تغییرات پروتئین و سیستم آنتی‌اکسیدانتی خیار‌ رقم اصفهانی در پاسخ به تنش خشکی

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه اراک، دانشکده علوم پایه، گروه زیست‌شناسی، کد پستی8349-8-38156

2 دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

3 دانشجوی کارشناسی ارشد فیزیولوژی گیاهی، دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی

چکیده

هدف: با توجه به ­اینکه ایران در دنیا یک منطقه خشک و نیمه­خشک به‌شمار می­آید و همچنین یکی از کشورهای اصلی تولیدکننده خیار محسوب می‏شود بررسی اثرات خشکی بر این گیاه و تغییرات سیستم آنتی­اکسیدانتی از اهمیت خاصی برخوردار است.
مواد و روش‌ها: در این پژوهش خیار رقم اصفهانی در شرایط گلخانه­ای کشت داده شد و در مرحله 3 تا 5 برگی از رشد گیاه به­منظور بررسی تغییرات پروتئینی و سیستم آنتی­اکسیدانتی به مدت 21 روز در معرض چهار سطح از تنش خشکی (100، 75، 50 و 25 درصد ظرفیت زراعی) قرارگرفت و پاسخ­های گیاه بررسی شد. میزان نشت الکترولیت، پراکسیداسیون­لیپید، پروتئین، پرولین، آنتی­اکسیدانت کل، کاتالاز و گایاکول­پراکسیداز، α­توکوفرول ­و پراکسیدهیدروژن اندازه­گیری شد.
نتایج: بررسی نتایج این مطالعه نشان داد که میزان نشت الکترولیت، پراکسیداسیون لیپید، پرولین، آنتی­اکسیدانت­کل، کاتالاز، گایاکول­پراکسیداز ، α­توکوفرول و ­پراکسیدهیدروژن تحت تنش خشکی در مقایسه با نمونه شاهد افزایش یافت و تنها شاخص میزان پروتئین تحت تنش خشکی در مقایسه با نمونه‌ شاهد کاهش یافت.
نتیجه‌گیری: نتایج این تحقیق نشان داد که احتمالا تحمل به­خشکی رقم خیار مورد نظر با توجه به فعالیت‏های سیستم آنتی­اکسیدانتی آنزیمی و غیرآنزیمی و همچنین تجمع پرولین صورت می­گیرد.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

خشکسالی در واقع عدم وجود رطوبت کافی برای یک گیاه است که در چرخه زندگی گیاه ایجاد مشکل می­کند و مانع از رشد گیاه می­شود (1). در اغلب موارد تنش خشکی منجر به کاهش عملکرد محصول به­خصوص در سبزیجات می­شود (2). کشور ما ایران با متوسط نزولات آسمانی سالیانه معادل 240 میلی متر در زمره مناطق خشک و نیمه خشک دنیا طبقه‌بندی می‌شود(3). از این‏رو مطالعه مولکولی، بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی گیاهان به­خصوص سبزیجاتی مانند خیار در شرایط خشکی به­منظور حفظ تولید مواد غذایی تحت شرایط خشکی لازم است (2). خیار گیاهی است که ریشه­های کم عمق و برگ گسترده دارد بنابراین به خشکی و شوری حساس است (4). به­طور عمده از اثرات اولیه تنش خشکی اختلال در جذب آب و مواد معدنی، هدایت روزنه ای و تولیدات فتوسنتز و کاهش رشد گیاه است (2 و 5). علاوه بر این گیاهان در تنش خشکی قادر به حفظ خود در برابر دیگر تنش­های زیستی یا غیرزیستی نیستند در نتیجه بهره­وری گیاه بیشتر محدود می­شود(6). در مجموع خشکسالی تنش چند بعدی است که نه تنها رشد گیاه را توسط اثرات اولیه محدود می­کند بلکه با تولید گونه‌های فعال اکسیژن  (Reactive Oxygen Species :ROS) اثرات مضر ثانویه تولید می­کند (7). اشکال مختلف ROS مانند رادیکال سوپر اکسید (O2-)، پراکسید هیدروژن (H2O2) و رادیکال هیدروکسیل ( OH-) در محفظه­های مختلف سلول مانند کلروپلاست یا میتوکندری تولید می­شود (8). فعالیت گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) ممکن است سبب بروز صدماتی همچون اکسید شدن (در نتیجه منجر به تغییر ساختار غشاء و از هم پاشیدگی یکپارچگی آن می‌شود)، تغییر ساختمان پروتئین‌ها و اکسید شدن گروه‌های سولفیدریل (‌-SH)، غیر فعال شدن آنزیم‌ها، بی‌رنگ شدن و یا از بین رفتن رنگدانه‌هائی مانند کلروفیل و سایر ترکیبات رنگیزه‌ای و هم چنین حمله مداوم به مولکول‌های آلی مثلDNA  و در نتیجه اختلال در رشته‌های DNA شود (9). گیاهان برای مقابله با تنش­هایی مانند تنش خشکی مکانیسم­های مختلفی از جمله انباشتن مقدار زیادی املاح سازگار (پرولین و قندهای محلول) و همچنین جاذب­های ROS را دارند (10). گیاهان سیستم آنتی­اکسیدانتی مختلف شامل ترکیبات آنزیمی و غیرآنزیمی دارند، گونه‌های فعال اکسیژن توسط آنتی­اکسیدانت­های غیرآنزیمی مانند گلوتاتیون، اسیدآسکوربیک، توکوفرول و آنتی­اکسیدانت­های آنزیمی مانند کاتالاز، سوپر اکسید دسموتاز، آسکوربات پراکسیداز، گونه‌های فعال اکسیژن را جاروب می‏کنند (11).

این تحقیق به‏منظور بررسی تغییرات در سیستم دفاع آنتی­اکسیدانتی در گیاه  خیار رقم اصفهانی در شرایط تنش خشکی انجام گرفته است.

