ارزیابی ریزازدیادی گیاه دارویی در معرض خطر انقراض پونه‌سای بی‌کرک (Nepeta nuda L.)

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه فردوسی مشهد، دانشکده کشاورزی، گروه علوم باغبانی، مشهد، ایران

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی تاثیر تیمار‌های مختلفی از تنظیم­کننده­های رشد بر میزان شاخه­زایی، ریشه‌زایی، تولید کالوس و باززایی گیاه دارویی پونه‌سای بی‌کرک در شرایط درون شیشه­ای بود.
مواد و روش‌ها: بذرهای این گیاه در محیط کشت MS (موراشیگ و اسکوگ) نیم غلظت کشت و سپس گیاهچه‌ها واکشت شدند. پس‌ از آن نمونه‌ها در سطوح مختلف تنظیم­کننده­های رشد BA و Kinetin، به‌صورت منفرد یا در ترکیب با IBA کشت شدند. برگ‌های همسان جهت کالوس‌زایی با تیمارهای تنظیم­کننده­های رشدBA  و NAA در دو محیط (روشن و تاریک) استفاده شدند. همچنین جهت باززایی، کالوس‌های یکسان با تیمارهای تنظیم­کننده­های رشدBA  و NAA به‌کاربرده شدند.
نتایج: نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که در بخش پرآوری بیشترین وزن ‌تر (91/2315 میلی‌گرم) و تعداد شاخه (22/15 در هر بوته) در هر گیاهچه در تیمار 1 میلی‌گرم در لیتر BA و 25/0 میلی‌گرم در لیتر IBA حاصل شد. همچنین تیمار BA با غلظت 2 میلی‌گرم در لیتر موجب تولید طویل‌ترین شاخه (50/5 سانتی‌متر) و بیشترین تعداد گره (53/6 در هر گیاهچه) گردید. بیشترین طول، تعداد و درصد ریشه در محیط کشت MS با 2/1 غلظت نمک و IBA 5/0 میلی‌گرم در لیتر حاصل شد. در بخش کالوس‌زایی، بیشترین وزن‌ تر کالوس مربوط به کاربرد 1 میلی‌گرم در لیتر BA و 5/0 میلی‌گرم در لیتر NAA بود. علاوه بر این، بیشترین درصد کالوس‌زایی در محیط تاریک مشاهده شد و بین تیمار‌های هورمونی به‌کاربرده شده تفاوت معنی‌داری دیده نشد. همچنین، بیشترین درصد باززایی از کالوس مربوط به دو تیمار تنظیم­کننده­ رشد BA 1 میلی‌گرم در لیتر با 2/0 میلی‌گرم در لیتر NAA (2/83 درصد) و BA 1 میلی‌گرم در لیتر با 5/0 میلی‌گرم در لیتر NAA (66/81  درصد)، بدون هیچ تفاوت معنی‌داری بود.  
نتیجه‌گیری: در مجموع مفیدترین ترکیب تنظیم­کننده رشد برای ریزازدیادی گیاه در معرض خطر انقراض پونه‌سای بی‌کرک تیمار 1 میلی‌گرم در لیتر BA با 5/0 میلی‌گرم در لیتر IBA و NAA بود

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

کشت بافت ابزاری را برای تکثیر سریع تعداد زیادی از گیاهان یکنواخت، در عین حفظ ژنوتیپ آن‌ها فراهم کرده است. در مورد گیاهان دارویی، کاربرد روش‌های کشت بافت و ریزازدیادی برای به‏دست آوردن شمار زیادی گیاهان شبیه به اصل و سالم با ظرفیت تولید بالا، توسط پژوهشگران استفاده می‌شود. علاوه بر این کشت بافت گیاهی می‌تواند بستر مناسبی برای حفظ و نگه‏داری گونه‌ها و ژنوتیپ­های مادری و یا در حال انقراض طبیعت به‌منزله منابع با ارزش ژرم­پلاسم محسوب شود (1). به‌دلیل برداشت بی‌رویه و تخریب رویشگاه‌های طبیعی، بسیاری از گونه‌های دارویی و معطر وحشی تحت خطر انقراض و فرسایش قرارگرفته‌اند. تقاضای روزافزون جهانی برای این گونه‌ها، نیاز به اهلی کردن و کشت آن‌ها در سیستم‌های زراعی را افزایش داده است (2 و 3). لذا به‏نظر می‌رسد که کشت این گیاهان، در سیستم‌های زراعی بتواند به‌عنوان یک راه‌کار مهم در تأمین بازار رو به گسترش و گسترده جهانی گیاهان دارویی باشد (4). با توجه به قدمت گیاهان دارویی تاکنون در مورد اصلاح آن‌ها پیشرفت چندانی انجام ‌نشده است. طی سال‌های گذشته مواد اولیه گیاهی مورد نیاز صنایع دارویی از طبیعت برداشت ‌شده است که علاوه بر تخریب روزافزون جنگل‌ها، مراتع و فضای سبز، تولید مواد اولیه ناهمگن، همچنین امکان خطر انقراض گونه را در پی داشته است. برخی از این گیاهان زیستگاه‌های طبیعی محدودی دارند و بسته به شرایط محیطی و جغرافیایی محل رویش گیاه، جمع‌آوری آن‌ها با مشکلاتی مواجه است. از آنجاکه استفاده از گیاهان دارویی در ایران تاریخچه غنی و پرافتخاری دارد، این دانش سنتی را باید مطابق استانداردهای روز دنیا به دانشی کاربردی تبدیل کرد که جوابگوی نیازمندی‌های روز دنیا با زبان علمی و قابل‌ قبول برای مراجع پزشکی و صنعت باشد. در این راستا کشت و اهلی کردن گیاهان دارویی به‌منظور ارتقای صفات کمی و کیفی فرآورده‌های گیاهی و ایجاد ژنوتیپ­هایی با صفات مطلوب اهمیت خاصی دارد (5).

خانواده نعناعیان شامل 200 جنس و 3300 گونه بوده که اکثر گونه‌های آن دارای اسانس می‌باشند. در بین گونه‌های مختلف این خانواده گیاه نپتا به‌عنوان گیاهی دارویی با خاصیت ضدتشنج، خلط‌آور، مدر، ضد آسم، ضد سرفه، تب­بر و... بسیار حائز اهمیت می‌باشد (6). مدیترانه منشا اولیه این گیاهان است اما به‏دلیل اهمیت دارویی و اقتصادی، آن‏ها در سراسر جهان انتشار یافته­اند. در ایران تاکنون مصارف دارویی بیش از 81 گونه از خانواده نعناعیان به ثبت رسیده، که در این میان 12 گونه آن متعلق به جنس Nepeta می‌باشد. به این دلیل در طب سنتی گونه‌های مختلف این جنس به‌طور گسترده مورد استفاده قرار گرفته‌اند. در طب سنتی ایران نیز برخی از گونه‌های آن شامل: N. ispahanica،N. pungens، N.pogomosperma،N. bracteata،N. binaludensisدر درمان بیماری‌های عصبی، تنفسی و گوارشی استفاده می‌شوند (7، 8 و 9). گونه مورد مطالعه با نام علمیNepet nudaگیاهی ­است علفی، چندساله به ارتفاع 50 تا 90 سانتی­متر که زمان گلدهی آن در رویشگاه طبیعی، در دامنه­ی کوه‏ها اواخر بهار در منطقه ایرانی تورانی می­باشد. پراکندگی این گیاه در ایران، شمال غرب همچون مناطق حفاظت شده­ی ارسباران، گرمی و ارومیه است (10). بر اساس مشاهدات Kökdil و همکاران (11) بیشترین مقدار ترکیبات اسانس در این گیاه نپتالاکتون می­باشد که خواص مختلفی همچون ضدقارچی، ضد باکتریایی و ضد ویروسی به این ترکیبات نسبت داده شده است (12).

