اثرات ضد تکثیری و کشندگی زهر زنبور عسل و -D آلفا توکوفرول سوکسینات (ویتامین E) بر روی رده ی سلول سرطانی پرومیلوسیتانسانی HL-60

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

-

چکیده

هدف: لوسمی حاد پرومیلوسیتی شایع‏ترین لوسمی حاد درمیان بزرگسالان است. امروزه ازD -آلفا توکوفرولسوکسینات(ویتامینE) جهت مهار تکثیر و القا مرگ سلولیدر درمان لوسمی استفاده می‏شود. با توجه به اینکه غلظت‏های بالای ویتامینجهت القا مرگ سلولی دارای اثرات جانبی بوده و استفاده از دوزهای بالای آن امکان پذیر نیست، لذا سعی می‏شود با بکار بردن همزمان دوزهای پایین این ویتامین و ترکیباتی که دارای اثر ضد تکثیری هستند، توانایی آن را در مهار تکثیر و القا مرگ سلولی افزایش داد.
مواد و روشها:در این مطالعه رده سلولی HL-60 در محیط  RPMIکشت داده شد. سپس اثرات ضد تکثیری و کشندگی غلظت‌های مختلف زهر زنبور عسل(BV) وD-آلفا توکوفرول سوکسینات  (VES)با استفاده از روش شمارش سلولی تریپان بلو و سنجش MTT مورد بررسی قرار گرفت.در نهایت داده‏ها با استفاده از نرم افزار instat3 و برنامه آماری one-way ANOVA آنالیز شدند.
نتایج:نتایج نشان دادند که اثرات ضد تکثیری و کشندگی سلولی ویتامین(VES) Eدر حضورزهرزنبور بطور چشمگیری افزایش ‌یافت. به طور کلی، یافته‌های تحقیق حاضر نشان داد که غلظت‏های پایین زهر زنبور عسل می‌تواند اثرات ضد تکثیری و کشندگی سلولی ویتامین Eرا بر روی سلول‏های سرطانیHL-60  افزایش دهد.
نتیجه گیری: نتایج ما نشان می‏دهند که زهر زنبور عسل اثرات ضد تکثیری و کشندگی ویتامینE را درسلول‏های سرطانی HL-60افزایش می‏دهد و امید است در آینده بتوان از این ترکیب جهت افزایشاثرات ضد تکثیری ویتامین‏ها در دوزهایی که غیر سمی هستندو فاقد اثرات جانبی می‏باشند، استفاده نمود.
 

کلیدواژه‌ها


مقدمه

خون سازی نرمال یک فرایند دینامیک است که درآن سلول‏های بنیادی خون ساز تمام سلول‏های خونی از جمله گلبول قرمز،گلبول های سفید، پلاکت‏ها و .... را تولید می‏کنند.این فرایندبه هماهنگی بین مسیرهای انتقال سیگنال تنظیمی فراوانی وابسته است که عمل‏کرد منظم این مسیرها که درآن‏ها پروتئین‏های تنظیمی ایفای نقش می‏کنند، منجر به تولید سلول‏های خونی باعمل‏کرد مناسب می‏شوند (1) اختلال و ناهنجاری در هریک ازاین مسیرها منجربه ایجاد سلول‏های نئوپلاستیک می‏شود که این اختلال به نوبه‏ی خود منجر به اختلال در آپوپتوزیس،تمایز و تکثیرغیر قابل کنترل سلول‏های خونی و پیشسازهای آن‏ها می‏شود(2، 3، 4 و5).لوسمی حاد پرومیلوسیتی،سرطان خون غالب و بدخیم ترین نوع سرطان خود با خونریزی شدید در میان بزرگسالان استکه با تکثیر غیر قابل کنترل و عدم تمایز پیش سازهای نابالغ میلوئید (پرومیلوسیت) و تجمع این سلول‏ها در مغزاستخوان مشخص می‏شود(6). سلول‏های پرومیلوسیت ((HL-60در 95 درصد از بیماران مبتلا به سرطان حاد پرومیلوسیت دارای جابجایی کروموزمی مشخصی بین بازوهای بلند کروموزم 15 و 17 هستند که این جابجایی منجربه ایجاد پروتئین مرکب به نام PML-RARمی‏گردد. این پروتئین مرکب، سبب اختلال در مسیرهای انتقال سیگنال تنظیم کننده‏ی فرایند خون‏سازی و توقف پیش‏ساز های نابالغ میلوئید (پرومیلوسیت) درمراحل اولیه تکوین (عدم تمایز به سمت سلول‏های بالغ از جمله  مونوسیت،نوتروفیل و ائوزینوفیل و ...) وتکثیر غیر قابل کنترل این پیش سازها می‏شود (7 و 8). درمان ایده آلی برای این سرطان تا بحال شناخته نشده است.هدف داروهای ضد سرطان بیشتر سنتز DNA و تقسیم سلولی است، درحالی که سلول‏های سرطانی تنها سلول‏هایی نیستند که نیازبه تقسیم سلولی و سنتز DNA دارند(9). امروزه روش‏های مختلفی در درمان سرطانخون بکار گرفته می‏شود. از جمله این روش‏ها می‏توان شیمی درمانی را نام برد.اما در این روش به دلیل غیر انتخابی بودن داروهای مورد استفاده، درصد زیادی از سلول‏های سالم خون نیز به همراه سلول‏های سرطانی از بین می‏روند (10 و 11). در سال‏های اخیر تحقیقات قابل توجهی درمورداثر ضد تکثیری وکشندگی ویتامین‏ها ازجمله ویتامین E بررده‎های مختلف سلول سرطانی دردرمان لوسمی حاد انجام شده است.- D آلفا توکوفرول سوکسیناتمشتق سنتزی ویتامینE  می‏باشد که بیشترین میزان جذب را در بدن به خود اختصاص داده است.این ترکیب دارای توانایی مهار تکثیر والقا تمایزوالقامرگ سلولی درانواع رده‏های سلول سرطانی است (12، 13، 14و 15). غلظت‏های مورد استفاده این ترکیب جهت القا آپوپتوزیس درسلول‏های سرطانی سمی می‏باشد(16).همچنیناین غلظت‏هامانع جذب ویتامین K (عدم انعقاد خون) وبه دنبال آن خونریزی و ایجاد زخم های گوارشی... در بیماران  مبتلا به سرطان می‏شود. بنابراین این اثرات جانبی عامل محدود کننده در استفاده‏ی بالینی ویتامین E در درمان سرطان می‏باشند (17 و 18).

