بررسی اثرات ساکارومیسس بولاردی غنی شده با نانواکسید سلنیوم بر سلول‏های سرطان پستان القا شده در رت DMBA توسط

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه آزاد اسلامی، گروه میکروبیولوژی، واحد فلاورجان، اصفهان، ایران

2 دانشگاه آزاد اسلامی، گروه زیست شناسی، واحد فلاورجان، اصفهان، ایران

3 دانشگاه آزاد اسلامی، گروه بیوشیمی، واحد فلاورجان، اصفهان، ایران

چکیده

هدف: این مطالعه به ‏بررسی اثرات ضدسرطانی ساکارومایسس بولاردی وساکارومایسس بولاردی غنی‏‏شده با نانواکسید سلنیوم بر سلول‏های سرطان پستان القا شده در رت توسط کارسینوژن 7-12 دی‏متیل بنزا آنتراسن پرداخته است.
مواد و روش‏ها: سرطان سینه با تزریق کارسینوژن به ‏نوک سینه رت‏های ماده القا شد. بعد از رسیدن تومورها به‏سایز 10 میلی‏متر و جهت تهیه مقاطع بافتی و سلول­های منفرد تومورها جدا شد. سلول‏های سرطانی با غلظت‏های متفاوتی از سوسپانسیون ساکارومایسس بولاردی و ساکارومایسس بولاردی غنی‏شده با نانواکسید سلنیوم تیمار شدند. سایتوتوکسیتی با دو روش MTT و تریپان‏بلو بررسی شد.
نتایج: مقایسه دو گروه دریافت کننده ساکارومایسس بولاردیو مخمر غنی‏شده با نانواکسید سلنیوم با استفاده از دو آزمون تغییرات درصد زیستایی سلول‏های سرطانی در هر دو غلظتµg/ml  5/0 و 1 مشاهده شد. به‏علاوه با افزایش غلظت، زیستایی به‏طور معنی‏داری کاهش یافته است. درصد زیستایی سلول‏های سرطانی در گروه‏های آزمایشی تیمار با مخمر غنی شده با نانواکسید سلنیوم با افزایش غلظت مخمر غنی شده کاهش یافت. با مقایسه غلظت‏های مختلف مخمر با مخمر غنی شده، نشان داده شد که بین اثر سایتوتوکسیستی آن‏ها برروی سلول‏ها اختلاف معنی‏داری وجود دارد.
نتیجه‏گیری: مخمرهای پروبیوتیکی احتمالا می­توانند کاندید مناسبی برای درمان بیماری­ها و در راس آن سرطان باشند، به‏ویژه زمانی که با ترکیبات نانواکسید سلنیوم همراه شوند.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

طبق آمار منتشر شده از سوی وزارت بهداشت و درمان، در حال حاضر سرطان پستان شایع‏ترین سرطان در میان زنان کشور به‏شمار می‏رود و دومین سرطان کشنده پس از ریه است. بالابودن آمار مبتلایان به این نوع سرطان در کشورمان ضرورت انجام تحقیقات بیشتر برای پی‏بردن به مکانیسم‏های ایجاد سرطان و ابداع روش‏های درمانی موثرتر را آشکار می‏سازد. سرطان پستان را می‏توان توسط انواع مختلفی از عواملی نظیر هورمون‏ها، پرتوهای یونیزان و مواد کارسینوژن ایجاد نمود، اما یکی از پرکاربردترین روش‏های القا سرطان پستان در رت، استفاده از نوعی ماده شیمیایی به‏نام 7 و 12 دی‏متیل بنزا آنتراسن میباشد. وجود عواملی مانند تنوع پروسه‏های پاتولوژیک و مکانیسم­های مقاومت به ‏درمان، انتخاب مناسب‏ترین و کارآمدترین نوع درمان را برای هر یک از بیماران مشکل ساخته است و این امر لزوم انجام آزمایشهای gurd ortiv nI tnatsiser/ytivitisnes را روشن می‏سازد.

