خاموش کردن بیان ژن کدئین رداکتاز به‏روش خاموش‌سازی القایی با ویروس در گیاه دارویی شقایق (Papaver somniferum L.)

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 1دانشگاه لرستان، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات، خرم آباد، ایران

2 دانشگاه لرستان، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات، خرم آباد، ایران

3 دانشگاه علوم پزشکی بقیه ا... ، مرکز تحقیقات کاربردی، تهران، ایران

چکیده

هدف: گیاه دارویی شقایق (Papaver somniferum L.) تنها منبع تجاری از آلکالوئیدهای دارویی بنزوفنانترین از زیر گروه آلکالوئیدهای بنزیل ایزوکوئینولین  است که  شامل مسکن­های ضد درد مانند کدئین و داروهای نیمه مصنوعی اکسی کدون، باپرنورفین و نالتروکسون می­باشد. اگرچه بیشتر ژن­های مسیر این آلکالوئیدها شناسایی شده­اند، ولی تنظیم پس از نسخه­برداری ژن­های مسیر آلکالوئیدهای آن‏ها به­خوبی شناسایی نشده است. خاموش سازی القایی با ویروس (virus induced gene slencing) یکی از روش‏های سریع برای خاموشی ژن است که در این تحقیق از این روش برای بررسی خاموشی یکی از ژن‏های مهم مسیر آلکالوئیدهای این گیاه استفاده شد.
مواد و روش‏ها: در این تحقیق به‏­منظور کاهش سیستماتیک در سطوح بیان ژن آنزیم­های مسیر تولید آلکالوئیدهای بنزیل ایزوکوئینولین از VIGS استفاده شد. جهت خاموشی ژن کدئین رداکتاز (Codeinone Reductase) از ناقل pTRV جهت همسانه­سازی استفاده شد. انتقال آگروباکتری حاوی سازه مورد نظر به برگ­های 2 تا 3 هفته­ای با استفاده از روش اگرواینفیلتراسیون انجام شد.
نتایج: نتایج همسانه­سازی این ژن با استفاده از روش­های مختلف مولکولی همانند PCR و هضم آنزیمی مورد تایید قرار گرفت. ترا ریختگی گیاهان تلقیح شده با سازه ژنتیکی مورد نظر با استفاده از PCR اثبات شد. تعیین سطوح نسخه­برداری ژن هدف با استفاده از فن PCR نیمه کمی و PCR در زمان واقعی نشان داد که بیان ژن   COR حدود 89 درصد کاهش یافته است.
نتیجه‌گیری: نتایج این تحقیق نشان داد که با استفاده از روش تداخل RNA، بیان ژن کدئین رداکتاز به‏صورت معنی‌داری در مقایسه با شاهد کاهش بیان داشت.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

گیاهان دارویی از ارزش و اهمیت خاصی در تأمین بهداشت و سلامت جوامع هم به لحاظ درمان و هم پیشگیری از بیماری­ها برخوردار می­باشند. گرایش عمومی جامعه به استفاده از داروها و درمان­های گیاهی و به‏طور کلی فرآورده­های طبیعی به‏ویژه در طی سال‏های اخیر رو به افزایش بوده و مهم‏ترین علل آن، اثبات اثرات مخرب و جانبی داروهای شیمیایی از یک طرف و ایجاد آلودگی­های زیست محیطی تهدید کننده کره زمین از سوی دیگر بوده است (1).

گیاه دارویی شقایق (Papaver somniferum) یکی از مهم‏ترین گیاهان دارویی می‌باشد. خصوصیات دارویی شقایق از زمان‏های بسیار دور شناخته شده و ترکیبات گیاهی آن در ارتباط با زمینه­های اقتصادی، اجتماعی و سیاسی موجب شده تا به‏عنوان یکی از مهم‏ترین گیاهان دارویی دنیا مطرح شود. اهمیت دارویی این گونه مربوط به قابلیت تولید گروهی از آلکالوئیدهای بنزوفنانتریدین از زیر گروه آلکالوئیدهای بنزوایزوکوئینولی می­باشد. برخی از این مسکن­ها به‏عنوان آلکالوئیدهای 5حلقه­ای بنزیل ایزوکوئینولین شامل تبائین، کدئین، مورفین و مشتقات آن‏ها می­باشند. مورفین به­همراه مواد شیمی درمانی دیگر نظیر وین کریستین و وین‌بلاستین و کامپوتسین ازآلکالوئیدهای مهم تجاری شده هستند که از این گیاه دارویی استخراج می­شوند. همچنین می‌توان به آنتی­بیوتیک­هایی نظیر سانگونارین دارای خاصیت ضد میکروبی و ضد التهابی، نوسکاپین دارای خاصیت ضد سرفه و ضد توموری، پاپاورین به‏عنوان گشاد کننده رگ‏ها و توبوکورارین شل‌کننده عضلات اشاره نمود (2).

