باززایی و تنوعات سوماتیکی در گیاه شمعدانی عطری ( L. Pelargonium roseum)

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

-

چکیده

هدف: شمعدانی عطری (Pelargomium roseum L.) گیاهی زینتی با خواص ارزشمند دارویی می‏باشد. هدف از این مطالعه، بهینه سازی شرایط تکثیر و باززایی گیاه شمعدانی عطری و همچنین بررسی تنوعات سوماتیکی احتمالی گیاهان باززایی شده می‏باشد.
مواد و روش‎ها: در این مطالعه ابتدا از گیاهان گلدانی جدا کشت هایی از ساقه که حاوی جوانه انتهایی و چند برگ کوچک بود تهیه و در محیط کشت MS پایه کشت داده شد. از گیاهان تکثیر شده، قطعاتی از ساقه و برگ انتخاب و به محیط‎های کشت حاوی تنظیم کنندگان رشد مختلف جهت باززایی منتقل شد. از بین گیاهان باززایی شده چندین لاین از نظر مورفولوژیکی و همچنین تنوع ژنتیکی مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتایج: بیشترین میزان تولید نوساقه و ریشه در محیط کشت حاوی 2 میلی‌گرم در لیتر BAP و 1/0 میلی‌گرم در لیتر NAA با بکارگیری جدا کشت برگ مشاهده شد. بررسی تنوعات سوماتیکی لاین‎های باززایی شده اختلافاتی را از نظر شکل برگ و تعداد و نوع کرک‎های برگ نسبت به شاهد و همچنین اختلافات ژنتیکی به صورت حذف و اضافه شدن باندها را در الگوی باندینگ  DNAنشان داد.
نتیجه گیری: تولید نوساقه و ریشه با درصد متفاوت نشانگر اثر القایی محیط کشت ها و قطعات جدا کشت مختلف در باززایی این گیاه می باشد. تطابق اختلاف ژنتیکی گیاهان باززایی شده با تنوعات مورفولوژیکی احتمالا می‌تواند نشانگر پایه و اساس ژنتیکی تنوعات سوماتیکی ایجاد شده باشد.
 

کلیدواژه‌ها


مقدمه

شمعدانی عطریPelargonium graveolens L.)  ) گیاهی از خانواده  Geraniaceaeمی­باشد. گیاهان این خانواده اغلب علفی بوده و بندرت به حالت چوبی در می­آیند (1). گونه­های مختلف شمعدانی، گیاهان گلداری هستند که از نظر اقتصادی دارای اهمیت می­باشند. قدرت نژاد زایی این گیاه تولید واریته­ها و هیبریدهای زیادی را نموده است. اصولا هدف از برنامه­ی اصلاح نبات برای این گیاه، تولید شمعدانی‎هایی با شکل‎ها و رنگ‎های متفاوت و همچنین مواد موثره (متابولیت‎های ثانویه) بیشتر می‏باشد. بخش مورد استفاده این گیاه جهت اسانس گیری برگ و قسمت‎های هوایی گیاه است. میزان اسانس حاصل از گیاه بسیار وابسته به سن گیاه می­باشد و با افزایش سن گیاه میزان آن کاهش می­یابد. اسانس این گیاه شبیه به اسانس گل رُز می‎باشد و حاوی ژرانیول (Geraniol)، سیترونلول (Citronelol)، ترپینئول (Terpineol) والکل­ها می­باشد. این اسانس زمانی ارزشمند است که محتوی مقادیر بیشتر سیترونلول باشد (2).

در تحقیقات زیادی باززایی گونه­های مختلف شمعدانی توسط تکنیک کشت بافت گزارش شده است. Marsolais و همکاران (3) جنین­زایی سوماتیکیhortorum) × (Pelargonium و       )  domatium× (Pelargonium را گزارش نمودند. Agarwal و همکاران (4) نیز گزارش نمودند که قطعات جدا کشت برگ بالغ hortorum) × (Pelargonium دارای پتانسیل بالای باززایی نسبت به قطعات جدا کشت برگ جوان می­باشند.

کشت قطعات برگ شمعدانی در محیط نصف غلظت MS حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA و 1 میلی­گرم در لیتر BAP و Zeatin و در شرایط تاریکی بیشترین میزان باززایی برای این گیاهان را ایجاد نموده است (5). Saxena و همکاران (6) یک دستورالعمل کارآمد برای باززایی گیاه P.graveolence پیشنهاد نمودند. در این دستورالعمل پس از انتقال کالوس به محیط کشت MS حاوی 5/0 میلی گرم در لیتر BAP و 1/0 میلی گرم در لیتر NAA بیشترین میزان تولید نو ساقه گزارش شده است.

