فصلنامه

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه آزاد اسلامی واحد دامغان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی، دامغان، ایران

2 دانشگاه آزاد اسلامی واحد نیشابور، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی، نیشاپور، ایران

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی تاثیر نانو­اکسید­ روی بر خصوصیات رشدی و فیزیولوژیکی، میزان تولید رزمارینیک­اسید و بیان ژن­های کلیدی در مسیر بیوسنتزی این ترکیب در گیاه بادرنجبویه است.
مواد و روش‏ها: در این مطالعه، دانه ­رست­های 30 روزه بادرنجبویه با غلظت­های صفر، 06/0 و 12/0 میلی‌گرم بر لیتر نانوذره‌­اکسید­ روی تیمار شدند و سپس پارامترهای رشدی، میزان رنگیزه­های فتوسنتزی، پرولین، گلایسین بتائین، پروتئین، فعالیت آنزیم­های آنتی ­اکسیدانتی و میزان تولید رزمارینیک­اسید مورد بررسی قرار گرفت. هم‌چنین بیان ژن‌های کلیدی در مسیر بیوسنتزی رزمارینیک­اسید با روش Real-time PCR  بررسی شد.
نتایج: نتایج حاکی از این است که تیمار نانو­ذره ‌اکسید­روی باعث افزایش رنگیزه­های فتوسنتزی کلروفیلی، کاروتنوئیدها و فعالیت آنتی ­اکسیدانتی این گیاه شد. هم‌چنین بیش‌ترین میزان پرولین و گلایسین بتائین نیز تحت غلظت 12/0 میلی‌گرم بر لیتر این تیمار به‌دست آمد. هم‌چنین نانوذره‌اکسید­ روی باعث افزایش بیان ژن­های مسیر بیوسنتزی رزمارینیک­اسید (TAT و 4-Cl) و در نتیجه افزایش مقدار این ترکیب شد.
نتیجه‏گیری: براساس نتایج این تحقیق نانوذره‌ اکسیدروی می­تواند بر مراحل رشدی و فیزیولوژیکی گیاه بادرنجبویه اثر گذاشته و بنابراین می­توان از آن به‌منظور افزایش تولید رزمارینیک­اسید استفاده کرد.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

dor -

عنوان مقاله [English]

Effect of Zinc Oxide nanoparticle on physiological characteristics, rosmarinic acid production and expression of TAT and 4-Cl genes in Lemongrass (Melissa officinalis L.)

نویسندگان [English]

  • S Farnoosh S 1
  • N Masoudian 1
  • A Safipour Afshar 2
  • F SaeidNematpour 2
  • B Roudi 1

1 Department of Biology, Faculty of Basic Science, Islamic Azad University Damghan Branch, Damghan, Iran

2 Department of Biology, Faculty of Basic Science, Islamic Azad University Neyshabur Branch, Neyshabur, Iran

چکیده [English]

Aim: The aim of this study was to investigate the effect of Zinc oxide nanoparticles on growth and physiological characteristics, rosmarinic acid production and the expression of key genes in the biosynthetic pathway of this compound in lemongrass.
Material and Methods: In this study, 30-day-old seedlings of lemongrass were treated with concentrations of 0, 0.06 and 0.12 mg/l Zinc oxide nanoparticles, and then growth parameters, photosynthetic pigments, proline, Glycine betaine, protein, activity of antioxidant enzymes and production of rosmarinic acid were examined. Also, the expression of key genes in the rosmarinic acid biosynthetic pathway was examined by real-time PCR.
Results: The results indicate that Zinc oxide nanoparticles treatment increased chlorophyll photosynthetic pigments, carotenoids and antioxidant activity of this plant. Also, the highest amount of proline and glycine betaine was obtained at a concentration of 12 mg/L of this treatment. Zinc oxide nanoparticles also increased the expression of rosmarinic acid biosynthetic pathway genes (TAT and 4-Cl) and thus increased this compound.
Conclusion: Based on the results of this study, Zinc oxide nanoparticles can affect the growth and physiological stages of lemongrass and therefore it can be used to increase the production of rosmarinic acid.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Lemongrass
  • Tyrosine aminotransferase
  • Rosmarinic acid
  • Coumarate CoA ligase
  • Zinc oxide nanoparticles
  • مقدمه

بادرنجبویه یکی از جنس‌های خانواده نعنا (Lamiaceae) و از رده دو لپه‌ای‌ها است. بیش‌ترین پراکنش این گیاه علفی و پایا در مناطق مدیترانه و نواحی شمال ایران است. عمده‌ترین ترکیب تشکیل دهنده اسانس بادرنجبویه سیترونلال (10 تا 50 درصد) است. از ترکیبات دیگر این گیاه می‌توان به اسانس (میانگین 1/0 درصد با سیترال-ژرانیل و نرال، لینالول، اوژنول، سیترونلال، ژرانیول)، تانن، رزین، پلی‌فنول، فلاونوئید، سوکسینیک‎اسید و رزمارینیک‌اسید اشاره کرد (1). اسانس آن دارای خواص ضدمیکروبی، ضدباکتری و ضدویروسی است. این گیاه به‌دلیل تولید متابولیت‌های ثانویه و اهمیت بسیاری که در مصارف پزشکی، صنایع آرایشی و بهداشتی و نیز صنایع غذایی دارد بسیار مورد توجه است. بیش‌تر خواص درمانی این گیاه را به‌ماده موثره آن یعنی رزمارینیک‌اسید نسبت می‌دهند. رزمارینیک‌اسید یک استر از کافئیک‌اسید و 3، 4-دی‌هیدروفنیل‌لاکتیک‌اسید است که در گیاهان از طریق مسیر بیوسنتزی فنیل‌پروپانوئیدی تولید می‌شود. اسیدآمینه‌های تیروزین و فنیل‌آلانین، سوبستراهای این مسیر بیوسنتزی بوده و آنزیم‌های مختلفی ازجمله تیروزین‌آمینوترانسفراز (TAT) و 4-کومارات‌کوآ‌لیگاز (4-Cl)  در این مسیر فعالیت دارند (2).

امروزه از نانوذرات به‌‌عنوان محرک‌های غیرزیستی بسیار استفاده می‌شود. این ترکیبات معمولا اندازه‌ای حدود 1 تا 100 نانومتر دارند و به‌علت همین اندازه کوچک، سطح تماس بیش‌تری دارند و در نتیجه میزان چسبندگی آن‌ها به‌سلول بیش‌تر است و همین امر باعث افزایش کارایی آن‌ها می‌شود (3). کاهش اندازه مواد در حد نانومتر به‌دلیل افزایش نسبت سطح به حجم باعث تغییر خصوصیات فیزیکی و شیمیایی آن‌ها شده به‌گونه‌ای که ویژگی‌هایی متفاوت از ترکیبات با ابعاد بزرگ‌تر از نانو ایجاد می‌کنند. نانوذرات کاربردهای بسیار متنوعی در صنایع مختلف ازقبیل صنایع‌غذایی، میکروالکترونیک، نساجی، ساختمان‌سازی، پزشکی و کشاورزی دارند و مطالعات مختلفی برروی اثر این نانوذرات بر سنتز و میزان متابولیت‌های ثانویه صورت گرفته است. تحقیقات مختلفی در گذشته صورت گرفته و ثابت شده است که محرک‌ها (عوامل مختلف فیزیکی و شیمیایی) در گیاهان منجر به‌بروز پاسخ‌های مورفولوژیک و فیزیولوژیک و به‌طورکلی پاسخ‌های دفاعی مانند تجمع متابولیت‌های ثانویه می‌شوند.