در طول مسیر ساخت داروهای نارکوتیک انتهایی، آنزیم مرحله نهایی در دو واکنش متناوب کدئینون رداکتاز می­باشد. اولین بار کدئینون رداکتاز (COR) توسط لنز و زنک (3) از کشت سلولی گونهP. somniferum استخراج شد. در سال 1999 نیز برای اولین بار جداسازی و شناسایی چهار cDNA مشابه کد کننده کدئینون رداکتاز انجام گرفت و در اشرشیاکلایی بیان شد (4). مسیر تولید آلکالوئیدهای مورفینان در شکل 1 آمده است (5).  

 

 

شکل 1: مسیر تولید آلکالوئیدهای مورفینان (5).

 

مهندسی متابولیک گیاهی رشته نسبتا جدیدی از تحقیقات است که فرصت­های تازه­ای را برای پیشرفت متابولیک­های گیاهی، سلولی و فرآیندهای فیزیولوژیکی ایجاد می­کند. امروزه مهندسی متابولیک به‏عنوان روشی خاص برای تنظیم ساخت آلکالوییدها و دست­کاری فرآورده­های متابولیکی است که می­تواند سطح مسیرهای با ارزش میانه یا فرآورده­های انتهایی را به­وسیله فوق بیان از یک آنزیم با سرعت محدود افزایش دهد و یا اینکه متابولیت­های نامطلوب را از طریق خاموشی ژن از بین برده و کاهش دهد (6). تاکنون آزمایش‏های زیادی جهت بررسی اثرات مهندسی متابولیکی مسیر آنزیمی ساخت مورفینان چه از طریق روش­های افزایش بیان ژن و چه از طریق روش­های خاموشی ژن انجام گرفته است. در گیاه شقایق  آزمایش‏هایی جهت افزایش بیان موقت ژن COR انجام گرفت که11 گیاه از 15 گیاه افزایش بیان را نشان دادند (7).

یکی از راه‏های کاهش و متوقف سازی یک محصول در گیاه، خاموشی ژن می باشد که انواع مختلفی دارد (8). خاموشی پس از رونویسی (Post-transcriptional gene silencing) شامل آلودگی توالی نوکلئوتیدی خاصی است که با ویروس و mRNA سلول انجام می­گیرد (9). VIGSروشی است که در آن از دفاع ذاتی گیاه بر علیه آلودگی ویروسی استفاده شده و براساس پدیده RNA- interference  (RNAi) می­باشد که به تداخل بیان ژن به واسطه RNA های کوچک در توالی خاصی اشاره دارد. در گیاهانی که با ویروس آلوده می­شوند، چرخه­هایی ایجاد می­شود که RNA ویروسی، خاموشی ژن را در میزبان در برابر ویروس، تحریک می­کند (10). فن VIGS فنی قوی برای خاموشی ژن­های خاص و مطالعه سریع کاهش عملکرد و آنالیز بیان ژن است که نیازمند تراریزش در گیاه می­باشد و روشی ساده است که عملکرد را به‏سرعت نشان می­دهد (11). هدف از انجام این تحقیق ساخت سازه خاموشی موقت ژن کدئینون رداکتاز (COR) و تاثیر آن روی بیان ژن هدف آن در گیاه دارویی شقایق بود.