در آزمایشی Bageri و همکاران (13) از BAP، NAA و IAA جهت بهینه­سازی باززایی موثر زیره سبز استفاده کردند و نشان دادند که بیشترین فراوانی کالوس­دهی و وزن خشک توده کالوس در غلظت­های 5/0 یا 1 میلی­گرم در لیتر BAP و NAA بدست آمد. همچنین Echeverrigaray و همکاران (14) بهبود جوانه­زنی و شاخه­زایی را در محیط­های کشت حاوی بنزیل آدنین در گیاه Lavandula dentate نشان دادند. در آزمایشی Afzalifar و همکاران (15) نیز BA را به منزله مؤثرترین تنظیم­کننده رشد در پرآوری دو گونه مرزه معرفی کردند. ریزازدیادی در گونه­های گیاهی متنوعی از جمله تعداد زیادی از گیاهان دارویی شامل Catharanthus roseus، Cinchona ledgeriana، Digitalis spp.،Datura melet ، Bacopa monnieriو Chlorophytum borivilianum نتایج مطلوبی را نشان داده است (16و17).

دستیابی به‏روش مطلوب تکثیر گیاهان یکی از عوامل مهم موفقیت کشت و اصلاح آن‏ها است. تکثیر موثر با قلمه و کشت بافت می‌تواند در کلون­سازی ژنوتیپ­های مرغوب کمک کند و در کوتاه‌ مدت برای تکثیر تجاری این ژنوتیپ‌ها استفاده شود. با توجه به موارد گفته‌ شده، تاکنون مطالعه­ای برای ریزازدیادی گیاه دارویی در معرض خطر انقراض پونه‌سای بی‌کرک انجام نشده است. لذا بررسی شرایط ریزازدیادی آن ازجمله موارد امید بخش در جهت حفاظت ژنتیکی از این گونه نادر و نگه‏داری گیاه مادری و علاوه بر آن گامی موثر در جهت انجام تحقیقات اصلاحی در آینده است که در پژوهش حاضر به آن پرداخته می‌شود.

مواد و روش‌ها

به‌منظور مطالعه ریزازدیادی گیاه پونه‌سای بی­کرک، بذرها این گیاه از رویشگاه طبیعی آن در استان اردبیل جمع‌آوری و به آزمایشگاه کشت بافت دانشکده کشاورزی دانشگاه فردوسی منتقل شد. سپس مراحل ضد عفونی سطحی بذرها انجام گرفت. بذرها ابتدا به‏مدت 30 دقیقه با آب جاری و چند قطره مایع ظرف‌شویی شسته و سپس 3 بار با آب مقطر غیراستریل آبکشی شدند. ضدعفونی نهایی قبل از کشت در زیر لامینارفلوی استریل انجام گرفت. پس‌ از آن نمونه‌ها ابتدا با اتانول 70 درصد به‏مدت 60 ثانیه ضدعفونی شدند. در مرحله بعدی آن‌ها با آب مقطر استریل آبکشی شدند. بلافاصله پس ‌از این مرحله، بذرها در محلول هیپوکلریت 10 درصد حاوی 1/0 درصد محلول توئین 20 به‏مدت 10 دقیقه تیمار و سپس با آب مقطر استریل، سه مرتبه و با فواصل 5، 10 و 15 دقیقه آبکشی شدند. با هدف تولید گیاهچه‌­های عاری از آلودگی، پس از ضدعفونی بذرها، آن‌ها در محیط کشت موراشیگ و اسکوگ (18) (MS) نیم غلظت کشت شدند. به‌منظور جوانه‌­زنی بذرها، نمونه‌ها در شرایط تاریکی در دمای 1±24 درجه سانتی­گراد قرار داده شدند. پس از جوانه‌زنی و رشد گیاهچه‌­‌ها، مراحل واکشت آغاز شد. در خصوص ایجاد یکنواخت کردن کشت‌ها، بهترین گیاهچه ‌­انتخاب و واکشت‌ها بر روی آن انجام گرفت. زمان هر دوره واکشت 30 تا40 روز و محیط کشت‌ها نیز MS کامل در نظر گرفته شد. پس از به‏دست آوردن تعداد کافی ریز نمونه، مرحله بعدی ریزازدیادی (پرآوری) شروع شد. به‌منظور بررسی اثر سطوح مختلف هورمون‌های سیتوکنین و اکسین، شاخه‌های تشکیل‌شده در مرحله قبل به قطعاتی دارای دو تا سه گره برش داده شدند و سپس به تعداد 3 عدد در ویال‌های حاوی 20 میلی‌لیتر محیط کشت MS و تنظیم­کننده­های رشدBA (5/0، 1، 5/1، 2 و 5/2 میلی‌گرم در لیتر) و Kinetin (5/0 و 1 میلی‌گرم در لیتر) به‌صورت منفرد و یا در ترکیب باIBA (25/0 و 5/0 میلی‌گرم در لیتر) کشت شدند (19). 6 هفته پس از کاشت پارامترهای لازم در رابطه با وزن‌ تر گیاهچه، تعداد شاخه، طول متوسط شاخه، تعداد گره در هر شاخه و طول بلندترین شاخه ثبت شد. داده‌ها در قالب طرح کاملا تصادفی با 5 تکرار پی‌ریزی شدند. پس از به‏دست آوردن تعداد زیادی نمونه، مرحله ریشه‌زایی شروع شد. پیش ­تیمار ریشه‌زایی به‌منظور حذف آثار بازدارنده سیتوکنین بر ریشه­دهی و یکنواخت کردن نسبی محتوای هورمونی، صورت گرفت. بدین‏منظور شاخه‌های تشکیل‌ شده در مرحله تکثیر به قطعاتی با طول تقریبی دو تا سه گره برش داده و سپس به‏مدت 30 روز در محیط کشت MS فاقد تنظیم­کننده­ رشد، کشت شدند. پس از طی این مدت برای بررسی ریشه‌زایی ریز نمونه‌ها، آن‌ها در محیط‌های کشت 4/1، 2/1 و غلظت کامل محیط کشت حاوی تنظیم­کننده رشدIBA (25/0 و 5/0میلی‌گرم در لیتر) و نیز محیط کشت فاقد هورمون (شاهد)، کشت شدند. چهار هفته پس از کاشت پارامترهای لازم از قبیل درصد ریشه‌زایی، تعداد و طول ریشه‌ها، ثبت شد. تیمارها شامل 3 غلظت محیط کشت و 3 غلظت مختلف تنظیم­کننده رشد IBA بودند که در قالب طرح کاملا تصادفی با 5 تکرار که در هر تکرار 5 ریز نمونه کشت‌شده بود، مقایسه شدند.