مطالعات انجام شده توسط Aminzadeh و همکاران (2016) نشان داد که محتوای سولفارافان در گیاهچه‌های Lepidum draba  تحت تیمار با نانوذرات اکسیدمس و آهن تحت تاثیر قرار گرفته است (4). علاوه‌برآن تاثیر مثبت نانوذرات نقره بر تولید مواد موثره در گیاه Artemisia annua و Calendula officinalis ثابت شده است (5، 6). افزایش محتوای ترکیبات فنلی و رزمارینیک‌اسید در گیاه اسطوخودوس (Lavandula angustiflora) تحت تیمار با نانوذرات نقره گزارش شده است (7). در بررسی اثر کود آهن و نانوکود آهن در گیاه ریحان، تفاوت معنی‌داری در میزان پروتئین مشاهده شد (8). هم‌چنین در مطالعه دیگری گزارش شده است که در گیاه نخود میزان متابولیت‌های ثانویه تحت تاثیر نانوذرات اکسیدتیتانیوم در شرایط کشت درون-شیشه افزایش پیدا کرده است (9). در تحقیقی دیگر که توسط Homaee و Ehsanpor در گیاه سیب‌زمینی انجام شد مشخص شد که تحت تنش نانوذرات نقره میزان کلروفیل به‌طور قابل توجهی در غلظت‌های پایین افزایش و در سطوح بالاتر کاهش یافته است. نانوذرات نقره در غلظت 100 میلی‌گرم بر لیتر اثر مثبت بر کلروفیل a و محتویات کلروفیل کل در گیاهچه خردل (Brassica juncea) داشته که با 25 و 40 درصد افزایش همراه بوده است (10).

بنابراین باتوجه به کاربردهای بسیار زیاد این گیاه در صنایع مختلف و ارزش دارویی آن، بهبود کمیت و کیفیت مواد موثره این گیاه مخصوصا رزمارینیک‌اسید امری ضروری است. لذا هدف از تحقیق حاضر بررسی اثر دو غلظت نانوذره‌اکسید ‌روی بر شاخص-های رشد، میزان متابولیت‌های ثانویه، فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانتی و بیان دو ژن کلیدی مسیر بیوسنتزی رزمارینیک‌اسید می‌باشد.

 

  • مواد و روش‌ها

بذرهای گیاه بادرنجبویه (Melisa officinalis) در گلدان حاوی ماسه و پرلیت کاشته شد. گلدان‌های حاوی بذرها به‌گل‌خانه با دمای 2±25 درجه سانتی‌گراد و شرایط دوره روشنایی/تاریکی (16/8) و شدت روشنایی (120-150 لوکس) انتقال داده شد. بعد از 30 روز گلدان‌ها با 20 میلی‌لیتر از تیمار نانواکسیدروی (خریداری شده به‌صورت پودر از شرکت بازرگانی نوترینو، میانگین اندازه ذرات 30 نانومتر و خلوص 9/99 درصد) با غلظت‌های (0، 06/0 و 12/0 میلی‌گرم بر لیتر) به‌طور هفتگی و برای سه هفته اسپری شدند. این پژوهش به‌صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد.

سنجش پارامترهای رشدی: پس از هر مرحله برداشت نمونه‌های شاهد و تیمار، طول ریشه از ناحیه‌ی یقه تا نوک ریشه و طول ساقه از ناحیه یقه تا نوک جوانه انتهایی با استفاده از خط‌کش اندازه‌گیری شد. اندازه‌گیری وزن تر اندام هوایی و وزن تر ریشه‌های گیاهان مربوط به‌هر گلدان با استفاده از ترازوی دیجیتال اندازه‌گیری شدند. سپس نمونه‌ها به‌منظور انجام آنالیزهای بیوشیمیایی در دمای 70- درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند.

سنجش رنگیزههای فتوسنتزی: به‌منظور سنجش میزان کلروفیل‌های  a، b ، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها از استون 80 درصد استفاده شد. سپس جهت محاسبه‌ی غلظت‌ها، جذب محلول در طول موج‌های 645، 663 و 470 نانومتر با استفاده از شاهد (استون 80 درصد) در دستگاه اسپکتروفتومتر مدل T80 (شرکتPG Instruments) خوانده شد (11).

میزان کلروفیل و کاروتنوئید بااستفاده از روابط زیر بر حسب میلی‌‌گرم در گرم وزن تر محاسبه شد:

Ca =12/25A663/2-2/79A646/8

Cb = 21/50A646/8-5/10A663/2

Tchl = Ca+Cb

Cx+c= (1000A470-1/82Ca-852/02Cb)/198

Ca: غلظت کلروفیلa

:Cb غلظت کلروفیلb

:Tchl کلروفیل کل

:Cx+c غلظت کاروتنوئیدها

سنجش میزان پروتئین: غلظت مقدار پروتئین نمونه‌ها به‌روش برادفورد تعیین شد (12). برای تعیین غلظت پروتئین‌های نمونه از هر عصاره پروتئینی مقدار 100 میکرولیتر در لوله آزمایش ریخته و 5 میلی‌لیتر محلول برادفورد به‌‌آن اضافه شد. سپس جذب آن‌ها با دستگاه اسپکتروفوتومتر در طول موج 595 نانومتر خوانده شد. غلظت پروتئین هر نمونه براساس میلی‌گرم بر گرم وزن تر با استفاده از منحنی استاندارد محاسبه شد.

سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز: سنجش آنزیم کاتالاز با استفاده از 3 میلی‌لیتر مخلوط واکنش شامل بافر فسفات 50 میلی‌مولار با 8/6=pH (2800 میکرولیتر)، آب‌اکسیژنه 15 میلی‌مولار (100 میکرولیتر) و عصاره آنزیمی (100 میکرولیتر) انجام شد. با اضافه کردن عصاره به محیط، واکنش شروع و میزان تغییرات جذب در طول موج 240 نانومتر به‌مدت 1 دقیقه در دستگاه اسپکتروفوتومتر خوانده و فعالیت آنزیمی به‌صورت تغییرات جذب به‌ازای گرم وزن تر در دقیقه سنجیده شد (13).

سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز: براساس روش Ranieri و همکاران (2003) سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز با 3 میلی‌لیتر مخلوط واکنش شامل بافر فسفات 25 میلی‌مولار با 8/6=pH (2750 میکرولیتر)، بنزیدین 20 میلی‌مولار (100 میکرولیتر)، آب‌اکسیژنه 40 میلی‌‌مولار (100 میکرولیتر) و عصاره آنزیمی (50 میکرولیتر) انجام و تغییرات جذب نیز در طول موج 470 نانومتر به‌مدت 3 دقیقه در دستگاه اسپکتروفوتومتر خوانده شد. سپس فعالیت آنزیمی به‌صورت تغییرات جذب به‌ازای گرم وزن تر در دقیقه سنجیده شد (14).