مواد و روش­ها

این آزمایش در آزمایشگاه بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی دانشگاه لرستان به اجرا در آمد. بذور گیاه شقایق (P. somniferum) از موسسه جنگل‏ها و مراتع تهیه شدند. پس از ضدعفونی بذور با الکل 70 درصد به‏مدت یک دقیقه، هیپوکلریت سدیم 5 درصد به‏مدت 10 دقیقه و پس از چند بار شستشو با آب مقطر استریل، در نهایت بذور استریل در محیط B5 (12) بدون هورمون حاوی 30 میلی­گرم بر لیتر ساکارز کشت شدند. بذ‏رهای کشت شده در شرایط مناسب جهت جوانه‌زنی در دمای 23 درجه سانتی­گراد با تناوب نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی نگه‏داری شدند. سپس برگ‏های جوان گیاه‏چه­های یک و نیم ماهه برداشت شد و با نیتروژن مایع پودر شد و بلافاصله در یخچال 80- درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شد. به‏منظور ساخت سازه خاموشی موقت ژن COR، ابتدا از گیاه با استفاده از کیت RNA XPLUS (شرکت سیناژن) استخراج RNA انجام گرفت. سپس با آنزیم رونوشت بردار معکوس، cDNA ساخته شد. از cDNA تکثیر شده به‏عنوان الگو جهت ساخت DNA دو رشته­ای و تکثیر ژن توسط PCR با استفاده از آغاز گرهای اختصاصی ژن طبق برنامه استفاده شد. طراحی آغاز گر با استفاده از نرم افزار Vector NTI (version 9.0) روی توالی گرفته شده از پایگاه اطلاع داده­ها NCBI (شماره دسترسی (AF108435 طراحی شد. برنامه زمانی PCR به‏صورت دمای واسرشتگی 94 درجه سانتی­گراد به‏مدت 1 دقیقه، دمای اتصال 56 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 1 دقیقه و بسط در دمای 72 درجه سانتی­گراد به‏مدت 2 دقیقه طراحی شد. 35 چرخه برای واکنش PCR در نظر گرفته شد. الکتروفورز ژل آگارز برای محصول PCR بر روی ژل 5/1 درصد انجام گرفت. به‏منظور تکثیر و نگه‏داری ژن موردنظر و همسانه­سازی آن در ناقل pTRV ابتدا محصول PCR در ناقل T/A کلون شد. سپس قطعه تکثیر شده و الکتروفورز محصول PCR بر روی ژل آگارز 5/1 درصد انجام شد و پس از مشاهده باند مورد نظر و تطبیق اندازه باند با اندازه باند نشانگر، باند توسط دستورالعمل شرکت فرمنتاز از روی ژل استخراج شد و بعد الحاق محصول PCR در ناقل Vector ) Ptz57R/Tشرکت فرمنتاز) به‏کمک آنزیم لیگاز T4 طبق دستورالعمل شرکت انجام شد. تراریزش و عمل انتقال ناقل به باکتری E.coli سوش DH5α به روش ذوب و یخ با استفاده از شوک کلسیمی انجام گرفت. برای غربال باکتری‏هایی که پلاسمید به آن‏ها منتقل نشده است از آنتی بیوتیک آمپی سیلین و برای جداسازی باکتری‏هایی با پلاسمید ترا ریخت از روش رنگ کلونی استفاده شد. تعدادی از کلونی­های سفید به‏دست آمده (تراریزش شده) واکشت شد و کلونی PCR  با آغاز گرهای ژن انجام گرفت. بعد از تایید کلونی PCR بر روی کلونی‏ها، از کلونی‏ها استخراج پلاسمید با روش Miniperpration انجام شد و سپس مورد توالی یابی قرار گرفتند. نتیجه حاصل از توالی یابی با بانک‌های اطلاعاتی تطابق داده شد و آغاز گرهایی برای تکثیر این قطعه توسط نرم افزار (Vector NTI (version 9.0) طراحی شد. بعد از طراحی آغاز گرها و بازیابی قطعه نهایی، قطعه موردنظر به‏منظور مشابه نبودن توالی‌های برشی بر روی قطعه، با نرم افزار  NEBCutter مورد بررسی قرار گرفت. برنامه زمانی PCR برای آغاز گرهای طراحی شده به این صورت بود که دمای واسرشتگی 94 درجه سانتی­گراد به‏مدت 1 دقیقه، دمای اتصال 59 درجه سانتی­گراد به‏مدت 1 دقیقه و بسط در دمای 72 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 2 دقیقه طراحی شد. 35 چرخه برای واکنش PCR در نظر گرفته شد. الکتروفورز ژل آگارز برای محصول PCR بر روی ژل 5/1 درصد انجام گرفت.

به‏علت اینکه در فن خاموشی به‏روش VIGS اساس کار بر پایه همولوژی است، قطعه مورد نظر با استفاده از سایت RNASCAN مورد بررسی قرار گرفت. بعد از تایید توالی یابی، کشت مایع از یکی از کلونی‏های سفید تایید شده انجام شد و به‏مدت یک شب در دمای 37 درجه سانتی‏گراد در انکوباتور انکوبه شد. روز بعد استخراج پلاسمید انجام گرفت.

همسانه سازی ژن  COR در ناقل خاموشی pTRV2

یکی از ناقل­های مورد استفاده در VIGS ناقل pTRV یا ویروس جغجغه ای توتون می­باشد که متعلق به جنس Tobravirus بوده و ژنوم آن از نوع مولکول RNA تک رشته ای می­باشد. ناقل pTRV در دو ناقلpTRV1 و pTRV2 توزیع شده است. ناقلpTRV1 حاوی ژن­های کد کننده برای حرکت پروتئین و تکثیر پروتئین می­باشد. ناقلpTRV2 شامل ژن­های کد کننده پروتئین پوششی (coat protein) و دو پروتئین غیرساختاری است. هر دو بخش ژنوم ویروسی به‏وسیله آغاز گر CaMV 35S  آغاز و با ساخت نوپالین به اتمام می­رسند. هر دو ناقل مقاومت به آنتی بیوتیک کانامایسین را دارند. در شکل 2 ساختارهای ناقل pTRV1 و pTRV2 آمده است (13).