در گزارشات دیگری محیط کشت MS حاوی 2/0 میلی‎گرم در لیتر NAA بهترین محیط  برای رشد گیاهچه و ریشه دار شدن آن عنوان شده است (7). اخیرا نشان دادند که محیط کشت MS پایه حاوی 5/0 تا 2 میلی گرم در لیتر BAP و 2/0 میلی گرم در لیتر NAA می­تواند باعث ایجاد نو ساقه و محیط کشت MS پایه حاوی 5/0 میلی گرم در لیتر IBA می­تواند بهترین محیط

برای ریشه دار شدن گیاه P.graveolence باشد (8).

تنوع سوماکلونال فرایندی است که منجر به تغییرات شیمیایی جدا کشت‎ها شده و تنوع خاصی را ایجاد می­نماید. این تنوع تغییرات ژنتیکی است که پاره­ای از تغییرات دیگر از جمله تغییر در مورفولوژی، بیوشیمی و امثال آن را به دنبال دارد. تنوع سوماکلونال در گیاهان به طور عمده پس از کشت بافت در بعضی از سیستم‎های باززایی گیاه که در آن گیاه مرحله کالوس را طی می­کند دیده می­شود. در واقع تنوع سوماکلونال نوعی ناپایداری ژنتیکی جدا کشت‎ها بوده و از مشکلات کشت بافت می­باشد ولی می­تواند به عنوان یکی از روش‎های اصلاح نباتات نیز بکار رود (9).

گیاهان حاصله از باززایی گیاه شمعدانی عطری را از نظر خصوصیات مورفولوژیکی Saxena و همکاران (10) مورد بررسی قرار دارند. نتایج بررسی‎های آن‎ها نشان دهنده تنوع مورفولوژیکی برگ این گیاهان می­باشد به صورتی که برگ گیاهان باززایی شده دارای بریدگی‎های کمتری نسبت به گیاهان والد می­باشند.

بررسی‎های مورفولوژی کرک‎های گیاه شمعدانی عطری نیز حضور سه نوع کرک را نشان می­دهد که یکی حالت کشیده و نوک تیز داشته و سه تای دیگر دارای بخش انتهای متورم می‎باشد. مشابه این نتیجه در گونه­های دیگر این گیاه نیز گزارش شده است (11).

گیاهان از طریق تنوعات سوماتیکی می‎توانند بهبود ژنتیکی پیدا نمایند و تنوعات سوماتیکی به عنوان یک فرآیند منطقی برای القا تغییرات وراثتی جهت ایجاد واگرایی یا انشعاب در گونه­های گیاهی عنوان شده است. نشانگرهای مورفولوژیکی و بیوشیمیایی برای نشان دادن تنوع ژنتیکی در گیاهان می‎تواند مورد  استفاده قرار گیرد، اما به دلیل اینکه این نشانگرها نسبت به عوامل محیطی آسیب پذیر می باشند و نیز لوکوس های محدودی بر روی ژنوم گیاه دارند نمی‎توانند کاربرد وسیعی داشته باشند. لذا نشانگرهای DNA با توانایی بسیار بالا و تعداد لوکوس‎های نامحدود را می‎توان جهت بررسی تنوع ژنتیکی در گیاهان مورد استفاده قرار داد. یکی از نشانگرهای معروف مبتنی بر PCR، نشانگر RAPD است. این تکنیک به علت قابلیت دسترسی سریع و آسان جهت مطالعات ژنتیکی متعددی مورد استفاده قرار می‎گیرد و این تکنیک می‎تواند جهت تشخیص تنوع سوماکلونال گیاهان باززایی شده بسیار سودمند باشد (12).

برای تعدادی از گونه­های شمعدانی زینتی همانندPelargonium zonal  و hortorum × Pelargonium تکنیک­های کشت بافت جهت بهبود ژنتیکی این گیاهان استفاده شده است (6). یکی از تنوع یافته­های سوماتیکی در شمعدانی که در حال حاضر به عنوان یک کولیتوار جدید معرفی شده است رز مخملی (Velvet rose) می­باشد (13). در سال‎های اخیر نیز روی گونه­ی Pelargonium graveolence تحقیقات متعددی در نقاط مختلف دنیا انجام شده است ولی روش بهینه­سازی و متد جهانی برای کشت درون شیشه گونه­های شمعدانی هنوز توسعه کاملی نیافته است (14).

گزارشی مبنی بر کشت بافت گیاه شمعدانی عطری در ایران ثبت نشده است. لذا در این پژوهش سعی بر آن است که با توجه به مطالعات قبلی که روی این گیاه انجام شده یک دستورالعمل بهینه جهت تکثیر و باززایی این گیاه پیشنهاد شود و همچنین تنوعات سوماتیکی گیاهان باززایی شده از نظر مورفولوژیکی و ژنتیکی نیز مورد بررسی قرار گیرد.