 پروبیوتیک­ها میکروارگانیسم­های زنده و مفیدی هستند که در صورت مصرف در انسان یا حیوان و با اثر بر فلور میکروبی بدن باعث بروز اثرات مفیدی بر سلامتی میزبان می‏شوند. امروزه پروبیوتیک‏ها به‏عنوان عاملی برای پیش‏گیری از ابتلا به‏بسیاری از بیماری­های عفونی و سرطانی شناخته شده‏اند (1). ریکی و همکاران (2) نشان دادند که لاکتوباسیلوس کازئی و لاکتوباسیلوس پاراکازیی کشته شده باحرارت قادر به‏مهار رشد سلول‏های لوسمی میلوئید می‏باشند. ثابت شده است که پروبیوتیک‏ها می­توانند نقش‏های ضدسرطان را ازطریق چندین مکانیسم، ازجمله القا پاسخ‏های سیستم ایمنی، فعالیت‏های ضدپرولیفراتیو و القا آپوپتوزیس اعمال کنند (3). مخمرها گروهی از پروبیوتیک‏ها بوده و مانند باکتری‏های پروبیوتیک، تاثیر به‏سزایی در درمان و تامین سلامت انسان دارد. مطالعات نشان داده که مخمرها ازجمله ساکارومایسس سرویزیه و ساکارومایسس بولاردی باعث افزایش پاسخ ایمنی شده و هم‏چنین اثرات پیش‏گیری کننده از ابتلا به سرطان و مهارکنندگی رشد سلول‏های توموری را دارند (4، 5). علاوه ‏بر این سلنیوم به‏فرم‏های سلنیت، سلنات، سلنوسیستئین و سلنومتیونین به‏طور طبیعی کوفاکتور موثری برای عمل‏کرد صحیح آنزیم‏های آنتی‏اکسیدانتی در بدن محسوب می‏شود و مصرف دزهای پایین سلنیوم به‏نظر می­رسد که نه‏تنها برای پیش‏گیری سرطان‏ها مفید است بلکه می‏تواند به‏طور مثبت بر بسیاری از سایر کارکردهای موجود زنده از طریق کاهش التهاب، کاهش بیماری‏های قلبی و تنظیم فشار خون عمل نماید (6). مکانیسم پیشنهاد شده برای خاصیت ضدسرطانی سلنیوم و ترکیبات سلنیومی شامل تغییر در متابولیسم کارسینوژن‏ها، القای ترمیم DNA، تنظیم التهاب و سیستم ایمنی، تنظیم چرخه سلولی و مهار تکثیر سلول‏های سرطانی، مهار تحرک سلولی، مهار رگزایی یا آنژیوژنز و القای آپوپتوزیس می‏باشد (7). به‏منظور بهبود ایمنی ترکیبات سلنیومی، فرمولاسیون آن‏ها به‏صورت نانوذرات مزایای زیادی دارد. کپسوله کردن سلنیوم در اندازه‏های نانو به‏طرز کارآمدی باعث فراتنظیمی فعالیت سلنوآنزیم‏ها همراه با کم‏ترین سمیت در مقایسه با ترکیبات سلنیومی دیگر میشود (8). طبق مطالعات انجام شده، دریافت سلنیوم به‏صورت مخمر غنی شده باسلنیوم به‏عنوان یک روش بسیار مناسب، ایمن در غنی­سازی موادغذایی شناخته شده است، زیرا در این روش، سد بیولوژیک بین سلنیوم معدنی و فرد مصرف‏کننده قرار دارد و خطر دریافت سلنیوم در حد زیاد، کاهش می­یابد و مخمر غنی شده با سلنیوم تنها شکل سلنیوم است که تاکنون در پژوهش‏های تداخلی ضدسرطان در انسان‏ها کارایی داشته است (9). در یک مطالعه انجام شده در سال 3102 نشان داده شد که تغذیه موش­ها توسط مخمر غنی شده با سلنیوم می‏تواندکاهش قابل توجهی از رشد تومورهای متاستاتیک مغز را نشان دهد (01).

در این پژوهش از مدل رت نژاد ویستار استفاده شده که قادر به تقلید شرایط تومورهای انسانی تا حد بسیار زیادی می‏باشد و بنابراین می‏تواند مدل مناسبی برای مطالعه اثر ترکیبات ضدسرطانی به‏شمار آید. با بررسی داده‏های به‏دست آمده از این مطالعه به‏این موضوع پی خواهیم برد که آیا استفاده از مدل رت نژاد ویستار می‏تواند مدل مناسبی برای مطالعه اثر ترکیبات ضدسرطانی به‏شمار آید و این‏که آیا ساکارومایسس بولاردی غنی‏شده با نانواکسیدسلنیوم قادر به ازبین بردن سلول‏های سرطانی هستند؟

 

مواد و روش‌ها

برای انجام این پژوهش، 10رت ماده بالغ از نژاد ویستار با میانگین وزنی (20±150) از مرکز نگه‏داری حیوانات در دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان خریداری و در شرایط استاندارد 12/12 ساعت روشنایی/تاریکی، حرارت 5±23 درجه سانتی‏گراد، رطوبت 5±50 و دسترسی به آب و غذا مناسب نگه‏داری شد.

