شناسایی کمی و فعالیت ضدتکثیری برخی از آنتوسیانین‌های عصاره پوست لوبیا قرمز (L. Phaseolus vulgaris) تحت تیمار میدان الکترومغناطیسی

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، تهران، ایران

چکیده

هدف: هدف از پژوهش حاضر تعیین کمی برخی از آنتوسیانین­های عصاره پوست لوبیا قرمز تیمار شده با میدان الکترومغناطیسی و همچنین بررسی فعالیت ضدتکثیری عصاره­های تهیه شده می­باشد.
مواد و روش­ها: در این تحقیق، گروه 1 و 2 (به‏ترتیب بذرهای خشک و مرطوب) به‏مدت 45 دقیقه و گروه 3 و 4 ( به‏ترتیب بذرهای خشک و مرطوب) دو بار، هر بار 45 دقیقه و با فاصله زمانی 120 دقیقه تحت تاثیر میدان الکترومغناطیسی قرار گرفتند. سپس بذرها کشت شدند. پوست بذرهای برداشت شده هر گروه جدا شد و با حلال متانولی عصاره­گیری شد. در عصاره­ها دو گروه آنتوسیانین شامل سیانیدین و پلارگونیدین، توسط دستگاه HPLC (کروماتوگرافی) شناسایی و اندازه­گیری شد. همچنین بررسی فعالیت ضدتکثیری به‏روش MTT بر روی لاین سلول­های سرطان تخمدان ( CP2780A) صورت گرفت.
نتایج: در بین عصاره­های مطالعه شده، به‏ترتیب گروه 1 دارای محتوای بیشتری سیانیدین و گروه 4 دارای محتوای بیشتری پلارگونیدین می­باشد. نتایج حاصل از بررسی فعالیت ضدتکثیری نشان داد که عصاره­های متانولی پوست لوبیاهای قرمز تیمار شده با شدت 4 میلی تسلا، دارای فعالیت ضدتکثیری سلولی بالایی بر روی سلول­های سرطان تخمدان هستند (74/78 تا  44/84 درصد). همچنین در بین نمونه­های تیمار شده، گروه 2 با 2/2 ± 63/72 IC50:  فعالیت ضدتکثیری سلولی بالاتری را نشان داد.
 نتیجه گیری: تیمار میدان الکترومغناطیسی در افزایش مقادیر آنتوسیانین­های لوبیا قرمز موثر می­باشد و عصاره پوست لوبیا قرمز می­تواند به‏عنوان یک منبع طبیعی برای مکمل­های غذایی و دارویی با خاصیت ضدتکثیری به‏شمار آید.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

در 50 سال گذشته، سرطان به‏عنوان یکی از علل شایع مرگ و میر در کشورهای صنعتی مطرح شده است. طبق گزارشی، سرطان بالای 10 درصد از علت مرگ و میر بشر در سال­های اخیر  بوده است (1). آمار سازمان بهداشت جهانی نشانگر این است که یک زن از بین هر 55 زن در سن بالای 55 سال مبتلا به بیمار سرطان تخمدان می‌شود. بسیاری از مواد غذایی به‏دلیل داشتن متابولیت­های متنوع می­توانند تاثیر متفاوتی در مراحل مختلف شروع و رشد سلول­های تکثیری اعمال کنند (2). یکی از عوامل شایع در القای سرطان رادیکال­های آزاد می­باشند. رادیکال­های آزاد مانند گونه­های فعال اکسیژن به‏طور طبیعی در سلول­های زنده­ تولید می­شوند و نقش مهمی در فرآیند علامت رسانی سلول­ها دارند. همچنین در طبیعت برخی از مواد ممکن است رادیکال­های آزاد داشته باشند یا سلول­ها را برای تولید آن­ها تحریک کنند (3). مقادیر بالای این ترکیبات برای سلول­ها خطرناکند و می­توانند به ساختارهای سلولی از جمله: نوکلئیک اسیدها، فسفولیپیدها، پلی­پپتیدها و غشاهای سلولی آسیب برسانند و نقش مهمی را در پیشرفت بیماری­هایی مانند سرطان دارند (4). آنتی اکسیدانت‏ها ترکیبات مهمی هستند که می­توانند برای پیشگیری و درمان این اختلالات مفید باشند. تحقیقات در زمینه پیشرفت­ بر روی شناسایی و کاربرد این ترکیبات در جلوگیری و درمان بیماری­های مختلف از جمله انواع سرطان متمرکز شده است (5). آنتی ­اکسیدانت‏ها ممکن است به‏عنوان یک جاروب کننده، احیا کننده­ی رادیکال­های آزاد یا فعال کننده آنزیم­های آنتی اکسیدانتی سلول برای جلوگیری از آسیب رادیکال­های آزاد در سیستم­های زیستی ایفای نقش کنند و یا حتی به‏عنوان سم برای سلول­های تکثیری عمل کنند (6-8). گیاهان منبع طبیعی برای این ترکیبات هستند (9). آنتی اکسیدانت­های مهمی که در گیاهان وجود دارند عبارتند از: توکوفرون­ها (ویتامین E)، فولیک اسید (ویتامین B9)، آسکوربیک اسید (ویتامین C)، کاروتنوئیدها، فنیل آکریلیک اسیدها و فلاونوئیدها مانند آنتوسیانین­ها که به‏عنوان بزرگترین گروه فنل­های طبیعی می­باشند. آنتوسیانین­ها رنگدانه­های طبیعی هستند که رنگ­های بنفش تا قرمز را در بسیاری از گیاهان مانند انگور، کلم قرمز، زغال اخته و لوبیا قرمز و سیاه تولید می­کنند. آنتوسیانین­ها از نظر ساختاری مشتق کاتیون فالویلیوم می­باشند. تاکنون حدود 540 نوع آنتوسیانین از منابع مختلف گیاهی شناسایی شده است (10). در مواد غذایی از جمله حبوبات چند نوع آنتوسیانین شامل پلارگونیدین، پئونیدین، مالویدین، سیانیدین و پتونیدین از اهمیت بیشتری برخوردارند که این ساختارها از نظر جایگاه قند در کربن سه و پنج و نوع قند می‏توانند متفاوت باشند (11). لوبیا بعد از سویا پر اهمیت­ترین حبوبات در دنیا می­باشد (12 و 13). نتایج مطالعات نشان می‏دهند مهم‏ترین آنتوسیانین­ها در لوبیا قرمز شامل سیانیدین 3، 5- دی گلیکوزید، دلفینیدین 3-گلیکوزید، سیانیدین 3- گلیکوزید، پتونیدین 3- گلیکوزید و پلارگونیدین 3- گلیکوزید می­باشند (14). گیاه لوبیا از طریق بذر و غلاف کشت می­شود. به‏طور کلی میزان متابولیت­های ثانویه هر گیاه به شرایط کشت و تیمار آن بستگی دارد. در میان تیمارهای مختلف، کاربرد مقادیر بهینه تیمارهای فیزیکی برای بذر و گیاه در محیط کشت، اثر ژنتیکی روی گیاه نداشته و به نسل بعد منتقل نخواهد شد. تحریک گیاهان با استفاده از تیمارهای فیزیکی مانند میدان­های  الکترومغناطیسی به‏عنوان راهی جهت افزایش کمیت و کیفیت متابولیت­های ثانویه مانند آنتوسیانین­ها مورد توجه قرار گرفته است (15 و 16). در سال­های اخیر، محققان در ارتباط با نقش آنتوسیانین­ها در کاهش و بهبود بیماری­های کرونری قلب، التهاب بافت، افزایش حد بینایی، مهار استرس اکسیداتیو و القای آپوپتوزیس در سلول­های تکثیری نتایجی را ارائه دادند (17-20). در تحقیق حاضر با توجه به تنوع و فراوانی آنتوسیانین­ها در پوست لوبیای قرمز و نیز امکان افزایش آن­ها تحت تاثیر میدان­های الکترومغناطیسی به بررسی نقش این میدان­ها در تغییرات کمی برخی آنتوسیانین­های پوست لوبیای قرمز و خواص آنتی اکسیدانتی و فعالیت ضد تکثیری آن­ها توجه شده است (شکل 1).