 

مواد و روش‌ها

تکثیر گیاه شمعدانی عطری: برای تکثیر گیاه شمعدانی عطری از گیاهان گلدانی تهیه شده از گلخانه­ی تحقیقاتی مرکز پژوهشی شهید فزوه اصفهان استفاده گردید. برای تکثیر گیاه قطعاتی از ساقه به طول حدود 5/1 تا 2سانتی­متر از بخش راس گیاه که حاوی 1 یا 2 عدد برگ کوچک و جوانه انتهایی بود جدا نموده، ابتدا توسط آب حاوی ماده شوینده (مایع ظرفشویی) و سپس توسط آب مقطر شستشوی آن‎ها انجام شد. بعد از این مرحله قطعات جدا کشت به مدت 20 دقیقه به محلول ضدعفونی کننده هیپوکلریت سدیم 15 درصد منتقل شدند. سپس قطعات با آب مقطر استریل شستشو داده شد و در پایان قطعات جداکشت به مدت 1 دقیقه به محلول قارچ کش ویتاواکس 2 درصد انتقال داده شد و در پایان مجدد قطعات جدا کشت با آب مقطر استریل شستشو داده شدند.

قطعات جداکشت در شرایط استریل به محیط کشت MS پایه جهت تکثیر انتقال داده شدند. محیط کشت­های حاوی قطعات جداکشت به اتاقک رشد با شرایط نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و در دمای حدود 1±25 درجه سانتی‎گراد منتقل شد. نمونه­ها پس از 15 روز به مرحله­ی ریشه دهی وارد شد و از روز 21 به بعد گیاهان افزایش رشد طولی و تولید برگ‎های جدید نمودند. گیاهان رشد یافته در این مرحله جهت مرحله­ی باززایی گیاه مورد استفاده قرار گرفت.

باززایی  گیاه شمعدانی عطری: در شرایط استریل، برگ و ساقه گیاه در قطعات حدود 5/0 تا 1 سانتی­متری برش یافتند و سپس این جدا کشت­ها از بخش سطح شکمی در مورد برگ و افقی در مورد ساقه به ظروف کشت حاوی محیط‎های کشت MS پایه حاوی تنظیم کنندگان رشد بر اساس جدول 1 انتقال داده شدند (8 و15). پس از یک هفته در لبه­های جدا کشت برگ و انتهای ساقه کالوس های کوچک تولید شد و پس از دو هفته نوساقه (shoot) از این کالوس ها ایجاد و پس از چهار هفته نو ساقه­های رشد یافته تولید ریشه نموده و بدین ترتیب گیاه شمعدانی عطری بارزایی شد. گیاهان باززایی شده سپس برای تکمیل رشد به محیط کشت MS پایه انتقال داده شدند.

بررسی تنوع مرفولوژیکی و آناتومیکی در گیاهان باززایی شده: پنج گیاه باززایی شده به صورت تصادفی انتخاب شدند و از نظر شکل برگ با یکدیگر و با نمونه شاهد (غیر باززائی) مقایسه گردیدند. همچنین از برگ گیاهان اپی‎درم تهیه شد و زیر میکروسکوپ تعداد و شکل کرک‎های گیاه مورد بررسی قرار گرفت. شمارش تعداد کرک در 3 تکرار انجام شد.

بررسی تنوع ژنتیکی در گیاهان باززایی شده: پنج گیاه باززایی شده در مرحله­ی قبل که تنوع مورفولوژیکی و آناتومیکی آن‎ها بررسی شده بود جهت بررسی تنوع ژنتیکی نیز استفاده گردید. از این گیاهان ابتدا DNA با استفاده از CTAB (16)  استخراج شد و سپس بررسی تنوعات سوماکلونال تعدادی از گیاهان باززایی شده با استفاده از پرایمرهای: RAPD ِDNA) ِAmplification Polymorphism Analysis ( Randomly شامل: OPAA-14 , FPK 1-05 , OPB-08 , OPB-07, OPA-18 و پرایمر های: ISSR   (Repeat  Inter Simple Sequence) شامل: (AC)8 TA , (AC)8 CG , (AC)8 T , (AC)8 C , (GATA)4 مورد بررسی قرار گرفت (17).

برای استخراجDNA  ، ابتدا 5/0 گرم از بافت  برگ گیاه با استفاده از دانه‏های کوچک شیشه (Glass beed) در یک تیوب 5/1 میلی لیتری خرد گردید. سپس به هر یک از تیوپ‏ها 250 میکرو لیتر بافر استخراج اضافه گردید. واکنش PCR در حجم نهایی 20میکرولیتر انجام گردید و شامل مواد زیر بود:

Taq DNA polymerase (یک واحد در میکرولیتر) 2/0 میکرولیتر،  dNTp(20 میلی مولار) 2 میکرولیتر ، PCR buffer(l0x)  2 میکرولیتر ،  DNA3 میکرولیتر،  primer(10 پیکومول در لیتر) 5/1 میکرولیتر و MgCl2  (50 میلی‎مولار) 8/0 میکرولیتر. پرایمرهای مورد استفاده از شرکت ARANCO, IRAN تهیه گردید. شرایط انجام PCR در جدول شماره 2 آورده شده است.