سنجش میزان رزمارینیک‌اسید: مقدار 100 میلی گرم از بافت خشک گیاهچه‌های تیمار شده و شاهد آسیاب شده و 10 میلی‌لیتر اتانول 30 درصد به‌آن اضافه شد. محلول حاصل از استخراج به‌مدت 20 دقیقه با دور 4000 rpm در دمای اتاق سانتریفیوژ شد. محلول رویی با آب‌مقطر به‌حجم 20 میلی‌لیتر رسانده شده و به‌وسیله فیلتر سرنگی 2/0 میکرومتری صاف شد. جذب نمونه‌ها در 330 نانومتر خوانده شده و مقدار رزمارینیک‌اسید بر حسب میلی‌گرم بر گرم وزن تر گزارش شد (15).

سنجش پرولین: پس از کوبیدن نمونه‌ها در هاون چینی، 10 میلی‌لیتر سولفوسالیسیلیک اسید 3 درصد به‌آن اضافه کرده و محتوای هاون را هم‌زده و با کاغذ صافی صاف شد. به 2 میلی‌لیتر محلول حاصل، 2 میلی‌لیتر معرف ناین‌هیدرین اضافه شد. محتوی حاصل هم‌زده و در حمام آب جوش در دمای 100 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 1 ساعت قرار داده شد. سپس لوله‌های محتوی حاصل را در یخ قرار داده، پس از یکی شدن دمای آن با دمای محیط به‌آن 4 میلی لیتر تولوئن اضافه شد و به‌مدت 15 تا 20 ثانیه مخلوط و سپس نمونه‌ها در طول موج 520 نانومتر خوانده و میزان پرولین نیز بر حسب فرمول زیر محاسبه شد (16). در این رابطه  :xمقدار پرولین برحسب میکرو‌مول بر گرم وزن تر برگ،:A  مقدار پرولین به‌دست آمده از منحنی استاندارد بر حسب میکروگرم در میلی‌لیتر، :B مقدار تولوئن استفاده شده بر حسب میلی‌لیتر، :C عدد مولکولی پرولین 13/115 میکروگرم بر میکرومول و  :D مقدار نمونه گیاهی وزن شده برحسب گرم می‌باشد.

سنجش گلایسین بتائین: برای اندازه‌گیری گلیسین بتائین از روش Grieve and Grattan (1983) استفاده شد (17). جذب نمونه‌ها توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در 365 نانومتر برآورد شد و غلظت گلیسین بتائین برحسب میلی‌گرم در گرم وزن تر بیان شد.

استخراج RNA کل، سنتز cDNA، تکثیر و بررسی بیان ژن‌ها: به‌منظور بررسی بیان ژن آنزیم TAT و 4CL، استخراج RNA  کل از گیاهچه‌های فریز شده با استفاده از کیت RNX-Plus (شرکت سیناژن، به‌شماره کاتالوگRN7713C ) و مطابق دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد. درنهایت پس از حذف DNA ژنومی بااستفاده از DNase1، کیفیت و کمیت RNA تخلیص شده برروی ژل آگارز 1 درصد و دستگاه نانودراپ c 2000 (Thermo Fisher Scientific) بررسی شد. رشته اول cDNA  بااستفاده از 5/0 میکروگرم RNA کل به‌وسیله کیتFirst Strand cDNA Synthesis kit  (شرکت Thermo Fisher Scientific) انجام و به‌عنوان الگو برای واکنش‌های ریل‌تایم مورد استفاده قرار گرفت. برای بررسی بیان ژن‌های TAT و4-Cl  از آغازگرهای اختصاصی با طول قطعه تکثیر شونده 130 جفت باز برای هر ژن برگرفته از مقاله Doring و همکاران (2014) با مشخصات ذکر شده در جدول 1 استفاده شد.

مخلوط واکنش شامل 25/0 میکرولیتر آغازگرهای رفت و برگشت، 4 میکرولیتر cDNA رقیق شده و 10 میکرولیتر مسترمیکس سایبرگرین با حجم 20 میکرولیتر استفاده شد. دستگاه ریلتایم مدل plus 9600 (شرکتLinegene ) برای بررسی بیان ژن‌ها استفاده شد. مراحل واکنش سه مرحله شامل مرحله 1- 95 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 15 دقیقه، مرحله 2-40 چرخه 95 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 15 ثانیه، 60 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 30 ثانیه، 72 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 25 ثانیه، مرحله 3- منحنی ذوب از 55 تا 95 درجه سانتی‌گراد با فاصله‎های افزایشی 5/0 درجه سانتی‌گراد در مدت 15 ثانیه بود. بااستفاده از روشΔΔCT-2 تعداد نسخه‌های تکثیر شده برای هر ژن محاسبه شد.

آنالیز آماری

کشت گیاه با سه تکرار مستقل و در قالب یک طرح کاملا تصادفی انجام شد. میانگین داده‌های حاصل از سه تکرار مستقل با استفاده از نرم‌افزار SPSS، توسط آزمون دانکن و با درنظرگرفتن سطح اطمینان 05/0p≤ مورد تجزیه واراینس یک عاملی (One way ANOVA)  قرار گرفتند. معنی‌دار بودن نتایج با حروف برروی هر ستون مشخص شد. حروف متفاوت بیان‌گر معنی‌داری در سطح 5 درصد می‌باشند و حروف مشابه و مشترک بیان‌گر عدم معنی‌دار بودن نتایج در سطح 5 درصد (05/0p≤) می‌باشند.

 

 

 

جدول 1. پرایمرهای مربوط به تکثیر ژن­های TAT و 4Cl و کنترل داخلی (β-Actin) (18)

نام پرایمر

توالی

TM (°C)

4Cl-forward

5′-AGACGATCATGCTCTTGCTCCC-3′

52

4Cl-reverse

5′-GGCCTTGGCTTGCTTGATTACC-3′

52

TAT-forward

5′-CCTACAAGCTACCAGCCGACTC-3′

4/54

TAT-reverse

5′-AGCCCGTAGATTGGGAAACACG-3′

3/54

ß-Actin-forward

5′-TGTATGTTGCCATCCAGGCCG-3′

55

ß-Actin-reverse

5′-AGCATGGGGAAGCGCATAACC-3′

55

 

  • نتایج

پارامترهای رشدی گیاه بادرنجبویه

جدول 2، مقادیر محاسبه شده صفات رشدی تحت تاثیر دو غلظت تیمار نانوذره اکسیدروی را بر وزن تر و خشک برگ، اندام هوایی و ریشه و هم‌چنین طول اندام هوایی و ریشه نشان می‌دهد. همان‌طور که در نتایج نیز دیده می‌شود هیچ‌کدام از غلظت‌های این تیمار تغییر معنی‌داری (05/0p≤) در مقایسه با شاهد در وزن تر و خشک برگ، اندام هوایی و ریشه ایجاد نکرد. هم‌چنین در طول اندام هوایی نیز تغییر معنی‌داری (05/0p≤) نسبت به شاهد مشاهده نشد اما هر دو غلظت تیمار نانواکسیدروی باعث افزایش معنی‌دار طول ریشه نسبت به شاهد شدند (05/0p≤).