القا سرطان و تیمار رت‏ها: 60 میلی‏گرم DMBA بر کیلوگرم (Sigma آلمان) محلول در 1 میلی‏لیتر روغن کنجد به‏نوک سینه چپ 10 رت تزریق شد. پس از رسیدن تومور به‏اندازه 1 میلی‏لیتر، حیوانات توسط دی‏اتیل‏اتر بی‏هوش و تومورها  به‏طور کامل خارج شد. یک سوم تومور به‏منظور تهیه مقاطع بافتی برای مطالعه هیستوپاتولوژیک در فرمالین 10 درصد قرار داده شد و دو سوم باقی‏مانده جهت تهیه سلول‏های منفرد مورد استفاده قرار گرفت (2). تمام مراحل انجام آزمایش طبق اصول مصوبه کمیته اخلاق کار با حیوانات آزمایشگاهی در دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان با کد IR.IAU.FALA.REC.1396.012  انجام شد.

تهیه اسلایدهای بافتی: نمونه به‏دست آمده از تومور جدا شده به‏مدت 48 تا 72 ساعت در فرمالین 10 درصد قرار داده شد و در ادامه پس از انجام مراحل آب‏گیری، شفاف‏سازی، قالب‏گیری، برش با میکروتوم، رنگ‏آمیزی با هماتوتوکسین- ائوزین، نمونه‏ها بر روی لام‏ها مونته شدند و تغییرات هیستوپاتولوژیک با کمک میکروسکوپ نوری مورد ارزیابی قرار گرفت.

تهیه سلول‏های منفرد از بافت تومور: برای تهیه سلول منفرد  از بافت تومور، تومورها به‏زیر هود لامینار انتقال داده شده، از قسمت‏های داخلی تومور قطعاتی بریده و به‏فالکون‏های ۱۰ میلی لیتر حاوی بافر HBSS  انتقال داده شد. پس از جدا کردن خون و بافت اضافه، باقی‏مانده تومور با اسکالپل به‏ذرات بسیار ریز خرد و در دور rpm1500 به‏مدت 5 دقیقه سانتریفوژ شد. پس از آن محلول رویی دور ریخته شد و به‏رسوب فالکون 5  میلی‏لیتر محیط کشت DMEM (Gibco) حاوی 10 درصد FBS اضافه شد. پس از پیتاژ 2 میلی‏لیتر از این مخلوط را به فلاسک منتقل و حجم فلاسک را به 5 میلی‏لیتر رسانده شد. پس از ۲۴ ساعت انکوباسیون فلاسک‏ها در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و CO2 محیط‌ روی فلاسک تخلیه و 5 میلی‏لیتر محیط کشت تازه به فلاسک اضافه و مجدد انکوبه شد (2). (تعویض محیط و پاساژ سلول‏ها هر چند روز یک‏بار انجام می‏شد). رده سلول نرمال MCF10α خریداری شده از انستیتو پاستور نیز پاساژ وکشت داده شد. جهت انجام کشت سلولی، رده­ سلولی در محیط کشتDMEM  (Gibco) حاوی 10 درصد FBS و 1 درصد پنی‏سیلین و استرپتومایسین (Gibco)  در حضور 5 درصد CO2 و در دمای 37 درجه سانتی­گراد انکوبه شد. محیط سلول­ها، هر سه روز یک مرتبه تعویض شد تا زمانیکه سلول­ها جهت تیمار به غلظت08 درصد برسند.

تهیه سوسپانسیون مخمری و غنیسازی با نانواکسید سلنیوم: مخمر ساکارومایسس بولاردی از شرکت داروییYomogy)) خریداری و در محیط سابرودکستروز براث کشت داده شد. کدورت سوسپانسیون میکروبی مطابق با لوله شماره 5/0 استاندارد مک فارلند تنظیم و جذب نوری با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 620 نانومتر بین 1/0-08/0 تنظیم شد.

به 100 میلی‏لیتر از سوسپانسیون تهیه شده از مخمر 90 میلی‏لیتر نانواکسید سلنیوم با غلظت (10 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر) اضافه و 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد. پس از سانتریفوژ جهت حذف سلنیوم اضافی رسوبات توسط سالین نرمال استریل دوبار شست‏وشو داده شد و در نهایت از رسوبات حاصله سوسپانسیون تهیه، شمارش و رقتی معادل با CFU/ml 108×5/1 ازمخمر غنی شده با نانواکسید سلنیوم تهیه شد (11).

ارزیابی میزان سایتوتوکسیسیتی: سنجش تترازولیوم (MTT) اساس این تست شکسته شدن کریستال‏های زرد رنگ تترازولیوم توسط آنزیم سوکسینات و هیدروژناز و تشکیل کریستال‏های آبی رنگ نامحلول فورمازان می­باشند.