بررسی آماری: هر آزمایش در پنج تکرار و با چهار قطعه­ی جدا کشت از برگ بالغ و ساقه در قالب طرح کامل تصادفی اجرا گردید. تحلیل آماری داده­ها توسط نرم‌افزار SPSS-18 و مقایسه میانگین‎ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام گرفت.

 

جدول 1:  محیط های کشت مختلف مورد استفاده برای باززایی گیاه شمعدانی

ترکیبات محیط کشت

نام محیط کشت

MS

M0

MS + Ki(2mg/lit) + NAA (2mg/lit)+2,4.D(2mg/lit)

M1

MS + BAP (2mg/lit) + NAA (0/1mg/lit)

M2

MS + BAP(2mg/lit) + NAA (1mg/lit)

M3

MS + BAP (2mg/lit) + NAA (2mg/lit)

M4

 

جدول 2: شرایط انجام PCR.

5 دقیقه

94 درجه سانتی‎گراد

Denataration

1 دقیقه

94 درجه سانتی‎گراد

Denaturation

30 ثانیه

37 درجه سانتی‎گراد

Anelling

30 ثانیه

72 درجه سانتی‎گراد

Extension

 

35

تعداد سیکل

 

 

نتایج

اثر محیط کشت و نوع قطعه­ی جدا کشت در تولید نوساقه و ریشه

در جدول 3 اثر محیط کشت­های مختلف و قطعات جدا کشت متفاوت بر درصد تولید نوساقه و ریشه نشان داده شده است. داده های جدول گویای این نکته است که درصد تولید نوساقه در محیط کشتM1 (شاهد) حاوی قطعات جدا کشت ساقه و برگ حداقل یعنی صفر بود.

 

شکل 1: تولید نوساقه روی کالوس حاصل از جداکشت برگ در محیط کشت M2

 

در محیط کشت M2 حاوی جدا کشت ساقه نیز تولید نوساقه حداقل بود. ولی در همین محیط کشت در حضور قطعه­ی جداکشت برگ حداکثر تولید نوساقه 95 درصد مشاهده شد (شکل 1) که اختلاف معنی‎داری بین نوع قطعه­ی به کار برده شده جهت کشت از نظر آماری را عنوان می­کند. بین محیط­های کشت M3 و M4 در حضور قطعات جدا کشت ساقه و برگ تفاوت معنی­داری از نظر درصد تولید نوساقه مشاهده نشد (جدول 3).

بررسی داده­ها نشان داد که در محیط کشت M1 هیچگونه ریشه­ای تولید نشد. محیط کشت M2 با جدا کشت برگ با ریشه­زایی 100 درصد بیشترین میزان ریشه­زایی را نشان داد که تفاوت معنی­داری را از نظر نوع محیط کشت و قطعه­ی جدا کشت با سایر محیط ها و قطعات جدا کشت مشاهده نشد   (شکل 2). در محیط کشت M3 نیز درصد ریشه­زایی در قطعات جدا کشت ساقه 45 درصد و در برگ 60 درصد بود که از نظر آماری تفاوت معنی­داری نشان نداد. در محیط کشت M4 نیز در حضور قطعه­ی جدا کشت برگ تنها 10 درصد و در حضور قطعه­ی جدا کشت ساقه 20 درصد ریشه­زایی مشاهده شد که از نظر آماری تفاوت معنی­داری نشان نداد. بین محیط کشت M3 و M4 از نظر تولید ریشه اختلاف معنی­داری از نظر آماری مشاهده نشد (جدول 3).

ریشه

شکل 2: تولید ریشه روی کالوس حاصل از جداکشت برگ در محیط کشت M3

مورفولوژی برگ گیاهان گیاهان غیر باززائی و باززایی شده

در گیاهان غیر باززایی شده برگ از نظر شکل ظاهری دارای بریدگی‎های عمیق و زیاد می باشد. در گیاهان باززایی شده نیز سه نوع تنوع برگ از نظر شکل ظاهری قابل تشخیص می­باشد. الف) برگی که مشابه با گیاهان والد بوده دارای بریدگی‎های زیاد و عمیق می­باشد که حدود 50 درصد از گیاهان باززایی شده را تشکیل می­دهد (شکلB3).  ب) برگی با تعداد بریدگی‎های بسیار کم در حاشیه که عمق این بریدگی‎ها نیز بسیار کم و نامحسوس است و حدود تقریبا 20 درصد از گیاهان باززایی شده را در برمی­گیرد (شکل A3). ج) برگی که حالت حد واسط بین دو نوع قبلی را دارد و حدود 30 درصد از گیاهان باززایی شده را شامل می­شود (شکلC 3).