رده‏ی سلولی HL-60 یک رده‏یسلول سرطانی خون انسانی استکه از بیماران مبتلا به سرطان حاد پرومیلوسیت گرفته شده است.این سلول‏ها درمرحله‏ی پرومیلوسیت تکوین سلول‏های خونی متوقف شده و به صورت غیر قابل کنترل به تکثیر ادامه می دهند (19).مطالعات قبلی نشان می‏دهد که–Dآلفا توکوفرول سوکسینات(ویتامینE) دارای اثر مهار تکثیر و کشندگی بر رده‏ی سلولیHL-60 دارد. اما از آنجایی که غلظت‏های مورد استفاده ویتامین E در القا مرگ سلولی والقا تمایز دارای اثرات جانبی است، برای مقابله با این محدودیت و حذف اثرات جانبی ویتامین راهکارهای دیگری ارائه شده از جمله اینکه موادی همراه با غلظتهایپائین ویتامین(غلطت‏هایی که غیر سمی و فاقد اثرات جانبی می‏باشند) به کار برده شوند،تااثر ضدتکثیری وکشندگی ویتامین را در سلول‏های سرطانی بدون ظهور اثرات جانبی آن افزایش دهند.از جمله این مواد می‏توان به زهر زنبور عسل اشاره نمود که اثرات ضد تکثیری و آپوپتوزی این ترکیب بر رده های مختلف سلول سرطانی اثبات شده است (20). زهر زنبور دارای بیش از 18 ترکیب فعال فیزیولوژیکی با خواص دارویی فراوان می باشد (21). برای اولین بارHavasدر سال 1950 اثر القایی آپوپتوزیس زهر زنبور را بر سلول‏های سرطانی گزارش کرد (21).اصلی‏ترین ترکیبات سمی زهر ملیتین و آنزیم فسفولیپاز A2 می‏باشند. ملیتین سبب فعال شدن آنزیم فسفولیپاز A2موجود در زهر می‏شودکه این آنزیم به نوبه‏ی خود دارای اثرات سیتوتوکسیک بر روی سلول‏های سرطانی می‏باشد (21). Moon وهمکارانش در سال 2006 نشان دادند که زهر می‏تواند آپوپتوزیس را در سلول‏های لوسمی القا کند، در حالی که هیچ اثر سایتوتوکسیکی بر سلول‏های نرمان خون موش ندارد.پیشنهاد شده که احتمالا زهراز طریق مکانیسم‏هایی چون آپوپتوزیس، نکروز و لیز سلولی سبب مهار رشد تومور می‏شود (22).با توجه به اثرات ضدسرطانی زهر زنبورعسل، این مطالعه باهدف بررسی بکارگیری توام غلظت‏های مهارکننده‏یتکثیرزهرزنبورعسل و ویتامینE به منظورافزایش توان ضد تکثیری ویتامین در غلظت‏های فاقد عوارض جانبی ‌‌انجام گرفت.

 