مواد و روش­ها

بذر گیاه خیار رقم اصفهانی از مرکز بذر و نهال اصفهان تهیه شد و بذرها به‏مدت 5 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم 2 درصد و سپس شستشو به‏مدت 1 دقیقه در آب مقطر استریل شدند. پس از آن بذرها به‏مدت 12 ساعت در آب مقطر خیسانده شدند و هر 10 بذر در یک پتری‏دیش حاوی 2 برگ کاغذ صافی همراه با 10 میلی لیتر آب مقطر  کشت شدند و به دستگاه ژرمیناتور با تناوب دمایی 20/25 (شب/روز) و تناوب نوری 16/8 (روشنایی/تاریکی) و رطوبت 40 تا 50 درصد انتقال داده شدند. پس از 3 روز بذرهای جوانه­زده به گلدان­هایی به قطر 15 سانتی­متر که حاوی یک کیلوگرم مخلوط خاک باغچه و کود حیوانی پوسیده و ماسه شسته­شده به نسبت 2:1:2 بود منتقل شدند. آبیاری با توزین روزانه­ی گلدان­ها به‏صورت کامل (بر حسب ظرفیت زراعیFC=) با آب شهری انجام گرفت (12). پس از گذشت 30 روز از شروع کشت و در مرحله 3 تا 5 برگی گیاهان، تیمار خشکی بر روی گیاهان اعمال گردید. تیمارهای اعمال شده (بر حسب مقادیر ظرفیت زراعی) عبارت بودند از: آبیاری به‏میزان 100 درصد  ظرفیت زراعی (شاهد)، آبیاری به‏میزان 75 درصد ظرفیت زراعی (تنش ملایم)، آبیاری به اندازه‏ی 50 درصد  ظرفیت زراعی (تنش متوسط) و آبیاری به‏میزان 25 درصد  ظرفیت زراعی (تنش شدید). پس از 21 روز اعمال تنش خشکی، برگ گیاهان برداشت شد و تغییرات بیوشیمیایی حاصل از تنش خشکی در آن­ها مورد بررسی قرار گرفت. برای هر تیمار 5 گلدان به‏عنوان 5 تکرار با 4 گیاه در هر گلدان در نظر گرفته شد. شرایط گلخانه با دمای 20/25 درجه سانتی­گراد با رطوبت نسبی 40/50 درصد بود و آبیاری گلدان­ها با آب شهری انجام شد. آزمایش در یک طرح کاملا تصادفی در قالب آزمایشات فاکتوریل در 4 سطح تیمار خشکی انجام شد. برای اندازه‌گیری وزن خشک اندام هوایی و ریشه گیاهان به‏مدت 24 در آون 75 درجه سانتی‏گراد قرار داده شدند و سپس وزن خشک توسط ترازوی دیجیتال اندازه‌گیری شد.

اندازهگیری پروتئین به‏روش برادفورد: به ١٠٠ میلی‏لیتر بافر تریس ٥/٠ مولار که pH آن با اسیدکلریدریک به ٨/٦ رسانده شده، مقدار ٢ گرم سدیم دودوسیل سولفات افزوده و حل شد. پس از توزین 2/0 گرم از نمونه‏های تازه برگ و سائیدن آن‏هادر دمای 4 درجه سانتی‏گراد در ازت مایع، ١٠٠ میکرولیتر از بافر استخراج به آن افزوده و مخلوط شد. سپس محلول‏ها به‏مدت ١٥ دقیقه با دور rpm ١٣٠٠٠ سانتریفوژ شد. سپس ١٠٠ میلی‏گرم کوماسی بلو G250 در ١٥٠ میلی‏لیتر اتانول ٩٥ درصد حل شد و ١٠٠ میلی‏لیتر اسیدفسفریک ٨٥ درصد قطره قطره همراه با شیکر به آن اضافه و به حجم ۱ لیتر رسانده شد. سپس با کاغذ صافی واتمن شماره 1 چندبار صاف گردید تا رنگ آن به صورت قهوه‏ای کم‏رنگ درآمد. سپس با حل نمودن ۱ میلی‏گرم پودر آلبومین سرم گاو (BSA) درون 1 میلی‏لیتر آب مقطر دو بار تقطیر، محلول استاندارد پروتئین به‏دست آمد. برای تعیین مقدار پروتئین در عصاره‏های سلولی، به‏هر لوله ٢٥٠ میکرولیتر بافر فسفات، ٥ میلی‏لیتر معرف برادفورد اضافه گردید. سپس ٥٠٠ میکرولیتر از عصاره سلولی به هر لوله اضافه شد و حجم نهایی هر لوله  6 میلی‏لیتر شد. محتویات درون هر لوله به‏خوبی مخلوط و سپس جذب آن‏ها در طول موج ٥٩٥ نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر خوانده شد (13).

استخراج عصاره خام پروتئینی: برای تهیه عصاره آنزیمی، ١/٠ گرم از بافت تازه برگ گیاه در نیتروژن مایع سائیده و در ١ میلی­لیتر بافر سدیم فسفات ٥٠ میلی­مولار (pH=7) حاوی 1 میلی­مولار EDTA  حل شد. ترکیب حاصل در دمای 4 درجه سانتی‏گراد به‏مدت ٢٠ دقیقه با سرعت rpm ١٣٠٠٠ سانتریفوژ شد. از محلول شفاف رویی که حاوی عصاره آنزیمی بود، جهت تعیین میزان فعالیت آنزیم‏های آنتی­اکسیدان کاتالاز (CAT) و گایاکول­پراکسیداز (GPOX) استفاده شد (14).

سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز:١٠٠ میکرولیتر عصاره آنزیمی همراه ٢ میلی­لیتر از محلول بافر فسفات­سدیم ٢٥ میلی­مولار (pH=7) حاوی ١٠ میلی­مولار H2O2 به‏روش نورسنجی در طول موج ٢٤٠ نانومتر تعیین شد. جذب نمونه­ها بلافاصله پس از قرار داده شدن در دستگاه و بعد از گذشت یک­ دقیقه برای بار دوم ثبت شد. میزان فعالیت آنزیم با استفاده از ضریب خاموشی mM-1cm-14/39 محاسبه و برحسب میکرومول پراکسیدهیدروژن مصرف شده در دقیقه بر میلی­گرم پروتئین بیان گردید (15).

سنجش فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز(GPOX) :٣ میلی­لیتر مخلوط واکنش حاوی بافرفسفات سدیم ١٠٠ میلی­مولار (pH=7)، گایاکول ٢٠ میلی­مولار و ٥٠ میکرولیتر عصاره آنزیمی مخلوط شد. جذب براساس اکسیداسیون گایاکول با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر   T80+PG Instruent UV/Vis به‏مدت ٣ دقیقه در طول موج ٤36 نانومتر خوانده شد. در نهایت فعالیت آنزیم پراکسیداز با استفاده از ضریب خاموشی معادل mM-1cm-15/25 محاسبه و برحسب میکرومول تتراگایاکول تولید شده در دقیقه به­ازای میلی­گرم پروتئین بیان شد (16).

تعیین فعالیت آنتی­اکسیدانت­های آنزیمی کل:برای تعیین فعالیت کل از روش تغییریافته Abe et al.  (17) استفاده شد.

100 میلی­گرم برگ گیاه خیار درون یک میکروتیوب در ازت مایع و اتانول ٩٠ درصد هموژنایز و به‏مدت ٢٤ ساعت در 4 درجه سانتی‏گراد نگه‏داری گردید سپس مواد جامد نامحلول با استفاده از سانتریفوژ g ٣٥٠٠ به‏مدت ٥ دقیقه جدا شدند. مقدار ٣٠ میکرولیتر از محلول استخراجی با ٨٠٠ میکرولیتر از DPPH محلول در اتانول (٥/٠ میلی­مولار) مخلوط شدند و در نهایت میزان جذب در ٥١٧ نانومتر پس از ٣٠ دقیقه تاریکی قرائت شد (17). برای تعیین ظرفیت مهار فعالیت رادیکال DPPH از فرمول زیر استفاده شد.

