیری توسط میکروتوم در یخچال نگهداری شدند.

تهیه مقاطع بافتی توسط میکروتوم: برش‌گیری از بلوک‎های پارافینی حاوی نمونه توسط میکروتوم و با ضخامت 3 میکرومتر تهیه شد. سپس جهت رفع چروکیدگی، نمونه‎ها را با شیب 30 درجه و بر روی حمام آب گرم با درجه حرارت 45 درجه سانتی‎گراد به روی لام که قبلا بر روی آن‎ها چسب آلبومین قرار داده شده بود منتقل گردید. لام‌ها به روی هیتر منتقل و سپس به روی تخته چوبی قرار داده شد و برای مدت 12 ساعت در فور و در دمای 39 درجه سانتی‎گراد قرارگرفت تا نمونه‌ها کاملا به روی لام بچسبند. از هر بلوک یک لام جهت رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین درنظرگرفته شد تا بمنظور مطالعه و تشخیص پاتولوژی استفاده گردد.

رنگ آمیزی مقاطع بافتی هماتوکسیلین- ائوزین :(H&E) قبل از رنگ آمیزی، لام‏ها در دمای 55 درجه سانتی‎گراد به مدت 1تا 2 ساعت در فور به جهت دپارافینه شدن قرار داده شد و پس از حذف گزیلل و الکل سلول‎ها، از محلول هماتوکسیلین هاریس جهت رنگ آمیزی برش های بافتی استفاده شد. جهت دائمی کردن نمونه‎ها از چسب انتلان بین لام و لامل استفاده گردید و‌ سپس لام‌ها به مدت 12 ساعت در هوای آزاد قرار گرفت تا کاملا خشک شوند.

 

نتایج

نتایج بدست آمده از بررسی هیستولوژیک مقاطع تهیه شده از بافت های توموری مؤید این مطلب است که پاتولوژی تومورهای ایجاد شده در موش‎های صحرائی مورد استفاده در این تحقیق، شباهت زیادی با تومورهای پستانی در انسان دارد. پیش از این نیز Russo (5) گزارش نموده که اکثر تومورهای پستانی القا شده توسط DMBA از نوع ادنوکارسینوما بوده و مشخصات تومورهای پستان انسانی را از نظر رشد وابسته به هورمون و هیستولوژی تقلید می‎کند و بنابراین مدل حیوانی مناسبی جهت تحقیق در مورد کارسینوژنز تومورهای پستان انسانی می باشد. همچنین مطالعات بیوشیمیایی انجام گرفته در مطالعات پیشین شباهت‎های بیشتری را بین این مدل با نمونه‎های انسانی آشکار نموده‎اند (6). با توجه به این یافته‎ها و با نظر به اینکه ژنوم انسان و رت تا حد زیادی با یکدیگر شباهت دارند، بنابراین از دیدگاه ژنتیکی نیز می‎بایست شباهت‎های زیادی بین تومورهای پستانی ایجاد شده در رت و تومورهای انسانی وجود داشته باشد. چنانکه در شکل2 مشاهده می گردد چهارچوب  تشکیلات توموری در نمونه موجود بوده و در برخی مناطق سلول‎های توموری دارای هسته بزرگ با سیتوپلاسم مشخص هستند و تعداد سلول‎های درحال نکروزکم می‎باشد. در سایر مناطق  ایجاد واکوئلی شدن در داخل سیتوپلاسم  سلولهای توموری  دال بر  نکروز سلولی می‎باشد. بافت پشتیبان به صورت نرمال (حاوی سلول و رشته بافت همبند) می‎باشد و در کل  نشانه مورفولوژیکی خاصی  دال  بر آسیب بافت پشتیبان وجود ندارد.