مواد و روش‌ها

در این پژوهش تجربی رده‏ی سلولی HL-60) (NCBI Code: C217 از انستیتو پاستور ایران تهیه شد و در محیط کشت (RPMI1640 (Gibco, USA حاوی 20 درصد FBS ((Gibco,USA و U/ml 100 پنی سیلین و 100 میکروگرم در میلی لیتر استرپتومایسین در فشار5 درصدCO2 و دمای 37 درجه سانتی‏گراد در فلاسک 25 سانتی متر مکعب کشت داده شدند. زهر زنبور عسل ( (Sigma, UKبا غلظت اولیه 1میلی گرم تهیه و در 1 میلی‏لیتر PBS حل گردید و در دمای 40- درجه سانتی‏گراد نگه داری شد.  - Dآلفا توکوفرول سوکسینات (ویتامین E) (Sigma, USA) با غلظت­های اولیه4 میلی‏گرم تهیه و در20 میلی‏لیتر اتانول مطلق حل گردید و در شرایط بدون نور در 4 درجه سانتی‏گراد به مدت یک ماه نگه داری شد. به منظور بررسی اثر زهر زنبور عسل،104×5 HL-60سلولبه ازای هر میلی‏لیتر محیط کشت شمارشو در پلیت 24 خانه با غلظت­های مختلف زهر زنبور عسل (1، 5/2، 5، 5/7، 10 و 20 میکروگرو در میلی‏لیتر) تیمار شد و بعد از طی بازه‏های زمانی مشخص (24، 48 و 72 ساعت) جهت تعیین اثر زهر بر زیستپذیریسلول‏ها و همچنین جهت تعین غلظت‏های مناسب زهر از روش های رنگ آمیزی تریپان بلوو سنجشMTT  استفاده شد. همچنین جهت بررسی اثر ویتامین بر زیست پذیری سلول و تعیین غلظت مناسب ویتامینE، میزان104×5 سلول به ازای هر میلی لیتر محیط کشت شمارش و در پلیت 24 خانه با غلظت‎های مختلف ویتامینE (1، 4، 6، 9، 12، 15، 18، 20، 25 و 30 میکروگرم در میلی‏لیتر) تیمارشد و درمدت 24، 48 و 72 ساعت با روش‏های ذکر شده بررسی شد. برای رنگ آمیزی تریپان بلو، 10 میکرولیتر محلول سلول با 10میکرولیتر رنگ تریپان‏بلو مخلوط گردید. سپس با استفاده از شمارش سلولی با لام هموسیتومتر درصد سلول­های زنده محاسبه شد. برای انجام روش سنجش MTT، بعد از گذشت بازه زمانی معین به هر خانه از پلیت های 24 خانه 100 میکرولیتر از محلول MTT (Sigma, UK) با غلظت 5 میلی‏گرم در میلی‏لیتر(حل شده درPBS) در شرایط تاریکی افزوده شد و پلیت 4 ساعت دور از نور در دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه گردید. سپس به هر خانه از پلیت،1میلی‏لیتر ایزوپروپانول اسیدی (Merck, Germany) افزوده شد. اسید موجود در ایزوپروپانول موجب لیز غشا سلول گردیده و بلورهای نامحلول (که در اثر احیا   MTTتوسط سلول زنده ایجاد شده‏اند) به محیط  بیرون از سلول ریخته شده وایزوپروپانول بلورهای نامحلول فورمازان را به حالت محلول در آورد. پس از گذشت 7 تا 8 ساعت محتوی خانه‏ها پیپتاژ شد و میزان جذب نوری در طول موج 570 نانومتر توسطدستگاه اسپکتروفتومتر((Milton Roy- Spectronic 21D- USAاندازه‏گیری گرفته شد. مطابق معادله زیر درصد بقا سلول‏ها  (Cell Viability) محاسبه گردید.

Viability=mean absorbance of sample/ mean absorbance of control ×100

LD50(دوز کشندگی) زهر زنبور و آلفا توکوفرول سوکسینات از طریق شمارش سلولی با تریپان بلو و سنجش MTTمحاسبه گردید. از محیط کشت خالی برای صفر کردن دستگاه و محیط کشت دارای سلول (نمونه کنترل) بدون حضور مواد مورد نظر بعنوان کنترل استفاده شد .تمامی تجربیات حداقل سه بار تکرار شدند.

آنالیز داده ها:

جهت تجزیه و تحلیل آماری داده‌ها و مقایسه میانگین‌ها از نرم افزار Instat3 و آزمون آماری پارامتریک One-way ANOVA استفاده شد. نمودارها از طریق نرم افزار EXCEL رسم شدند.

 

نتایج

اثر زهر زنبور عسل بر تکثیر رده‏ی سلولی HL-60

نتایج حاصلهازشمارش سلول‏های رنگ آمیزی شده با تریپان بلو و سنجش MTT نشان دادند که زهر زنبور در غلطت های مختلف در بازه‏ی زمانی مختلف دارای اثرات متفاوتی بر روی میزان تکثیر سلول‏های HL-60 می باشد، به طوری‏که زهر در غلظت‏های بالای 15 میکروگرم در میلی‏لیتر دارای اثر کشندگی بسیار شدیدی بود و به محض اضافه نمودن زهر در این غلظت‏ها لیز شدید سلولی مشاهده شد. غلظت 5/2 میکروگرم در میلی‏لیتر زهر زنبور پس از گذشت 72 ساعت تفاوتی در تعداد سلول­های مرده نسبت به نمونه کنترل ایجاد نکرد و مهار تکثیر نسبت به نمونه کنترل در سطح 001/0P<معنی دار بود (نمودار 1 و 2).


 

نمودار1: اثرغلظت‏های مختلف زهر زنبورعسل (BV) بر تکثیرسلول­های  HL-60 پس از طی ٢٤‏‏‏‏‎ٌ، ٤٨ و ٧٢ ساعت با استفاده از سنجشMTT.