 

جدول 2. مقادیر محاسبه شده صفات رشدی

نوع تیمار

غلظت تیمار (mg/l)

برگ

اندام هوایی

ریشه

وزن تر

(mg)

وزن خشک

(mg)

وزن تر

(mg)

وزن خشک

(mg)

طول

(mm)

وزن تر

(mg)

وزن خشک

(mg)

طول

(mm)

شاهد

0

165/0a*

040/0a

757/4a

831/0a

167/22a

101/4abc

440/0a

500/18c

نانو اکسید­روی

06/0

165/0a

042/0a

983/4a

909/0a

833/24a

439/4abc

521/0a

333/27ab

12/0

182/0a

048/0a

300/6a

314/1a

500/22a

305/6ab

839/0a

833/26ab

 

 

 

 

 

 

 

رنگیزه­های فتوسنتزی

رنگیزه­هایی که در این تحقیق مورد بررسی قرار گرفتند شامل کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کاروتنوئید می­باشند.غلظت 06/0 میلی­گرم در لیتر روی تغییر معنی­داری را نسبت به شاهد ایجاد نکرده است، درصورتی‌که استفاده از تیمار 12/0 میلی­گرم در لیتر نانوروی موجب افزایش معنی­دار مقدار کلروفیل a در مقایسه با شاهد و غلظت 06/0 میلی­گرم در لیتر روی شده است. دو غلظت نانوروی به‌کار رفته نیز نسبت به شاهد و یک‌دیگر افزایش معنی­داری را نشان داده است. تیمارهای نانوروی استفاده شده نیز موجب افزایش معنی­دار در مقدار کلروفیل کل در مقایسه با شاهد شده است (شکل 1).

در مورد میزان کاروتنوئید نیز نتایج نشان داد که غلظت 06/0 میلی­گرم در لیتر نانوروی تغییری در مقایسه با شاهد را نشان نداده است، درصورتی‌که غلظت 12/0 میلی­گرم در لیتر نانوروی افزایش معنی­دار در محتوای کاروتنوئید را نشان داده است (شکل 2د).

محتوای پروتئین، فعالیت آنزیم­های کاتالاز و پراکسیداز

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که هر دو غلظت تیمار نانوروی مورد استفاده در این مطالعه، موجب ایجاد افزایش معنی­دار در محتوای پروتئینی بادرنجبویه نسبت به شاهد و یک‌دیگر شدند (05/0p≤). در مورد آنزیم کاتالاز نیز تغییرات مشاهده شده به‌این صورت بود که تیمار اول نانوروی با غلظت 06/0 میلی­گرم در لیتر در مقایسه با شاهد تفاوت معنی­داری (05/0p≤) ایجاد نکرد ولی با افزایش غلظت نانوذره اکسید­روی استفاده شده، بر میزان فعالیت آنزیم کاتالاز افزوده شد به‌طوری‌که هم با گروه شاهد هم با غلطت اولیه نانوذره اکسید­روی تفاوت معنی­داری نشان داد (05/0p≤). در مورد آنزیم پراکسیداز نیز نتایج نشان داد که هر دو غلظت تیمار نانو­اکسید­روی باعث افزایش معنی­دار میزان فعالیت آنزیم نسبت به شاهد و یک‌دیگر شدند (05/0p≤) (شکل 2).

محتوای پرولین و گلایسین بتائین

همان‌طور که در شکل 3 نیز مشاهده می شود، هر دو غلظت تیمار نانوروی موجب افزایش معنی­دار مقدار پرولین و گلایسین بتائین نسبت به شاهد و یکدی‌گر شده­اند (05/0P ≤).

محتوای رزمارینی­ اسید

مطابق شکل 3 ج، تیمار اول نانوروی در مقایسه با شاهد تغییر معنی­داری را نشان نداده است (05/0p≤)، درصورتی‌که تیمار دوم آن (دارای غلظت نانو روی معادل 12/0 میلی­گرم در لیتر) افزایش معنی­داری را هم نسبت به تیمار اول و هم نسبت به شاهد نشان داده است (05/0p≤).

میزان بیان ژن­های TAT و 4Cl

همان‌طور که در نتایج نیز قابل مشاهده است (شکل 4)، تیمار با غلظت 06/0 میلی­گرم در لیتر نانوذره اکسید­روی تغییر معنی‌داری (05/0p≤) در بیان ژن TAT نسبت به شاهد ایجاد نکرد، اما در غلظت بالاتر یعنی 12/0 میلی­گرم در لیتر افزایش معنی­داری (05/0p≤) هم نسبت به شاهد و هم نسبت به غلظت 06/0 میلی­گرم در لیتر ایجاد شد. اما در مورد ژن 4-Cl هر دو غلظت تیمار باعث افزایش معنی­دار (05/0p≤) بیان ژن نسبت به شاهد و یک‌دیگر شدند.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

الف

شکل 1. الف) مقادیر کلروفیل a، ب) مقادیر کلروفیل b، ج) مقادیر کلروفیل کل و د) مقادیر کلروفیل کل تحت تاثیر تیمارهای نانوروی. حروف متفاوت نشان دهنده اختلاف معنی­دار (05/0p≤) می­باشد. هر داده میانگین سه تکرار می­باشد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2. الف) مقادیر پروتئین، ب) فعالیت آنزیم کاتالاز و ج) فعالیت آنزیم پراکسیداز تحت تاثیر تیمارهای نانواکسیدروی. حروف متفاوت نشان‌دهنده اختلاف معنی­دار (05/0p) می­باشد. هر داده میانگین سه تکرار می­باشد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 3. الف) میزان پرولین، ب) میزان گلایسین بتائین و ج) میزان رزمارینیک‌اسید تحت تاثیر تیمارهای نانواکسیدروی. حروف متفاوت نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار (05/0p≤) می‌باشد. هر داده میانگین سه تکرار می‌باشد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 4: میزان بیان ژن. تحت تاثیر تیمارهای نانواکسیدروی. حروف متفاوت نشان­دهنده اختلاف معنی­دار (05/0p≤) می­باشد. هر داده میانگین سه تکرار می­باشد.

  • بحث

امروزه استفاده از نانوذرات در کلیه عرصه‌های علمی ازجمله بخش‌های مختلف کشاورزی در حال‌ گسترش است، در سال‌های اخیر نحوه تاثیر تغذیه عناصر مورد نیاز با شکل نانوذرات بر رشدونمو گیاهان مورد توجه قرار گرفته و نتایج مثبتی در این رابطه گزارش شده است. در این پژوهش از تیمار نانوذره اکسیدروی به‌عنوان یک محرک غیرزیستی بر مسیر بیوسنتزی رزمارینیک‌اسید در گیاه بادرنجبویه استفاده شد و هم‌چنین تاثیر آن بر پارامترهای رشدی و فیزیولوژیکی گیاه مورد بررسی قرار گرفت.