در مرحله بعد ریزنمونه‌های حاصل از گیاهچه‌های تولیدشده در محیط کشت، به‌منظور بررسی اثر تنظیم­کننده­های رشد مختلف در دو محیط (تاریکی و روشنایی) بر کالوس‌زایی پونه­سای بی‌کرک مورد استفاده قرار گرفتند. در این بررسی اثر تنظیم­کننده‏های رشد BA (5/0، 1 و 5/1 میلی‌گرم در لیتر) و NAA (2/0 و 5/0 میلی‌گرم در لیتر) مورد بررسی قرار گرفت. ریز نمونه­های برگی، به­دلیل شرایط کاملا سترون درون ویال­ها به گندزدایی نیازی نداشته و در زیر هود با اندازه­های یکسان (تقریبا 1×1سانتی­متر) از قسمت میانی برگ برای کشت مورد استفاده قرار گرفتند. همچنین جهت باززایی غیرمستقیم، از کالوس‌های یکسان با تیمار تنظیم­کننده­های رشد BA (1 و 5/1 میلی‌گرم در لیتر) و NAA (2/0 و 5/0 میلی‌گرم در لیتر) در محیط کشت MS استفاده شد. این قسمت شامل 5 تکرار بود که در هر تکرار 3 نمونه قرار داشت.

مرحله سازگاری با هدف انتقال گیاهچه‌های ریشه‌دار شده از محیط کشت مصنوعی به خاک و سازگار کردن آن‌ها با شرایط طبیعی محیط انجام شد. بدین منظور گیاهچه‌های ریشه‌دار شده در محیط کشت خود و در ویال‌هایی که درب آن‌ها نیمه باز نگه ‌داشته شده بودند، به‏مدت 6 هفته در اتاقک رشد و در شرایط دمایی 2±24 درجه سانتی­گراد و فتوپریود 16 ساعت روشنایی (با شدت ‌جریان فتون فتوسنتزی PPFD=40μ mol m-2s-1)، نگه‏داری شدند. سپس گیاهچه‌های ریشه‌دار شده از محیط‌های کشت با احتیاط و به کمک پنس خارج‌شده و پس از شست‌وشوی آرام ریشه‌ها با جریان آب و حذف آگار، به‌صورت مستقیم در مخلوطی از خاک، خاک پیت و ماسه با نسبت وزنی، 1:1:1، در گلخانه نگه‏داری شدند. آبیاری به‌صورت روزانه انجام گرفت. پس از 2 ماه، درصد بقای گیاهچه­ها ثبت شد.

داده‌های حاصل از هر آزمایش بر اساس طرح آماری استفاده‌ شده، با استفاده از نرم‌افزار JMP8 تجزیه ‌و تحلیل شدند و مقایسه‌ی میانگین‌ها با استفاده از آزمون LSD در سطح احتمال 5 درصد صورت گرفت. رسم اشکال و برخی محاسبات با استفاده از نرم‌افزار Excel 2003 انجام گرفت.

نتایج

نتایج به‌دست‌آمده از این تحقیق حاکی از آن بود که اعمال تیمارها در 11 شاخص مورد ارزیابی شامل وزن ‌تر گیاهچه، تعداد شاخه، ارتفاع متوسط، ارتفاع بلندترین شاخه، تعداد گره، طول ریشه، تعداد ریشه، درصد ریشه‌زایی، وزن‌ تر کالوس، درصد کالوس‌زایی و درصد باززایی دارای تفاوت معنی‌داری (01/0p≤) بودند (جدول 1و2).

 

جدول 1: تجزیه واریانس تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد بر نرخ شاخه­زایی گیاه دارویی پونه‌سای بی‌کرک (Nepeta nuda L.)

منابع تغییرات

درجه آزادی

میانگین مربعات

وزن‌ تر گیاهچه

تعداد شاخه

ارتفاع متوسط

ارتفاع بلندترین شاخه

تعداد گره

تنظیم­کننده رشد

20

**948033

**9476/31

**44783/1

**61812/4

**41513/3

خطا

84

9682

2056/0

03415/0

16833/0

11684/0

* ،** و ns: به‏ترتیب معنی­داری در سطح احتمال 1 و 5 درصد و عدم اختلاف معنی­دار را نشان می­دهد.

جدول2: تجزیه واریانس تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد بر نرخ ریشه‌زایی، کالوس‌زایی و باززایی گیاه دارویی پونه‌سای بی‌کرک (Nepeta nuda L.)

 

منابع تغییرات

تنظیم­کننده رشد

خطا

میانگین مربعات

طول ریشه

**59860/8

14044/0

تعداد ریشه

**0100/10

2680/0

درصد ریشه‌زایی

**1000

72/159

درجه آزادی

8

36

وزن‌تر کالوس

**03/3934

53/108

درصد کالوس‌زایی

**91/2111

29/77

درجه آزادی

11

48

درصد باززایی

**66/1915

79/414

درجه آزادی

5

24

* ،** و ns: به‏ترتیب معنی­داری در سطح احتمال 1 و 5 درصد و عدم اختلاف معنی­دار را نشان می­دهد.

 

 

 

پرآوری و ریشه‌زایی

قطعات گره‌دار به‌دست‌آمده از گیاهچه­های رشد کرده در مرحله قبل، در تمامی ترکیب‌های مختلف سیتوکنین‌ها و تنظیم­کننده‌های رشدی، به‌خوبی رشد کرد و تولید گره‌های جدید ساقه، از طریق افزایش رشد طولی شاخه‌ها و نیز افزایش تعداد گره در هر گیاهچه، انجام شد. بیشترین وزن ‌تر (91/2315 میلی‌گرم) و تعداد شاخه (22/15 در هر بوته) در هر گیاهچه به‏ترتیب مربوط به تیمار 1 میلی‌گرم در لیتر BA و 25/0 میلی‌گرم در لیتر IBA می‌باشد. همان‌طوری که در جدول 3 مشاهده می‌شود کاربرد Kinetinبهصورت تنها یا همراه با IBA باعث کاهش در صفات فوق شده است. همچنین مقدار بالای BA نیز روند کاهشی را در صفات ذکرشده در پی داشت. در بخش طول شاخه و تعداد گره، کاربرد مقدار 2 میلی‌گرم در لیتر BA باعث افزایش چشمگیری در این صفات شد. به‌طوری‌که با کاهش در مقدار این تنظیم­کننده‌ رشد سیر نزولی در مقدار طول شاخه و تعداد گره قابل‌ مشاهده است. البته کاربرد مقدار پایین IBA (25/0 میلی‌گرم در لیتر) همراه با 2 میلی‌گرم در لیترBA نیز در طول بلندترین شاخه و طول متوسط گیاهچه موثر واقع شد (شکل 2 و جدول 3).