 

 

شکل 2: ساختار ناقل­های pTRV1 و pTRV2 (13).

 

برروی پلاسمید استخراج شده از ناقل T/A به‏منظور ساخت سازه خاموشی، هضم آنزیمی با آنزیم‌های XbaI وSma1 گذاشته شد. هم‏زمان با آن هضم آنزیمی بر روی ناقل pTRV2 با همان آنزیم‏های برشی انجام گرفت. در روی ژل محصول حاصل از هضم آنزیمی در ناقل T/A دو باند به‏دست آمد، یک باند 214 جفت نوکلئوتیدی و یک باندی در حدود سه کیلو بازی، که باند 214 جفت نوکلئوتیدی از ژل آگارز جدا شد. هم‏زمان با آن محصول هضم ناقل خاموشی pTRV2 نیز بر روی ژل آگارز برده شد و باند بریده شده آن از روی ژل با استفاده از کیت استخراج ژن از ژل انجام شد. سپس الحاق باند بریده شده از روی ژل در ناقل pTRV2 توسط آنزیم لیگاز T4 طبق دستورالعمل شرکت انجام شد.

انتقال سازه خاموشی موقت ژن COR به آگروباکتری: پس از ساخت سازه خاموشی موقت ژن COR، از آگروباکتری تومیفشنس (A. tumefaciens) سویه GV3101 برای انتقال ژن به گیاه استفاده شد. پلاسمید از باکتری E.coli استخراج شده و به باکتری آگروباکتری تومیفشینس سویه GV3101 به‏روش ذوب انجماد شوک کلسیمی انتقال داده شد.

انتقال سازه خاموشی موقت به گیاه: برای انتقال سازه به گیاه، بذور گیاه شقایق در گل‏خانه در گلدان­های حاوی خاک سیلتی لومی کشت شدند و در دمای 23 درجه سانتی‏گراد و تناوب نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار گرفتند. به‏منظور انتقال سازه خاموشی به گیاه ابتدا یک تک کلونی از آگروباکتری حاوی سازه خاموشی در LB مایع حاوی آنتی‏بیوتیک‌های کانامایسین (50 میلی­گرم بر لیتر) و ریفامپسین (20 میلی­گرم بر لیتر) و 20 میکرولیتر استوسرینگون و 10 میلی‏مولار بافر MES اضافه شد و کشت شبانه داده شد. باکتری رشد یافته در سانتریفیوژ با 3000 دور در دقیقه با دمای 4 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 20 دقیقه قرار گرفت. به رسوب باکتری، محیط القایی رشد که شامل 10 میلی مولار Mgcl2 و 20 میکرولیتر استوسرینگون و 10 میلی مولار بافر MES است اضافه شد، به‏طوری‌که به OD600=0.25 رسید. اگروباکتری دارای COR-pTRV2 با pTRV1 خالی با نسبت 1:1 ترکیب و برای شاهد نیزpTRV2 خالی با pTRV1 خالی با نسبت 1:1 ترکیب شدند. بعد از دو ساعت که باکتری در دمای اتاق قرار گرفت و رشد کرد، مقدار 1 میلی‏لیتر از محیط را با سرنگ کشیده و به سطح پشتی برگ تزریق شد.