 

 

 

شکل 1: فرآیند تهیه عصاره و بررسی فعالیت ضدتکثیری به‏روش MTT را نشان می­دهد.

 

موادها و روش­ها

مواد شیمیایی و استانداردها: استانداردهای دو آنتوسیانین شامل سیانیدین کلراید و کالیستفین کلراید از شرکت سیگما-آلدریچ آمریکا تهیه شدند. حلال­های آلی استفاده شده در این تحقیق از قبیل متانول با درجه خلوص بالا از شرکت مرک آلمان سفارش داده شدند.

مواد گیاهی: بذرهای لوبیا قرمز از مرکز تحقیقات لوبیای خمین تهیه شدند. بذرها برای بررسی به‏دو حالت خشک و مرطوب (12 ساعت خیسانده شده در آب) تحت تاثیر میدان­های الکترومغناطیسی قرار گرفتند.

تیمار میدان الکترومغناطیسی: به‏منظور بررسی تاثیر میـدان الکترومغناطیسی بر محتوای آنتوسیانین­ها و پتانسیل ضدتکثیری لوبیا قرمز، میدان الکترومغناطیسی با شدت یکسان (4 میلی تسلا) و مـدت زمان­های مختلف 45 و 90 در نظر گرفته شدنـد. بذرهای برداشت شده در گروه­های مختلف قرار گرفتند، گروه 1 و 2 به‏ترتیب شامل بذرهای خشک و مرطوبی بودند که تحت تاثیر میدان الکترومغناطیسی به‏مدت 45 دقیقه قرار گرفتند. گروه 3 و 4 نیز به‏ترتیب شامل بذرهایی خشک و مرطوبی بودند که دو بار، هر بار 45 دقیقه و با فاصله زمانی 120 دقیقه تحت تاثیر میدان الکترومغناطیسی قرار گرفتند. گروه شاهد شامل بذرهای بدون تیمار بودند. در پایان این مرحله بذرها کشت شدند و پس از رسیدن گیاهان به مرحله بذردهی، بذرها برداشت شدند و مورد آزمایش قرار گرفتند.

کشت بذرها: بذرها (شاهد و تیمار شده) در خاک، در دمای محیط (حدود 25 تا 30 درجه سانتی‏گراد) و دوره نوری- تاریکی 8 تا 16 ساعتی کشت شدند. آبیاری به‏مدت دو و نیم ماه (خرداد تا شهریور) انجام شد و بعد از رسیدن لوبیاهای قرمز کشت شده به مرحله بذر برداشت انجام شد. بذر لوبیاهای قرمز برداشت شده از گیاه جدا شد و تا زمان انجام مراحل بعدی آزمایش در دمای 20- درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شدند.

تهیه عصاره: برای تهیه عصاره، بذرهای لوبیای قرمز به‏مدت کوتاهی در آب خیسانده و سریع از آن  خارج شدند (به  مقداری که آنتوسیانین پوست بذر در آب حل نشود و بذرها فقط مرطوب شوند)، سپس پوست بذرها جدا شد و پس از خشک شدن در معرض هوا، توسط آسیاب برقی، سه بار و در هر بار به‏مدت 10 ثانیه آسیاب شد. استخراج عصاره از 10 گرم پوست پودر شده به‏وسیله دستگاه استخراج کننده سوکسله و توسط 100 میلی­لیتر متانول با خلوص بالا به‏مدت 6 ساعت انجام شد. به‏منظور حذف ذرات ریز عصاره از کاغذ صافی وات من استفاده شد و نمونه­ها در 4500 دور در دقیقه به‏مدت سه دقیقه سانتریفوژ شدند. عصاره­های به‏دست آمده توسط دستگاه فریز درایر خشک شدند .سپس تا زمان استفاده برای استخراج و شناسایی ترکیبات مورد نظر با دستگاه کروماتوگرافی، در ظروف شیشه­ای کوچک قهوه­ای رنگ و داخل فریزر (20- درجه سانتی‏گراد) ذخیره شدند.