 

جدول 3: مقایسه میانگین تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد بر نرخ شاخه‌زایی گیاه دارویی پونه‌سای بی‌کرک (Nepeta nuda L.)

تنظیم­کننده رشد

صفات موردبررسی

سیتوکینن

(mg/L)

اکسین

(mg/L)

وزن‌تر گیاهچه

(mg)

تعداد شاخه

(در هر گیاهچه)

طول متوسط گیاهچه(cm)

طول بلندترین شاخه (cm)

تعداد گره

(درهر گیاهچه)

5/0BA

-

   hij82/365

kl06/4

d82/2

d70/3

hij60/3

1BA

-

b37/1148

fg83/5

de78/2

de38/3

j33/3

5/1BA

-

def38/532

ig76/4

defg68/2

def30/3

fg26/4

2BA

-

J24/279

lm60/3

b44/3

a50/5

a53/6

5/2BA

-

hij362

hij10/5

j01/2

g54/2

def53/4

5/0Ki

-

de24/573

gh66/5

defg69/2

c76/4

cd93/4

1Ki

-

defg28/524

cde53/6

def74/2

c50/4

cdef59/4

5/0BA

25/0IBA

cd25/639

b66/8

ghi49/2

def28/3

def28/3

5/0BA

5/0IBA

fghi38/426

efg20/6

fgh55/2

d60/3

gh86/3

1BA

25/0IBA

a91/2315

a22/15

j96/1

g46/2

gh86/3

1BA

5/0IBA

c89/750

efg23/6

defgh62/2

efg90/2

hij60/3

5/1BA

25/0IBA

efg41/506

efg06/6

jk79/1

fg80/2

ij40/3

5/1BA

5/0IBA

fghi22/413

jk53/4

k59/1

g50/2

ef39/4

2BA

25/0IBA

ij04/326

mn33/3

a68/3

ab34/5

def53/4

2BA

5/0IBA

ghi90/403

n86/2

j95/1

efg90/2

hi79/3

5/2BA

25/0IBA

fghi21/425

hi15/5

i29/2

d50/3

hij66/3

5/2BA

5/0IBA

efgh31/476

ij05/5

hi42/2

def22/3

cde80/4

5/0Ki

25/0IBA

efg58/506

c06/7

c13/3

bc86/4

b60/5

5/0Ki

5/0IBA

fghi68/417

def33/6

bc32/3

c48/4

c99/4

1Ki

25/0IBA

def45/529

cd90/6

defg71/2

c82/4

hij53/3

1Ki

5/0IBA

efgh61/465

hi15/5

efgh56/2

c40/4

hij53/3

در هر ستون میانگین­های با حروف مشابه در سطح احتمال آماری 5 درصد براساس آزمونLSD اختلاف معنی­دار ندارند.

 

در قسمت ریشه‌زایی بیشترین تعداد ریشه (60/5 و 5 در هر گیاهچه) و درصد ریشه‌زایی (75 درصد) در محیط کشت MS و MS4/1 همراه با کاربرد 5/0 میلی‌گرم در لیتر IBA حاصل شد که این دو محیط در صفات ذکرشده تفاوت معنی‌داری با هم نداشتند. همچنین بیشترین طول ریشه مربوط به محیط کشت MS با غلظت 4/1 نمک همراه با 5/0 میلی‌گرم در لیتر IBA به مقدار 82/4 سانتی‌متر بود (جدول 4). بنابراین به‏‌نظر می‌رسد کاربرد مقدار متوسط IBA (5/0 میلی‌گرم در لیتر) همراه محیط کشت با نصف غلظت نمک بهترین نتیجه را در ریشه‌زایی دارد. پس از ریشه‌زایی، مرحله سازگاری گیاهچه­ها طبق روشی که در قسمت مواد و روش ذکر شد انجام شد و 70 درصد گیاهچه­ها به‌صورت موفقیت‌آمیزی در محیط گلخانه سازگار شدند (شکل 2).

 

جدول 4: مقایسه میانگین تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد بر نرخ ریشه‌زایی گیاه دارویی پونه‌سای بی‌کرک (Nepeta nuda L.)

تنظیم­کننده رشد

 

صفات مورد بررسی

محیط کشت

اکسین (mg/L)

 

 (cm) طول ریشه

تعداد ریشه (در هر گیاهچه)

درصد ریشه‌زایی

MS4/1

25/0IBA

 

f03/1

d40/1

c40

MS4/1

5/0IBA

 

def45/1

cd2

ab65

MS4/1

1IBA

 

ef23/1

cd99/1

ab60

MS2/1

25/0IBA

 

ef06/1

c40/2

c35

MS2/1

5/0IBA

 

a82/4

a5

a75

MS2/1

1IBA

 

c65/2

b14/3

bc50

MS

25/0IBA

 

d80/1

bc60/2

ab60

MS

5/0IBA

 

b59/3

a60/5

a75

MS

1IBA

 

de51/1

bc60/2

ab65

در هر ستون میانگین­های با حروف مشابه در سطح احتمال آماری 5 درصد بر اساس آزمونLSD اختلاف معنی­دار ندارند.

 

شکل 1: مقایسه میانگین تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد (BA1.5 و BA1: بنزیل آدنین 1 و 5/1 میلی‌گرم در لیتر، NAA0.2 و NAA0.5: نفتالین استیک اسید 2/0 و 5/0 میلی­گرم در لیتر) بر نرخ باززایی از کالوس‌ گیاه دارویی پونه‌سای بی‌کرک (Nepeta nuda L.). در هر ستون میانگین­های با حروف مشابه در سطح احتمال آماری 5 درصد بر اساس آزمونLSD اختلاف معنی­دار ندارند.

 

کالوس‌زایی

در رابطه با کالوس‌زایی همان‌طور که در جدول 5 مشاهده می‌شود محیط تاریک نتیجه مطلوبی را در رابطه با وزن ‌تر کالوس و درصد کالوس‌زایی داشته است. به‏طوری‏که بیشترین مقدار وزن ‌تر کالوس مربوط به تیمار تنظیم­کننده رشد BA (1 میلی‌گرم در لیتر) همراه با NAA (5/0 میلی‌گرم در لیتر) با مقدار 818/143 میلی‌گرم مربوط به محیط تاریک می‌باشد. همچنین درصد کالوس در محیط تاریک بالاترین مقدار خود را دارا بود به‌طوری‌که بین تیمارهای تنظیم­کننده­های رشد مورد استفاده در این محیط تفاوت معنی‌داری مشاهده نشد (جدول 5).

 

جدول 5: مقایسه میانگین تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد بر نرخ کالوس‌زایی گیاه دارویی پونه‌سای بی‌کرک (Nepeta nuda L.)