به‏منظور بررسی گیاهان ترا ریخت، حدود 8 تا 10 هفته پس از اگرواینفیلتراسیون گیاه، هم‏زمان با ظهور جوانه­های گل، سه قطعه یک سانتیمتری از بافت ساقه در زیر جوانه گل برش خورده و به‏صورت تازه در نیتروژن مایع پودر شد، سپس از آن‏ها استخراج RNA و ساخت cDNA انجام گرفت. از ساخت پروتئین پوششی ویروس برای جداسازی اولیه ترا ریخت­ها از غیر ترا ریخت­ها استفاده شد که به‏کمک PCR غربال شدند. سپس گیاهانی که وجود پروتئین پوششی در آن‏ها تایید شد PCR نیمه کمی با آغاز گرهای کدئینون رداکتاز (COR) و فاکتورهای طویل شدن نسخه برداری ((Elongation factor انجام گرفت. آغاز گرهای طراحی شده برای پروتئین پوششی و ژن کدئینون رداکتاز در جدول 1 آمده است. پس از انتخاب گیاهان بر اساس PCR نیمه‌کمی، واکنش PCR در زمان واقعی انجام گرفت. این واکنش براساس نورسنجی رنگ فلورسنس سایبرگرین انجام گرفت و از ژن دائم‌البیان فاکتور طویل شدن نسخه برداری (EF) به‏عنوان ژن کنترل داخلی استفاده شد. جهت آنالیز نتایج PCR در زمان واقعی، از فرمول ΔΔct -2  استفاده شد (14). مواد واکنش PCR در زمان واقعی شامل 10 میکرولیتر محلول حاوی سایبرگرین، 1 میکرولیترآغاز گر رفت (باغلظت pmol/µL 10)، 1 میکرولیترآغاز گر برگشت (باغلظت pmol/µL 10)، 2 میکرولیتر از نمونه موردنظر و 6 میکرولیتر آب مقطر استریل بود که حجم نهایی واکنش به 20 میکرولیتر رسید. واکنش PCR در زمان واقعی به این صورت انجام شد که واسرشتگی مقدماتی به‏مدت 3 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی‏گراد، واسرشتگی به‏مدت 10 ثانیه در دمای 95 درجه سانتی­گراد و برای اتصال  آغاز‏گر‏ها به‏مدت 25 ثانیه در دمای 60 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند. تعداد چرخه­ها 35 سیکل بود.

 

 

 

جدول1 : لیست آغاز گرهای به‏کاربرده شده در واکنش PCR در زمان واقعی.

 

 

نتایج

به‏منظور تایید ساخت سازه خاموشی ژن کدئینون رداکتاز در ناقل pTRV2، از روش کلونی PCR روی کلونی­های E.coli استفاده شد. نتایج این واکنش نشان داد که تعداد قابل توجهی از کلونی‌ها باند مورد نظر (قطعه 224 جفت باز) را تولید کردند (شکل 3). در مرحله بعد، از کلونی‌هایی که وجود سازه مورد نظر در آن‏ها تایید شد،‌ استخراج ناقل صورت گرفت و ناقل مربوطه به آگروباکتری ترانسفورم شد. سپس وجود ناقل حاوی سازه خاموشی ژن کدئینون رداکتاز در آگروباکتری با روش PCR مورد بررسی قرار گرفت. برای این منظور از آگروباکتری استخراج پلاسمید صورت گرفت و با استفاده از واکنش PCR قطعه مورد نظر (قطعه 224 جفت باز) تکثیر شد (شکل 4) که تایید کافی بر وجود ناقل حاوی قطعه خاموشی ژن هدف در آگروباکتری بود.

 

 

شکل 3: نتیجه کلونی PCR روی کلونی­های E.coli حاوی خاموشی  CORدر ناقل خاموشی موقت pTRV2. چاهک شماره 1و20 نشانگر bp100، چاهک شماره 2، 3، 4، 5، 6، 11، 15و 19 کلونی­هایی که قطعه خاموشی در آن‏ها تراریزش شده است.

 

شکل 4: نتیجه استخراج پلاسمید از آگروباکتری و PCR خاموشی  COR، چاهک 1 مارکر bp 100، چاهک 2 و3 محصول PCR قطعه خاموشی COR ، چاهک 4 کنترل منفی.

 

با توجه به اینکه از روش تلقیح با آگروباکتری حاوی ناقل ویروسی در بردارنده قطعه خاموشی جهت ترا ریخت نمودن موقت گیاهان استفاده شد؛ از این‏رو جهت غربال و تفکیک گیاهان ترا ریخت از غیرترا ریخت از روش PCR استفاده شد. برای این منظور، پس از  استخراج RNA و ساخت cDNA، از آغاز گرهای ژن پروتئین پوششی ویروس (CP) جهت واکنش استفاده شد. نتایج نشان داد که تعداد قابل توجهی از گیاهان ترانسفورم شده، حاوی سازه ژنتیکی مورد نظر بودند و باندی با اندازه 370 جفت باز در این گیاهان مشاهده شد (شکل 5). 

 

 

شکل 5: تعیین نمونه­های دارای پروتئین پوششی، چاهک 1 نشانگرbp100، چاهک 2، 3، 5، 7، 8، 10، 11 نمونه­های دارای پروتئین پوششی.

 

جهت بررسی میزان خاموشی ژن مورد نظر در گیاهان ترا ریخت تایید شده از این آزمایش، ابتدا از واکنش PCR نیمه کمی استفاده شد. نتایج نشان داد که در تعدادی از نمونه‌ها بر اساس مقایسه شدت باندهای تولید شده (شکل 6)، گیاهان یا نمونه‌های شماره نمونه­های شماره 2، 7، 8 و 10 دارای کاهش بیان بیشتری نسبت به گیاه شاهد (غیرترا ریخت) بودند. بنابراین این گیاهان جهت آنالیز بیان ژن با روش PCR در زمان واقعی انتخاب شدند.