استخراجآنتوسیانین­هاازعصاره­ها: برای استخراج حداکثر آنتوسیانین­ها از عصاره­های به‏دست آمده توسط دستگاه سوکسله و به‏منظور آماده سازی آن­ها برای تزریق به دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا از روش استخراج مایع- مایع استفاده شد. آنتوسیانین­ها توسط فاز متحرکی متشکل از دو محلول آبی فرمیک اسید 10 درصد و محلولی شامل فرمیک اسید/آب/متانول (50:40:10 حجمی/حجمی) با شیبی ملایم در مدت زمان 50 دقیقه و با سرعت 2/1 میلی­لیتر در دقیقه جدا سازی و توسط دستگاه کروماتوگرافی در طول موج 520 نانومتر شناسایی شدند.

دستگاهکروماتوگرافیمایعباکاراییبالا: برای انجام این تحقیق از یک دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا ساخت آمریکا شامل اچ پی با چهار پمپ و انژکتور دستی (مدل 7127، فئوداین، کوتاتی، سی ای) مجهز به جایگاه نمونه 20 میکرولیتری استفاده شد. اطلاعات به‏وسیله یک اچ پی­کایم استیشن ارائه شدند. ستون فاز معکوس ساخت آمریکا با مشخصات 6/4 میلی­متر قطر و 250 میلی­متر طول با قطر ذرات 5 میکرون استفاده شد.

شناساییآنتوسیانین­ها: برای شناسایی و تعیین مقدار آنتوسیانین­ها، ابتدا به‏روش استاندارد خارجی منحنی استاندارد رسم شد و سپس پیک نمونه بر اساس مقایسه زمان بازداری آن با استاندارد متناظرش شناسایی شد و در نهایت بر اساس معادله خطی حاصل از منحنی درجه بندی استاندارد مربوطه تعیین مقدار شد .در جدول شماره 1 و 2 زمان بازداری پیک ترکیبات، مقدار سنجش شده و ضریب همبستگی وابسته نشان داده شده است.

 

جدول 1: مقدار سیانیدین (برحسب میلی­گرم در 10 گرم وزن خشک عصاره) نمونه­های تیمار شده، شاهد و استاندارد (سیانیدین کلراید) و برخی فاکتورهای کروماتوگرام.

 

پارامترها

نمونه ها

گروه 2

گروه 4

گروه 1

گروه 3

شاهد

استاندارد

زمان بازداری

635/16

277/16

607/16

741/16

475/16

968/16

مقادیر

016/0

017/0

099/0

017/0

014/0

021/0

ضریب همبستگی (r)

997/0

997/0

997/0

997/0

997/0

999/0

 

جدول 2: مقدار پلارگونیدین (برحسب میلی­گرم در 10 گرم وزن خشک عصاره) نمونه­های تیمار شده، شاهد و استاندارد (کالستیفن کلراید) و برخی فاکتورهای کروماتوگرام.

 

پارامترها

نمونه ها

گروه 2

گروه 4

گروه 1

گروه 3

شاهد

استاندارد

زمان بازداری

435/20

197/20

393/20

475/20

468/20

563/20

مقادیر

038/0

040/0

019/0

035/0

018/0

102/0

ضریب همبستگی (r)

995/0

998/0

997/0

997/0

997/0

999/0

 

 

بررسی فعالیت ضدتکثیری سلولی

کشتسلولی: ابتدا لاین سلول­های سرطان تخمدان (CP2780A) از مرکز انستیتو پاستور تهیه شد و بر روی محیط کشت RPMI حاوی FBS 10 درصد، پنی سیلین، استرپتومایسین و آمفوتریپسین یک درصدکشت داده شد. زمانی‏که سلول­ها حداقل به 70 درصد رشد سلولی رسیدند توسط تریپسین-EDTA  (اتیلن در تترا استیک اسید) از ته فلاسک جدا شده و در 1500 دور در دقیقه به‏مدت پنج دقیقه سانتریفوژ شدند. رسوب سلولی در یک میلی­لیتر محیط کشت به‏حالت سوسپانسیون تهیه شد و درصد زنده بودن سلول­های موجود در سوسپانسیون سلولی با مخلوط شدن نسبت مساوی از تریپان بلو با استفاده از لام هموسیتومتر و بررسی با میکروسکوپ نوری تعیین شد. پس از حصول اطمینان از عدم آلودگی سلول­ها، از سلول­های با درصد زنده بودن بالای 90 درصد برای انجام تست استفاده شد (21 و 22).

سنجشمیزانفعالیت ضدتکثیریسلولی: برای بررسی فعالیت ضدتکثیری عصاره­ها از روش MTT استفاده شد (22، 23). این روش یک تست متابولیک رقابتی میتوکندریایی است و بر پایه شکستن نمک تترازولیوم توسط آنزیم سوکسینات دهیدروژناز میتوکندریایی استوار است. در این روش 200 میکرو لیتر محیط حاوی 105 سلول در هر چاهک پلیت کاشته شد. پس از 48 ساعت انکوباسیون غلظت­های مختلف (0، 125، 250، 500 و 1000 میکروگرم در میلی­لیتر)، از هر عصاره (حل شده در DMSO 1/0 درصد) به سلول­ها اضافه شد و سپس 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی­گراد انکوبه شد. بعد از انکوباسیون، سلول­ها سه بار با بافر سالین فسفات شستشو شدند و مقدار 20 میکرولیتر رنگ  MTT(5 میلی­گرم بر میلی­لیتر) 5 درصد به هر حفره اضافه شد. 4 ساعت بعد از انکوباسیون، به چاهک­ها محلول 04/0 مولار کلریدریک اسید / ایزوپروپانول اضافه شد. میزان جذب توسط دستگاه الایزا (Stat Fax-2100,USA) در طول موج­های 570 نانومتر اندازه­گیری شد. برای سنجش میزان فعالیت ضد تکثیری سلولی و قدرت بقای سلول ها از فرمول­های زیر استفاده شد و نتایج حاصل بر اساس درصد و IC50 بیان شد.  IC50  غلظتی از عصاره می­باشد که در آن غلظت رشد و تمایز 50 درصد سلول­های تکثیری در مقایسه با سلول­های گروه کنترل که تحت تأثیر عصاره قرار نگرفته­اند مهار شود.

 

آنالیز آماری:

داده­های حاصل از آزمایش و رسم نمودارها با نرم­های افزار SPSS وExel  انجام شد. سپس، مقایسه میانگین­ها به‏روش دانکن در سطح  05/0p< انجام شد. نتایج حاصل از این بررسی به‏صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شد.