001/0 ,***p <01/0**p <0در مقایسه با گروه کنترل، Mean ± SEM

 

نمودار 2: اثرغلظت‏های مختلف زهر زنبور عسل (BV) بر تکثیرسلول­های  HL-60( تعداد سلول­ها ×١٠٤) پس از طی ٢٤‏‏‏‏‎ٌ، ٤٨ و ٧٢ ساعت با استفاده از سنجشMTT..001/0 ,***p <01/0**p <0در مقایسه با گروه کنترل، Mean ± SEM

 

نمودار 3: اثرغلظت‏های مختلف D-آلفا توکوفرول سوکسینات (VES) بر تکثیرسلول‏های  HL-60پس از طی ٢٤‏‏‏‏‎ٌ، ٤٨ و ٧٢ ساعت با استفاده از سنجشMTT.001/0 ,***p <01/0**p <0در مقایسه با گروه کنترل، Mean ± SEM

 


اثر D-آلفا توکوفرول سوکسینات (ویتامین (Eبر تکثیر رده ی سلولی HL-60

جهت بررسی اثرD -آلفا توکوفرول سوکسینات بر تکثیر سلول‏ها و بدست آوردن غلظت‏های سمی و غیر سمی، غلظت‏های 4، 6، 9، 12، 15، 18، 20و30 میکروگرم در میلی‏لیتر بر سلول‏ها اثر داده شد.نتایج بدست آمده از سنجش MTT ورنگ آمیری تریپان بلو نشان دادند که ویتامین در الگویی وابسته به زمان و دوزسبب القاء مرگ سلولی و یا مهار تکثیر می‏گردد. بدین صورت که غلظت 30 وغلظت‏های بالاترازآن بیشترین میزان القا مرگ سلولی را به خود اختصاص دادند (نمودار4).

 

 

نمودار 4: اثرغلظت‏های مختلف آلفا توکوفرول سوکسینات((VES برتکثیرسلول‏های  HL-60(تعداد سلول­ها ×١٠٤) پس از طی ٢٤‏‏‏‏‎ٌ، ٤٨ و ٧٢ ساعت با استفاده از روشتریپان بلو. 001/0 ,***p <05/0*p <، Mean ± SEM


اثر هم افزایی زهر زنبور وD-آلفا توکوفرول سوکسینات(ویتامینE) بر تکثیر و بقا سلول‏های HL-60 :

جهت بررسی اثر هم افزایی زهر زنبوروD-آلفا توکوفرول سوکسینات بر میزان بقا و تکثیر سلول‏هایHL-60 ، غلظت‏های 5/2 میکروگرم بر میلی‏لیتر از زهرو 4و6 میکروگرم بر میلی‏لیتر از ویتامین انتخاب شدند (این غلظت‏ها موجب مهار تکثیر سلول‏ها شده ودرعین حال اثرات سمی کمتری نسبت به غلظت‏های بالاتر داشتند). بررسیاثر هم‏زمان این دوماده نشان داد که میزان مهار تکثیر سلولی در زمان هم افزایی بطور معنی داری نسبت به زمان استفاده از هریک از این مواد به تنهایی افزایش یافت (نمودار5 و 6).

 

 

نمودار 5: اثرغلظت 5/2 میکروگرم در میلی‏لیتر زهر زنبور (BV) و غلظت های6و4میکروگرم در میلی‏لیتر آلفا توکوفرول سوکسینات (VES) بهصورت توام بر تکثیرسلول­های  HL-60پس از طی ٢٤‏‏‏‏‎ٌ، ٤٨ و ٧٢ ساعت با استفاده از سنجش MTT.تعداد اولیه سلول ها 104×5 در هر میلی لیتر محیط کشت. 001/0 ,***p <01/0 , **p <05/0*p <، Mean ± SEM

 

 

نمودار6 :اثر غلظت 5/2 میکروگرم در میلی‏لیتر زهر زنبور (BV)و غلظت های6و4میکروگرم در میلی‏لیتر آلفا توکوفرول سوکسینات (VES) به صورت توام بر تکثیر سلول­هایHL-60 پس از طی ٢٤‏‏‏‏‎ٌ، ٤٨ و ٧٢ ساعت با استفاده از شمارش سلول‏های رنگ آمیزی شده توسط تریپان بلو. تعداد اولیه سلول‏ها 104×5 در هر میلی لیتر محیط کشت. 001/0 ,***p <01/0**p <0در مقایسه با گروه کنترل، Mean ± SEM

 


 