104 از سلول‏های موردنظر در چاهک‏های یک پلیت 96 خانه کشت و به‏مدت 24 ساعت در انکوباتور قرار داده شد. سپس محیط رویی خارج و سلول‏ها توسط بافر PBS شست‏وشو و در نهایت 100 میکرولیتر محیط کشت فاقد سرم حاوی غلظت‏های 5/0 و 1 میکروگرم در میلی‏لیتر از مخمر ساکارومایسس بولاردیو ساکارومایسس بولاردی غنی‏شده با نانواکسید سلنیوم و نانواکسید سلنیوم (غلظت 10 میکروگرم بر میلی‏لیتر) به‏هر چاهک از پلیت اضافه شد و به‏مدت 48 ساعت انکوبه شد. پس از آن محیط هر چاهک با 100 میکرولیتر محیط فاقد سرم تازه جایگزین شد. به‏هر یک از چاهک‏ها 20 میکرولیتر محلول MTT (Sigma آلمان) با غلظت 5 میکروگرم بر میلی‏لیتر اضافه و پلیت مجددا به‏مدت 3 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. نهایتا محیط رویی هر چاهک تخلیه و به‏منظور حل شدن بلورهای فورمازان 001 میکرولیتر دی متیل سولفوکساید به‏هر یک از چاهک‏ها اضافه و پیتاژ شد. جذب نوری هر چاهک در طول موج 294 نانومتر با استفاده از دستگاه الیزا ریدر قرائت و درصد حیات سلول‏ها با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد (2).

100×  =درصد بقا سلول

سنجش توانایی زیستی سلولی با استفاده از رنگ‏آمیزی تریپان بلو: در چاهک‏های یک پلیت 6 خانه‏ای 180 میکرولیتر، از سوسپانسیون سلولی حاوی 104سلول اضافه و به‏مدت 48 ساعت در انکوباتور CO2 دار و در دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه و پس از 48 ساعت محیط رویی خارج ، و 180 میکرولیتر محیط کشت فاقد سرم و 20 میکرولیتر از غلظت‏های 5/0 و 1 مخمر ساکارومایسس بولاردی و مخمر ساکارومایسس بولاردی غنی شده با نانواکسید سلنیوم و نانواکسید سلنیوم (غلظت 10 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر) اضافه شد. بعد از 48 ساعت تمام چاهک‏ها تریپسین زنی شده سپس با اضافه کردن محیط کشت کامل و غیر فعال شدن تریپسین به نسبت 01/0 تریپان بلو، 4/0 درصد به‏هر چاهک اضافه و پلیت به‏مدت 2 دقیقه در انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد. شمارش سلول‏ها با استفاده از لام نئوبار انجام گرفت. سلول‏های آبی رنگ به‏عنوان سلول‏های مرده و سلول‏های بی‏رنگ به‏عنوان سلول‏های زنده در نظر گرفته شد. سپس با استفاده از فرمول زیر درصد حیات سلول‏ها را در هر غلظت محاسبه شد.

100×  =توانایی زیستی سلول‏ها

تحلیل آماری

نتایج و داده‏های به‏دست آمده از انجام مطالعات با استفاده از آنالیز واریانس یک‏طرفه و جهت مقایسه غلظت‏ها در دو روش ارزیابی سایتوتوکسیسیتی از آنالیز T مستقل test (independent T) استفاده شد و با استفاده از نرم­افزار SPSS مورد تحلیل آماری قرار گرفت و نمودارها توسط نرم افزار Excel (ورژن 16) ترسیم شد. هر نقطه روی نمودار بیان‏گر میانگین سه روز آزمایش و هر روز سه تکراراست.Error bar = Mean ± SD

 

 

 

 

نتایج

مطالعات هیستوپاتولوژیکی به‏منظور اطمینان از بدخیم بودن تومورها انجام شد. طبق نتایج به‏دست آمده از مقایسه بافت پستان سالم (شکل 1A –) با اسلایدهای بافتی تهیه شده از پستان موش‏هایی مواجهه با DMBA تهاجم سلول‏‏‏‏‏‏های سرطانی دراستروما و عضله بافت پستان (شکل 1B –) مشاهده شد که تاییدی بر ایجاد سرطان پستان در این جانوران بود.

 

 

شکل 1: مقایسه نمونه‏های بافت پستان. A: بافت پستان موش‏های سالم با استروما (بیضی) و بافت عضله (ستاره) نرمال. B: بافت پستان موشهای سرطانی. تهاجم سلولهای سرطانی در کل استروما و بافت عضلانی (بیضی و ستاره بترتیب). فلشها آنژیوژنز (رگ زایی) را نشان میدهد.