 

 

 

نتایج

آنتوسیانین­ها

در جدول 1 و 2 آنتوسیانین­های شناسایی شده در عصاره­های مختلف (شاهد، استاندارد و تیمار شده) همراه با مقدار آن­ها بر حسب میلی­گرم در 10 گرم وزن خشک عصاره گیاه ارائه شده است. نتایج نشان دادند که از میان دو آنتوسیانین مطالعه شده، عصاره­ها دارای محتوای پلارگونیدین (018/0 تا 040/0 میلی­گرم در 10 گرم وزن خشک عصاره) بالاتری نسبت به سیانیدین (014/0 تا 099/0 میلی­گرم در 10 گرم وزن خشک عصاره) هستند. در بین عصاره­های مطالعه شده نمونه­های حاصل از بذرهای گروه 1 بیشترین محتوای سیانیدین (099/0 میلی­گرم در 10 گرم وزن خشک عصاره) و نمونه­های حاصل از بذرهای گروه 4 بیشترین محتوای پلارگونیدین (040/0 میلی­گرم در 10 گرم وزن خشک عصاره) را دارند. همه عصاره­های مربوط به نمونه­های تیمار شده با تیمارهای مختلف میدان الکترومغناطیسی محتوای آنتوسیانین بالاتری را نسبت به نمونه شاهد نشان دادند.

فعالیت ضدتکثیری

در این مطالعه برای بررسی فعالیت ضدتکثیری عصاره­ها از روش MTT استفاده شد. نتایج بررسی­های فعالیت ضدتکثیری سلولی، بر روی رده سلول­های سرطان تخمدان ( CP2780A) به‏صورت درصد وIC50  در جدول 3 و 4 و همچنین شکل 2 نشان داده شده است. در تمامی تست­ها میزان فعالیت بالا در IC50 کمتر  مشخص می­شود. میزان فعالیت ضدتکثیری سلولی عصاره­ها بر حسب IC50 به‏ترتیب عبارت است از: شاهد > گروه 4 ≥ گروه 3 > گروه 1 ≥ گروه 2 > کنترل. درصد فعالیت ضدتکثیری سلولی و درصد بقای سلول­ها که تحت تاثیر عصاره­ها در غلظت­های مختلف 125، 250، 500 و 1000 میکروگرم در میلی­لیتر قرار گرفتند، به‏ترتیب در جدول 3 و 4  آورده شده است. نتایج نشان دادند که در بین عصاره لوبیاهای قرمز تیمار شده، نمونه­های حاصل از بذرهای گروه 4 بیشترین فعالیت ضد تکثیری سلولی و کمترین میزان بقای سلولی را در لاین­های سلول سرطان تخمدان نشان می­دهد (به‏ترتیب 44/84 و 56/15درصد).

 

 

 

 

جدول 3: درصد فعالیت ضدتکثیری عصاره­ها ­و استاندارد در غلظت­های مختلف (125 تا 1000 میکروگرم بر میلی­لیتر) را نشان می­دهد.

 

نمونه­ها

غلظت (میکروگرم/میلی­لیتر)

125

250

500

1000

میانگین

گروه 2

60/70 ± 2/1b

10/82 ± 2/2a

33/81 ± 9/0a

92/80 ± 6/2a

74/78

گروه4

80/83 ± 7/1a

61/84 ± 0/2a

00/84 ± 7/0a

33/85 ± 5/1a

44/84

گروه 1

10/76 ± 1/1a

70/80 ± 5/1a

22/80 ± 3/2a

45/79 ± 9/0a

12/79

گروه3

61/82 ± 2/2a

11/83 ± 1/3a

91/83 ± 6/1a

20/84 ± 3/1a

46/83

شاهد

51/90 ± 5/2a

20/90 ± 2/1a

00/91 ± 8/0a

53/92 ± 0/3a

06/91

سیانیدین کلراید

71/32 ± 4/0a

70/32 ± 0/0a

22/35 ± 5/0a

61/35 ± 3/0a

25/27

مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SD است .حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح 05/0 p ≤ است.

 

جدول 4: درصد بقای سلولی در لاین­های سلول سرطان تخمدان تیمار شده با غلظت­های مختلف (در غلظت­های 125 تا 1000 میکروگرم بر میلی­لیتر) عصاره­ها و استاندارد.

 

نمونه­ها

غلظت (میکروگرم/میلی­لیتر)

125

250

500

1000

میانگین

گروه 2

40/29 ± 6/0a

91/17 ± 2/1b

67/18 ± 7/0b

09/19 ± 1/1b

47/21

گروه 4

11/16 ± 7/0a

40/15 ± 3/1a

00/16 ± 9/0a

67/14 ± 6/0a

56/15

گروه 1

10/23 ± 1/1a

31/19 ± 5/0a

80/18 ± 0/1b

55/20 ± 4/1a

44/20

گروه 3

41/17 ± 1/1a

91/16 ± 6/0a

11/16 ± 8/0a

80/15 ± 4/0a

56/16

شاهد

51/9 ± 8/0a

80/9 ± 2/0a

00/9 ± 5/0a

53/7 ± 0/0a

96/8

سیانیدین کلراید

29/67 ± 2/1a

30/67± 0/1a

78/64 ± 5/0a

39/64 ± 3/1a

75/52

مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SD است .حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح 05/0 p ≤ است.