نتایج آنالیز بیان ژن در گیاهان ترا ریخت حاوی قطعه خاموشی ژن کدئینون رداکتاز با روش PCR در زمان واقعی در حداقل سه تکرار فنی و زیست شناختی روی سه قسمت ساقه انجام شد. نتایج نشان داد که سطح نسخه­برداری ژن  CORدر گیاهان ترا ریخت انتخاب شده نهایی به‏طور میانگین حدود 89 درصد نسبت به گیاهان غیر ترا ریخت (شاهد) کاهش بین نشان داد ( شکل7).

 

 

شکل 6: مقایسه نمونه­های خاموشی ژن COR با فاکتورهای طویل شدن نسخه برداری.

 

شکل 7: مقایسه سطح نسبی نسخه­برداری ژن  CORدرگیاهان ترا ریخت (TRV2-COR) با گیاهان غیر ترا ریخت (TRV2-EMPTY).

 

بحث

گیاه شقایق (Papaver somniferum) منبع تجاری مهمی از داروهای مسکن مورفینانی و کدئین می­باشد. سایر ترکیبات با خاصیت دارویی مثل وین­کریستین، وین­بلاستین و کامپوتسین از مهم‏ترین آلکالوئیدهای تجاری هستند که از گیاه داروئی شقایق استخراج می­شوند. ساخت از ابتدا و تبدیل شیمیایی این ترکیبات عملی است ولی در درجه اول مقرون به صرفه نیست (15). از این‏رو دانشمندان به‏دنبال اصلاح و دست‌ورزی مسیر ژن‏های ساخت این آلکالوئیدها با استفاده از روش­های مرسوم اصلاح گیاهان (مثل روش‏های جهش­زایی) و یا روش‏های مبتنی بر مهندسی ژنتیک (مثل روش‏های انتقال ژن‏های مربوط به فوق بیان ژن یا روش‏های خاموش‌سازی ژن‏ها) با تکیه بر فن تراریزش پایدار یا تراریزش موقت به‏واسطه آگروباکتری بوده‌اند (16).

نتایج این تحقیق نشان داد که VIGS روشی سریع و موثر برای بررسی عملکرد ژن در P. somniferum است که می­تواند در سطح بالایی خاموشی را در گیاه ایجاد کند. خاموش سازی القایی با ویروس یا همان VIGS یک روش منتخب برای خاموشی سریع ژن­های گیاهی به‏منظور شناخت عملکرد ژن است. با استفاده از این فن قابلیت تجزیه و تحلیل ژن­های گیاهانی که دستورالعمل­های انتقال برای آن‏ها هنوز در دسترس نیست امکان‏پذیر است و به‏علاوه نکته قابل توجه اینکه خاموشی ژن­ها در این روش در نواحی مریستمی موثر می­باشد (17). بر این اساس این امکان فراهم می­شود که عملکرد ژن را بتوان در همان مراحل اولیه بررسی نمود. از بین روش­های به‏کار رفته در خاموشی موقت، روش آگرواینفیلتراسیون گیاه موثرترین روش بوده است. همچنین از بین سویه­های مختلف آگروباکتری سویه GV3101 بیشترین خاموشی و از بین تلقیح در مراحل مختلف رشد گیاه، تلقیح در مرحله 3 تا 5 برگی بیشترین خاموشی را در گیاه موجب شده است (18).

 سطوح خاموشی نیز بسته به شرایط محیطی میزبان، دما، شرایط رشد و مرحله تلقیح متفاوت است (9). در تحقیقاتی که به‏منظور بررسی نقش ژن Norcoclaurine Synthase (NCS) در Opium poppy انجام شد، خاموشی سیستمیک با استفاده از ناقل ویروسی pTRV  درگیاه شقایق القا شد که نتایج آن کاهش 80 درصدی در بیان ژن NCS را نسبت به گیاهان شاهد نشان داد (19). در مطالعات دیگری که در خاموشی ژن­های Salsyn، SalR،SalAT ،T6ODM ، CODM وCOR در گیاه شقایق صورت گرفت، خاموشی هر کدام از ژن­ها در سطح نسخه برداری باPCR   در زمان واقعی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج پژوهش مذکور نشان داد که سرکوب سطوح نسخه برداری (خاموشی) در محدوده­ای از 70 تا 90 درصد (که برای ژن CODM کمترین و برای ژن COR بیشترین بود) متغیر بود (9). نتایج تحقیق حاضر نشان داد که خاموشی بیان ژن در یرای ژن COR حدود 89 درصد بود. با توجه با این نتایج دیده می‌شود که این نتایج با نتایج به‏دست آمده در پژوهش‌های مذکور مطابقت دارد. به‏طور کلی از نظر کاربردی، نتایج حاضر ثابت کرد که بیان ژن‏های مربوط به ساخت آلکالوئیدهای بنزوایزوکوئینولین گیاه مورد مطالعه می­تواند با به‏طور موثری با فن خاموشی سیستمیک با استفاده از ناقل ویروسی (VIGS) تغییر یابد.