١٠٠× (جذب نمونه شاهد/ (جذب نمونه مورد ارزیابی- جذب نمونه شاهد) = I درصد

اندازه­گیری آلفا توکوفرول: اساس این روش واکنش Emmene – Engel است که توسط  Rosenberg (18) گزارش شده است. 5/2 گرم بافت تر برگ گیاه در ml50 سولفوریک اسید 1/0 نرمال هموژنایز شده و به‏مدت یک شب روی شیکر نگه­داری گردید. سپس نمونه­ها به‏مدت ١٥ دقیقه با دور  rpm١٣٠٠٠ سانتریفوژ گردید و عصاره حاصل جهت اندازه­گیری α-توکوفرول استفاده شد. در 3 لوله فالکن جدا به‏ترتیب 5/1 میلی‏لیتر از عصاره استخراج شده، 5/1 میلی‏لیتر محلول استاندارد (10 میلی‏گرم α-توکوفرول در یک لیتر اتانول خالص)و 5/1 میلی‏لیتر آب ریخته شد و سپس 5/1 میلی­لیتر اتانول و 5/1 میلی­لیتر از زایلن به‏هر لوله اضافه و مخلوط گردید و توسط سانتریفوژ به‏مدت ١٥ دقیقه با دور rpm١٣٠٠٠ سانتریفوژ شد. در این‏جا نمونه­ها دو فاز می­دهد یک میلی­لیتر از فاز رویی که حاوی زایلن و توکوفرول است و یک میلی­لیتر از محلول 2و2 دی پریدین به خوبی مخلوط شد. در مرحله بعد جذب نمونه­ها در طول موج 460 نانومتر خوانده شد سپس33/0 میلی­لیتر از محلول کلرید آهن به نمونه­ها اضافه شد و جذب نمونه­ها بعد از 15 دقیقه در طول موج 520 نانومتر خوانده شد. از فرمول زیر برای محاسبه مقدار توکوفرول استفاده می­شود:

 

اندازه­گیری پراکسیداسیون لیپیدهای غشا:به­منظور اندازه­گیری پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء ازغلظت مالون­دی­آلدئید استفاده شد. ابتدا 5/0 گرم بافت برگ تازه در ازت مایع هموژن و سپس 4 میلی لیتر محلول  1/0 درصد  تری­کلرواستیک اسید به آن اضافه شد. محلول حاصل با دور rpm 10000 به‏مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شد. سپس ، 2 میلی­لیتر از عصاره رویی و 2 میلی‏لیتر محلول تری کلرواستیک اسید 20 درصد  حاوی 5/0 درصد تیوباربیتوریک اسید به‏مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم در دمای 95 درجه سانتی­گراد قرار داده شد سپس لوله­ها به‏مدت چند دقیقه روی یخ خرد شده قرار گرفت. محتوای لوله­ها مجددا به‏مدت 5 دقیقه سانتریفوژ شد و سپس جذب محلول­ها در طول موج 532 و 600 نانومتر خوانده شد. غلظت مالون­دی­آلدئید، با استفاده از فرمول زیر و با ضریب خاموشی  mM-1cm-1155 و برحسب نانومول بر گرم وزن تر محاسبه شد (19).

A=b

اندازه­گیرینشتپذیریغشاءسلولی: برای اندازه­گیری نشت پذیری غشاء سلولی 3/0 گرم برگ در 15 میلی­لیتر آب مقطر در شیشه­های استریل شناور شده و به‏مدت 2 ساعت در انکوباتور با دمای 25 درجه سانتی­گراد قرار داده وپس از این مدت هدایت الکتریکی توسط هدایت سنج الکتریکی برحسب (میلی زیمنس بر سانتی­متر) در دمای اتاق سنجیده شد. سپس نمونه­ها به انکوباتور با دمای 120  درجه سانتی­گراد منتقل پس از 20 دقیقه نمونه­ها از انکوباتور خارج و در دمای اتاق خنک شدند و مجددا هدایت الکتریکی نمونه­ها برحسب اندازه­گیری شد و از رابطه زیر نشت پذیری غشاء سلولی برحسب درصد محاسبه شد (20).

= (E1/E2)×100 نشت پذیری غشاء سلولی که در آنE1 بیان‏گر نشت اولیه و E2 نشت ثانویه می‏باشد.

اندازه­گیری هیدروژن پراکسید: در اندازه‌گیری هیدروژن‌ پراکسید از روش تغییریافتهولیکووا و همکاران (21) استفاده شد. ابتدا 5/0گرم از بافت برگ را با 5 میلی­لیتر ازتری­کلرو­استیک اسید یک دهم درصد روی یخ ساییده و عصاره حاصل به‏مدت 15 دقیقه در سانتریفوژ یخچال دار در دمای 4 درجه سانتی­گراد با 10000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد. سپس 500 میکرولیتر از محلول رویی را با 500 میکرولیتر بافر فسفات پتاسیم یک صدم مولار و 7pH= و یک میلی­لیتر از KI یک مولار مخلوط کرده جذب نمونه­ها را در طول موج 390 نانومتر خوانده و با رسم منحنی استاندارد H2O2 در غلظت­های 10، 25، 50، 75، 100 میکرومول  میزان H2O2 بر حسب میکرومول بر گرم محاسبه شد (21).

سنجش و اندازه­گیری اسیدآمینه پرولین: به‏منظور اندازه­گیری پرولین از روش Bates (22) استفاده شد. به ١/٠ گرم از بافت تر برگ ١٠ میلی­لیتر سولفوسالیسیلیک ٣ درصد افزوده شد. مخلوط حاصل هموژن سپس با کاغذ صافی واتمن شماره یک صاف شد. دو میلی­لیتر عصاره حاصل، دو میلی­لیتر معرف نین­هیدرین و دو میلی­لیتر اسیداستیک گلاسیال در لوله آزمایش ریخته و به‏مدت یک ساعت در بن­ماری با حرارت ١٠٠ درجه سانتی­گراد قرار داده شد، سپس لوله­ها از بن­ماری خارج و در دمای محیط سرد شدند، به‏هر لوله آزمایش ٤ میلی­لیتر تولوئن افزوده شد. پس از گذشت 1 تا 2 ساعت دو فازدر لوله آزمایش تشکیل شد: از فاز بالایی جهت خواندن جذب در طول موج ٥٢٠ نانومتر استفاده گردید. از تولوئن به‏عنوان محلول بلانک استفاده شد. میزان پرولین با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد.

X= [(A= B)/C]/(D/5)

X: مقدار پرولین برحسب میکرو‌مول بر گرم وزن تر برگ، A: مقدار پرولین به‏دست آمده از منحنی استاندارد بر حسب میکروگرم در میلی‌لیتر (پیوست 6)، B: مقدار تولوئن استفاده شده بر حسب میلی‌لیتر، C: عدد مولکولی پرولین μg/μmol 13/115 و D: مقدار نمونه گیاهی وزن شده برحسب گرم.