بحث

نتایج حاصله از این پژوهش نشان داد که زهر زنبور عسل و آلفا توکوفرول سوکسینات در الگویی وابسته به دوز و زمان  در غلظت های بالا سبب القا مرگ سلولی ودر دوزهای پائین سبب مهارتکثیر می شود. به این صورت که زهر زنبور در غلظت­های بالای10 میکروگرم در میلی‏لیتر دارای اثر کشندگی شدیدی بر روی سلول­هایHL-60  است. زهر زنبور در دوز­های 5، 5/7 و 10 میکروگرم در میلی‏لیتر بصورت وابسته به زمان و غلظت باعث کاهش بقا سلولی گردید. زهر زنبور در غلظت5/2 میکروگرم در میلی‏لیتر در طی 72 ساعت بدون القا مرگ سلولی باعث کاهش معنی داری در میزان سلول­های زنده نسبت به نمونه کنترل گردید و بقایای سلول‏های مرده در محیط تفاوتی با نمونه کنترل نداشت و به نظر می‏رسد این کاهش بیشتر مرتبط با مهار تکثیر بوده باشد نه مرگ سلولی. در بررسی اثر -Dآلفا توکوفرول سوکسینات  بر روی سلول­های HL-60 مشاهده شد که آلفا توکوفرول سوکسینات  در غلظت‏های بالاتر از 30 دارای اثرات سیتوتوکسیک بر روی سلول­های HL-60 می‏باشد به طوری که بعد از 24 ساعت سلول زنده‏ای در محیط مشاهده نشد. .غلظتهای4، 6، 9، 12، 15، 18، 20، 25و 30 میکروگرم در میلی‏لیتر  -Dآلفا توکوفرول به صورت وابسته به زمان و دوز  دارای اثر بر روی تکثیر رده‏ی سلولی می‏باشندبطوری که در غلطت20 بعد از گذشت 24 ساعت از تیمار و در غلظت 15 بعد از گذشت 48 ساعت و در غلظت12 پس از گذشت 72 ساعت از تیمار بقای سلولی به 50 درصد کاهش یافت.در غلظت بالای 30 ویتامین، لیز شدید سلولی مشاهده شد،بطوری‏که پس از گذشت 24 ساعت تقریبا هیچ سلول زنده ای در محیط مشاهده نشد. با توجه به خاصیت ضد تکثیری زهر زنبور، در اینتحقیق زهر به عنوان یک گزینه مناسب جهت کاهش اثر سیتوتوکسیک غلظت‏های بالایآلفا توکوفرول سوکسینات مورد توجه قرار گرفت. بدین منظور زهر زنبور بصورت توام با غلظت غیر سمیآلفا توکوفرول سوکسینات،جهت افزایش مهار تکثیر سلول­های HL-60 و کاهش اثرات جانبی غلظت بالای آلفا توکوفرولسوکسینات به کار گرفته شد. نتایج این هم افزایی نشان داد که استفاده از زهر زنبور با غلظت 5/2 میکروگرم در میلی‏لیتر وآلفا توکوفرول سوکسینات با غلظت‏های 4 و 6 میکروگرم در میلی‏لیتر بصورت هم‏زمان بدون داشتن اثر سیتوتوکسیک باعث افزایش مهار تکثیر سلول­های HL-60 شدندکه بیشترین اثر مهار تکثیر در غلظت 6 ویتامین و 5/2 زهر زنبور مشاهده شد. برای اولین بار نقش ضد سرطانی ویتامینE در سال 1960 نشان داده شد و مطالعات قبلی نشان دادند که مشتقات استری ویتامین E(آلفا توکوفرول سوکسینات) مهم‏ترین ترکیب موثر در مهار تکثیر سلول‏های سرطانی می‏باشند.Jenifer و همکارانش نشان دادند که آلفا توکوفرول سوکسینات در غلطت 15 پس از طی 48 ساعت بقاء سلولی را به60 درصد می‏رساند که این نیز با یافته‎های این پژوهش هم‏خوانی داشت (23 و 24). این غلظت از آلفا توکوفرول سوکسینات سبب توقف سلول‏ها در فازG2/M  چرخه‏ی سلولی می شود.هم چنین مطالعات قبلی نشان داده‏اند که مشتق آلفا توکوفرول سوکسینات نسبت به سایرمشتقات دارای بیشترین اثر بر تکثیر رده‏ی سلولی HL-60  می باشد (25).به هرحال مکانیسم­های مولکولی سیگنالینگ سلولی که طی آنها آلفا توکوفرول سوکسینات سبب مهار تکثیر و القامرگ سلولی در رده‏های مختلف سلولی می شود، به طور واضح مشخص نیست. مطالعات قبلی نشان داده‏اند که سلول سرطانی به دلیل دارابودن pH اسیدی تری نسبت به سلول سالم میزان بیشتری از ویتامین را جذب می کند. Kozin و همکارانشنشان دادند که توکوفرول سوکسینات می‏تواند بطور قوی به صورت وابسته به pH مرگ سلولی را در سلول‏های سرطانی پستان و خون القا کند (26). هم چنین نشان دادند که فعالیت پروآپپتوتیک این ترکیب با کاهش pH افزایش می یابد.در سال2007، Crispenو همکارانش پیشنهاد نمودند که آلفا توکوفرول سوکسینات از طریق مهار فعالیت فاکتور هسته ایkappa-β  (NF-kβ) و مهار رونویسیAP-1  سبب مهار تکثیر سلول‏های سرطانی می‏شود(27). فاکتور هسته­ای kappa-β بعنوان تنظیم کننده بیان بسیاری از ژن‏ها از جمله آنزیم سیکلواکسیژناز-2 (هدف بسیاری از داروهای ضد سرطان) شناخته می شود و در تکثیر سلولی، پاسخ های التهابی وآپوپتوزیس دخیل است (28). بیان بالای این فاکتور در رده‏های مختلف سلول سرطانی دیده شده است.این فاکتور منجر به تکثیر غیر قابل کنترل و مقاوم شدن سلول‏های سرطانی در برابرعوامل القا کننده‏یآپوپتوزیس می‏شود .Ni وهمکارانش(نشان دادند که آلفا توکوفرول سوکسینات از طریق مهار بیان پروتِئین های تنظیمی چرخه ی سلولی از جمله  Cyclin D, E CDK 2,4و کاهش فسفوریلاسیون Rb سبب توقف سلول‏ها در فاز S/G1  می شود(25). همچنین مطالعات قبلی نشان داده‏اند که توکوفرول سوکسینات سبب تولید رادیکالهای آزاد در انواع سلول‏های سرطانی می‏شود که به دنبال آن القا مرگ سلول‏های سرطانی را منجر می‏گردد، این در حالی است که این ترکیب در سلول‏های طبیعی نقش آنتی اکسیدانت را ایفا می‏کند.Gu  و همکارانش(29) نشان دادند توکوفرول سوکسینات سبب افزایش فعالیت اسفنگومیلیناز در غشای سلولی می‏شود که در اثر فعال شدن این آنزیم، اسفنگومیلین غشای سلولی به اسپونژیومین هیدرولیز شده و به دنبال آن مرگ سلولی وابسته به اسپونژیومین آغاز می‏گردد.به این صورتکه اسپونژیومین سبب راه اندازی آبشاری از کاسپازهاو کاهش پایداری غشا میتوکندری،لیزورم وسپس مرگ سلولی می شود.هم چنین Neuzil  و همکارانش نشان دادند که توکوفرول سوکسینات سبب فعال سازی PP2A (پروتئین فسفاتاز  (2Aمی‏شود که این ترکیب منجر به دفسفوریلاسیون و غیر فعال شدن αPKC می‎شود که به نوبه خود سبب دفسفوریلاسیون و غیر فعال شدن پروتئینBcl-2 می‏گردد(30). در نهایت  فعال شدن PP2A و غیر فعال شدن PKC سبب آزاد سازی سیتوکروم c از میتوکندری شده که سیتوکروم c به نوبه ی خود باApaf-1  و کاسپاز 9 جسم آپپتوتیک را تشکیل می‏دهند که این کمپلکس منجر به فعال شدن سایر کاسپازها از جمله کاسپاز 3 می‏گردد (30).بررسی‏های متعددی خاصیت ضد تکثیری زهر را در رده‏های مختلف سلول سرطانی نشان داده اند. زهر زنبور دارای توانایی القا آپوپتوزیس، نکروز و لیز سلولی در سلول‏های سرطانی می باشد (31و32 و 33).kim  پیشنهاد می­کند که ملیتین موجوددرزهر زنبورازطریقفعال کردن فسفولیپاز A2 سبب القا مرگ در سلول‏های سرطانیمی شود(32). بررسی دیگرینشان داد که ملیتین بعنوان یک مهار کننده کالمودولین، تکثیر را در سلول­های لوسمی انسان و موش مهار می­کند(30).همچنینOrsolic و  Liu نتایج جالبی را در مورد ارتباط بین مهارکننده های کالمودولین و مهار رشد سلول سرطانی گزارش کردند(20و31). هم چنین نشان داده شده که  ملیتین و فسفولیپاز- A2  موجود در زهر در غلظت های غیر سمی، باعث مهار فعالیت فاکتور هسته­ای kappa-β و مهار m-RNA سیکلواکسیژناز-2 می­شود (33). Park وهمکارانش نشان دادند که زهر زنبور با مهار فاکتور هسته­ایkappa-β  باعث کاهش بیان آنزیم COX-2و سبب مهار تکثیر در سلول‏های Raw 264.7 می­شود(33). در سال 2006،Son  و همکارانش نشان دادند که ملیتین موجود در زهر زنبور در الگویی وابسته به غلظت از طریق مهار فعالیت سیگنال‏های Akt و فاکتور هسته­ای β -kappa و همچنین بالا بردن بیان پروتئین‏های دخیل در آپوپتوزیس باعث مهار تکثیر سلول­های عضله صاف جداره عروق می­گردد. نتایج حاصل از این پژوهش نیز نشان داد که زهر زنبور عسل تکثیر را در رده­ی سلولی HL-60  مهار می­کند که با تحقیقات انجام گرفته در رابطه با توانایی مهار تکثیر زهر زنبور مطابقت دارد (34).Zhu  و همکارانشگزارش کردند که ملیتین در غلظتی که تکثیر را در سلول­های سرطانی مهار می­کند بر روی مهار رشد سلول­های نرمال موثر نیست(36). SONو همکاران گزارش کردند که Dunn و  Killionنشان دادند که  حساسیت سلول­های لوسمی سرطانی L1210نسبت به سلول‏های سالم DBA/2 طحال موش به اثرات  سمی ملیتین 2تا 4 بار بیشتر است(34).