 

شکل2: تصویری از تومور 3 روز  بعد از تزریق رادیوفسفر:32. (رنگ آمیزی هماتوکسیلین هاریس و بزرگنمایی با ابژکتیوx 40)، (A: سلول‎های چربی، B: بافت همبند،C: سلول‎های تومور، D: فیبروبلاست، E: واکوئل سازی سلول‎های توموری)

 

در شکل3 که 5 روز بعد از تزریق رادیوفسفر تهیه شده است مشاهده می گردد که مجاری و غدد تومورال توسط  باقیمانده‎های سلول‎های اپی‎تلیال پوشیده شده است و بسیاری از سلول‎ها از غشای پایه جدا شده‎اند  و به داخل حفره‎های غددی ریزش پیدا کرده‎اند. سلول‎های باقیمانده دارای هسته کوچک با کروماتینی متراکم و سیتوپلاسم نیز حالت فشرده و متراکم  دارد که مجموعا طرحی شبیه به آپوپتوزیس  بوجود آورده‎اند. هر چند ظاهر سلولی  با تعاریف مربوط به نکروز سلولی  منطبق نمی باشد  ولی به نظر می‎رسد که سلول‎ها  بر اثر تاثیرات رادیودارو  در حال از بین رفتن باشند.

 

شکل3: تصویری از تومور 5 روز  بعد از تزریق رادیوفسفر32. (رنگ آمیزی هماتوکسیلین هاریس و بزرگنمایی با ابژکتیوx 40) (A: سلولهای اپی تلیال، B: سلول اپی تلیال نکروزی، C: فیبروبلا ست، D: ماکروفاژ، E: بافت پشتیبان متورم)

در شکل4 نیز مراحل توضیح داده شده در فوق، با  پیشرفت بیشتری را نشان می دهد و فلش‎ها نکروز شدن کامل سلول‎های اپی تلیال و بقایای حاصل از آن می‎باشد. لازم به ذکر است این نواحی، نواحی نزدیک به منطقه نفوذ رادیودارو می باشد و مناطق اطراف محل تزریق دارو به شعاع حدود 7 تا 8 میلی‎متر تمامی سلول‎ها نکروزه شده و تشکیل حفره‎ای در داخل تومور داده‎اند.

 

شکل4: تصویری از تومور 7 روز  بعد از تزریق رادیوفسفر32. (رنگ آمیزی هماتوکسیلین هاریس و بزرگنمایی با ابژکتیوx 40) (A: نکروز کامل سلولهای اپی تلیال ترشحی و مجرایی و  باقی ماندن بقایا در محل، B: بافت پشتیبان بسیار متورم همراه با سلولهای فیبروبلاست، C: حضوراندک سلولهای التهابی)

 

این مشاهدات نشان‎دهنده نفوذ و تاثیر بیشتر تشعشعات ساطع شده از فسفر 32 در بافت توموری را نشان می دهد و چنانچه نقاط تزریق با فاصله مناسب در تومور تزریق گردد توانایی نابودی تومور در زمان کوتاه تری را خواهد داشت. بررسی های این تحقیق نشان داد که در دو روش تزریقی یعنی تزریق صفاقی و تزریق وریدی میزان جذب فسفر 32 در بسیاری از اندام‎ها از جمله رحم، قلب، چربی داخل شکم، و جمجمه مشابه بود ولی بر اساس روش تزریق تجمع این رادیودارو در صفاق و ریه متفاوت دیده می شد که به ترتیب مربوط به تزریق داخل صفاقی و تزریق وریدی بود ( نمودار های 1و2). تفاوت های جزیی نیز قابل مشاهده بود ازجمله اینکه در هنگام تزریق رادیودارو از طریق ورید تجمع آن در خون، استخوان دست و کبد بیشتر از روش تزریق داخل صفاقی بوده است. ولی در تزریق داخل صفاقی تجمع این رادیودارو در روده بزرگ، طحال و روده کوچک بیشتر دیده می شد. از نظر هیستوپاتولوژیکی محل تزریق دارو به شعاع حدود 7 تا 8 میلی‎متر باعث مرگ سلول‎های توموری شده بود و در حاشیه آن نیز تغییراتی ازجمله هستک های بزرگ و برجسته و الگوی کروماتینی وزیکولی مشاهده گردید. لازم به ذکر است که تمامی رت های گروه دوم این تحقیق تومورهای سرطانی پستانی را سه ماه بعد از خوراندن DMBA بروز دادند و هیچ یک علائمی دال بر کوچک شده تومور و یا بهبودی نشان ندادند، لذا در بیشتر موارد جهت جلوگیری از زجر کشیدن حیوان آن‎ها را با استفاده از  اتاق‎های مرگ حاوی اتر اشباع شده از بین برده و در موارد دیگر خود بر اثر ابتلا به بیماری از بین رفتند.