آنالیز آماری

تجزیه و تحلیل داده‌ها با نرم‌افزار spss16، مقایسه میانگین‌ها براساس آزمون دانکن و رسم نمودارها با کمک نرم‌افزار Excel انجام شد.

نتایج

بررسی نتایج این مطالعه نشان داد که تنش خشکی اثر منفی و معنی‌داری بر میزان پروتئین محلول برگ نشان داد. با افزایش سطح تنش میزان پروتئین کاهش یافت. بیشترین میزان پروتئین در گیاهان شاهد و کمترین میزان آن در گیاهان تحت تنش شدید مشاهده شد. طی تنش متوسط و شدید به ترتیب کاهش 92/36 و 01/49 درصدی در میزان پروتئین محلول برگ مشاهده شد (شکل1).

خشکی اثر معنی‌داری بر فعالیت آنزیم کاتالاز، گایاکول پراکسیداز، میزان آنتی‌اکسیدان کل و آلفا توکوفرول در (سطح 01/0) داشت. مقایسه میانگین‌ها نشان داد که کمترین میزان این شاخص­ها در گیاهان شاهد بود و با افزایش سطح خشکی میزان این شاخص­ها نیز افزایش یافت به‏طوری‏که بیشترین میزان این شاخص‏ها در گیاهان تحت تنش شدید مشاهده شد. طی تنش شدید میزان فعالیت آنزیم کاتالاز افزایش 69/49 درصدی، میزان فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز افزایش 11/33 درصدی، میزان آنتی‌اکسیدان کل افزایش 68/31 درصدی و آلفا توکوفرول افزایش20/6 برابری را نسبت به شاهد نشان داد(شکل 1).

 

 

   
   

 

شکل1: مقایسه میانگین اثر سطوح مختلف تنش خشکی [25، 50، 75 و 100 درصد ظرفیت زراعی (FC)] بر میزان فعالیت آنزیم کاتالاز (a) ، فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز (b)، آنتی‌اکسیدانت کل (c)،آلفا توکوفرول (d) و پروتئین (d) برگ گیاه خیار رقم اصفهانی. خطوط نشان‌دهندهSE  وحروف غیرمشابه نشان‌دهنده معنی‌دار بودن بر اساس آزمون دانکن (سطح 05/0) می‌باشد.

 

نتایج نشان داد که تنش خشکی بر میزان پراکسیداسیون لیپید و نشت‌پذیری غشای سلولی اثر معنی‌داری (سطح01/0) داشته است. کمترین میزان این شاخص­ها در گیاهان شاهد و بیشترین میزان آن در گیاهان تحت تنش شدید مشاهده شد. بیشترین افزایش پراکسیداسیون لیپید 12/39 و نشت‌پذیری غشاء سلولی83/4 درصد نسبت به شاهد در گیاهان تحت تنش شدید مشاهده شد (شکل2).

 

   

شکل2: مقایسه میانگین اثر سطوح [100، 75، 50 و 25 درصد ظرفیت زراعی (FC)] تنش خشکی بر میزان پراکسیداسیون لیپید (a) و نشت‌پذیری غشای سلولی (b) خیار اصفهانی. خطوط نشان‌دهندهSE  وحروف غیرمشابه نشان‌دهنده معنی‌دار بودن بر اساس آزمون دانکن (سطح 05/0) می‌باشد.

 

آنالیز داده‌ها و مقایسه میانگین‌ها بر روی میزان هیدروژن پراکسید و پرولین تولید شده در شرایط خشکی بیانگر افزایش معنی‌دار (سطح 01/0) بود. کمترین میزان این شاخص­ها در گیاهان شاهد و بیشترین میزان آن در گیاهان تحت تنش شدید مشاهده شد میزان هیدروژن پراکسید در تنش شدید 14/2 برابر و میزان پرولین 89/64 درصدی افزایش یافت(شکل3).

 

   

شکل3: مقایسه میانگین اثر سطوح [100، 75، 50 و 25 درصد ظرفیت زراعی (FC)] تنش خشکی بر میزان هیدروژن پراکسید  (a) و پرولین (b) خیار اصفهانی. خطوط نشان‌دهندهSE  وحروف غیرمشابه نشان‌دهنده معنی‌دار بودن بر اساس آزمون دانکن (سطح 01/0) می‌باشد.

 

بحث

کاهش محتوای پروتئین در اثر تنش خشکی در این مطالعه مشاهده شد. بررسی محتوای پروتئین کل گیاه انجدان رومی قرار گرفته در معرض تنش خشکی، کاهش این محتوا را در طی تنش شدید خشکی مشخص کرد که با نتایج مطالعه ما مطابقت دارد (23). کاهش در غلظت پروتئین یک نشانه‌ی معمول از تنش اکسیداتیو می‌باشد و اغلب در گیاهان قرارگرفته تحت تنش خشکی مشاهده می‌شود (24). در مطالعه مفاخری و همکاران (24) روی کولتیوارهای Bivaniej، ILC482 و Pirouz  نخود در مراحل رشد رویشی و فاز گل‏د‏هی تحت تاثیر تنش خشکی کاهش محتوای پروتئین هر سه کولتیوار در هر دو فاز رویشی و گلدهی مشاهده شد. در بررسی دیگری محتوای پروتئین دانه در 5 کولتیوار مطالعه شده از گندم در طی تنش خشکی کاهش معنی‌داری را نشان داد (25).

در بسیاری از تحقیقات کاهش عوارض جانبی ناشی از تنش خشکی در گیاهان، توسط سیستم­های آنتی­اکسیدانتی آنزیمی و غیرآنزیمی گزارش شده است (26 و 27). محققان معتقدند از اثرات تنش اکسیداتیو ناشی از خشکسالی در گیاهان، توسعه یک مکانیسم پیچیده­ای از سیستم آنتی­اکسیدانتی است. فعالیت آنتی­اکسیدانت‏های آنزیمی (27) و غیرآنزیمی (28) در گیاهان مقاوم به تنش خشکی در مقایسه با گونه­های حساس به خشکی، بالاتر است. در نتیجه نقش سیستم آنتی اکسیدانتی در تحمل به تنش خشکی اجتناب ناپذیر است. دانگ و همکارانش (28) افزایش فعالیت آنتی‏اکسیدانت‏های آنزیمی و غیرآنزیمی را در افزایش سطوح تنش خشکی و سرما  در گیاه خیار نشان دادند. گونه‌های واکنش‌گر اکسیژن (ROS) تولیدی توسط تنش‌های مختلف از جمله خشکی از طریق تخریب نوکلئیک اسیدها، اکسیداسیون پروتئین‌ها و پراکسیداسیون لیپیدها روی بسیاری از جنبه‌های عملکردی سلول‌ها اثر می‌گذارند (8)، بنابراین سلول برای حفظ بقا مجبور به استفاده از یک سیستم دفاعی آنتی‌اکسیدانتی در برابر ROS می‌شود. به عبارت دیگر تجمع ROSهای القا شده توسط تنش به وسیله سیستم آنتی‌اکسیدانتی خنثی می‌شود. مطالعات نشان داد که گونه‌های گیاهی متحمل نسبت به تنش، سیستم‌های آنتی‌اکسیدانتی کارآمدتری را نسبت به گونه‌ها یا سویه‌های حساس دارند. هر چند که، القای سنتز آنتی‌اکسیدانت‌های آنزیمی در پاسخ به تنش وابسته به گونه و شدت تنش متغیر است (29). گیاه در چنین شرایطی با افزایش سنتز آنتی‌اکسیدانت‏های آنزیمی همچون گایاکول ‌پراکسیداز و کاتالاز از تجمع ROS و در نتیجه اثرات منفی ناشی از آن‌ها جلوگیری می‌کند.