Jangو همکارانش اثر زهر را در مهار COX2 و القا آپوپتوزیس در رده‎ی سلولیNCI-H1299 مربوط به سرطان ریه گزارش کردند(37).هم چنین Moon  و همکارانش با بررسی اثر زهر زنبور بر رده ی سلولی میلوئیدی U937  به این نتیجه رسیدند که زهر زنبور سبب کاهش بیان پروتئین های ضدآپوپتوزیس از جملهBcl-2 , Bcl-x1 , و سبب فعال شدن کاسپازهای 3 و 9 در این رده سلول سرطانی می شود(22).مطالعات اخیر فعالیت ضد توموری زهر زنبور را در محیطinvivo و in vitro نشان داده­اند و بیان می­کنند که زهر زنبور می­تواند بعنوان یک عامل  در درمان سرطان استفاده شود (37). با توجه به مسیرهایمولکولی دخیل در مهار  تکثیر سلولی و القا آپوپتوز توسط زهر زنبور و آلفا توکوفرول سوکسینات می­توان گفت که عمل‏کرد زهر زنبور و آلفا توکوفرول سوکسینات در چندین مسیر در طول مهار تکثیر و القا آپوپتوزیس مشابه می باشد. بنابراین می توان بیان نمود که زهر زنبور در غلظت‏های غیر سمی و مهاری می­تواند از طریق مهار فعالیت فاکتور هسته­ایkappa-β  و کاهش بیان COX-2، کاهش بیان پروتئین‏های ضد آپوپتوزیس از جمله Bcl-2 , Bcl-x1 موجب افزایش اثر مهار تکثیری آلفا توکوفرول سوکسینات بر روی سلول­های سرطانی HL-60 شود (38).