 

بحث

پلی­فنل­ها از جمله فلاونوئیدها در ساختار شیمیایی خود دارای گروه­های هیدروکسیل می­باشند که دهنده قوی هیدروژن به‏حساب می­آیند و به‏عنوان عوامل آنتی اکسیدانتی شناخته می­شوند. این ترکیبات با توانایی احیا کنندگی بالا می­توانند با گونه­های فعال اکسیژن و نیتروژن واکنش دهند و از خسارات تنش اکسیداتیو در بدن جلوگیری کنند (24 و 25). ساختار این ترکیبات دارای پتانسیل بالایی برای واکنش دادن با پروتئین­های مختلف از جمله آنزیم­ها می­باشند. به این دلیل آن­ها می­توانند باعث ممانعت از فعالیت آنزیم­هایی مانند ایزوفرم­های مختلف سیتوکروم  P450، سیکلواکسیژناز، لیپو اکسیژناز و زانتین اکسیداز شوند که در تولید رادیکال­های آزاد دخالت دارند (26). همچنین اثرات هم سو و غیر هم سوی پلی­فنل­ها با دیگر عوامل آنتی اکسیدانتی و سطوح گلوتاتیون (به‏عنوان عامل آنتی اکسیدانتی در جانوران، گیاهان، قارچ­ها و باکتری­ها هستند) درون سلولی نیز بررسی شده است (27 و 28). معمولا تفاوت در فعالیت زیستی مانند خاصیت سمیت سلولی می­تواند مرتبط با انواع ترکیبات فنلی مانند 7آنتوسیانین­ها باشد نه لزوما مقدار آن­ها (29). آنتوسیانین­ها رنگدانه­های طبیعی هستند که رنگ­های مختلفی را در بسیاری از گیاهان مانند لوبیا تولید می­کنند (10). لوبیا دارای واریته­های مختلفی می­باشد که از نظر اندازه، شکل و رنگ بذر با یکدیگر متفاوت هستند. تنوع رنگ در لوبیا خصوصیت مهمی به‏شمار می­آید و رنگ­های قرمز، سیاه، سفید، قهوه‏ای و مخطط در این گیاه متداول است (30 و 31). پلارگونیدین 3- گلوکوزید، آنتوسیانین اصلی در لوبیای قرمز محسوب می­شود که مسئول رنگ قرمز در این نوع لوبیا است (14 و 32). مطالعات نشان داده است که محتوای آنتوسیانین­ها در هر گیاه به شرایط کشت و تیمار آن بستگی دارد. در میان تیمارهای مختلف، کاربرد بهینه تیمار میدان­های الکترومغناطیسی به‏عنوان راهی جهت افزایش کمیت و کیفیت متابولیت­های ثانویه مانند آنتوسیانین­ها مورد توجه قرار گرفته است (15 و 16). نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که عصاره­های لوبیا قرمز دارای محتوای بالایی از سیانین و پلارگونیدین هستند. این نتایج موافق با نتایج حاصل از تحقیقات دیگر محققان بر روی آنتوسیانین­های لوبیای قرمز می­باشد (14 و 32). در بین عصاره­ها، گروه 1 دارای محتوای بیشتری از سیانیدین (099/0 میلی­گرم در 10 گرم وزن خشک عصاره) و گروه 4 دارای محتوای بیشتری از پلارگونیدین (040/0 میلی­گرم در 10 گرم وزن خشک عصاره) می­باشد. همچنین با مقایسه عصاره گیاه شاهد و عصاره گیاه‏های تیمار شده مشخص شد که تیمار میدان الکترومغناطیسی باعث افزایش محتوای آنتوسیانین­ها در گیاه می‏شود (جدول 1 و 2). اولین گزارش پیرامون محتوای آنتوسیانین­ها در پوست لوبیا قرمز در سال 1960 ارائه شد، و به‏دنبال آن مطالعات دیگری مالیدین 3- گلیکوزید، پتونیدین 3- گلیکوزید، پتونیدین 3، 5 دی گلیکوزید، مالیدین 3- گلیکوزید و دلفینین 3- گلیکوزید، به‏عنوان آنتوسیانین‏های اصلی در لوبیا قرمز تعیین کردند (14، 33-35). آنتوسیانین­ها دارای فعالیت آنتی اکسیدانتی و جاروب کنندگی رادیکال­ها آزاد هستند و می­توانند از خسارت ناشی از استرس اکسیداتیو مانند بیماری­های قلبی، آلزایمر و سرطان جلوگیری ­کنند (17-20، 36). تحقیقات نشان می­دهد که سیانیدین­ بیشتر از سایر آنتوسانین­ها جهت مهار رشد سلول­های توموری و القا آپوپتوزیس در این سلول­ها موثرند (37، 38). باتوجه به این که تاکنون اثر مقایسه­ای ضدتکثیری عصاره پوست لوبیا قرمز تحت تیمار میدان الکترومغناطیسی گزارش نشده است، در این مطالعه فعالیت ضدتکثیری عصاره متانولی پوست لوبیا قرمز بر روی لاین سلول­های سرطان تخمدان به‏روش MTT مورد مطالعه قرار گرفت. آمار سازمان بهداشت جهانی نشانگر این است سرطان تخمدان یکی از شایع­ترین سرطان­ها در بین زنان بالای 55 سال است (2). نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که عصاره­های مطالعه شده دارای توانایی بالایی در القای آپوپتوزیس در سلول­های تکثیری هستند (جدول 3 و 4). مقایسه مقادیر IC50 نشان داد که در بین عصاره لوبیاهای تیمار شده با میدان الکترومغناطیسی، بذرهای حاصل از نمونه­های گروه 4 (6/2 ± 58/74IC50:  میکروگرم در میلی­لیتر) بیشترین سمیت سلولی را در مقابل سلول­های سرطان تخمدان نشان می­دهد. عصاره‏های مطالعه شده فعالیت ضدتکثیری بیشتری نسبت به کنترل مثبت (سیانیدین کلراید) نشان دادند و عصاره گیاهان شاهد در مقایسه با عصاره لوبیاهای تیمار شده IC50 کمتری نشان داد (شکل 2). برخی از محققان اثبات کردند که یک همبستگی قوی بین محتوای پلی­فنل­ها و فعالیت­های زیستی عصاره­های گیاهی وجود دارد در حالی که در مطالعات دیگر هیچ همبستگی گزارش نشد (39-41). نتایج این مطالعه یک همبستگی ضعیف در بین محتوای سیانیدین (24/0 < r2) و پلارگونین (11/0 < r2) عصاره­ها (شاهد و تیمار شده) با فعالیت ضدتکثیری وجود دارد. این نتایج ما در موافقت با دیگر محققان می­باشد که فلاونوئیدها از جمله آنتوسیانین­ها را کاملا مسئول تمام فعالیت زیستی عصاره­های گیاهی نمی­دانند، بلکه تاثیر دیگر ترکیبات مانند قندها، توکوفرول­ها، کاروتوئیدها، ترپن­ها و همچنین اثرات هم سو و غیر هم سو این ترکیبات را مورد توجه قرار داده­اند (42، 43).