نتیجه­گیری

در مجموع اگر چه روش‏های مختلفی از قبیل الیسیتورهای زیستی (20)، روش‏های به‌زراعی و غیره جهت تغییر مقدار آلکالوئیدهای گیاهی وجود دارد، ولی نتایج این تحقیق نشان داد که می‌توان از فن VIGS به‏طور قابل ملاحظه ای جهت دستورزی بیان ژن‏های مسیرهای متابولیکی دارویی بنزوایزوکوئنولینی در گیاه دارویی شقایق بهره برد.

منابع

  1. Aryapor, A, Mirzaeimolla Mohammad, R. Medicinal, aromatic and industrial plants of forest and rangeland.1th Ed. High education of Elmikarbordi Press; 2010; 232 (in Persian)                  
  2. Fiore SD, Hoppmann V, Fischer R, Schillberg S. Transient gene expression of          recombinant terpenoid indole alkaloid enzymes in Catharanthus roseus leaves. Plant Mol Biol Rep. 2004; 22: 15-22.

 

  1. Lenz R, Zenk MH. Purification and properties of codeinone reductase (NADPH) from Papaver somniferum cell cultures and differentiated plants. Eur J Biochem. 1995; 233: 132-139.
  2. Unterlinner B, Lenz R, Kutchan TM. Molecular cloning and functional expression of codeinone reductase: the penultimate enzyme in morphine biosynthesis in the opium poppy Papaver somniferum. Plant J. 1999; 18(5): 465-475.
  3. Frick S, Kramell R, Kutchan, TM. Metabolic engineering with a morphine biosynthetic P450 in opium poppy surpasses breeding. Metabolic Eng. 2007; 9(2): 169-176.
  4. Larkin PJ, Miller JA, Allen RS, Chitty JA, et al. Increasing morphinan alkaloid production by over‐expressing codeinone reductase in transgenic Papaver somniferum. Plant Biotech J. 2007; 5(1): 26-37.
  5. Hosseini B, Shahriari-Ahmadi F, Hashemi H, Marashi MH, et al. Transient Expression of cor Gene in Papaver somniferum. BioImpacts. 2011; 1(4): 229.
  6. Kahrizi, D. Reduction of EPSP synthase in transgenic wild turnip (Brassica rapa) weed via suppression of aroA. Mol. Biol. Rep. 2014; 41: 8177-8184.
  7. Wijekoon CP, Facchini PJ. Systematic knockdown of morphine pathway enzymes in opium poppy using virus‐induced gene silencing. Plant J. 2012; 69(6): 1052-1063.
  8. Purkayastha A, Dasgupta I. Virus-induced gene silencing: a versatile tool for discovery of gene functions in plants. Plant Physiol. Biochem.2009; 47: 967-976.
  9. Dang TTT, Facchini PJ. Characterization of three O-methyltransferases involved in noscapine biosynthesis in opium poppy. Plant Physiol. 2012; 159(2): 618-631.
  10. Gamborg O, Miller R, Ojima K. Nutrient requirements of suspensioncultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 1968; 50(1): 151–158.
  11.  Tekleyohans DG, Lange S, Becker A. Virus-Induced Gene Silencing of the Alkaloid-Producing Basal Eudicot Model Plant Eschscholzia californica (California Poppy) in Virus-Induced Gene Silencing pp. Springer. 2013; 975: 83-98.
  12.  Livak K. Comparative CT method. ABI Prism. 1997; 7700(2): 11-15.
  13. La Valva V, Sabato S, Siniscalco Gigliano G. Morphology and alkaloid chemistry of Papaver setigerum DC. (Papaveraceae). Taxon. 1985; 34(2): 191–196.
  14. Facchini PJ, Loukanina N, Blanche V. Genetic transformation via somatic embryogenesis to establish herbicide-resistant opium poppy. Plant Cell Rep. 2008; 27: 719–727.  
  15. Liu Y, Nakayama N, Schiff M, Litt A, et al. Virus induced gene silencing of a deficiens ortholog in Nicotiana benthamiana. Plant Mol. Biol. 2004a; 54: 701-711.
  16. Hileman LC, Drea S, Martino G, Litt A, Irish VF. Virus‐induced gene silencing is an effective tool for assaying gene function in the basal eudicot species Papaver somniferum (opium poppy). The Plant Journal. 2005; 44(2): 334-341.
  17. Lee EJ, Facchini PJ. Norcoclaurine synthase is a member of the pathogenesis-related 10/Bet v1 protein family. Plant Cell. 2010; 22(10): 3489-350.