تاثیر فلزات سنگین مختلف برروی فاکتورهای رشد گیاهان بسیار متنوع است و این اثر به‌گونه گیاهی، ژنوتیپ و نوع بافت گیاهی بستگی دارد. بنابراین صفات رشدی پارامترهای بسیار حساسی هستند که شاخصی برای اندازه‌گیری پاسخ گیاهان در برابر سمیت فلزات سنگین مختلفند به‌طوری‌که می‌توانند در برخی غلظت‌ها موجب افزایش و در غلظت‌های بالاتر موجب کاهش شوند (19، 20). روی به‌عنوان یک ماده مغذی در گیاه عمل می‌کند، اما در غلظت‌های بالاتر سمی است. سمیت روی در گیاهان با مهار رشد و کاهش تولید زیست توده به‌وضوح قابل مشاهده است. سمیت شدید نیز می‌تواند کشنده باشد. سمیت روی ممکن است نتیجه برهم‌کنش‌های پیچیده یون‌های سمی اصلی مانند کادمیوم، مس و سرب با کلسیم، منیزیم، آهن و فسفر و سایر عوامل محیطی باشد. مسمومیت روی تقریبا به‌طور قطع با متابولیسم از طریق رقابت برای جذب، غیرفعال کردن آنزیم‌ها و جابجایی عناصر ضروری از مکان‌های عملکردی درگیر می‌باشد. به‌طور کلی، سمیت روی باعث کوتاه‌ شدن ساقه، پیچ خوردن و غلتیده شدن برگ‌های جوان، مرگ نوک برگ‌ها، کلروز و در برخی موارد مهار انتقال آهن می‌شود. مطالعات متعددی از اثرات غلظت‌های مختلف این تیمار برروی گیاهان متنوع انجام شده است و نشان داده است که سمیت روی در گیاهان مختلف متفاوت است و به pH نیز بستگی دارد، اما به‌طور کلی مرگ‌ومیر سلول‌ها همراه با افزایش غلظت روی (7-10 تا 4-10 مولار) و افزایش زمان تیماردهی (روز دوم تا دوازدهم) افزایش می‌یابد. ازآن‌جمله می‌توان به گیاهچه‌های Typha latifolia اشاره کرد که در حضور غلظت‌های حدود 80 میکرومولار روی دچار کلروز شدند و یا کلروز برگی که روی گیاهچه‌های Thlaspi ochroleucum تیمار شده با 1 میلی مولار روی پس از 4 روز کشت ظاهر شد (21). در این پژوهش، نتایج پارامترهای رشدی نشان دادند که تحت تاثیر دو غلظت تیمار نانوذره اکسید‌روی وزن خشک و تر برگ، اندام هوایی و ریشه تغییر معنی‌داری نسبت به شاهد نشان نداده است، البته غلظت بالاتر باعث افزایش این پارامترها شد ولی این افزایش معنی‌دار نبود. هم‌چنین طول اندام هوایی نیز در اثر تیمار اکسیدروی نسبت به شاهد تغییر معنی‌داری نشان نداد اما طول ریشه نسبت به شاهد افزایش معنی‌داری داشت. در مطالعه‌ای برروی گیاه یونجه نیز طی گزارش رمضانی و همکاران (1393) استفاده از نانوذرات روی باعث افزایش معنی‎دار وزن خشک گیاهچه‌های یونجه در مقایسه با شاهد شد. همچنین طول شاخساره نیز با استفاده از نانوذرات روی نسبت به شاهد افزایش معنی‌داری نشان داد (22). در گزارش دیگری Hassanpour و همکاران در سال 2019 اثر محلول پاشی نانوآهن (با غلظت‌های 0، 75 ، 150 و 225 میلی‌مولار) و نانوروی (0 و 3 میلی‌گرم بر لیتر) را بر عملکرد و ویژگی‌های فیزیولوژیکی گیاه Rosmarinus officinalis در یک سیستم کشت بدون خاک باز مورد بررسی قرار دادند و نتایج نشان داد که هر دو تیمارهای نانوآهن و نانوروی باعث افزایش رشد گیاه می‌شود (23). ازجمله دلایلی که برای این افزایش در رشد و طویل شدن سلول‌ها قابل ذکر است این است که نانوذرات می‌توانند توزیع هورمون و سازمان‌دهی میکروتوبول‌ها را در جهت تسریع رشد و تقسیم سلولی تحت تاثیر قرار دهند. هم‌چنین نانوذرات می‌توانند با ایجاد پروتئین‌های حامل، ازطریق آکواپورین‌ها و کانال‌های یونی به‌وسیله ایجاد منفذهای جدید وارد سلول‌های گیاهی شوند و منجر به اصلاح بیان ژن گیاه و مسیرهای بیولوژیکی مرتبط شده و درنهایت باعث افزایش بازدهی و عمل‌کرد، بهبود سیستم‌های رشدی محصول و بهبود کیفیت در بسیاری از گیاهان شوند (24).

تیمارهای نانوذره اکسید‌روی استفاده شده نیز موجب افزایش معنی‌دار در مقدار کلروفیلa، b و کلروفیل کل و هم‌چنین میزان کاروتنوئیدها در مقایسه با شاهد شده است. کلروفیل‌ها نقش بسیار مهمی در فرآیندهای رشدی گیاهان ایفا می‌کنند. بیوسنتز و تخریب این رنگیزه‌ها تحت مسیرهای پیچیده سلولی و مولکولی است که توسط فاکتورهای مختلفی تنظیم می‌شوند. این افزایش میزان کلروفیل در مطالعات قبلی نیز مشاهده شده است که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد. در سال 2014، هلالی و همکارانش برروی تیمار گیاهان موز با نانوذرات روی و اکسیدروی مطالعه‌ای انجام دادند و نتایج آن‌ها نشان داد که این تیمار باعث افزایش کلروفیل کل و نسبت کلروفیل a/bنسبت به شاهد شد. این دو فاکتور که با کاربرد تیمار نانوذرات تحت تاثیر قرار گرفته بودند، بیش‌ترین میزان توسعه کامل سلول‌های بازسازی شده در شرایط درون شیشه‌ای را به‌خود اختصاص دادند. در این مطالعه علت افزایش نسبت کلروفیل a/b را افزایش میزان فتوسیستم I و فتوسیستم II بیان کردند که منجر به افزایش میزان فتوسنتز در شرایط استرس می‌شود (25). هم‌چنین در مطالعه دیگری Vankhadeh در سال 2002 نشان داد که محتوای کلروفیل برگ و وزن خشک گیاه در تیمارهای حاوی نانو ذرات روی افزایش می‌یابند (26). کارتنوئیدها نیز ترکیبات تتراترپنی می‌باشند که وظیفه حفظ کلروفیل از اکسیداسیون نوری، جذب نور و انتقال انرژی به کلروفیل a را برعهده دارند. هم‌چنین به‌عنوان حامی رنگیزه‌های غیرفتوسنتزی شناخته شده‌اند که می‌توانند انرژی اضافی طول موج‌های کوتاه را بگیرند و اکسیژن تکی را به اکسیژن سه‌تایی تبدیل کرده و با گرفتن رادیکال‌های اکسیژن تولید شده، نقش آنتی‌اکسیدانتی از خود بروز دهند (27). افزایش در میزان کاروتنوئیدها در مقاله ثریا و همکاران در سال 1398 نیز گزارش شده است. این محققان تاثیر نانوذره روی را بر میزان فعالیت‌های آنتی‌اکسیدانت گیاهچه‌های بادرنجبویه بررسی کرده و افزایش در میزان کاروتنوئیدها را در پاسخ به غلظت‌های 25، 50 و 75 میلی‌گرم بر لیتر نانوذره روی اعلام داشتند (28).