 

جدول 3: اثرنوع محیط کشت و نوع قطعه­ی جدا کشت در تولید نوساقه و ریشه گیاه شمعدانی عطری. حروف غیرمشابه در هر ستون بطور مستقل بیانگر معنی­دار بودن داده­ها بر اساس آزمون دانکن (05/0P≤ ) است. اعداد به صوت میانگین±SE بیان شده است.

قطعه جدا کشت

محیط کشت

درصد تولید نو ساقه

در صد تولید ریشه

سـاقه

M0

c 0±0

c 0±0

M1

c 0±0

c 0±0

M2

c 0±0

c 0±0

M3

b 7/18±35

b 04/14±45

M4

bc  0/5±20

c 0/5±20

بـرگ

M0

c 0±0

c 0±0

M1

c 0±0

c 0±0

M2

a 1/11±95

a 0±100

M3

bc  3/18±30

b 7/12±60

M4

b 1/6±35

c 1/6±10

 

 

شکل3: تنوع شکل برگ در گیاهان باززایی شده

 


مورفولوژی کرکهای غده­ای و غیرغده­ای در گیاه غیر باززائی وباززایی شده

در برش­های تهیه شده از بخش اپی‎درم فوقانی برگ گیاه شمعدانی عطری سه نوع کرک غده­ای و همچنین یک نوع کرک غیرغده­ای از هم قابل تشخیص بود که شامل: الف) کرک غده­ای با 5 سلول که 3 سلول آن پایه کرک را می­سازد و یکی به عنوان سلول نگهدارنده در بخش قاعده­ای قرار دارد و یک سلول متورم که در راس قرار گرفته و حاوی ماده ترشحی است. این کرک از نظر طولی کوتاه قد بود (شکلB4). ب)ـ کرک غده ای، کرک کوتاهی است که قسمت راسی کرک به سمت نوک برگ فرم خمیده پیدا کرده است و سلول انتهای این کرک به فرم کروی شکل است و به نظر دارای مواد ترشحی کمی می­باشد (شکل A4). ج) کرک غیر غده­ای که دارای قسمت راسی  نوک تیز می باشد و نقش محافظتی دارد (شکل C4) و د) کرک غده­ای مشابه با نوع اول از 5 سلول تشکیل شده ولی نسبت به نوع اول کشیده­تر است و سلول انتهای آن نیز تورم زیادی پیدا نکرده است (شکل D4). بین گیاهان غیر باززایی و باززایی شده ار نظر مورفولوژی کرک‎ها تفاوتی مشاهده نشد و انواع کرک‎های مشاهده شده در گیاهان غیر باززایی در گیاهان باززایی شده نیز مشاهده گردید.

 

 

شکل4: انواع کرک در اپیدرم برگ گیاه شمعدانی عطری باززائی شده و غیر باززائی


 تعداد کرکهای غده­ای و غیر غده­ای گیاهان غیر باززائی(شاهد) و گیاهان باززایی شده

داده­های جدول4 نشان می­دهد که از نظر تعداد کرک غده­ای بین گیاه غیر باززایی (شاهد) ولاین­های 1، 3، 4 و 5 گیاهان باززایی شده اختلاف معنی­داری از نظر آماری مشاهده می­شود. بدین صورت که گیاه شاهد با میانگین تعداد 73 عدد کرک غده‎ای در هر میلی­متر برگ دارای بیشترین تعداد کرک غده­ای ولاین‎های 3 و4 به ترتیب با داشتن 22 و 3/26 میانگین تعداد کرک غده­ای در هر میلی‎متر برگ دارای کمترین تعداد کرک غدهای هستند.

نتایج بررسی تعداد کرک‎های غیرغده­ای و مقایسه میانگین آن‎ها نیز نشان داد که بین تعداد کرک غیرغده­ای گیاه شاهد ولاین‎های 1و5 از نظر آماری اختلاف معنی­داری مشاهده نشد، ولی لاین‎های 3 و 4 با کمترین میانگین تعداد کرک غیر غده­ای در هر میلی‎متر مربع اپی‎درم فوقانی برگ شمعدانی عطری نسبت به گیاه شاهد اختلاف معنی­داری را نشان داد.


جدول4: مقایسه میانگین تعداد کرکهای غده­ای و غیرغده­ای در هر میلیمتر مربع سطح اپیدرم فوقانی برگ لاینهای گیاهان باززایی شده با گیاه شاهد (غیر باززایی شده). حروف غیرمشابه در هر ستون بطور مستقل بیانگر معنی­دار بودن داده­ها بر اساس آزمون دانکن (05/0P≤ ) است. اعداد به صورت میانگین±SE بیان شده است.