 

 

شکل 2: مقایسه فعالیت ضدتکثیری عصاره­ها بر حسب مقادیر IC50. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SD  است .حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح 05/0 p ≤ است.

 

نتیجه گیری

نتایج این تحقیق نشان داد که تیمارهای مختلف میدان الکترومغناطیسی در افزایش محتوای آنتوسیانین­های پوست لوبیا قرمز مطالعه شده موثر است و عصاره­های تهیه شده دارای فعالیت ضدتکثیری سلولی بالای در مقابل لاین سلول­های سرطان تخمدان هستند و می­توانند به‏عنوان منابع امید بخشی در جهت تولید داروهایی برای جلوگیری و درمان اغلب بیماری­های مرتبط با تنش اکسیداتیو مانند سرطان­ها بویژه سرطان تخمدان مورد توجه قرار گیرند.

منابع

1. Thun M.J. Epidemiology of cancer. In: Goldman L, Ausiello D eds Cecil Medicine23 rd (eds) Philadelphia Pa Saunders Elsevier, chap; 2007; 185.

2. Abdullaev F, Riveron-Negretts L, Rotenburd-Belacortu V, Kasumov FJ. Saffron as chemopreventive agent. Food of 21st century: Food and resource technology environment. China: Ligh Industry Press; 2000; p: 185-95.

3. Aruoma OI, Cuppette SL. Antioxidant methodology, in vivo and in vitro concept. Champaign, IL: AOCS Press; 1997; 142-69.

4. Valko M, Leibfritz D, Moncol J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2007; 39(1): 44-84.

5. Zhang HY, Yang DP, Tang GY. Multipotent antioxidants: from screening to design. Drug Discovery Today. 2006; 11(15-16): 749-54.

 

6. Yu L, Perret J, Davy B, Wilson J, et al. Antioxidant properties of cereal products. J. Food Chem. Sci. 2002; 67(7): 2600-2603.

 7. Prior RL, Wu XM, Schaich K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. J. Agricul. Food Chem. 2005; 53(10): 4290-302.

8. Shoeb M. Anticancer agents from medicinal plants. Bangladesh Pharmacological Society. 2006; 1(2): 35-41.

9. Walton NJ, Brown DE. Chemicals from plants perspectives on plant secondary products. London, UK: Imperial College Press1999; 1-25.

10. Anderson O, Jordheim M. The anthocyanins in Flavonoids chemistry, Biochemistry and application. CRC Press Boca, Raton, FL. 2006; pp. 471–473.

11. Clifford MN. Anthocyanins–nature, occurrence and dietary burden. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2000; 80(7): 1063-1072.

12. Takeoka GR, Dao LT, Full GH, Wong RY, et al. Characterization of black bean (Phaseolus Vulgaris L.) anthocyanins. J. Agric. Food Chem. 1997; 45(9): 3395-3400.

13. Tsuda T, Ohshima K, Kawakishi S, Osawa T. Antioxidative pigments isolated from the seeds of Phaseolus Vulgaris L. J. Agric. Food Chem. 1994; 42(2): 248-251.

14. Choung MG, Choi BR, An YN, Chu YH, et al. Anthocyanin Profile of Korean cultivated kidney bean (Phaseolus vulgaris L.). J. Agric. Food Chem. 2003; 51(24): 7040-7043.

15. Aladjadjiyan A. The use of physical methods for plant growing stimulation in Bulgaria. J. Central Europ. Agricul. 2007; 8(3): 369-380.

16. Dhawi F, Al-Khayri JM, Hassan E. Static magnetic field influence on elements composition in date palm (Phoenix dactylifera L.). Res. J. Agricul. Biol. Sci. 2009; 5(2): 161-166.

17. Tsuda T, Horio F, Osawa T. The role of anthocyanins as an antioxidant under oxidative stress in rats. Biofactors. 2000; 13(1-4): 133-139.

18. Miranda-Rottmann S, Aspillaga AA, Perez DD, Vasquez L, et al. Juice and phenolic fractions of the berry Aristotelia chilensis inhibit LDL oxidation in vitro and protect human endothelial cells against oxidative stress. J. Agric. Food. Chem, 2002; 50(26): 7542-7.

19. Yi W, Fischer J, Krewer G, Akoh CC. Phenolic compounds from blueberries can inhibit colon cancer cell proliferation and induce apoptosis. J. Agric. Food Chem. 2005;53(18): 7320-9.

20. Kuo PL, Hsu YL, Lin TC, Lin LT, et al. Induction of apoptosis in human breast adenocarcinoma MCF-7 cells by prodelphinidin B-2 3,3'-di-O-gallate from Myrica rubra via Fas-mediated pathway. J. Pharm. Pharmacol. 2004; 56: 1399-406.

21. Ismail M, Bagalkotkar G, Iqbal S, Adamu HA. Anticancer properties and phenolic contents of sequentially prepared extracts from different parts of selected medicinal plants indigenous to Malaysia. Molecules. 2012; 17(5): 5745-5756.

22. Shokrzadeh M, Parvaresh A, Shahani S,  Habibi O, et al. Cytotoxic effects of Lagenaria siceraria Standl. extract on cancer cell line. J. Mazandaran. Univ. Med. Sci. 2013; 23(97): 225-230.

23. Mosmann TR, Bond MW, Coffman RL, Paul WE. T cell and mast cell lines respond to B cell stimulatory factor-1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983; 83(15): 5654.

24. Shahidi F, Wanasundara PKJPD. Phenolic antioxidants. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 1992; 32(1): 67-103.

25. Valentao P, Fernandes E, Carvalho F, Andrade PB, et al. Hydroxyl radical and hypochlorous acid scavenging activity of small centaury (Centaurium erythraea) infusion. A comparative study with green tea (Camellia sinensis). Phytomedicin. 2003; 10(6-7): 517-22.

26. Parr AJ, Bolwell JP. Phenols in the plant and in man. The potential for possible nutritional enhancement of the diet by modifying the phenols content or profile. J. Sci. Food Agric. 2002; 80(7): 985-1012.