 

طبق نمودار قابلیت زیستایی سلول‏های سرطانی به‏روش MTT (نمودار 1) در سلول‏های تیمار شده با غلظت نیم ساکاورمایسس بولاردی غنی شده با نانو اکسیدسلنیوم به‏طور معنی داری کمتر از سلول‏های تیمار شده با ساکارومایسس به‏تنهایی در غلظت 5/0 می‏باشد ولی با سایر گروه‏ها اختلاف مشاهده شده معنی‏دار نیست. در غلظت بالاتر یعنی غلظت 1 میکروگرم در میلی‏لیتر ساکارومایسس بولاردی  غنی شده با نانواکسیدسلنیوم قابلیت زیستایی این رده سلولی به‏طور معنی‏داری کمتر از گروه‏های تیمار شده با غلظت نیم (001/0≥p) و یک (01/0≥p) ساکارمایسس  بولاردی به‏تنهایی و نانواکسید سلنیوم به تنهایی (001/0≥p) می‏باشد. نتایج حاصل به‏روش تریپان بلو در نمودار 2 نشان داده شده است. طبق نمودار قابلیت زیستایی سلول‏های سرطانی تیمار شده با ساکارمایسس بولاردی غنی شده با نانواکسید سلنیوم در غلظت 1 با غلظت نیم تفاوت معنی‏داری نشان نمی‏دهد. درحالی‏که در غلظت 1 ساکارمایسس بولاردی غنی شده با نانواکسید سلنیوم قابلیت زیستایی سلول‏های سرطانی به‏طور معنی‏داری کمتر از سلول‏های تیمار شده با غلظت 5/0(001/0≥p) و یک (05/0≥p) ساکاورمایسس  بولاردی به‏تنهایی و نانواکسید سلنیوم به‏تنهایی (01/0≥p) می‏باشد.

تفاوت معنی‏داری در قابلیت زیستایی سلول‏ها در گروه‏های آزمایشی نسبت به سلول‏های تیمار شده با ساکارمایسس  بولاردی غنی شده با نانواکسیدسلنیوم در غلظت 5/0 مشاهده نشد، به‏استثنای گروه تیمار شده با ساکارمایسس  بولاردی به‏تنهایی در غلظت 5/0 (05/0≥p). به‏دنبال مقایسه نتایج در روش MTT و Tblue (نمودار 3) هیچ‏گونه تفاوت معنی‏داری بین نتایج هر یک از گروه‏های آزمایشی نسبت به هم‏دیگر مشاهده نشد.

طبق نمودار 4 در قابلیت زیستایی سلول‏های نرمال به‏روش MTT به‏دنبال تیمار  با غلظت‏های  نیم و یک  میکروگرم در میلی‏لیتر ساکارومایسس بولاردی غنی شده با نانواکسید سلنیوم، ساکاورمایسس بولاردی و نانو اکسیدسلنیوم کاهش 10 تا 15 درصد مشاهده شد و اختلاف معنی‏داری در گروه‏های آزمایشی مشاهده نشد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 1: مقایسه قابلیت زیستایی سلول‏های سرطانی در گروه‏های آزمایشی با روش MTT. داده‏ها به‏صورت SD±   Meanبیان شد. ستاره‏های بالای نمودار مقایسه ساکارو مایسس بولاردی غنی شده با نانواکسید سلنیم غلظت 1 با سایر گروه‏ها. بیضی‏ها مقایسه غلظت نیم آن با سایر گروه‏ها. ستاره‏های زیر نمودار مقایسه نانواکسید سلنیوم با سایر گروه‏ها

 

 

نمودار2: مقایسه قابلیت زیستایی سلول‏های سرطانی در گروه‏های آزمایشی با روش تریپان بلو. داده‏ها به‏صورت SD±  Meanبیان شد. ستاره‏های بالای  نمودار مقایسه ساکارو مایسس بولاردی غنی‏شده با نانواکسید سلنیوم در غلظت 1 با سایر گروه‏ها. بیضی‏ها مقایسه غلظت نیم آن با سایر گروه‏ها. ستاره‏های زیر نمودار مقایسه  نانواکسید سلنیوم با سایر گروه‏ها

 

نمودار3: مقایسه قابلیت زیستایی سلول‏های سرطانی گروه‏های آزمایشی در دو روش تریپان بلو و MTT. داده‏ها به‏صورت SD±  Meanبیان شد.

 

نمودار 4: بررسی قابلیت زیستایی سلول‏های نرمال MCF10α در گروه‏های آزمایشی به‏روش MTT. داده‏ها به‏صورت SD±  Meanبیان شد.