تنظیم­کننده رشد

 

صفات موردبررسی

 

سیتوکینن (mg/L)

اکسین (mg/L)

 

(mg)وزن‌ترکالوس

درصد کالوس‌زایی

روشنایی

5/0BA

2/0NAA

 

g364/53

c80/37

1BA

2/0NAA

 

f072/71

b58

5/1BA

2/0NAA

 

ef074/76

b60/53

5/0BA

5/0NAA

 

cd896/93

b63

1BA

5/0NAA

 

ef460/78

b20/56

5/1BA

5/0NAA

 

f040/67

b80/56

تاریکی

5/0BA

2/0NAA

 

ef442/77

a66/91

1BA

2/0NAA

 

c166/101

a59/91

5/1BA

2/0NAA

 

de100/85

a49/87

5/0BA

5/0NAA

 

b602/129

a66/96

1BA

5/0NAA

 

a818/143

a66/91

5/1BA

5/0NAA

 

b900/126

a66/91

 

C

 

B

 

A

 

F

 

E

 

 D

 

       

شکل2: استقرار اولیه گیاه پونه­سای بی­کرک در محیط کشت MS (B) تکثیر شاخه (C) ریشه­دهی (D) کالوس‌زایی (E) سازگاری (F) انتقال به گلخانه

 

باززایی

باززایی غیرمستقیم (ازکالوس) با کاربرد تنظیم­کننده‌ رشد BA (1میلی‌گرم در لیتر) همراه با NAA (2/0 و 5/0 میلی‌گرم در لیتر) نتیجه مطلوبی را داشت. به‌طوری‌که در این غلظت تنظیم­کننده‌های رشد، مقدار کالوس‌های باززایی شده 2/83 و 6/81 درصد بود. همچنین کاربرد تنهای BA موفقیت‌آمیز نبود به‌طوری‌که کمترین مقدار باززایی در غلظت 1 و 5/1 میلی‌گرم در لیتر BA مشاهده شد(شکل 1).

بحث

یکی از پارامترهایی که در تکنیک کشت بافت اهمیت دارد مسئله تولید شاخه جانبی می­باشد، زیرا در مرحله واکشت نمونه­ها، شاخه­های جانبی تولید شده را می­توان جدا کرد و هر یک را به‏عنوان یک نمونه در محیطی جداگانه کشت نمود. حتی در برخی موارد که رشد شاخساره­ها قوی باشد از هر شاخساره می­توان چندین ریزنمونه تهیه کرد و با این کار سرعت تکثیر بسیار افزایش می­یابد. نتایج به‏دست آمده از تحقیق حاضر نشان داد که در غلظت­های پایین نتایج بهتری را می­توان در رابطه با شاخه­زایی به‏دست آورد. AL- Sulaiman و همکاران (20) گزارش کردند که مقادیر کم سیتوکنین­ها برای شاخه­زایی عناب مناسب می­باشد.

Muna و همکاران (21) گزارش کردند در محیط حاوی مقادیر کم NAA و IBA به‏ویژه زمانی که در ترکیب با غلظت­های بالای BA همراه هستند، تشکیل کالوس اتفاق افتاده و شاخه­های نابجا تمایز می­یابند. Eliasson و Nordstrom (22) نیز گزارش کردند که در محیط حاوی BA شاخه­زایی زیادی اتفاق می­افتد. نقش BA در محیط کشت، شکستن غالبیت انتهایی و تحریک رشد شاخه­های جدید است. اثر آشکار دیگر حضور BA در محیط کشت، اثر بازداندگی آن در تشکیل ریشه می­باشد. این نتایج با یافته­های ما در این مطالعه هم­خوانی دارد.

Afzalifar و همکاران (15) طی آزمایشی BA را به‌منزله­ی موثرترین تنظیم­کننده رشد در پرآوری دو گونه مرزه معرفی کردند. در آزمایش آن‏ها، بیشترین تأثیر را غلظت 2 میلی‌گرم در لیتر BA از خود نشان داد. این بدان معناست که مرزه به غلظت‌های متوسط به بالای سیتوکنین از نوع BA جواب­دهی بهتری از خود نشان می‌دهند. در صورتی‌که در پژوهش حاضر در پونه­سای بی­کرک BA به‌تنهایی نتیجه مطلوبی را به‏همراه نداشت. همچنین آن‏ها بیان کردند که در بین سیتوکنین‌های آزمون شده، کینتین در پرآوری کمترین اثر را داشته است که با نتیجه پژوهش ما در پونه­سای بی­کرک کاملا مطابقت دارد (جدول 3). آن‏ها گزارش کردند که طویل‌ترین شاخه در ریزازدیادی مرزه در تیمار 2 میلی‌گرم در لیتر BA مشاهده گردید که مطابق با نتایج به‌دست‌آمده در پژوهش حاضر در پونه­سای بی­کرک است. مطالعات انجام ‌شده درباره اثرات تنظیم­کننده­های رشد سیتوکینینی بر ریزازدیادی گیاهان مختلف حاکی از تأثیر بیشتر و بهتر تنظیم­کننده رشد BAP در مقایسه با سایر تنظیم­کننده‌های رشد مورد مطالعه است که موید نتایج به‌دست‌آمده است (23). در مطالعه Shafie Haji Abad و همکاران (24) بر پرآوری ریز نمونه‌های سرخس بوستونی، بیشترین تعداد شاخساره را در محیط کشت حاوی غلظت‌های 1 و 2 میلی‌گرم در لیتر BAP به‏دست آوردند که نشان از اهمیت این تنظیم­کننده‌ رشد با غلظت به‌کاربرده شده دارد. در آزمایش حاضر تنظیم­کننده‌ رشد BA همراه با IBA دارای نتیجه‌ای مطلوبی بود. البته لازم به ذکر است که غلظت تنظیم­کننده رشد BA توصیه ‌شده در هر دو آزمایش مشابه هم می‌باشد. در بررسی تأثیر غلظت‌های مختلف تنظیم­کننده‌های رشد سیتوکینینی بر ریزازدیادی گل آهار ظریف توسطMahmoodzadeh و همکاران (25)، مشخص شد کینتین با غلظت 5/0 میلی‌گرم در لیتر تأثیر مثبتی بر جوانه‌زنی و افزایش ارتفاع گیاه داشت که با نتایج این تحقیق مشابهت دارد و نشان می‌دهد با افزایش غلظت کینتین، ارتفاع گیاه نیز افزایش‌ می­یابد و این تنظیم­کننده‌ رشد نیز به‌نوبه‌ی خود توانسته در افزایش ارتفاع گیاه موثر واقع شود. در بررسی‌های Karuppusamy و همکاران (26) با استفاده از تنظیم­کننده‌های رشدKin ،2iP و BAP موفق به ساقه­زایی در گیاه Vanasushava pedata شده و BAP را از کینتین و 2iP موثرتر دانست. همچنین فراوانی تولید شاخه در تنظیم­کننده‌ BAP نسبت به دو تنظیم­کننده‌ دیگر بیشتر بود، که با نتایج این تحقیق نیز مطابقت دارد.