با توجه به اینکه نتایج این پژوهش همسو با نتایج سایر تحقیقات انجام شده در این زمینه می­باشد، به منظور تکمیل نتایج و جامع تر شدن ابعاد این بررسی، پیگیری موضوعات زیر پیشنهاد می‎شود:

1-   بررسی فعالیت فاکتور هسته­ایkappa-β  و بیان آنزیم COX-2 در هم افزایی دو ترکیب ذکر شده.

2-   با توجه به موفق بودن درمان ترکیبی  در درمان لوسمی­حاد بررسی اثر هم­افزایی زهر زنبور ویتامین E در سطح in-vivo.

3-   بررسی بیان فاکتورهایی  چون Bcl-2 , Bcl-x1 در هم افزایی دو ترکیب ذکر شده.

 

نتیجه گیری

 نتایج حاصل از این پژوهش تائید کننده اثر مهاری زهر زنبور عسل وآلفا توکوفرول سوکسینات بر تکثیر رده سلولی HL-60 می­باشد.مقایسه اثرهمافزایی زهر زنبور و-D آلفا توکوفرول سوکسینات با اثر منفرد هر یک از این مواد نشانمی‎دهد که زهر زنبور موجب افزایش اثر مهار تکثیری آلفا توکوفرولسوکسینات می­شود. افزایش اثر مهارتکثیری ویتامینE بر رده‏ی سلول سرطانی HL-60 توسط زهر زنبور تاکنون درهیچ مطالعه‎ای بررسی نشده و برای اولین باردراین پژوهش مورد بررسی قرار گرفته است. لازم به ذکر است که نتایج این مطالعه حاصل کار در محیط آزمایشگاهی  است و لزوم انجام تحقیقات بیشتر مورد تاکید می‏باشد.

 

تشکر و قدردانی

 این تحقیق در آزمایشگاه زیست شناسی سلولی تکوینی دانشکده علوم زیستی دانشگاه خوارزمی انجام شد. مولفین بر خود لازم می‏دانند از پرسنل آزمایشگاه و ریاست دانشکده علوم زیستی، سپاسگزاری نمایند.

 

1 Rane SG, Reddy EP. JAKSTATs and Src kinases in hematopoiesis. Oncogene.2002; 21(21): 3334–3358.

2. Ravandi F, Talpaz M, Estrov Z. Targeted Therapy in Hematological Malignancies Modulation ofCellular Signaling Pathways:Prospects forTargeted Therapy in Hematological Malignancies. 2003; 9: 535-550.

3. KL Rice KL, Hormaeche I, LichtJD. Epigenetic regulation of normal and malignant hematopoiesis. 2007; 26:6697-6714.

4. James SY, Williams MA, Newland AC, Colston KWL.4. differentiation of Leukemia cell. Gene Pharmacol .1999; 32(1): 143-54.

5.Waxman S. Differentiation therapy in acute myeloid leukemia. Leukemia. 2000; 14: 491-496.

6. Altucci L, Wilhelm E, Gronemeyer H. Leukemia: beneficial actions of retinoids and rexinoids. Biochemistry and Cell Biology J. 2003; 36(2): 178-182.

7. Dong  S, Geng J, Tong J, Wu Y, et al. Breakpoint clusters of PML gene in acute promyelocytic leukemia:primary structure of the reciprocal products ofPML-RARA gene in patient with (15:17) gene Chromosome .Cancer.1993; 6: 133-139.

8. Kakizuka A,Miller WJ, Umesono K, Warrell RJ, et al. Choromosomal translocation t(15 , 17) in humane acute promyelocytic leukemia fuses RAR

 

alpha with a novel putative transcription factor PML.CELL .1991 ; 66(4) :663-674.

9. Gocek E, Marcinkowaka E. Differentiation Therapy of acute Myeloid Leukemia. Cancera.  2011; 3(2):2402-2420.

10. Chen Z, Wang ZY, Chen SJ. Acute promyelocytic leukemia: Cellular and  Molecular basis of differentation and apoptosis. Pharmacol Ther 1997; 76(1-3): 141-9.

11. Burnett AK, Eden OB. The treatment of acute leukemia. Lancet 1997; 349(9047): 270-5.

12.Kedar N. Prasad,  KumarB,  Yan XD, et al. α-Tocopheryl succinate , the most Effective from of Vitamin E for Adjuvante Cancer Treatment :A Review.2003; 22(2): 108-117.

13. Kline K, Yu w, Sanders BG. Vitamin E:mechanisms of action as tumor cell growth inhibitors .J Nutr .2001; 131(2): 161S -163S.