گیاه

تعداد کرک غده­ای

تعداد کرک غیر غده­ای

شاهد(غیر باززایی)

a     7 ±73

b   5/6 ±6/59

لاین1

b   4/3 ±62

ab  5/6 ±3/66

لاین2

ab  3/4 ±64

a     4 ±3/75

لاین3

d   4/3 ±22

c   5/7 ±3/44

لاین4

d   5/6 ±3/26

c   5/6 ±6/39

لاین5

c   5/7 ±6/41

ab   5/6 ±3/66

 

 

شکل5: الگوی باندهای حاصل از RAPD-PCR پنج لاین گیاه باززایی شده در مقایسه با گیاه شاهد (غیر باززایی). نمونه ها پس از PCR با پرایمرهای OPB-07 ,OPB-08 برروی ژل آگارز 1 درصد تفکیک شدند. M: مارکر، L0: گیاه شاهد و L1  تا L5 به ترتیب گیاهان باززایی شده می باشند. (فلشها باندهای متفاوت را نشان می دهد)

 


تنوعات ژنتیکی گیاهان باززایی شده

به منظور بررسی تنوعات سوماتیکی احتمالی بین گیاهان باززایی شده و مقایسه­ی آن با گیاه شاهد RAPD-PCR بر روی این گیاهان انجام شد که تنها نتایج ثابت و قابل تکرار با استفاده از پرایمرهای  OPB-08و OPB-07 که به صورت ترکیبی استفاده شدند بدست آمد. با توجه به شکل 5 با استفاده از پرایمرهای             OPB-08 وOPB-07 باندهایی در محدوده bp 300 تا 1600 مشاهده شد. با مقایسه این باندها بین گیاه شاهد و گیاهان باززایی شده تنها بین گیاه شاهد ولاین‎های 3 و 4 اختلاف از نظر حضور باندهایی اختصاصی در محدوده bp 1600 و حذف باندهایی در  این لاین‎ها در محدوده bp 400 تا 700 مشاهده شد و سایر لاین‎ها از نظر حضور یا عدم حضور باند با گیاه شاهد تفاوتی نداشت. وجود باندهای اختصاصی و عدم حضور سایر باندهای مربوط به شاهد در دو لاین 3و4 بیانگر اختلاف این دولاین با سایر لاین‎های باززایی شده و شاهد بود.

 

بحث

در این مطالعه اثر نوع قطعه جداکشت و محیط کشت‎های مختلف بر باززایی گیاه شمعدانی عطری مورد مطالعه قرار گرفت. باززایی گیاهان در شرایط کشت در شیشه تحت تاثیر تنظیم کنندگان رشد اندوژن و اگزوژن و وابسته به مقادیر اکسین و سیتوکینین و نوع قطعه­ی جدا کشت و شرایط محیط کشت می‎باشد (18). در حضور قطعه جدا کشت برگ، بیشترین میزان تولید نوساقه و ریشه در محیط کشت  M2یعنی 2 میلی­گرم در لیترBAP و 1/0 میلی­گرم در لیتر NAA مشاهده شد. با استفاده از قطعه جداکشت ساقه در حضور همین محیط کشت هیچگونه اندام زایی مشاهده نشد و اختلاف معنی­داری بین کاربرد این دو نوع قطعه­ی جداکشت از نظر آماری مشاهده شد که این گویای تاثیر استفاده از قطعات جداکشت متفاوت در ارگانوژنز این گیاه می­باشد و دلیل آن را می توان به میزان سطح غلظت هورمون های درونی قطعات جداکشت نسبت داد. افزایش توان باززایی گیاه شمعدانی عطری توسط به‎کارگیری قطعه جداکشت برگ در گزارش‎های پیشین نیز عنوان شده که با نتایج حاصل از این تحقیق مطابقت دارد (19و20). 

در محیط­های کشت مختلف در حضور جداکشت برگ تفاوت معنی­داری از نظر تولید نوساقه و ریشه از نظر آماری مشاهده شد که این گویای این نکته است که القا نوساقه و ریشه در گیاه شمعدانی تحت تاثیر غلظت تنظیم کنندگان، به خصوص سیتوکینین و اکسین می­باشد (21). در محیط کشت M1هیچگونه اندام زائی مشاهده نشد که این امر احتمالا به علت اثرات نامطلوب 2,4-D می­باشد که یک علف کش و متوقف کننده ارگانوژنز است (22). در این پژوهش محیط کشت MS حاوی 2 میلی­گرم در لیتر BAP و 1/0 میلی­گرم در لیتر NAA با به کارگیری قطعه­ی جدا کشت برگ بهترین محیط برای باززایی گیاه شمعدانی عطری در بین سایر محیط های کشت بدست آمده است. در این راستا گزارش‎هایی مبنی بر استفاده محیط کشت حاوی 5/0 تا 2 میلی گرم در لیتر BAP و 2/0 میلی گرم در لیتر NAA (8) جهت بیشترین میزان تولید نوساقه و محیط کشت حاوی 1/0 میلی‎گرم در لیتر NAA برای ریشه‎زایی گیاه شمعدانی پیشنهاد شده است (15) که تا حدودی با نتایج ما مطابقت دارد.