در این مطالعه با افزایش سطح خشکی میزان آنزیم کاتالاز، گایاکول پراکسیداز، میزان آنتی‌اکسیدانت کل و میزان آلفا توکوفرول نیز افزایش یافت به‏طوری‏که بیشترین میزان این شاخص‏ها در گیاهان تحت تنش شدید مشاهده شد. کاتالاز با توانایی جاروب رادیکال H2O2 از تجمع ROS جلوگیری می‌کند و بنابراین گیاه را در برابر پراکسیداسیون لیپیدی سیستم‌های غشایی و آسیب‌های اکسیداتیو تحت استرس خشکی محافظت می‌نماید (24). نتیجه‌ی مشابه مطالعه حاضر در افزایش فعالیت کاتالاز در گیاه Curcuma alismatifolia تحت تنش کمبود آب گزارش شد (30). لوم و همکاران (31) 8 واریته از گیاه برنج را در معرض استرس خشکی قرار دادند. بررسی فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانتی افزایش فعالیت آنزیم گایاکول‌پراکسیداز را مشخص کرد. حبیبی (32) در بررسی اثر تنش خشکی در گیاه جو، افزایش فعالیت آنزیم پراکسیداز در این گیاه را طی تنش گزارش کرد. افزایش تولید گونه‌های فعال اکسیژن منجر به افزایش پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی و تخریب اسیدهای نوکلئیک، پروتئین‌های عملکردی و ساختاری می‌شود. اندامک‌های مختلف شامل کلروپلاست‌ها، میتوکندری‌ها و پراکسی‌زوم‌ها جزء اولین اهداف گونه‌های فعال اکسیژن تولیدشده در طی تنش خشکی هستند (33). سیستم دفاعی آنتی‌اکسیدانتی موجود در گیاهان از آن‌ها در برابر آسیب‌های تنش اکسیداتیو محافظت می‌کند (34). سعیدنژاد و همکاران (35) اثر تنش خشکی را بر سیستم آنتی‌اکسیدانتی گیاه زیره کوهی مطالعه کردند و افزایش درصد تخریب رادیکال DPPH را در طی این تنش مشاهده کردند. محمد و اکلادیوس (36) سیستم آنتی‌اکسیدانتی گیاه سویا قرار گرفته در معرض تنش خشکی را مورد مطالعه قرار دادند. آلفا توکوفرول در غشاء تیلاکویئد واقع است و در سم زدایی ROS درگیر است و همچنین مانع از پراکسیداسیون لیپید می‏شود (37). آلفا توکوفرول ترکیب اصلی ویتامین E اثرات نامطلوب استرس‏های محیطی را در غیاب چرخه گزانتوفیل کاهش می‏دهد (38). در این مطالعه محتوای آنتی‌اکسیدانت‌های غیر آنزیمی از جمله آلفا توکوفرول با افزایش شدت خشکی افزایش یافت. افزایش سطوح این ترکیب در هنگام تنش نشان‌دهنده‌ی مقاومت گیاه در برابر تنش می‌باشد که با کاهش آسیب‌های اکسیداتیو ناشی از تنش همراه است (37).

نتایج مطالعه ما مشخص کرد که نشت‌پذیری غشاء سلولی و پراکسیداسیون لیپید با افزایش سطوح خشکی افزایش معنی‌داری یافت. افزایش نشت الکترولیتی مواد نشانه‌ای از آسیب غشاها و کاهش پایداری غشاها می‌باشد که احتمالا نتیجه تنش اکسیداتیو است. بر اثر تجزیه اسیدهای چـرب غیراشـباع توسط ROS، ترکیبـاتی مثـل مـالون‌دی‌آلدئیـد (MDA) تولیـد می‌شود که برای سلول مسمومیت ایجاد می‌کند. تجمع مالون دی‌آلدئید در شرایط تنش سبب افزایش نفوذپـذیری غـشای پلاسمایی می‌شود و نشت یونی افزایش می‌یابد که شاخـصی از میزان صدمه‌ی اکسایشی به‌شمار می‌رود (39) جانگ‌لانگ و همکاران (30) نیز نتیجه مشابهی را در مورد افزایش نشت یون بر اثر تنش کمبود آب در گیاه Curcuma alismatifoliaتحت شدت‌های مختلف خشکی گزارش کردند، اندازه‌گیری نشت یون برگ پس از 30 روز افزایش این شاخص را با افزایش شدت خشکی مشخص کرد. پراکسیداسیون لیپیدها در غشاهای زیستی بارزترین علامت استرس اکسیداتیو در گیاهان است. هنگامی‏که سطوح ROS از ظرفیت گیاه برای جاروب‌کردن رادیکال‌های آزاد بیشتر می‌شود، پراکسیداسیون لیپیدها افزایش می‌یابد و به موجب آن فرآیندهای فیزیولوژیکی سلول را تحت تاثیر قرار می‌دهد (40). بررسی تاثیر تنش خشکی بر گیاه سیاه‌ گلیافزایش 82 درصدی محتوای MDA تحت تنش خفیف و افزایش 131 درصدی MDA تحت تنش شدید را نشان داد (41). لی و همکارانش (4) افزایش تولید گونه های ROS مانند هیدروژن پراکسید و محتوای MDA را با افزایش شدت خشکی در گیاهان خیار مشخص کردند. در مطالعات دیگر افزایش محتوای  MDA و نشت‌پذیری غشاء سلولی در گیاهان خیار گزارش شد (42).