در این تحقیق مشاهده شده که نانوذره اکسیدروی منجر به افزایش پروتئین و فعالیت آنزیم‌های کاتالاز و پراکسیداز در گیاه بادرنجبویه شده است که این به‌دلیل فعال شدن مکانیسم‌های دفاعی گیاه در برابر تنش فلز سنگین می‌باشد. این پاسخ افزایشی در کابرد دیگر نانوذرات نیز مشاهده شده است و با نتایج این تحقیق مطابق است. در گزارشی شاه‌ولی‌بر و اسماعیل زاده (1396) اثرات نانوذرات نقره را بر رشد و شاخص‌های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه بادرنجبویه سنجیدند و افزایش میان پروتئین را گزارش کردند (29). هم‌چنین با نتایج Krishnaraj و همکاران (2012) که برروی اثرات نانوذرات‌نقره روی گونه Bacopa monnieri مطالعه کرده و گزارش کردند که میزان پروتئین افزایش نشان داده است، مطابقت دارد (30). علاوه‌براین   Anusuyaو همکاران (2016) گزارش دادند که نانوذرات نقره-کیتوزان به‌طور قابل‌توجهی میزان پروتئین کل را در گیاهچه نخود افزایش می‌دهد (31). هم‌چنین در مطالعه دیگری Sharma و همکاران در سال 2012 برروی اثرات نانوذرات نقره برروی رشد و خواص فیزیکوشیمیایی گیاه Brassica juncea مطالعه کردند و گزارش دادند که نانوذرات نقره باعث افزایش فعالیت آنزیم‌هایی آنتی‌اکسیدانتی ازجمله کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز شده است.آن‌ها بیان داشتند که این افزایش مشاهده شده در فعالیت‌های آنزیمی یکی از مکانیسم‌های اصلی حفاظت در مقابل تولید ROS می‌باشد. این تغییرات فعالیت آنزیم‌ها بسته به غلظت، نوع نانوذره و مدت زمانی که تحت تاثیر قرار می‌گیرد و هم‌چنین نوع گیاه متنوع است (32).

نتایج سنجش میزان پرولین در حضور تیمار نانوذره اکسیدروی نیز نشان داد که در هر دو غلظت تیمار میزان پرولین به‌طور معنی‌داری افزایش یافته است. پرولین با افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیداتیو، و با حذف فعالیت اکسیژن واکنش پذیر (ROS)، مقاومت گیاه به استرس اکسیداتیو را افزایش می‌دهد، بنابراین باعث حفظ فعالیت ردوکس می‌شود (33). این نتایج مطابق است با گزارش Karimi و Mohsenzadeh که در سال 2017 مطالعه‌ای روی گیاه گندم انجام دادند و اعلام کردند که میزان پرولین در گیاه گندم تحت تاثیر نانوذرات‌نقره با افزایش غلظت در مقایسه با شاهد به‌طور معنی‌داری افزایش یافته است و حداکثر افزایش در غلظت 100 میلی‌گرم بر لیتر بوده است (34). بنابراین به‌نظر می‌رسد در گیاه میزان پرولین به‌عنوان یک مکانیسم دفاعی در برابر استرس اکسیداتیو عمل می‌کند و با افزایش غلظت نانوذره‌نقره، افزایش می‌یابد.

میزان گلایسین بتائین نیز تحت هر دو غلظت تیمار نانواکسیدروی افزایش معنی‌داری نسبت به شاهد نشان داد. این نتایج مطابق است با گزارش‌های غیرزیستی تشکیل می‌شود (35). این مولکول نه‌تنها به‌عنوان یک اسمولیت برای تنظیم اسمزی عمل می‌کند، بلکه به‌عنوان یک ترکیب با دو حوزه آب‌گریز و آب‌دوست می‌تواند با کمپلکس‌های پروتئینی و غشاها تعامل داشته باشد. این امر به تثبیت و حفظ یک‌پارچگی ساختاری و عمل‌کردی آن‌ها کمک می‌کند و باعث حفظ آن‌ها در برابر اثرات مضر گونه‌های فعال اکسیژن بسیار واکنش‌پذیر (ROS) می‌شود (36، 37 و 38). علاوه‌براین، می‌تواند پایداری ترمودینامیکی ماکرومولکول‌ها را حفظ کند، و پیچ‌خوردگی‌های نادرست و/یا تجمع پروتئین را بدون آسیب رساندن به فعالیت‌های عمل‌کردی بومی آن‌ها برطرف کند (39). هنگامی‌که گلایسین بتائین در سطوح بالا وجود دارد، همراه با پرولین، در محافظت از گیاهان در برابر استرس اکسیداتیو بسیار کارآمد است (40 و 41). هم‌چنین این افزایش در میزان گلایسین بتائین با گزارش دیگری نیز که توسط Jahani و همکاران در سال 2019 انجام شد مطابق است. آن‌ها به بررسی اثرات نانوذرات اکسیدسریوم بر پارامترهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه همیشه بهار (Calendula officinalis L) پرداختند و افزایش میزان گلایسین بتائین را گزارش کردند (42).

رزمارینیک‌اسید از دسته متابولیت‌های ثانویه از گروه فلاونوئیدها جزو اسیدهای فنولیک می‌باشد. این ترکیب برای گیاه اهمیت دفاعی داشته و در شرایط نامساعد ازقبیل استرس‌های محیطی و حمله پاتوژن‌ها بیوسنتز آن افزایش می‌یابد. هنگامی که سلول‌های گیاه در معرض تنش‌های غیرزیستی و زیستی مانند تیماردهی با محرک‌ها قرار می‌گیرند، سیگنالی دریافت شده توسط گیرنده‌های غشا یک سیگنال هدایت شبکه‌ای ایجاد می‌کند که بیان ژن‌های درگیر در بیوسنتز متابولیت‌های ثانویه گیاهی و به‌علاوه آنزیم‌های کلیدی که بیوسنتز متابولیت‌های ثانویه هدف را کاتالیز می‌کنند، تنظیم می‌نمایند. استفاده از نانوذرات نیز به‌طور موثری باعث افزایش بیوسنتز ترکیبات دارویی با ارزش می‌شد (قربانپور و هادیان، 2015). در غلظت‌های بالای نانوذرات که گیاهان دچار تنش می‌شوند درصد اسانس اکثر گیاهان دارویی افزایش می‌یابد، چون در مواقع تنش متابولیت‌های بیش‌تری تولید شده و این مواد به‌عنوان آنتی‌اکسیدانت باعث جلوگیری از عمل اکسیداسیون در سلول می‌شوند (43). البته این اثرات بسته به مقدار و نوع ترکیب تیمار ممکن است پاسخ‌های متنوعی ایجاد کند (44).