 

بحث

گزارشات پیشین حاکی از آن است که اکثر تومورهای القا شده توسط DMBA از نوع ادنوکارسینوما بوده و مشخصات تومورهای انسانی را از نظر رشد، وابستگی به هورمون‏ها و هیستولوژی تقلید می‏کنند و درنتیجه مدل حیوانی مناسبی جهت تحقیق در مورد کارسینوژنز تومورهای پستان انسانی می‏باشند (12). ازاین‏رو در پژوهش حاضر از این مدل حیوانی استفاده شد و بررسی‏های بافتی نیز بیان‏گر القا سرطان سینه در این مدل حیوانی بود. بررسی توانایی زیستی سلول‏های سرطانی با استفاده از دو روش رنگ آمیزی با تریپان بلو و MTT نشان داد که مخمرساکارومایسس بولاردی به‏تنهایی در هر دو غلظت و هم‏چنین نانواکسید سلنیوم به‏تنهایی سمیت قابل توجهی بر توانایی زیستی سلول‏های سرطانی نداشتند و به‏طور میانگین 10 تا 17 درصد باعث کاهش زیستایی این سلول‏ها شدند. این‏درحالی است که هر دو غلظت ساکارومایسس بولاردی غنی شده با نانواکسید سلنیوم توانایی زیستایی سلول‏ها را کاهش دادند و این کاهش در غلظت بالاتر به‏مراتب معنی‏دارتر نسبت به‏سایر موارد مورد آزمون بود. به‏طوری‏که به‏دنبال تیمار سلول‏های توموری با این غلظت از ساکارومایسس بولاردی غنی شده، تقریبا کاهش 35 درصدی در توانایی زیستایی این سلول‏ها مشاهده شد. این نتایج با استفاده از دو روش نیز در راستای هم‏دیگر بود. تحقیقات پیشین بیان‏گر این است که پروبیوتیک‏ها با تاثیر بر آنزیم‏های گوارشی حیوانات و انسان‏ها، مهار عوامل سرطان‏زا در داخل بدن و شرایط آزمایشگاهی، مهار ترکیبات القاکننده سرطان و تومورها در حیوانات نقش موثری در جهت مقابله با سرطان ایفا می‏کنند (13). هم‏چنین اثرات ضدسرطانی پروبیوتیک‏ها از طریق جلوگیری از تبدیل پروکارسینوژن به کارسینوژن، اتصال و غیرفعال کردن ترکیبات میتوژنی، کاهش رشد باکتری‏های پروکارسینوژنز، کاهش جذب میتوژن‏ها و افزایش عمل‏کرد سیستم ایمنی می‏باشد (14). بنابراین استفاده از مخمرساکارومایسس بولاردیبه‏عنوان یک باکتری پروبیوتیک در درمان و پیش‏گیری از سرطان موثر بوده و نتایج این تحقیق نیز هم‏راستا با تحقیقات گذشته در زمینه استفاده از پروبیوتیک‏ها در درمان سرطان می‏باشد. سایر مطالعاتی که پیش از این در رابطه با اثرات سایتوتوکسیک مخمر ساکارومایسس بولاردی صورت گرفته است نیز توانایی این مخمر را در کاهش توانایی زیستی سلول‏های سرطانی نشان داده است. تحقیقات متعددی در رابطه با مخمرهای پروبیوتیکی صورت گرفته است که بیان‏گر این موضوع است که مخمرها نیز با استفاده از مکانیسم‏هایی هم‏چون اتصال به مواد سرطان‏زا و تخریب آن‏ها، جلوگیری از تولید مواد سرطان‏زا مانند آمونیاک و اسیدهای صفراوی ثانویه، تولید مواد ضدسرطان و تقویت پاسخ‏های ایمنی میزبان می‏توانند از سرطان پیش‏گیری کنند (4). مطالعات دیگر نیز مشخص کرده است که مخمر ساکارومایسس بولاردیکشته شده با حرارت می‏تواند باعث وقوع  آپوپتوزیس سلولی در سه رده سلول‏های