ریشه­زایی که نقش مهمی در آماده­سازی ریزشاخساره­ها برای مرحله سازگاری دارد، در برگیرنده ریشه­زایی تک­ریز شاخساره­ها در محیط کشتی است که در آن میزان اکسین افزایش و میزان سایتوکینین­ها کاهش یافته و یا به­طورکلی حذف شده است. هورمون اکسین در گیاهان معمولا باعث تحریک ریشه­زایی و جلوگیری از ایجاد شاخه­های جانبی می­شود. یکی از متداول­ترین اکسین­ها در کشت بافت گیاهی تنظیم­کننده‌ رشد IBA می­باشد. در رابطه با ریشه‌زایی، IBA به‌منظور ریشه‌زایی برخی گیاهان خانواده چتریان نظیر V. pedata توسط Karuppusamyو همکاران (26)، Anethum graveolens توسط Sharma و همکاران (27) گزارش ‌شده که با نتایج این تحقیق مشابهت دارد. برخی پژوهش‌ها آثار مثبت کاهش غلظت نمک‌ها را در افزایش و بهبود ریشه‌زایی، در گونه‌های دارویی از قبیل Salix humboldtiana (28) و Hancorina speciosa(29) نشان داده‌اند. در این پژوهش نیز کاهش غلظت نمک به نصف به‏همراه کاربرد غلظت متوسط IBA موجب تولید بیشترین درصد و طول ریشه در ریز نمونه­های پونه­سای بی­کرک شد. در تحقیقی بر روی گونه Origanum sipyleum L. برای آزمون ریشه‌زایی از دو اکسین NAA و IBA استفاده کردند. در اینجا نیز مانند آزمون شاخه‌زایی مقدار کمتر تنظیم­کننده‌ رشد تأثیر بهتری بر صفات مربوط به ریشه­زایی داشت. 96% از شاخه‌ها پس از قرارگیری در محیط کشت با 5/0 میلی‌گرم بر لیتر IBA پس از سه هفته ریشه‌دار شدند که کاملا با نتایج این پژوهش مطابقت دارد (30). همچنین نتایج تحقیق Junaid و همکاران (31) نیز نشان داد که با افزایش غلظت تنظیم­کننده‌ رشد IBA تعداد ریشه­ها کاهش پیدا می­کند. Dhandapani و همکاران (32) نیز از غلظت 44/0 میلی­گرم در لیتر IBA بهترین نتیجه ریشه­زایی را به‏دست آوردند و بیان داشتند که این تنظیم­کننده‌ رشد در غلظت­های پایین تأثیر به­مراتب بهتری در ریشه­زایی دارد.

بافت کالوس گیاهی علاوه بر ازدیاد گیاهان، قابلیت­های متنوع دیگری نیز دارد که از جمله می­توان به استفاده از آن­ها در انتقال ژن به گیاه و یا کاربرد آن در تهیه کشت­های سوسپانسیون سلولی به‏منظور تولید متابولیت­های ثانویه و یا ترکیبات مفید دیگر حاصل از آن‏ها اشاره نمود (16). اثر تنظیم­کننده‌های رشد را روی کالوس­زایی ریز نمونه­های مختلف (برگ، ساقه، ریشه و هیپوکوتیل) گیاه Saussurea obvallata بررسی نموده و دریافتند که ریز نمونه برگی و غلظت 5/2 میلی­گرم BA و 10 میلی‏گرم NAA بیشترین میزان کالوس­زایی را داشتند (33). تنوع در فراوانی تولید کالوس در گیاهان مختلف و در پاسخ به سطوح مختلف تنظیم­کننده‌های رشد، می­تواند به‏دلیل تمایز در بیان ژن­های کنترل کننده تولید کالوس باشد. همچنین ممکن است که در بعضی از سطوح تنظیم­کننده‌های رشد مورد استفاده، برخی از ژن­های مسئول در سنتز کالوس، به‏طور کامل بیان نشوند (34). در بسیاری از مطالعات اثر القایی تاریکی بر تولید کالوس گزارش‌شده است (35 و 36). در این مطالعه نیز کالوس‌زایی اختلاف چشمگیری را در نور و تاریکی نشان داد. به‌طوری‌که در شرایط وجود نور کالوس‌ها بعد از مدتی به رنگ سیاه درآمدند. اغلب مطالعات نشان می‌دهد که تنظیم­کننده­های رشد گروه اکسین به‌ویژه 2,4-D و NAA در تمایززدایی و تولید کالوس نقش مهمی دارند. همچنین این تنظیم­کننده­های رشد همراه با سیتوکینین‌هایی ازجمله BA در تولید و رشد کالوس موثرند (37).

نقش سیتوکینین‌ها به‌عنوان مهم‌ترین فاکتور موثر در باززایی ساقه به اثبات رسیده‌ است و اثرات چشمگیر آن‌ها شاید با تغییرات بافت‌شناسی در بافت‌های القاشده مرتبط باشد (38). در گیاه Taxus wallichiana گزارش‌ شده است که با افزایش سیتوکینین و کاهش اکسین، باززایی افزایش می‌یابد که منطبق با نتیجه این آزمایش می‌باشد. همان‌طور که در شکل 1 مشاهده می‌شود کمترین غلظتBA (1 میلی‌گرم در لیتر) دارای بیشترین باززایی می‌باشد (39).

نتیجه‌گیری

در پژوهش حاضر به ریزازدیادی پونه‌سای بی‌کرک پرداخته شد. نتایج به‌دست ‌آمده بیانگر این بود که تیمار 1میلی‌گرم در لیتر BA با 5/0 میلی‌گرم در لیتر IBA و NAA از مهم‌ترین و مفیدترین ترکیبات تنظیم­کننده‌ رشد برای ریزازدیادی این گیاه می‏‌باشند.