متابولیت‌های ثانویه در گیاهان به سازگاری و ارتباط گیاه کمک می‌کنند. بااین‌حال، تعدیل متابولیسم ثانویه گیاهان در پاسخ به نانوذرات هنوز مبهم است. بیان ژن‌های مختلف در ارتباط مستقیم با سیستم آنتی‌اکسیدانتی (45 و 46) و فتوسنتز (47) است و در گونه‌های مختلف گیاهی در پاسخ به قرارگرفتن در معرض نانوذره اکسیدروی تغییر می‌کند. نتایج پژوهش حاضر نشان داد که غلظت 06/0 میلی‌گرم در لیتر تیمار نانوذره اکسیدروی باعث افزایش بیان ژن TAT نسبت به شاهد شد. البته در مورد ژن 4-Cl این افزایش در هر دو غلظت رخ داد. نتایج این پژوهش هم‌چنین با یافته‌های Xun و همکاران (2017) سازگار است که افزایش بیان ژن‌ها در ریشه‌های در معرض نانوذره اکسیدروی گزارش کرده است (48). هم‌چنین در تحقیق دیگری Babajani و همکارانش (2019) اثرات به نانوذرات اکسیدروی (0، 100 و 300 میلی‌گرم در لیتر) را بر گیاه بادرنجبویه مطالعه کردند و گزارش کردند که قرارگرفتن در معرض نانوذره اکسیدروی به‌شدت بیان ژن رزمارینیک‌اسید سنتاز (RAS) و ژن‌های هیدروکسی فنیل‌پیروات‌ردوکتاز (HPPR) را افزایش داد (49).

 

5- نتیجه­گیری

همان‌طورکه در مطالعات گذشته نیز بیان شده است محرک­های غیر­زیستی یکی از روش­های کارآمد جهت افزایش متابولیت‌های ثانویه در گیاهان مختلف است. در این مطالعه از غلظت­های مختلف نانو­اکسید ­روی برای افزایش متابولیت­های ثانویه استفاده شد. هم‌چنین جزئیات اثر این نانوذره بر خصوصیات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاهچه­های بادرنجبویه مورد بررسی قرار گرفت. مشاهدات تجربی نشان داد که نانوذرات می­توانند در غلظت­های پایین به‌طور قابل­توجهی باعث افزایش پارامترهای رشد و پرآوری و هم‌چنین پارامترهای بیوشیمیایی مثل شاخص‌های فتوسنتزی، میزان پرولین و گلایسین بتائین و افزایش آنزیم­های آنتی­اکسیدانتی شوند. نانوذره اکسیدروی با مکانیسم­های خاصی ازجمله افزایش جذب آب و املاح، باعث افزایش رشد و طویل شدن سلول­ها و هم‌چنین بهبود فعالیت سلول­های گیاهی می­شود. به‌دنبال افزایش رشد سلول­ها و افزایش سرعت متابولیسم در آن­ها، متابولیت­های تولیدی توسط سلول‌ها نیز با سرعت بیش‌تری افزایش پیدا می­کنند. هم‌چنین این نانوذره با اثر­گذاری بر سیستم دفاعی گیاه باعث تحریک افزایش بیان برخی آنزیم­های بیوسنتزی ترکیبات ثانویه شده و آن­ها را افزایش می­دهد.

 

6- تشکر وقدردانی

نویسندگان این مقاله از معاونت پژوهشی دانشگاه دامغان به‌لحاظ تامین امکانات لازم جهت انجام این تحقیق تشکر و قدردانی می‌نمایند.