سرطان پستان (HCC70، ZR-75-1، MCF-7) شود که به‏کلسیم درون سلولی وابسته است. هم‏چنین  نشان داده شده که با تزریق 45 روزه ساکارومایسس بولاردی به‏تومورهای ایجادشده در رت به‏دنبال تزریق سلول‏های  MCF-7به‏مرور زمان میتوان کاهش قابل توجهی در حجم تومور مشاهده نمود (4، 51). چان و همکاران خاصیت ضدتوموری مخمرها را به ‏بتاگلوکان و مانان موجود در دیواره سلولی آن‏ها نسبت داده اند(61). ساکارومیسس سرویزیه حاوی ترکیبی به‏نام ارگوسترول است که یکی از اجزای اصلی غشای سیتوپلاسمی آن محسوب می­شود. درمطالعه ­سوبیاح و همکاران نشان داده شد که این ترکیب رشد سلولهای سرطان سینه (7-FCM و  132-ADM) را درشرایط ortiv nIبا مکانیسمی که ممکن است شامل محصولات اکسایشی ارگوسترول باشد، مهار می­کند (71). بتاگلوکان جداشده از ساکارومایسس بولاردی قادر است مقاومت میزبان را در برابر آنتی‏ژن‏های خارجی مختلف مانند ویروس‏ها، باکتری‏ها و آلودگی‏های انگلی افزایش دهد و هم‏چنین ممکن است باعث فعالیت میزبان علیه تومورها ازطریق تحریک سیستم ایمنی شود(81). همین امر بیان‏گر اهمیت وجود بتاگلوکان در دیواره سلولی مخمر ساکارومایسس بولاردی بوده و در پژوهش حاضر نیز احتمالا  یکی از دلایل کاهش توانایی زیستی سلول‏های سرطانی است. مقایسه نتایج پژوهش حاضر با سایر مطالعات بیان‏گر آن است که مخمرها از جمله ساکارومایسس بولاردی دارای خاصیت ضدسرطانی است و غنی شدن مخمر با نانواکسید سلنیوم، می‏تواند اثرات سایتوتوکسیک مخمر را افزایش دهد. یافته­های پیشین نشان می­دهند که به‏وسیله حفظ سطح مناسب سلنیوم در رژیم غذایی می­توان از بروز انواع سرطان­ها پیش‏گیری کرد. اثرات سلنیوم بر سلول‏های سرطانی وابسته به‏غلظت بوده و سطوح کم و متوسط ​​می‏توانند رشد سلول‏ها را تحریک در حالی‏که سطوح بالاتر سیتوتوکسیک هستند. به‏عبارتی خواص سایتوتوکسیک سلنیوم به‏عوامل مختلفی ازجمله دوز سلنیوم مصرفی، نوع ترکیب سلنیومی و مراحل مختلف سرطان (مرحله ابتدایی و مرحله پیشرفته) وابسته است (91). مطالعات نشان می‏دهد که نفوذپذیری سلول­های سرطانی نسبت به سلول­های سالم بیش‏تر و بافت‏های سرطانی، مواد مغذی با سایز کوچک در حد 2 نانومتر را از طریق فرآیند انتشار می‏توانند دریافت کنند (02). از این‏رو استفاده از ترکیبات سلنیومی در سطح نانو در این تحقیق عامل مهمی در افزایش خاصیت سیتوتوکسیک مخمرهای غنی شده نسبت به مخمر به‏تنهایی می‏باشد. مطالعات نشان داده است که پروبیوتیک‏ها قادر به تولید مهارکننده‏های رشد سلولی و انتخابی برای سلول‏های سرطانی هستند. در پژوهش حاضر ساکارومایسس بولاردی خاصیت سایتوتوکسیک پایین‏تری نسبت به سلول‏های نرمال نشان داد و مقایسه این پژوهش با سایر پژوهش‏ها بیان‏گر آن است که این ویژگی احتمالا به‏دلیل حلالیت ذاتی بالای پلی‏ساکاریدهای دیواره و عصاره سیتوپلاسمی این دسته از پروبیوتیک‏ها می‏باشد (12).