14. Prasad KN, Edwards-Prasad J. "Effects of Tocopherol (Vitamin E) Acid Succinate on Morphological Alterations and Growth Inhibition in Melanoma Cells in Culture. Cancer Res. 1982; 42(2):550-555.

15. Kline K, Cochran GS, Sanders  BG. "Growth-Inhibitory Effects of Vitamin E Succinate on Retrovirus- Transformed Tumor Cells In Vitro." Nutr Cancer. 1990; 14(1): 27-41.

16. Alexander G, Suttic J. The effect of vitamin E on vitamin K activity .FASEB J .1999; 13:A535(abstr).

17. March BE, Wong F, Seier L, Sim J, et al. Hypervitaminosis E, in the chick .J Nutr .1973; 103 :317-327.

18. Corrigan JJ, Ulfers LL. Effect of vitamin E  on prothrombine levels in warfarin –induced vitamin K deficiency .AM J .1981; 34(9): 1701-1705.

19. Gallaghe R, Collins r, Trujillo SJ, KAhearn M, et al. Characterization of the continuous, differentiating myeloid cell line (HL-60) from a patient with acute promyelocytic leukemia. Blood J. 1979; 54(3): 713-733.

20. Liu X, Chen D. Effect of honey bee venom on proliferation of K1735M2 mouse melanoma cells in-vitro and growth of murine B16 melanomas in-vivo. Pharmacy and Pharmacology J. 2002; 54:1083-1089.

21. Son DJ, Lee JW, Lee YH, Song HS, et al. Therapeutic application of anti-arthritis, pain-releasing and anti-cancer effects of bee venom and its constituent compounds. Pharmacology & Therapeutics J.  2007;  115:246-270.

22. Moon DO, Park SY, Heo MS, Kim KC, et al. Key regulators in bee venom-induced apoptosis are Bcl-2 and caspase-3 in human leukemic U937 cells through downregulation of ERK and Akt. Int Immunopharmacol J. 2006;6(12): 1796-1807.

23. Jennifer M, Bob G, Kimberly K. RRR‐α‐tocopheryl succinate modulation of human promyelocytic leukemia (HL‐60) cell proliferation and differentiation. 1992; 18: 201-213.

24. Neuzil J, Weber T, Gellert N, et al .Selective cancer cell killing by alpha –tocopheryl succinate .Br J Cancer .2001 ;84(1) :87-89.

25. Ni J, Chen M, Zhang Y, Li R , et al.Vitamin E succinate inhibits human prostate cancer cell growth via modulating cell cycle regulation machinery .Biochem Biophys Res Commun .2003 ;300:357-363.

26. Kozin SV, Shkarin P, Gerweck LE. The cell transmembrance Ph gradient in tumors enhances cytotoxicity of specific weak acid chemotherapeutics. Cancer Res .2001; 61(12): 4740-4743.

27. Crispen PL, Uzzo RG, Golovine K, et al.Vitamin E succinate inhibitis NF –kappaB and prevents the development of metastatic phenotype in prostate cancer calls:implication for chemoprevention .Prostate .2007 ;67(6): 582-590.

28. Orsolic CN, Sever L, Verstovsek S, Terzic S. Basic I. Inhibition of mammary carcinoma cell proliferation in vitro and tumor growth in vivo by bee venom. Toxicon J. 2003; 41(7): 861-870.

29. Gu X, Song X, et al .Vitamin E  succinate induces ceramid –mediated  apoptosis in head  and neck squmous  cell carcinoma In vitro and invivo.Clin Cancer Res .2008; 14(6): 1840-1848.

30. Neuzil J, Weber T, Schroder A, et al. Induction of cancer cell apoptosis by alpha tocopheryle succinate : molecular pathways and strutural reqirement .FASEB J . 2001; 15:403-415.

31. Orsolic N, Sver L, Bendelja K. Basic antitumor activity of bee venom. Periodicum Biologorum J. 2001; 103:49-54.

32. Kim HW, Kwon YB, Ham TW, Roh DH, et al. General pharmacological profiles of bee venom and its water soluble fractions in rodent models. Vet Sci J. 2004; 5:309-318.

33. Park HJ, Lee SH, Son DJ, Oh KW, et al. Anti-arthritic effect of bee venom: inhibition of inflammation mediator generation by suppression of NF-kappa β through interaction with the p50 subunit. Arthritis Rheum J.2004; 50: 3504-3515.

34. Son DJ, Ha SJ, Song HS, Lim Y, et al. Melittin inhibits vascular smooth muscle cell proliferation through induction of apoptosis via suppression of nuclear factor-kappa β and Akt activation and enhancement of apoptotic protein expression. Pharmacol Experimental Therapeutics J.2006; 317: 627-634.

36. Zhu H, Tayeh I, Israel L, Castagna M. Different susceptibility of lung cell lines to inhibitors of tumor promotion and inducers of differentiation. Biol Regul Homeost Agents J. 1991;5: 52-58.

37. Jang MH, Shin MC, Lim S, Han SM,et al. Bee Venom Induces Apoptosis and Inhibits Expression of Cyclooxygenase-2 mRNAin Human Lung Cancer Cell Line NCI-H1299.J Pharmacol. 2003; 91(2): 95-104.