منابع

  1. Arikat NA, Jawad FM, Karam NS, Shibli RA. Micropropagation and accumulation of essential oils in wild sage (Salvia fruticosa Mill.). Sci. Hort. 2004; 100(1):193-202.
  2. Lambert J, Srivastava J, Vietmeyer N. Medicinal plants: rescuing a global heritage. 1th Ed. The World Bank Washington, D. C; 1997.
  3. Pushpangadan P. On Conservation Biology, Domestication and Commercial Cultivation of Wild Medicinal and Aromatic Plants. Recent Advances in Medicinal Aromatic, Spices and Crop. 1992; 2: 431-436.
  4. Uniyal RC, Uniyal MR, Jain P. Cultivation of Medicinal Plants in India: A reference book– New Delhi, India, TRAFFIC India & WWF India; 2000.
  5. Fotovati H, Noorbakhsh, S. Biotechnology, the new aspect for agricultural progress. The 6th National Biotechnology Congress of Iran, 13-15 Aug, Tehran; 2009.
  6. Seitz HV, Hinderer W. Anthocyanins in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. San Diego Academic Press: Constabel, F & Vasil, I., 1988; 49-76
  7. Amin G. Traditional Medical Plants of Iran, 2th Ed, Tehran: Ministry of Health publisher; 1990; 55p.
  8. Jamzad Z, Chase MW, Ingrouille M, Simmonds MS, et al. Phylogenetic relationships in Nepeta L. (Lamiaceae) and related genera based on ITS sequence data. J. Taxon. 2003; 52(1): 21-32.
  9. Zargari A, Medical Plants, 4th ET, Tehran University Publisher, 1993; Page 450.
  10. Rechinger KH. Nepeta. Flora Iranica. 1982; 150: 108-216.
  11. Kökdil G, Kurucu S, Topçu G. Chemical constituents of the essential oils of Nepeta italica L. and Nepeta sulfuriflora PH Davis. Flavour Frag. J. 1997; 12(1): 33-5.
  12. Skaltsa HD, Lazari DM, Loukis AE, Constantinidis T. Essential oil analysis of Nepeta argolica Bory & Chaub. Subsp. argolica (Lamiaceae) growing wild in Greece. Flavour Frag. J. 2000; 15(2): 96-9.
  13. Bagheri A, Moshiri F, Khosravinia S. Investigation on reaction of explants and plant growth regulators on callus induction, rooting and in vitro regeneration of Bunium persicum (Boiss.) B. Fedtsch. Crop Biotech. 2013; 5: 53-61.
  14. Echeverrigaray S, Basso R, Andrade LB. Micropropagation of Lavandula dentata from axillary buds of field-grown adult plants. Biol. Plantarum. 2005; 49(3): 439-42.
  15. Afzalifar M. Evaluation of different propagation and androgenesis in Satureja khuzistanica and S. rechingeri. M.Sc. thesis. Medicinal Plants and Drug Research Institute. Shahid Beheshti University, Iran. 2012; 46-73.
  16. Kayser O, Quax W. Medicinal Plant Biotechnology. 7th ET. Federal Republic of Germany: Wiley-VCH; 2006.
  17. Tripathi L, Tripathi JN. Role of biotechnology in medicinal plants. Trop. J. Pharm. Res. 2003; 2(2): 243-53.
  18. Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962; 15(3): 473-97.
  19. Zahedi B, Sahraro A. Evaluation of the micropropagation of Satureja khuzistanica. Iranian Hort. Sci. 2015; 7(2): 291-296.
  20. Al-Sulaiman MA. Clonal propagation of Ziziphus spina-christi by shoot tip culture: I. improved inorganic and organic media constituents for in vitro shoot multiplication. J. King Abdulaziz Uni. 2010; 21(2): 3.
  21. Muna AS, Ahmad AK, Mahmoud K, Abdul-Rahman K. In vitro propagation of a semi-dwarfing cherry rootstock. PCTOC. 1999; 59(3): 203-8.
  22. Nordstrom A, Eliasson L. Uptake and translocation of C14-labled benzylaminopurine in apple shoots grown in vitro in relation to shoot development. Physiol. Plant. 1986; 68(3): 431-435.
  23. Nowruzian A, Masoumian M, Ebrahimi MA, Bakhshi Khaniki GR. Optimization of cytokinin concentration on Ferula assa-foetida height. 1th International & 13th Iranian Crop & Plant Breeding Sciences Congress and 3rd Seed Science and Technology Conference. Karaj, Iran. Agust 2014; 26-28.
  24. Shafie Haji Abad M, Hamid Oghli Y. Fatahi Moghadam, J. The effects of different nutrient media on shoot proliferation of Boston Fern (Nephrolepis exaltata Schott cv. ‘Bostoniensis’). J. Horti. Sci. Technol. 2008; 9: 139-144.
  25. Mahmoodzadeh H, Abbasi F, Rohani Sh. The effect of different concentrations of cytokinins on micropropagation of Zinnia elegans Thumbelina. J. Biol. Sci., Islamic Azad Uni. Zanjan. 2010; 2: 61-65.
  26. Karuppusamy S, Kiranmai C, Aruna V, Pullaiah T. Micropropagation of Vanasushava pedata-An endangered medicinal plant of South India. BAPTC&B. 2006; 16(2): 85-94.
  27. Sharma RK, Wakhlu AK, Boleria M. Micropropagation of Anethum graveolens L. through axillary shoot proliferation. J. Plant Biochem. Biot. 2004; 13(2): 157-9.
  28. Pereira AMS, Bertoni BW, Moraes RM, Franca SC. Micropropagation of Salix humboldtiana Hild. Rev. Bras. Plantas Med. 2000; 2: 17-21.
  29. Pereira-Netto AB. In vitro propagation of Hancornia speciosa, a tropical fruit tree. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 1996; 32(4): 253-6.
  30. Ccedil AK, Oluk a E, Ihsan YA. Comparison of the antimicrobial activity and essential oil content of wild and micropropagated Origanum sipyleum L.: A medicinal herb native to Turkey. J. Med. Plants Res. 2013; 7(6): 230-3.
  31. Junaid A, Mujib A, Bhat MA, Sharma MP, et al. Somatic embryogenesis and plant regeneration in Catharanthus roseus. Biol. Plantarum. 2007; 51(4): 641-6.
  32. Dhandapani M, Kim DH, Hong SB. Efficient plant regeneration via somatic embryogenesis and organogenesis from the explants of Catharanthus roseus. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 2008; 44(1):18-25.
  33. Dhar U, Joshi M. Efficient plant regeneration protocol through callus for Saussurea obvallata (DC.) Edgew. (Asteraceae): effect of explant type, age and plant growth regulators. Plant Cell Rep. 2005; 24(4): 195-200.
  34. Mahmood I, Razzaq A, Khan ZD, Hafiz IA, et al. Evaluation of tissue culture responses of promising wheat (Triticum aestivum L.) cultivars and development of efficient regeneration system. Pak. J. Bot. 2012; 44(1): 277-84.
  35. Li X, Krasnyanski SF, Korban SS. Somatic embryogenesis, secondary somatic embryogenesis, and shoot organogenesis in Rosa. J. Plant Physiol. 2002; 159(3): 313-9.
  36. Nakamura M, Takeuchi Y, Miyanaga K, Seki M, et al. High anthocyanin accumulation in the dark by strawberry (Fragaria ananassa) callus. Biotechnol. Lett. 1999; 21(8): 695-9.
  37. Dixon, RA, Gonzales, RA. A Practical Approach Plant Cell Culture. 2nd Ed. IRL Press; 1996; 230 p.
  38. Neibaur I, Gallo M, Altpeter F. The effect of auxin type and cytokinin concentration on callus induction and plant regeneration frequency from immature inflorescence segments of seashore paspalum (Paspalum vaginatum Swartz). In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 2008; 44(6): 480-486.
  39. Datta MM, Jha S. Embryo culture of Taxus wallichiana (Zucc.). J. Plant Biotech. 2004; 6(4): 213-219.