 

نتیجه­گیری

طبق نتایج حاصل از تحقیقات، مخمرهای پروبیوتیکی مانند باکتری­های پروبیوتیک احتمالا می­توانند گام مناسبی  برای درمان بیماری­ها و در راس آن­ها سرطان باشند، به‏ویژه زمانی که با ترکیبات سلنیوم درسایز نانو همراه شوند. زیرا پروبیوتیک­ها ترکیبات ایمن و موثر بر سلامت میزبان می‏باشند و سلنیوم نیز در مقادیر مشخصی می­تواند به‏طور سینرژیسم اثر سایتوتوکسیک پروبیوتیک‏ها را افزایش دهد. هم‏چنین نتایج به‏دست آمده در این تحقیق با نتایج به‏دست آمده برروی رده‏های سلولی انسانی نشان‏گر این مطلب است که مدل القایی سرطان پستان رت که در این تحقیق مورد استفاده قرارگرفته است می‏تواند یک مدل مناسب و قابل اطمینان برای انجام آزمایشات سایتوتوکسیک باشد. 

1. Kwan JM, Fialho AM, Kundu M, Thomas J, et al. Bacterial proteins as potential drugs in the treatment of leukemia. Leukemia Res. 2009; 33(10): 1392-99.
2. Riki M, Tukmechi A, Hajirahimi A, bonyadi F. Evaluation of Inhibitory Effects of heat-killed Lactobacillus casei and Lactobacillus paracasei on human chronic myelocytic leukemia K562 cell line: an in vitro study. RJMS. 2019; 26 (1) :1-9.
3. Tsai YT, Cheng PC, Fun CK, Pan TM. Time-dependent persistence of enhanced immune response by a potential probiotic strain Lactobacillus paracasei subsp Paracasei NTU 101. Inter J Food Microb. 2008; 128(2): 219-25.
4. Bonyadi F, Nejati V, Tukmechi A, Hasanzadeh SH, et al. Evaluation of Apoptotic Effects of Cell Wall and Cytoplasmic Extract from Saccharomyces cerevisiae on K562 Cell Line. Armaghane-Danesh. Yasuj Uni Med Sci J. 2013. 18(9):699-710.
5. Ghoneum M, Wang L, Agrawal S, Gollapudi S. Yeast therapy for the treatment of breast cancer: a nude mice model study In Vivo: Anticancer research. 2007; 21(2): 251-8
6. Behne D, Hofer T, Von Berswardt- Wallrabe R, Elger W. Selenium in the testis of the rat: studies on its regulation and its importance for the organism. J Nutr.1982;102(11):1682-1687.
7. Wrobel J, Power R, Toborek M. Critical Review Biological Activity of Selenium: International Union of Biochemistry and Molecular Biology. 2015; 68(2): 97–105.
8. Sanmartín C, Plano D, Sharma A, Antonio Palop J. Selenium Compounds, Apoptosis and Other Types of Cell Death: An Overview for Cancer Therapy: International Journal of Molecular Sciences.2012; 13(8): 9649-9672.
9. Yu S, Zhu YJ, Li WG. Protective role of selenium against hepatitis B virus and primary liver cancer in Qidong: Biol Trace Elem Res. 2009; 56(1): 117–24.
10. Wrobel JK, Seelbach MJ, Chen L, Power RF, et al. Supplementation with selenium-enriched yeast attenuates brain metastatic growth: Nutr Cancer. 2013;65(4): 563–70.
11. Chen L, Pan DD, Zhou YZ. Protective effect of selenium- enriched lactobacillus on CC14- induced liver injury in mice and it´s possible mechanisms: Gastroenterology. 2005; 11(37): 5795-5800.
12. Hamta A, Shariatzadeh SMA, Solimani M. Verification of some cancer markers and blood factors in DBMA induced breast cancer on SD rats. Journal of Behbod. 2012; 15(3): 200-207. [Persian]. Issues Intest Microbiol. 2000; 1(1): 13-24
14. Shira D, Sherwood LG. Probiotics: their role in the treatment and prevention of disease: J Expert Review of Anti-infective Therapy. 2006; 4 (2); 261-275.
15. Boniadi F, Tukmechi A, Nejati V. Comparative study on the effect of obtained cell wall and cytoplasmic fraction from Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces boulardii on K562 cell line. Pharma Sci .2012; 18(1) :78-96.
16. Chan WKD, Cheung CC, Law HKD, Lau YLD, et al. Ganoderma lucidum polygosaccharides can induce human monocytic leukemia cells into dendritic cells with immune stimulatory function. J Hematol Oncol. 2008; 1- 9.
17. Subbiah MT, Abplanalp W. Ergosterol (majorsterol of baker's and brewer's yeast extracts) inhibits the growth of human breast cancer cells in vitro and the potential role of its oxidation products. Int J Vitam Nutr Res.2003; 73(1): 19-23.
18. Rodriguez A, Cuesta A, Ortuno J, Esteban MA, et al. Immuno stimulant properties of a cell wall-modified whole Saccharomyces cerevisi aestrain administered by diet to seabream (Sparusaurata L.): Vet Immunol Immuno pathol.2003; 96(3-4): 183-92.
19. Sanmartín C, Plano D, Sharma A, Antonio Palop J. Selenium Compounds, Apoptosis and Other Types of Cell Death: An Overview for Cancer Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 2012; 13(8): 9649-9672.
20. Yang X, Liu J, He H, Zhou L, et al. SiO2 nanoparticles induce cytotoxicity and protein expression alteration in HaCaT cells. Part Fibre Toxicol. 2010; 7(1):1-12.
21. Choi SS, Kim Y, Han KS, You S, et al. Effects of Lactobacillus strains on cancer cell. proliferation and oxidative stress in vitro. The Society for Applied Microbiology, Letters in Applied Microbiology. 2006; 42(5) 452–4.