27. Seabra RM, Andrade PB, Valentao P, Fernandes E, et al. Biomaterials from Aquatic and Terrestrial organisms. In: Fingerman M, Nagabhushanam R, editors. Antioxidant compounds extracted from several plant materials. Enfield, NH: Science Publishers; 2006. 115-74.

28. Cao G, Booth SL, Sadowski JA, Prior RL. Increases in human plasma antioxidant capacity after consumption of controlled diets high in fruit and vegetables. Am. J. Clin. Nutr. 1998; 68(5): 1081-7.

29. Shahidi F, Marian N. Phenolics in food and nutraceuticals. Boca Raton, FL: CRS Press; 2003; 144-50.

30. Tsuda T, Ohshima K, Kawakishi S, Osawa T. Antioxidative pigments isolated from the seeds of Phaseolus Vulgaris L. J. Agric. Food Chem. 1994, 42(2): 248-251.

31. Mazza G, Miniati E. Legumes. In Anthocyanins in Fruits, Vegetables, and Grains; CRC Press: Boca Raton, FL. 1993; 249-251.

32. Lin LZ,  Harnly JM, Pastor-Corrales MS, Luthria DL. The polyphenolic profiles of common bean (Phaseolus vulgaris L.). Food Chem. 2008; 107(1): 399-410.

33. Feenstra WJ. Biochemical aspects of seed coat colour inheritance in Phaseolus Vulgaris L. Meded. Land bouwhogesch. Wageningen. 1960; 60(2): 1-53.

34. Okita C, Kazuko S, Kazuko Y, Hamaguchi Y. Anthocyanins of Phaseolus Vulgaris, cv. Kurodanekinugasa. Eiyo To Shokuryo. 1972; 25: 427-430.

35. Stanton WR, Francis BJ. Ecological significance of anthocyanins in the seed coats of the Phaseoleae. Nature. 1966; 211: 970-971.

36. Renault JH, Thepenier P, Zeches-Hanrot M, Men Olivier LL, et al. Preparative separation of anthocyanins by gradient elution centrifugal partition chromatography. J. Chromatogr. A 1997; 763: 345-352.

37. Close DC, Beadle CL. The ecophysiology of foliar anthocyanin. Bot. Rev. 2003; 69: 149-161.

38. Fimognar C, Berti F, Nusse M, Cantelli Forti G, et al. In Vitro Anticancer Activity of Cyanidin-3-O-‚-Glucopyranoside: Effects on Transformed and Non-transformed T Lymphocytes. Anticancer res. 2005; 25(4): 2837-2840.

39. Siddique NA, Mujeeb M, Najmi AK, Akram M. Evaluation of antioxidant activity, quantitative estimation of phenols and flavonoids in different parts of Aegle marmelos. Int. J. Plant Physiol. Biochem. 2010; 4(1): 001-005.

40. Cardozo ML, Ordonez RM, Alberto MR, Zampini IC, et al. Antioxidant and anti-inflammatory activity characterization and genotoxicity evaluation of Ziziphus mistol ripe berries, exotic Argentinean fruit. Food Res. Inter. 2011; 44: 2063-2071.

41. Conforti F, Sosa S, Marrelli M, Menichini F, , et al. In vivo anti-inflammatory and in vitro antioxidant activities of Mediterranean dietary plants. J. Ethnopharmacol. 2008; 116: 144-151.

42. Burt S. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods- a review. Int. J. Food Microbiol. 2004; 94(3): 223-253.

43. Karamian R, Asadbegy M. Antioxidant activity, total phenolic and flavonoid contents of three Onobrychis Species from Iran. Pharm. Sci. 2016; 22: 112-119.

. Thun M.J. Epidemiology of cancer. In: Goldman L, Ausiello D eds Cecil Medicine23 rd (eds) Philadelphia Pa Saunders Elsevier, chap; 2007; 185.

2. Abdullaev F, Riveron-Negretts L, Rotenburd-Belacortu V, Kasumov FJ. Saffron as chemopreventive agent. Food of 21st century: Food and resource technology environment. China: Ligh Industry Press; 2000; p: 185-95.

3. Aruoma OI, Cuppette SL. Antioxidant methodology, in vivo and in vitro concept. Champaign, IL: AOCS Press; 1997; 142-69.

4. Valko M, Leibfritz D, Moncol J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2007; 39(1): 44-84.

5. Zhang HY, Yang DP, Tang GY. Multipotent antioxidants: from screening to design. Drug Discovery Today. 2006; 11(15-16): 749-54.

 

6. Yu L, Perret J, Davy B, Wilson J, et al. Antioxidant properties of cereal products. J. Food Chem. Sci. 2002; 67(7): 2600-2603.

 7. Prior RL, Wu XM, Schaich K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. J. Agricul. Food Chem. 2005; 53(10): 4290-302.

8. Shoeb M. Anticancer agents from medicinal plants. Bangladesh Pharmacological Society. 2006; 1(2): 35-41.

9. Walton NJ, Brown DE. Chemicals from plants perspectives on plant secondary products. London, UK: Imperial College Press1999; 1-25.

10. Anderson O, Jordheim M. The anthocyanins in Flavonoids chemistry, Biochemistry and application. CRC Press Boca, Raton, FL. 2006; pp. 471–473.

11. Clifford MN. Anthocyanins–nature, occurrence and dietary burden. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2000; 80(7): 1063-1072.

12. Takeoka GR, Dao LT, Full GH, Wong RY, et al. Characterization of black bean (Phaseolus Vulgaris L.) anthocyanins. J. Agric. Food Chem. 1997; 45(9): 3395-3400.

13. Tsuda T, Ohshima K, Kawakishi S, Osawa T. Antioxidative pigments isolated from the seeds of Phaseolus Vulgaris L. J. Agric. Food Chem. 1994; 42(2): 248-251.

14. Choung MG, Choi BR, An YN, Chu YH, et al. Anthocyanin Profile of Korean cultivated kidney bean (Phaseolus vulgaris L.). J. Agric. Food Chem. 2003; 51(24): 7040-7043.

15. Aladjadjiyan A. The use of physical methods for plant growing stimulation in Bulgaria. J. Central Europ. Agricul. 2007; 8(3): 369-380.