-

  1. Awad R, Muhammad A, Durst T, Trudeau VL, et al. Bioassay‐guided fractionation of lemon balm (Melissa officinalis L.) using an in vitro measure of GABA transaminase activity. Phytotherapy Research: An International Journal Devoted to Pharmacological and Toxicological Evaluation of Natural Product Derivatives. 2009;23(8):1075-1081.
  2. Petersen M, Simmonds MSJ. Rosmarinic acid. Phytochemistry. 2003; 62(2):121-5.
  3. Shah V, Belozerova I. Influence of metal nanoparticles on the soil microbial community and germination of lettuce seeds. Water, Air, and Soil Pollution. 2009;197(1): 143-148.
  4. Aminizadeh M, Riahi-Madvar A, Mohammadi M. Nano-Metal Oxides Induced Sulforaphane Production and Peroxidase Activity in Seedlings of Lepidium draba (Brassicaceae). Progress in Biological Sciences. 2016;6(1):75-83.
  5. Ghanati F, Bakhtiarian S. Effect of Methyl Jasmonate and Silver nanoparticles on Production of Secondary Metabolites by Calendula officinalis L (Asteraceae). Trop J Pharm Res. 2014;13(11):17831789.
  6. Wei C, Zhang Y, Guo J, Han B, et al. Effects of silica nanoparticles on growth and photosynthetic pigment contents of Scenedemus obliquus. Journal of Environmental Sciences. 2010;22(1):155-160.
  7. Alirezaee F, Kiarostami Kh, Hosseinzadeh Namin M. Effects of nano-silver on phenolic contents and rosemarinic acid in tissue cultured Lavandula. First national conference of Irani Biology and Natural science, Tehran. 2014.
  8. Peyvandi M, Kamali Jamakani Z, Mirza M. Comparison of nano Fe chelat with Fe chelate effect on growth parameters and antioxidant enzymes activity of Satureja hortensis. New Cellular and Molecular Biotechnology Journal. 2011;2(5):25-32.
  9. Al-Oubaidi HM, Kasid NM. Increasing (phenolyic and flavoniods compoundes of Cicer arietinum L.) from embryo explant using titanium dioxide nanoparticle in vitro. World Journal of Pharmaceutical Research. 2015;4(11):1791-1799.
  10. Homaee MB, Ehsanpour AA. Silver nanoparticles and silver ions: Oxidative stress responses and toxicity in potato (Solanum tuberosum L.) grown in vitro. Horticulture, Environment, and Biotechnology, 2016;57(6):544-553.
  11. Sand-Jensen K. Metabolic adaptation and vertical zonation of Littorella uniflora (L.) Aschers. and Isoetes lacustris L. Aquatic Botany. 1978;4:1-10.
  12. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 1976;72(1-2):248-254.
  13. Aebi H. Catalase. In Methods of enzymatic analysis (pp. 673-684). Academic press. 1974.
  14. Ranieri A, Castagna A, Pacini J, Baldan B, et al. Early production and scavenging of hydrogen peroxide in the apoplast of sunflower plants exposed to ozone. J Experi Botany. 2003;54(392):2529-2540.
  15. Nasiri-Bezenjani MA, Riahi-Madvar A, Baghizadeh A, Ahmadi AR. Rosmarinic acid production and expression of tyrosine aminotransferase gene in Melissa officinalis seedlings in response to yeast extract. J Agr Sci Tech. 2014;16:921-930.
  16. Irigoyen JJ, Einerich DW, Sánchez‐Díaz M. Water stress induced changes in concentrations of proline and total soluble sugars in nodulated alfalfa (Medicago sativa) plants. Physiologia plantarum. 1992;84(1):55-60.
  17. Grieve CM, Grattan SR. Rapid assay for determination of water-soluble quaternary ammonium compounds. Plant and soil. 1983;70(2):303-307.
  18. Doring AS, Pellegrini E, Della Batola M, Nali C, et al. How do background ozone concentrations affect the biosynthesis of rosmarinic acid in Melissa officinalis? Journal of plant physiology. 2014;171(5):35-41.
  19. Imtiaz M, Tu S, Xie Z, Han D, et al. Growth, V. uptake, and antioxidant enzymes responses of chickpea (Cicer arietinum L.) genotypes under vanadium stress. Plant and Soil. 2015; 390(1): 17-27.
  20. Mondal NK, Chittaranjan D, Satinath R, Datta JK, et al. Effect of varying cadmium stress on chickpea (Cicer arietinum L.) seedlings: an ultrastructural study. Annals of Environmental Science. 2013;7:59-70.
  21. Gyana Rout, Premananda Das. Effect of Metal Toxicity on Plant Growth and Metabolism: I. Zinc. Agronomie, EDP Sciences, 2003;23(1):3-11.
  22. Ramezani F, Shayanfar A, Afshari RT, Rezaee K. Effects of silver, nickel, zinc and zinc-copper nanoparticles on germination, seedling establishment and enzyme activity of alfalfa (Medicago sativa) seed. Iranian Journal of Field Crop Science. 2014;45(1).
  23. Hassanpouraghdam MB, Mehrabani LV, Tzortzakis N. Foliar application of nano-zinc and iron affects physiological attributes of Rosmarinus officinalis and quietens NaCl salinity depression. Journal of Soil Science and Plant Nutrition. 2020;20(2):335-345.
  24. Aslani F, Bagheri S, Muhd Julkapli N, Juraimi AS, et al. Effects of engineered nanomaterials on plants growth: an overview. Scientific World Journal. 2014; 2014:641759.
  25. Helaly MN, El-Metwally MA, El-Hoseiny H, Omar SA, et al. Effect of nanoparticles on biological contamination of 'in vitro' cultures and organogenic regeneration of banana. Australian Journal of Crop Science. 2014;8(4):612-624.
  26. Vankhadeh S. Response of sunflower to applied Zn, Fe, P, N. nes. S. zz. 2002;1:143-5.
  27. Pandey Renu. Mineral nutrition of plants. Plant biology and biotechnology. Springer, New Delhi, 2015;499-538.
  28. Soraya E, Gohari GhR, Motalebi Azad AR, Alizadeh saleteh S. Nano-zinc effects on Melissa officinalis in vitro sterilization and establishment states. Environmental Physiology. 2019;15(60):48-60.
  29. Shavalibor A, Esmailzadeh Bahabadi S. The effect of silver nanoparticles synthesized by biological method on growth, physiological and biochemical properties of Melissa officinalis L. Plant procedure and application. 2018;8(32):19-34.
  30. Krishnaraj C, Jagan EG, Ramachandran R, Abirami SM, et al. Effect of biologically synthesized silver nanoparticles on Bacopa monnieri (Linn.) Wettst. plant growth metabolism. Process biochemistry. 2012;47(4):651-658.
  31. Anusuya S, Muthamilan M, Revathy N, Ananthan M. Prevalence, symptomatology, pathogenicity and nutritional requirements of Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli causing Fusarium yellows of French bean in Thandikudi. International Journal of Plant Sciences (Muzaffarnagar). 2016;11(2):161-166.
  32. Sharma P, Bhatt D, Zaidi MGH, Saradhi PP, et al. Silver nanoparticle-mediated enhancement in growth and antioxidant status of Brassica juncea. Applied biochemistry and biotechnology. 2012;167(8):2225-2233.
  33. Matysik J, Alia BB, Mohanty P.  Molecular mechanisms of quenching of reactive oxygen species by proline under stress in plants. Current Science. 2002;82:525–32.  
  34. Karimi J, Mohsenzadeh S. Physiological effects of silver nanoparticles and silver nitrate toxicity in Triticum aestivum. Iranian Journal of Science and Technology, Transactions A: Science. 2017;41(1):111-120.
  35. Jain P, Pandey B, Singh P, Singh R, et al. Plant Performance and Defensive Role of Glycine Betaine Under Environmental Stress. In Plant Performance Under Environmental Stress. Springer, Cham. 2021;225-248.
  36. Islam MS, Yoshida H, Matsuki N, Ono K, et al. Antioxidant, free radical–scavenging, and NF-κB–inhibitory activities of phytosteryl ferulates: structure–activity studies. Journal of pharmacological sciences. 2009;111(4):328-337.
  37. Banu MNA, Hoque MA, Watanabe-Sugimoto M, Islam MM, et al. Proline and glycinebetaine ameliorated NaCl stress via scavenging of hydrogen peroxide and methylglyoxal but not superoxide or nitric oxide in tobacco cultured cells. Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 2010;74(10):2043-249.
  38. Gupta B, Huang B. Mechanism of salinity tolerance in plants: physiological, biochemical, and molecular characterization. International journal of genomics. 2014; 2014:701596.
  39. Khan A, Ahmad A, Akhtar F, Yousuf S, et al. Ocimum sanctum essential oil and its active principles exert their antifungal activity by disrupting ergosterol biosynthesis and membrane integrity. Research in microbiology. 2010;161(10):816-823.
  40. Annunziata MG, Ciarmiello LF, Woodrow P, Dell’Aversana E, et al. Spatial and temporal profile of glycine betaine accumulation in plants under abiotic stresses. Frontiers in plant science. 2019;10(230):1-13.
  41. Woodrow CJ, White NJ. The clinical impact of artemisinin resistance in Southeast Asia and the potential for future spread. FEMS microbiology reviews. 2017;41(1):34-48.
  42. Jahani S, Saadatmand S, Mahmoodzadeh H, Khavari-Nejad RA. Effect of foliar application of cerium oxide nanoparticles on growth, photosynthetic pigments, electrolyte leakage, compatible osmolytes and antioxidant enzymes activities of Calendula officinalis L. Biologia. 2019;74(9):1063-1075.
  43. AliAbadi Farahani H. The effect of sowing date and planting density on the essential oil content and composition of Valeriana officinalis L. Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants. 2019;25(2):272-282.
  44. Rad MS, Rad JS, Heshmati GA, Miri A, et al. Biological synthesis of gold and silver nanoparticles by Nitraria schoberi fruits. American Journal of Advanced Drug Delivery. 2013;1(2):174-179.
  45. Saleh AM, Abdel-Mawgoud M, Hassan AR, Habeeb TH, et al. Global metabolic changes induced by arbuscular mycorrhizal fungi in oregano plants grown under ambient and elevated levels of atmospheric CO2. Plant Physiology and Biochemistry. 2020;151:255-263.
  46. Venkatachalam S, Ko SB. Design of power and area efficient approximate multipliers. IEEE Transactions on Very Large Scale Integration (VLSI) Systems. 2017; 25(5):1782-1786.
  47. Wang J, Lu W, Tong Y, Yang Q. Leaf morphology, photosynthetic performance, chlorophyll fluorescence, stomatal development of lettuce (Lactuca sativa L.) exposed to different ratios of red light to blue light. Frontiers in plant science. 2016;7:1-10.
  48. Xun H, Ma X, Chen J, Yang Z, et al. Zinc oxide nanoparticle exposure triggers different gene expression patterns in maize shoots and roots. Environmental Pollution. 2017; 229:479-488.
  49. Babajani A, Iranbakhsh A, Ardebili ZO, Eslami B. Differential growth, nutrition, physiology, and gene expression in Melissa officinalis mediated by zinc oxide and elemental selenium nanoparticles. Environmental Science and Pollution Research. 2019; 26(24):24430-24444.