 Esmaeilzadeh Bahabadi S, Sharifi M. Increasing the Production of Plant Secondary Metabolites Using Biotic Elicitors. J Cell Tissue. 2013; 4(2): 119-128.

  1. Aryapor, A, Mirzaeimolla Mohammad, R. Medicinal, aromatic and industrial plants of forest and rangeland.1th Ed. High education of Elmikarbordi Press; 2010; 232 (in Persian)                  
  2. Fiore SD, Hoppmann V, Fischer R, Schillberg S. Transient gene expression of          recombinant terpenoid indole alkaloid enzymes in Catharanthus roseus leaves. Plant Mol Biol Rep. 2004; 22: 15-22.
 

  1. Lenz R, Zenk MH. Purification and properties of codeinone reductase (NADPH) from Papaver somniferum cell cultures and differentiated plants. Eur J Biochem. 1995; 233: 132-139.
  2. Unterlinner B, Lenz R, Kutchan TM. Molecular cloning and functional expression of codeinone reductase: the penultimate enzyme in morphine biosynthesis in the opium poppy Papaver somniferum. Plant J. 1999; 18(5): 465-475.
  3. Frick S, Kramell R, Kutchan, TM. Metabolic engineering with a morphine biosynthetic P450 in opium poppy surpasses breeding. Metabolic Eng. 2007; 9(2): 169-176.
  4. Larkin PJ, Miller JA, Allen RS, Chitty JA, et al. Increasing morphinan alkaloid production by over‐expressing codeinone reductase in transgenic Papaver somniferum. Plant Biotech J. 2007; 5(1): 26-37.
  5. Hosseini B, Shahriari-Ahmadi F, Hashemi H, Marashi MH, et al. Transient Expression of cor Gene in Papaver somniferum. BioImpacts. 2011; 1(4): 229.
  6. Kahrizi, D. Reduction of EPSP synthase in transgenic wild turnip (Brassica rapa) weed via suppression of aroA. Mol. Biol. Rep. 2014; 41: 8177-8184.
  7. Wijekoon CP, Facchini PJ. Systematic knockdown of morphine pathway enzymes in opium poppy using virus‐induced gene silencing. Plant J. 2012; 69(6): 1052-1063.
  8. Purkayastha A, Dasgupta I. Virus-induced gene silencing: a versatile tool for discovery of gene functions in plants. Plant Physiol. Biochem.2009; 47: 967-976.
  9. Dang TTT, Facchini PJ. Characterization of three O-methyltransferases involved in noscapine biosynthesis in opium poppy. Plant Physiol. 2012; 159(2): 618-631.
  10. Gamborg O, Miller R, Ojima K. Nutrient requirements of suspensioncultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 1968; 50(1): 151–158.
  11.  Tekleyohans DG, Lange S, Becker A. Virus-Induced Gene Silencing of the Alkaloid-Producing Basal Eudicot Model Plant Eschscholzia californica (California Poppy) in Virus-Induced Gene Silencing pp. Springer. 2013; 975: 83-98.
  12.  Livak K. Comparative CT method. ABI Prism. 1997; 7700(2): 11-15.
  13. La Valva V, Sabato S, Siniscalco Gigliano G. Morphology and alkaloid chemistry of Papaver setigerum DC. (Papaveraceae). Taxon. 1985; 34(2): 191–196.
  14. Facchini PJ, Loukanina N, Blanche V. Genetic transformation via somatic embryogenesis to establish herbicide-resistant opium poppy. Plant Cell Rep. 2008; 27: 719–727.  
  15. Liu Y, Nakayama N, Schiff M, Litt A, et al. Virus induced gene silencing of a deficiens ortholog in Nicotiana benthamiana. Plant Mol. Biol. 2004a; 54: 701-711.
  16. Hileman LC, Drea S, Martino G, Litt A, Irish VF. Virus‐induced gene silencing is an effective tool for assaying gene function in the basal eudicot species Papaver somniferum (opium poppy). The Plant Journal. 2005; 44(2): 334-341.
  17. Lee EJ, Facchini PJ. Norcoclaurine synthase is a member of the pathogenesis-related 10/Bet v1 protein family. Plant Cell. 2010; 22(10): 3489-350.
  18.  Esmaeilzadeh Bahabadi S, Sharifi M. Increasing the Production of Plant Secondary Metabolites Using Biotic Elicitors. J Cell Tissue. 2013; 4(2): 119-128.