نتایج این مطالعه مشخص کرد که افزایش تنش خشکی سبب افزایش میزان هیدروژن پراکسید و محتوای پرولین گاه خیار رقم اصفهانی شد. فان و همکاران (43) اثرات کوتاه‌مدت تنش کمبود آب را بر محتوای H2O2 ریشه گیاه خیار مورد بررسی قرار دادند. بررسی‌ها نشان داد که محتوایH2O2 در طی تنش در ریشه گیاه خیار افزایش معنی‌داری را نشان داد. در میان گونه‌های فعال اکسیژن، H2O2 به‏عنوان یک ROS پایدار می‌تواند در سراسر غشاهای زیستی منتشر شود و آسیب‌های شدیدی را در متابولیسم گیاه تحت شرایط تنش ایجاد کند. جعفری و همکاران (44) اثرپرولین به‏عنوان یک اسمولیت، یک پیش ماده برای پروتئین ها، سم زدای ROS، تثبیت کننده غشا، مولکول آنتی‌اکسیدانت‌ و مولکول سیگنال گزارش شده است (45). بنابراین محتوای پرولین یک شاخص خوب برای نشان دادن مقاومت به خشکی است. افزایش محتوای بالای پرولین گیاه خیار را در طی تنش اسمزی گزارش کردند. نشان داده شده است که پرولین تولید اکسیژن منفرد را سرکوب می‌کند. کاهش محتوای ROS و تنظیم نسبت NAD/NADH به پرولین نسبت داده شده است (46).

نتیجه‏گیری

این مطالعه نشان می‏دهد که تنش خشکی منجر به افزایش در پراکسیداسیون لیپیدها، پراکسید هیدروژن و نشت‌پذیری غشاء سلولی می­شود. از طرفی تنش خشکی منجر به کاهش میزان پروتئین در خیار اصفهانی شد.

منابع

1. Manivannan P, Jaleel CA, Somasundaram R, Panneerselvam R. Osmoregulation and antioxidant metabolism in drought-stressed Helianthus annuus under triadimefon drenching. C. R. Biol. 2008; 331(6): 418-425.

2. Kusvuran S. Effects of drought and salt stresses on growth, stomatal conductance, leaf water and osmotic potentials of melon genotypes (Cucumis melo L.). Afr. J. Agric. Res. 2012; 7(5): 775-781.

3. Sarmadnia GH. [The importance of environmental stresses in agriculture. Key articles of the First Congress of Agronomy and Plant Breeding], Tehran University, Tehran. 1993.(in Persian).

4. Li J, Nishimura Y, Zhao X, Fukumoto Y. Effects of Drought Stress on the Metabolic Properties of Active Oxygen Species, Nitrogen and Photosynthesis in Cucumber ‘Jinchun No. 5’Seedlings. JPN. AGR. RES. Q. 2014; 48: 175-181.

5. Hu Y, Schmidhalter U. Drought and salinity: a comparison of their effects on mineral nutrition of plants. J.Plant Nutr. Soil Sci. 2005; 168(4): 541-549.

6. Ramegowda V, Senthil-Kumar M. The interactive effects of simultaneous biotic and abiotic stresses on plants: Mechanistic understanding from drought and pathogen combination. J. Plant Physiol. 2015; 176: 47-54.

7. Zhu Z, Wei G, Li J, Qian Q, et al.Silicon alleviates salt stress and increases antioxidant enzymes activity in leaves of salt-stressed cucumber (Cucumis sativus L.). Plant Sci. 2004; 167: 527-533.

8. Foryer C, Noctor G. Oxygen processing in photosynthesis: regulation and signaling. New Phytol. 2000; 146: 359-388.

9. Habibi D, Mashdi-Akbar M, Boojar A, Mahmoudi M, et al. Antioxidative enzyme in sunflower subjected to drought stress. 4th International Crop Science, Congress, Brisbane, Australia, 2004.

10. Serraj R, Sinclair T. Osmolyte accumulation: can it really help increase crop yield under drought conditions? Plant cell environ. 2002; 25(2): 333-341.

11. Li H, Li X, Zhang D, Liu H, et al.Effects of drought stress on the seed germination and early seedling growth of the endemic desert plant Eremosparton songoricum (Fabaceae). J. Exp. Clin. Sci. 2013; 12:89-101.

12. Amiri-Dehabadi R, Parsa M, Ganjali A. Effect of drought stress on morphological characteristics and yield components in different phenological stages of chickpea (Cicer arietinum L.) in greenhouse conditions. Iranian J. Field Crops Res. 2010; 8: 157-166.

13. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72(1-2): 248-254.

14. Giannopolitis CN, Ries SK. Superoxide dismutases: I. occurrence in higher plants. Plant Physiol. 1977; 59(2):309-314.

15. Cakmak I, Marschner H. Magnesium deficiency and high light intensity enhance activities of superoxide dismutase, ascorbate peroxidase, and glutathione reductase in bean leaves. Plant physiol. 1992; 98(4): 1222-1227.

16. Polle A, Otter T, Seifert F. Apoplastic peroxidases and lignification in needles of Norway spruce (Picea abies L.). Plant Physiol. 1994; 106(1): 53-60.

17. Abe N, Murata T, Hirota A. Novel 1,1-diphenyl-2-picryhy- drazyl- radical scavengers, bisorbicillin and demethyltrichodimerol, from a fungus. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998; 62: 661-662.

18. Rosenberg HR. Chemistry and physiology of the vitamins. New York, Interscience, 1942.

19. Heath RL, Packer L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts: I. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Arch. Biochem. biophys. 1968; 125(1): 189-198.

20. Valentovic P, Luxova M, Kolarovic L, Gasparikova O. Effect of osmotic stress on compatible solutes content, membrane stability and water relations in two maize cultivars. Plant Soil Environ. 2006; 52(4): 184-191.

21. Velikova V, Yordanov I, Edreva A. Oxidative stress and some antioxidant systems in acid rain-treated bean plants: protective role of exogenous polyamines. Plant Sci. 2000; 151(1): 59-66.

22. Bates LS, Waldren RP, Teare ID. Rapid determination of free proline for water-stress studies. Plant Soil. 1973; 39(1): 205-207.

23. Akhzari D, Pessarakli M. Effect of Drought Stress on Total Protein, Essential Oil Content, and Physiological Traits of Levisticum officinale Koch. J. Plant Nutr. 2016; 39(10): 243-250.

24. Mafakheri A, Siosemardeh A, Bahramnejad B, Struik PC, et al. Effect of drought stress and subsequent recovery on protein, carbohydrate contents, catalase and peroxidase activities in three chickpea (Cicer arietinum) cultivars. Aust. J.Crop Sci. 2011; 5(10): 1255-1260.

25. Ashrafi-Parchin R, Shaban M. Study on protein Changes in wheat under drought stress. International journal of Advanced Biological and Biomedical Research, 2014; 2: 317-320.

26. Khan A, Ashraf M. Exogenously applied ascorbic acid alleviates salt-induced oxidative stress in wheat. Environ. Exper. Bot. 2008; 63: 224-231.

27. Mandhania S, Madan S, Sawhney V. Antioxidant defense mechanism under salt stress in wheat seedlings. Biol. Plantarum. 2006; 50(2): 227-231.

28. Dong X, Bi H, Wu G, Ai X. Drought-induced chilling tolerance in cucumber involves membrane stabilisation improved by antioxidant system. Int. J.Plant Prod. 2013; 7(1): 67-80.