  1. Arikat NA, Jawad FM, Karam NS, Shibli RA. Micropropagation and accumulation of essential oils in wild sage (Salvia fruticosa Mill.). Sci. Hort. 2004; 100(1):193-202.
  2. Lambert J, Srivastava J, Vietmeyer N. Medicinal plants: rescuing a global heritage. 1th Ed. The World Bank Washington, D. C; 1997.
  3. Pushpangadan P. On Conservation Biology, Domestication and Commercial Cultivation of Wild Medicinal and Aromatic Plants. Recent Advances in Medicinal Aromatic, Spices and Crop. 1992; 2: 431-436.
  4. Uniyal RC, Uniyal MR, Jain P. Cultivation of Medicinal Plants in India: A reference book– New Delhi, India, TRAFFIC India & WWF India; 2000.
  5. Fotovati H, Noorbakhsh, S. Biotechnology, the new aspect for agricultural progress. The 6th National Biotechnology Congress of Iran, 13-15 Aug, Tehran; 2009.
  6. Seitz HV, Hinderer W. Anthocyanins in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. San Diego Academic Press: Constabel, F & Vasil, I., 1988; 49-76
  7. Amin G. Traditional Medical Plants of Iran, 2th Ed, Tehran: Ministry of Health publisher; 1990; 55p.
  8. Jamzad Z, Chase MW, Ingrouille M, Simmonds MS, et al. Phylogenetic relationships in Nepeta L. (Lamiaceae) and related genera based on ITS sequence data. J. Taxon. 2003; 52(1): 21-32.
  9. Zargari A, Medical Plants, 4th ET, Tehran University Publisher, 1993; Page 450.
  10. Rechinger KH. Nepeta. Flora Iranica. 1982; 150: 108-216.
  11. Kökdil G, Kurucu S, Topçu G. Chemical constituents of the essential oils of Nepeta italica L. and Nepeta sulfuriflora PH Davis. Flavour Frag. J. 1997; 12(1): 33-5.
  12. Skaltsa HD, Lazari DM, Loukis AE, Constantinidis T. Essential oil analysis of Nepeta argolica Bory & Chaub. Subsp. argolica (Lamiaceae) growing wild in Greece. Flavour Frag. J. 2000; 15(2): 96-9.
  13. Bagheri A, Moshiri F, Khosravinia S. Investigation on reaction of explants and plant growth regulators on callus induction, rooting and in vitro regeneration of Bunium persicum (Boiss.) B. Fedtsch. Crop Biotech. 2013; 5: 53-61.
  14. Echeverrigaray S, Basso R, Andrade LB. Micropropagation of Lavandula dentata from axillary buds of field-grown adult plants. Biol. Plantarum. 2005; 49(3): 439-42.
  15. Afzalifar M. Evaluation of different propagation and androgenesis in Satureja khuzistanica and S. rechingeri. M.Sc. thesis. Medicinal Plants and Drug Research Institute. Shahid Beheshti University, Iran. 2012; 46-73.
  16. Kayser O, Quax W. Medicinal Plant Biotechnology. 7th ET. Federal Republic of Germany: Wiley-VCH; 2006.
  17. Tripathi L, Tripathi JN. Role of biotechnology in medicinal plants. Trop. J. Pharm. Res. 2003; 2(2): 243-53.
  18. Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962; 15(3): 473-97.
  19. Zahedi B, Sahraro A. Evaluation of the micropropagation of Satureja khuzistanica. Iranian Hort. Sci. 2015; 7(2): 291-296.
  20. Al-Sulaiman MA. Clonal propagation of Ziziphus spina-christi by shoot tip culture: I. improved inorganic and organic media constituents for in vitro shoot multiplication. J. King Abdulaziz Uni. 2010; 21(2): 3.
  21. Muna AS, Ahmad AK, Mahmoud K, Abdul-Rahman K. In vitro propagation of a semi-dwarfing cherry rootstock. PCTOC. 1999; 59(3): 203-8.
  22. Nordstrom A, Eliasson L. Uptake and translocation of C14-labled benzylaminopurine in apple shoots grown in vitro in relation to shoot development. Physiol. Plant. 1986; 68(3): 431-435.
  23. Nowruzian A, Masoumian M, Ebrahimi MA, Bakhshi Khaniki GR. Optimization of cytokinin concentration on Ferula assa-foetida height. 1th International & 13th Iranian Crop & Plant Breeding Sciences Congress and 3rd Seed Science and Technology Conference. Karaj, Iran. Agust 2014; 26-28.
  24. Shafie Haji Abad M, Hamid Oghli Y. Fatahi Moghadam, J. The effects of different nutrient media on shoot proliferation of Boston Fern (Nephrolepis exaltata Schott cv. ‘Bostoniensis’). J. Horti. Sci. Technol. 2008; 9: 139-144.
  25. Mahmoodzadeh H, Abbasi F, Rohani Sh. The effect of different concentrations of cytokinins on micropropagation of Zinnia elegans Thumbelina. J. Biol. Sci., Islamic Azad Uni. Zanjan. 2010; 2: 61-65.
  26. Karuppusamy S, Kiranmai C, Aruna V, Pullaiah T. Micropropagation of Vanasushava pedata-An endangered medicinal plant of South India. BAPTC&B. 2006; 16(2): 85-94.
  27. Sharma RK, Wakhlu AK, Boleria M. Micropropagation of Anethum graveolens L. through axillary shoot proliferation. J. Plant Biochem. Biot. 2004; 13(2): 157-9.
  28. Pereira AMS, Bertoni BW, Moraes RM, Franca SC. Micropropagation of Salix humboldtiana Hild. Rev. Bras. Plantas Med. 2000; 2: 17-21.
  29. Pereira-Netto AB. In vitro propagation of Hancornia speciosa, a tropical fruit tree. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 1996; 32(4): 253-6.
  30. Ccedil AK, Oluk a E, Ihsan YA. Comparison of the antimicrobial activity and essential oil content of wild and micropropagated Origanum sipyleum L.: A medicinal herb native to Turkey. J. Med. Plants Res. 2013; 7(6): 230-3.
  31. Junaid A, Mujib A, Bhat MA, Sharma MP, et al. Somatic embryogenesis and plant regeneration in Catharanthus roseus. Biol. Plantarum. 2007; 51(4): 641-6.
  32. Dhandapani M, Kim DH, Hong SB. Efficient plant regeneration via somatic embryogenesis and organogenesis from the explants of Catharanthus roseus. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 2008; 44(1):18-25.
  33. Dhar U, Joshi M. Efficient plant regeneration protocol through callus for Saussurea obvallata (DC.) Edgew. (Asteraceae): effect of explant type, age and plant growth regulators. Plant Cell Rep. 2005; 24(4): 195-200.
  34. Mahmood I, Razzaq A, Khan ZD, Hafiz IA, et al. Evaluation of tissue culture responses of promising wheat (Triticum aestivum L.) cultivars and development of efficient regeneration system. Pak. J. Bot. 2012; 44(1): 277-84.
  35. Li X, Krasnyanski SF, Korban SS. Somatic embryogenesis, secondary somatic embryogenesis, and shoot organogenesis in Rosa. J. Plant Physiol. 2002; 159(3): 313-9.
  36. Nakamura M, Takeuchi Y, Miyanaga K, Seki M, et al. High anthocyanin accumulation in the dark by strawberry (Fragaria ananassa) callus. Biotechnol. Lett. 1999; 21(8): 695-9.
  37. Dixon, RA, Gonzales, RA. A Practical Approach Plant Cell Culture. 2nd Ed. IRL Press; 1996; 230 p.
  38. Neibaur I, Gallo M, Altpeter F. The effect of auxin type and cytokinin concentration on callus induction and plant regeneration frequency from immature inflorescence segments of seashore paspalum (Paspalum vaginatum Swartz). In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 2008; 44(6): 480-486.
  39. Datta MM, Jha S. Embryo culture of Taxus wallichiana (Zucc.). J. Plant Biotech. 2004; 6(4): 213-219.