16. Dhawi F, Al-Khayri JM, Hassan E. Static magnetic field influence on elements composition in date palm (Phoenix dactylifera L.). Res. J. Agricul. Biol. Sci. 2009; 5(2): 161-166.

17. Tsuda T, Horio F, Osawa T. The role of anthocyanins as an antioxidant under oxidative stress in rats. Biofactors. 2000; 13(1-4): 133-139.

18. Miranda-Rottmann S, Aspillaga AA, Perez DD, Vasquez L, et al. Juice and phenolic fractions of the berry Aristotelia chilensis inhibit LDL oxidation in vitro and protect human endothelial cells against oxidative stress. J. Agric. Food. Chem, 2002; 50(26): 7542-7.

19. Yi W, Fischer J, Krewer G, Akoh CC. Phenolic compounds from blueberries can inhibit colon cancer cell proliferation and induce apoptosis. J. Agric. Food Chem. 2005;53(18): 7320-9.

20. Kuo PL, Hsu YL, Lin TC, Lin LT, et al. Induction of apoptosis in human breast adenocarcinoma MCF-7 cells by prodelphinidin B-2 3,3'-di-O-gallate from Myrica rubra via Fas-mediated pathway. J. Pharm. Pharmacol. 2004; 56: 1399-406.

21. Ismail M, Bagalkotkar G, Iqbal S, Adamu HA. Anticancer properties and phenolic contents of sequentially prepared extracts from different parts of selected medicinal plants indigenous to Malaysia. Molecules. 2012; 17(5): 5745-5756.

22. Shokrzadeh M, Parvaresh A, Shahani S,  Habibi O, et al. Cytotoxic effects of Lagenaria siceraria Standl. extract on cancer cell line. J. Mazandaran. Univ. Med. Sci. 2013; 23(97): 225-230.

23. Mosmann TR, Bond MW, Coffman RL, Paul WE. T cell and mast cell lines respond to B cell stimulatory factor-1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983; 83(15): 5654.

24. Shahidi F, Wanasundara PKJPD. Phenolic antioxidants. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 1992; 32(1): 67-103.

25. Valentao P, Fernandes E, Carvalho F, Andrade PB, et al. Hydroxyl radical and hypochlorous acid scavenging activity of small centaury (Centaurium erythraea) infusion. A comparative study with green tea (Camellia sinensis). Phytomedicin. 2003; 10(6-7): 517-22.

26. Parr AJ, Bolwell JP. Phenols in the plant and in man. The potential for possible nutritional enhancement of the diet by modifying the phenols content or profile. J. Sci. Food Agric. 2002; 80(7): 985-1012.

27. Seabra RM, Andrade PB, Valentao P, Fernandes E, et al. Biomaterials from Aquatic and Terrestrial organisms. In: Fingerman M, Nagabhushanam R, editors. Antioxidant compounds extracted from several plant materials. Enfield, NH: Science Publishers; 2006. 115-74.

28. Cao G, Booth SL, Sadowski JA, Prior RL. Increases in human plasma antioxidant capacity after consumption of controlled diets high in fruit and vegetables. Am. J. Clin. Nutr. 1998; 68(5): 1081-7.

29. Shahidi F, Marian N. Phenolics in food and nutraceuticals. Boca Raton, FL: CRS Press; 2003; 144-50.

30. Tsuda T, Ohshima K, Kawakishi S, Osawa T. Antioxidative pigments isolated from the seeds of Phaseolus Vulgaris L. J. Agric. Food Chem. 1994, 42(2): 248-251.

31. Mazza G, Miniati E. Legumes. In Anthocyanins in Fruits, Vegetables, and Grains; CRC Press: Boca Raton, FL. 1993; 249-251.

32. Lin LZ,  Harnly JM, Pastor-Corrales MS, Luthria DL. The polyphenolic profiles of common bean (Phaseolus vulgaris L.). Food Chem. 2008; 107(1): 399-410.

33. Feenstra WJ. Biochemical aspects of seed coat colour inheritance in Phaseolus Vulgaris L. Meded. Land bouwhogesch. Wageningen. 1960; 60(2): 1-53.

34. Okita C, Kazuko S, Kazuko Y, Hamaguchi Y. Anthocyanins of Phaseolus Vulgaris, cv. Kurodanekinugasa. Eiyo To Shokuryo. 1972; 25: 427-430.

35. Stanton WR, Francis BJ. Ecological significance of anthocyanins in the seed coats of the Phaseoleae. Nature. 1966; 211: 970-971.

36. Renault JH, Thepenier P, Zeches-Hanrot M, Men Olivier LL, et al. Preparative separation of anthocyanins by gradient elution centrifugal partition chromatography. J. Chromatogr. A 1997; 763: 345-352.

37. Close DC, Beadle CL. The ecophysiology of foliar anthocyanin. Bot. Rev. 2003; 69: 149-161.

38. Fimognar C, Berti F, Nusse M, Cantelli Forti G, et al. In Vitro Anticancer Activity of Cyanidin-3-O-‚-Glucopyranoside: Effects on Transformed and Non-transformed T Lymphocytes. Anticancer res. 2005; 25(4): 2837-2840.

39. Siddique NA, Mujeeb M, Najmi AK, Akram M. Evaluation of antioxidant activity, quantitative estimation of phenols and flavonoids in different parts of Aegle marmelos. Int. J. Plant Physiol. Biochem. 2010; 4(1): 001-005.

40. Cardozo ML, Ordonez RM, Alberto MR, Zampini IC, et al. Antioxidant and anti-inflammatory activity characterization and genotoxicity evaluation of Ziziphus mistol ripe berries, exotic Argentinean fruit. Food Res. Inter. 2011; 44: 2063-2071.

41. Conforti F, Sosa S, Marrelli M, Menichini F, , et al. In vivo anti-inflammatory and in vitro antioxidant activities of Mediterranean dietary plants. J. Ethnopharmacol. 2008; 116: 144-151.

42. Burt S. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods- a review. Int. J. Food Microbiol. 2004; 94(3): 223-253.

43. Karamian R, Asadbegy M. Antioxidant activity, total phenolic and flavonoid contents of three Onobrychis Species from Iran. Pharm. Sci. 2016; 22: 112-119.