محیط‌‌های کشت مورد استفاده برای باززایی گیاه کامل از قطعات جدا کشت اغلب منشا تنوع هستند. این بدین مفهوم است که درصد قابل توجهی از گیاهان باززایی شده ممکن است از نظر ژنوتیپ و فنوتیپ شبیه گیاهان والدی که ریز نمونه­ی اولیه از آن گرفته شده است نباشد. برای ارزیابی تنوع سوماتیکی در گیاهان باززایی شده می­توان از تجزیه و تحلیل­های فنوتیپی استفاده نمود ولی به تازگی فنون مولکولی به طور فزآینده­ای در این زمینه مورد استفاده قرار می­گیرد (23).

نتایج حاصل از بررسی‎های مورفولوژیکی برگ گیاهان باززایی تنوع شکل برگ را در بخش حاشیه­ی برگ و تنوع عمق بریدگیها در این بخش را نشان می­دهد. این نتایج با یافته­های گزارش شده توسط saxena و همکاران (6) مبنی به تنوع مورفولوژیکی برگ‎ها در گیاهان باززایی شده شمعدانی عطری نسبت به گیاهان والد تطابق دارد. در این گزارش عنوان شده که گیاهان باززایی شده دارای برگ‎هایی با بریدگی کمتر نسبت به والدین می­باشند. بررسی‎های مورفولوژیکی کرک‎های گیاه شمعدانی عطری نیز حضور سه نوع کرک را نشان می­دهد که یکی حالت کشیده و نوک تیز داشته و سه تای دیگر دارای بخش انتهای متورم می­باشد. مشابه این نتیجه در گونه­های دیگرشمعدانی نیز گزارش شده است (10). دلیل حضور سه نوع کرک غده­ای با مورفولوژی متفاوت مشخص نمی­باشد. احتمالا کرک‎های غده­ای کوچک، کرک‎های مشابه با کرک‎های غده­ای بزرگ هستند که موفق به رشد کامل نشده­اند و تکامل به منظور ترشح یا ذخیره روغن فرار را پیدا نکرده­اند (24). از نظر تعداد کرک‎های غده­ای و غیر غده­ای نیز مقایسه­ی میانگین تعداد کرکها در گیاهان باززایی شده با گیاه شاهد نشان داده که در بیشتر لاین­های باززایی شده از نظر تعداد کرک ترشحی و غیر ترشحی کاهشی نسبت به گیاه شاهد مشاهده می­شود که از نظر آماری معنی­دار می­باشد. با بررسی داده­ها مشاهده می­شود که این کاهش در لاین 3 و 4 بیشتر می­باشد. کاهش تعداد کرک غده­ای برای این گیاه با توجه به اینکه کرک­های غده­ای در این گیاه حاوی مواد ترشحی می­باشند یک صفت مطلوب نیست. البته در مطالعه­ای که روی این گیاه برای اثر تعداد کرک بر میزان تولید مواد ترشحه انجام گرفت عنوان شده که تعداد کرک تاثیر زیادی بر میزان تولید روغن فرار در این گیاه ندارد (24).

بررسی تنوع سوماتیکی 5 لاین باززایی شده گیاه شمعدانی عطری به روش RAPD-PCR نیز گویای وقوع تنوع سوماتیکی می­باشد. مقایسه­ی الگوی باندهای حاصل از تکثیر قطعات DNA در نمونه شاهد ولاین‎های باززایی شده نشان می­دهد که در لاین‎های 1، 2 و 5 الگوی باندها مشابه با شاهد می­باشد ولی در لاین‎های 3و4 تغییری در الگوی باندها نسبت به گیاه شاهد مشاهده می­شود. با توجه به نتایج حاصل از بررسی‎های مرفولوژیکی روی تعداد کرک­های غده­ای و غیرغده­ای که بیشترین کاهش تعداد این کرک‎ها نیز در لاین‎ها 3 و4 مشاهده شد و نتایج حاصل از بررسی الگوی باندهای الکتروفورزی این لاین‎ها می­توان نتیجه گرفت که تغییر در میزان تعداد کرک‎های غده­ای و غیرغده­ای در این گیاه در تنوع سوماتیکی ایجاد شده می­تواند پایه و اساس ژنتیکی داشته باشد. این تنوعات می‌تواند در اثر هورمون‌های بکار رفته در سیستم باززائی و استعداد ذاتی گیاه شمعدانی جهت تنوع‌پذیری باشد.

 

نتیجه گیری

نتایج حاصل از تکثیر و باززایی گیاه شمعدانی عطری در این پژوهش نشان می‎دهد که این گیاه می تواند در محیط MS پایه تکثیر یابد و در محیط حاوی 2 میلی گرم در لیتر BAP و 1/0 میلی گرم در لیتر NAA دارای بیشترین میزان باززایی می باشد. بررسی تنوعات سوماتیکی این گیاه نیز تنوع مورفولوژیکی برگ و کرک را در گیاهان باززایی شده نسبت به شاهد نشان می‎دهد که منطبق بر تغییرات ژنتیکی در این گیاهان می باشد.