29. Bernardi R, Nali C, Gargiulo R, Puglieesi C, et al. Protein pattern and Fe-superoxide dismutase activity of bean plants under sulphur dioxide stress. J. Phytopathol. 2001; 149: 477-480.

30. Jungklang J, Saengnil K, Uthaibutra J. Effects of water-deficit stress and paclobutrazol on growth, relative water content, electrolyte leakage, proline content and some antioxidant changes in Curcuma alismatifolia Gagnep. cv. Chiang Mai Pink. Saudi J. Biol. Sci. 2015; In press.  

31. Lum MS, Hanafi MM, Rafii YM, Akmar ASN. Effect of drought on growth, proline and antioxidant enzyme activities of upland rice, 2014، The Journal of Animal and Plant Sciences. 2014; 24(5): 1487-1493.

32. Habibi G. Effect of drought stress and selenium spraying on photosynthesis and antioxidant activity of spring barley. Acta agric. Slov. 2013; 101(1): 31-39.

33. Farooq M, Wahid A, Kobahashi N, Fujita D, et al. Plant drought stress: effects, mechanisms and management. Agron. Sustain. Dev. 2009; 29(1): 185-212.

34. Gill SS, Tuteja N. Reactive oxygen species and antioxidant machinary in abiotic stress tolerant in crop plants. Plant Physiol. Biochem. 2010; 48(12): 909-930.

35. Saeidnejad AH, Kafi M, Khazaei HR, Pessarakli M. Efects of drought stress on quantitative and qualitative yield and antioxidative activity of Bunium persicum. Turk. J.Bot. 2013; 37: 930-939.

36. Mohamed HI, Akladious SA. Influence of garlic extract on enzymatic and non enzymatic antioxidants in soybean plants (Glycine max) grown under drought stress. Life Sci. 2014; 11(3s): 46-58.

37. Munne-Bosch S. The role of α-tocopherol in plant stress tolerance. Plant Physiol. 2005; 162(7): 743-748.

38. Havaux, M, Bonfils, J.-P, Lütz, C, Niyogi KK. Photodamage of the photosynthetic apparatus and its dependence on the leaf developmental stage in the npq1 Arabidopsis mutant deficient in the xanthophyll cycle enzyme violaxanthin de-epoxidase. Plant Physiol. 2000; 124(1): 273-284.

39. Gulen H, Turhan E, Eris A. Changes in peroxidase activities and soluble proteins in strawberry varieties under salt stress. Acta Physiol. Plant. 2006; 28: 109–116.

40. Labudda M. Lipid peroxidation as a biochemical marker for oxidative stress during drought. An effective tool for plant breeding. E-wydawnictwo, Poland. 2013; 5(2): 23-29.

41. Ashaha DVM, Liu L, Ueda A, Nagaoka T. et al. Effects of drought stress on growth, solute accumulation and membrane stability of leafy vegetable, huckleberry (Solanum scabrum Mill.). J. Environm. Biol. 2016; 37(1): 107-114. 

42. Arasimowicz-Jelonek M, Floryszak-Wieczorek J, Kubiś J. (2009). Interaction Between Polyamine and Nitric Oxide Signaling in Adaptive Responses to Drought in Cucumber. Journal of Plant Growth Regulation, 28(2): 177-186.

43. Fan HF, Ding L, Du CX, Wu X. Effect of short-term water deficit stress on antioxidative systems in cucumber seedling roots. Bot. Stud. 2014; 55: 1-7.

44. Jafari SR, Arvin SMJ, Manoochehri-Kalantari K. Response of cucumber (Cucumis sativus l.) seedlings to exogenous silicon and salicylic acid under osmotic stress. Acta Biolo. Szegediensis. 2015; 59(1): 25-33.

45. Hayat S, Hayat  Q, Alyemeni MN, Wani AS, et al. Role of proline under changing environments: a review. Plant Signaling & Behavior. 2012; 7(11), 1456-1466.

46. Soshinkova TN, Radyukina NL, Korolkova DV, Nosov AV. Proline and functioning of the antioxidant system in Thellungiella salsuginea plants and cultured cells subjected to oxidative stress. Russ. J. Plant Physiol. 2013; 60: 41-54.

. Manivannan P, Jaleel CA, Somasundaram R, Panneerselvam R. Osmoregulation and antioxidant metabolism in drought-stressed Helianthus annuus under triadimefon drenching. C. R. Biol. 2008; 331(6): 418-425.

2. Kusvuran S. Effects of drought and salt stresses on growth, stomatal conductance, leaf water and osmotic potentials of melon genotypes (Cucumis melo L.). Afr. J. Agric. Res. 2012; 7(5): 775-781.

3. Sarmadnia GH. [The importance of environmental stresses in agriculture. Key articles of the First Congress of Agronomy and Plant Breeding], Tehran University, Tehran. 1993.(in Persian).

4. Li J, Nishimura Y, Zhao X, Fukumoto Y. Effects of Drought Stress on the Metabolic Properties of Active Oxygen Species, Nitrogen and Photosynthesis in Cucumber ‘Jinchun No. 5’Seedlings. JPN. AGR. RES. Q. 2014; 48: 175-181.

5. Hu Y, Schmidhalter U. Drought and salinity: a comparison of their effects on mineral nutrition of plants. J.Plant Nutr. Soil Sci. 2005; 168(4): 541-549.

6. Ramegowda V, Senthil-Kumar M. The interactive effects of simultaneous biotic and abiotic stresses on plants: Mechanistic understanding from drought and pathogen combination. J. Plant Physiol. 2015; 176: 47-54.

7. Zhu Z, Wei G, Li J, Qian Q, et al.Silicon alleviates salt stress and increases antioxidant enzymes activity in leaves of salt-stressed cucumber (Cucumis sativus L.). Plant Sci. 2004; 167: 527-533.

8. Foryer C, Noctor G. Oxygen processing in photosynthesis: regulation and signaling. New Phytol. 2000; 146: 359-388.

9. Habibi D, Mashdi-Akbar M, Boojar A, Mahmoudi M, et al. Antioxidative enzyme in sunflower subjected to drought stress. 4th International Crop Science, Congress, Brisbane, Australia, 2004.

10. Serraj R, Sinclair T. Osmolyte accumulation: can it really help increase crop yield under drought conditions? Plant cell environ. 2002; 25(2): 333-341.

11. Li H, Li X, Zhang D, Liu H, et al.Effects of drought stress on the seed germination and early seedling growth of the endemic desert plant Eremosparton songoricum (Fabaceae). J. Exp. Clin. Sci. 2013; 12:89-101.

12. Amiri-Dehabadi R, Parsa M, Ganjali A. Effect of drought stress on morphological characteristics and yield components in different phenological stages of chickpea (Cicer arietinum L.) in greenhouse conditions. Iranian J. Field Crops Res. 2010; 8: 157-166.

13. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72(1-2): 248-254.

14. Giannopolitis CN, Ries SK. Superoxide dismutases: I. occurrence in higher plants. Plant Physiol. 1977; 59(2):309-314.