 

بحث

همانطور که اشاره شد بعد از تزریق رادیوفسفر مشاهده گردید که مجاری و غدد تومورال توسط باقیمانده های  سلول‎های اپی‎تلیال پوشانده شده و اکثر سلول‎ها از غشای پایه جدا شده‎اند و به داخل حفره‎های غددی ریزش پیدا کرده بودند. سلول‎های باقی‎مانده دارای هسته کوچک با کروماتینی متراکم و سیتوپلاسم نیز حالت فشرده و متراکم داشت. این تغییرات از بین رفتن سلول‎های توموری تا شعاع 7 تا 8 میلی‎متری محل تزریق رادیودارو را نشان می دهد. ازنظر هیستوپاتولوژیکی محل تزریق دارو به شعاع حدود 7 تا 8 میلی‎متر باعث مرگ سلول‎های توموری شده بود و در حاشیه آن نیز تغییراتی ازجمله هستک های بزرگ و برجسته و الگوی کروماتینی وزیکولی مشاهده گردید. بر طبق مطالعات انجام شده رادیودارو P32 از محل تزریق به بافت های مجاور و جریان خون منتقل نمی شود (2 و 7). ولی مطالعه این تحقیق نشان داد 5 روز بعد از تزریق، رادیودارو در تومور می توان اثر آنرا در جریان خون و مغز استخوان اندازه گیری نمود.

 

نتیجه گیری

 چنانچه نقاط تزریق با فاصله مناسب حدود 7 تا 8 میلی متر در تومور صورت گیرد توانایی نابودی تومور در زمان کوتاه‎تری را خواهد داشت. جهت نابودی سلول‎های حاشیه ای تومور محاسبه دقیق محل تزریق پیشنهاد و همزمان شیمی درمانی نیز بسیار موثر خواهد بود.

 

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از زحمات آقای فراهانی کارشناس آزمایشگاه که ما را در مراحل مختلف این مقاله کمک و یاری نمودند تشکر و قدردانی می گردد. لازم به ذکر است که طرح مذکور با استفاده از حمایت‎های مالی حوزه معاونت پژوهش و فناوری دانشگاه اراک انجام شده است.

  1. Zhang DS, Liu L, Jin LD, Wan ML, et al. Effect of phosphorus -32 aglass microspheres on human hepatocellular carcinoma in nude mice. World J Gastroenterol 2004;10:10551-4.
  2. Firusian N, Dempke W. An early phase II study of intratumoral P-32 Chromic phosphate injection therapy for patients with. Refractory Solid Tumors & Solitary metastasis. Cancer, Feb 1999; 85 (4), 480- 987.
  3. Bomford CK, Kunkler IH. Radiation physics, therapy and oncology. In Walter & Miller's Textbook of Radiotherapy. 6th ed. New York: Chuchill Livigstone; 2002. P. 246.
  4. Order SE, ASiegel JA, Principato R, Zerger LE, et al. Selective tumor irradiation by infusional brachytherapy in nonresectable pancreatic cancer: a phase I study. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1996; 36(5): 1117-26.
5. Russo J, Russo IH. Atlas and Histologic Classification of Tumors of the Rat Mammary Gland. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 2000; 5(2): 187-200.

6. Hamta A,  Shariatzadeh SMA, Solimani M. Verification of some cancer markers and blood factors in DBMA induced breast cancer on SD rats. Journal of Behbod. 2012; 15(3): 200-207.[Persian]

7. Mccrea VR, Cornes P. The potential of intratumoural unsealed radioaetine Source therapy Eur J Nocl Med 2001; 28: 2867-9.