 

تشکر و قدردانی

 نویسنده مقاله از دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان به واسطه حمایت از این پژوهش تشکر می‌نمایند.

1. Mozafarian, V.A. The culture of the Iranian plant name. 2th Ed.Iran: Contemporary Culture company; 2004.

2. Mithila J, Murch SJ, KrishnaRaj S,Saxena PK.Recent advances in Pelargonium in vitro regeneration system. Plant Cell Tissue Org. Cult. 2001; 67: 1-9.  

3. Marsolias AA, Wilson DPM, Tsuita MJ, enaratna T. Somatic emberigenesis and artifical seed production in zonal ( Pelargonium ×hortorum) and ragal( Pelargonium × domesticum) geranium.Can. J. Bot. 2001; 69: 1188-1193.

4. Agarwal PK, Ranu RS. Regeneration of plantlets from leaf and petiole explants of Pelargonium×hortorum. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 2000; 36: 392-397.

5. Hassanein A, Dorion N. Efficient plant regeneration system from leaf discs of zonal (Pelargonium×hortorum) and two scented (P. capitatum and P. graveolens) geranium. Plant Cell Tissue Org. Cult. 2000; 83: 231-240.

6. Saxena G, Banerjee S, Rahman L, Mallavarapu GR, et al. An efficient in vitro procedure for micropropagation and generation of somaclones of rose-scented Pelargonium. Plant Sci. 2005;155: 133-140.

7. Zhou jh, Yang MX, Xian YX. Study on leaves in vitro culture of Pelargonium  graveolens, Journal of Zhongkai Agrotechnical College. 2005; 2: 5-9.

8.Yi Qy, Xia Kg, Jiang M, Ren H. Study on in vitro Shoot Culture of Pelargonium graveolens and Its Production. Southwest China Journal of Agricultural. 2010: 2: 59-67.

9. Ehsanpour, AA, Amini F. Plant cell and tissue culture. 2thEd. Jahad University, Isfahan branch; 2003.

10. Saxenaa G, Rahmanb L, Vermac P, Banerjeed S, et al. Field performance of somaclones of rose scented geranium (Pelargonium graveolens L’Her Ex Ait.) for evaluation of their essential oil yield and composition. industrial crops and products. 2008; 27: 86-90.

11. Oosthuzen L, Coetzee J. Morphogenesis of thrichomes of Plargonium scabrum. South African Journal of Botany. 1983; 2: 305-310.

12. Gutierrez N, Avila CM, Due G, Marget P, et al. CAPs markers to assist selection for low vicine and convicine contents in faba bean (Vicia faba L.) Theor. Appl. Genet. 2006; 114(1): 59-66.

13. Skirvin RM, Janick J. Velvet rose, Pelargonium a scented geranium, Hort. Sci. 1976; 11: 61- 62.

14. Wojtana A, Gabryszewska E, Marasek A. Regeneration of  Pelargonium× Hederaefolium ‘Bonete’ from petiole explants. Acta Physiol. Plant. 2004; 26: 255-262.

15.Sukhumpinij P,  Kakihara F,  Kato M. In vitro regeneration from mature leaf explants of Pelargonium rapaceum (L.).  Science Horticulturae. 2010; 126: 385-389.

16. Ehsanpour AA, Twell D. Analysis of SFL1 and SFL2 promoter region in Arabidopsis thaliana using gateway cloning system. Journal of Science. 2005; 16(4): 303-309.

17. Ehsanpour AA, Tavassoli M, Arab L. Sex determination of Pistacia vera L. using ISSR markers. Malays Appl Biol. 2008; 37(2): 25-28.

18. Skoog F, Miller CO. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp. Soc. Exp. Biol. 1957; 11: 118-131.

19. Dunbar KB, Stephen CT. Shoot regeneration of hybrid seed geranium (Pelargonium×hortorum) and regal geranium (Pelargonium×domesticum) from primary callus cultures. Plant Cell Tissue Org. Cult. 1989; 19: 13-21.

20. Yi QY, Xia KG, Jiang M, Ren Ht. Study on in vitro shoot culture of Pelargonium graveolens and Its production.Southwest China Journal of Agricultural. 2010; 2: 59-67.

 

21. Poudyal BK, Zhang Y, Du G. Adventitious shoot regeneration from the leaves of some pear varieties (Pyrus spp.) grown in vitro. Front Agric.China. 2008; 2: 82-92.

22. Dodd JH, Robert LW. Experiment in Plant Tissue Culture. 3thEd.CambridgeUniversity Press,New York. 1995.

23. Khosrosahi, M, Behnamian M. Plant cell culture. 1thEd.TabrizUniversity; 2007.

24. Eiasu  BK, Steyn  JM, Soundy  P. Physiomorphological response of rose-scented geranium (Pelargonium spp.) to irrigation frequency South African Journal of Botany. 2011; 5: 1-8.