15. Cakmak I, Marschner H. Magnesium deficiency and high light intensity enhance activities of superoxide dismutase, ascorbate peroxidase, and glutathione reductase in bean leaves. Plant physiol. 1992; 98(4): 1222-1227.

16. Polle A, Otter T, Seifert F. Apoplastic peroxidases and lignification in needles of Norway spruce (Picea abies L.). Plant Physiol. 1994; 106(1): 53-60.

17. Abe N, Murata T, Hirota A. Novel 1,1-diphenyl-2-picryhy- drazyl- radical scavengers, bisorbicillin and demethyltrichodimerol, from a fungus. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998; 62: 661-662.

18. Rosenberg HR. Chemistry and physiology of the vitamins. New York, Interscience, 1942.

19. Heath RL, Packer L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts: I. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Arch. Biochem. biophys. 1968; 125(1): 189-198.

20. Valentovic P, Luxova M, Kolarovic L, Gasparikova O. Effect of osmotic stress on compatible solutes content, membrane stability and water relations in two maize cultivars. Plant Soil Environ. 2006; 52(4): 184-191.

21. Velikova V, Yordanov I, Edreva A. Oxidative stress and some antioxidant systems in acid rain-treated bean plants: protective role of exogenous polyamines. Plant Sci. 2000; 151(1): 59-66.

22. Bates LS, Waldren RP, Teare ID. Rapid determination of free proline for water-stress studies. Plant Soil. 1973; 39(1): 205-207.

23. Akhzari D, Pessarakli M. Effect of Drought Stress on Total Protein, Essential Oil Content, and Physiological Traits of Levisticum officinale Koch. J. Plant Nutr. 2016; 39(10): 243-250.

24. Mafakheri A, Siosemardeh A, Bahramnejad B, Struik PC, et al. Effect of drought stress and subsequent recovery on protein, carbohydrate contents, catalase and peroxidase activities in three chickpea (Cicer arietinum) cultivars. Aust. J.Crop Sci. 2011; 5(10): 1255-1260.

25. Ashrafi-Parchin R, Shaban M. Study on protein Changes in wheat under drought stress. International journal of Advanced Biological and Biomedical Research, 2014; 2: 317-320.

26. Khan A, Ashraf M. Exogenously applied ascorbic acid alleviates salt-induced oxidative stress in wheat. Environ. Exper. Bot. 2008; 63: 224-231.

27. Mandhania S, Madan S, Sawhney V. Antioxidant defense mechanism under salt stress in wheat seedlings. Biol. Plantarum. 2006; 50(2): 227-231.

28. Dong X, Bi H, Wu G, Ai X. Drought-induced chilling tolerance in cucumber involves membrane stabilisation improved by antioxidant system. Int. J.Plant Prod. 2013; 7(1): 67-80.

29. Bernardi R, Nali C, Gargiulo R, Puglieesi C, et al. Protein pattern and Fe-superoxide dismutase activity of bean plants under sulphur dioxide stress. J. Phytopathol. 2001; 149: 477-480.

30. Jungklang J, Saengnil K, Uthaibutra J. Effects of water-deficit stress and paclobutrazol on growth, relative water content, electrolyte leakage, proline content and some antioxidant changes in Curcuma alismatifolia Gagnep. cv. Chiang Mai Pink. Saudi J. Biol. Sci. 2015; In press.  

31. Lum MS, Hanafi MM, Rafii YM, Akmar ASN. Effect of drought on growth, proline and antioxidant enzyme activities of upland rice, 2014، The Journal of Animal and Plant Sciences. 2014; 24(5): 1487-1493.

32. Habibi G. Effect of drought stress and selenium spraying on photosynthesis and antioxidant activity of spring barley. Acta agric. Slov. 2013; 101(1): 31-39.

33. Farooq M, Wahid A, Kobahashi N, Fujita D, et al. Plant drought stress: effects, mechanisms and management. Agron. Sustain. Dev. 2009; 29(1): 185-212.

34. Gill SS, Tuteja N. Reactive oxygen species and antioxidant machinary in abiotic stress tolerant in crop plants. Plant Physiol. Biochem. 2010; 48(12): 909-930.

35. Saeidnejad AH, Kafi M, Khazaei HR, Pessarakli M. Efects of drought stress on quantitative and qualitative yield and antioxidative activity of Bunium persicum. Turk. J.Bot. 2013; 37: 930-939.

36. Mohamed HI, Akladious SA. Influence of garlic extract on enzymatic and non enzymatic antioxidants in soybean plants (Glycine max) grown under drought stress. Life Sci. 2014; 11(3s): 46-58.

37. Munne-Bosch S. The role of α-tocopherol in plant stress tolerance. Plant Physiol. 2005; 162(7): 743-748.

38. Havaux, M, Bonfils, J.-P, Lütz, C, Niyogi KK. Photodamage of the photosynthetic apparatus and its dependence on the leaf developmental stage in the npq1 Arabidopsis mutant deficient in the xanthophyll cycle enzyme violaxanthin de-epoxidase. Plant Physiol. 2000; 124(1): 273-284.

39. Gulen H, Turhan E, Eris A. Changes in peroxidase activities and soluble proteins in strawberry varieties under salt stress. Acta Physiol. Plant. 2006; 28: 109–116.

40. Labudda M. Lipid peroxidation as a biochemical marker for oxidative stress during drought. An effective tool for plant breeding. E-wydawnictwo, Poland. 2013; 5(2): 23-29.

41. Ashaha DVM, Liu L, Ueda A, Nagaoka T. et al. Effects of drought stress on growth, solute accumulation and membrane stability of leafy vegetable, huckleberry (Solanum scabrum Mill.). J. Environm. Biol. 2016; 37(1): 107-114. 

42. Arasimowicz-Jelonek M, Floryszak-Wieczorek J, Kubiś J. (2009). Interaction Between Polyamine and Nitric Oxide Signaling in Adaptive Responses to Drought in Cucumber. Journal of Plant Growth Regulation, 28(2): 177-186.

43. Fan HF, Ding L, Du CX, Wu X. Effect of short-term water deficit stress on antioxidative systems in cucumber seedling roots. Bot. Stud. 2014; 55: 1-7.

44. Jafari SR, Arvin SMJ, Manoochehri-Kalantari K. Response of cucumber (Cucumis sativus l.) seedlings to exogenous silicon and salicylic acid under osmotic stress. Acta Biolo. Szegediensis. 2015; 59(1): 25-33.

45. Hayat S, Hayat  Q, Alyemeni MN, Wani AS, et al. Role of proline under changing environments: a review. Plant Signaling & Behavior. 2012; 7(11), 1456-1466.

46. Soshinkova TN, Radyukina NL, Korolkova DV, Nosov AV. Proline and functioning of the antioxidant system in Thellungiella salsuginea plants and cultured cells subjected to oxidative stress. Russ. J. Plant Physiol. 2013; 60: 41-54.