محتوای فنل و فلاونوئید کل در عصاره‌ گونه Meristotropis xanthioides Vassilcz. و اثر حفاظتی آن بر مسمومیت کبدی القا شده با اتانول

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه بوعلی سینا همدان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، همدان، ایران

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی نفش حفاظتی عصاره گونه M. xanthioidesدر برابر مسمومیت کبدی القا شده با اتانول می­باشد.
مواد و روش­ها: محتوای فنل و فلاونوئید کل به‏ترتیب به‏روش­های فولن-سیوکالتو و کلرید آلومینیوم اندازه­گیری شدند. در جهت سنجش اثر حفاظتی عصاره گونه مورد نظر، رَت­های نر نژاد ویستار به سه گروه 6 تایی تقسیم شدند: گروه 1(گروه کنترل)، گروه 2 با اتانول تیمار شدند و گروه 3 به‏طور همزمان با اتانول و عصاره گیاه M. xanthioides، تیمار شدند. رَت­ها همه تیمارها را از طریق دهان دریافت کردند. در این تحقیق سیلی‏مارین به‏عنوان کنترل مثبت استفاده شد. در پایان پارامترهای بیوشیمیایی، هیستولوژیکی و مورفولوژیکی در گروه­های مختلف مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج: نتایج نشان دادند که گونه مورد مطالعه دارای محتوای بالای فنل و فلاونوئید می­باشد. بررسی­های مورفولوژیکی و بیوشیمیایی مشخص نمود که نسبت وزن کبد به وزن بدن، مقادیر مالون دی آلدئید (MDA) و پراکسید هیدروژن بافتی و همچنین آنزیم­های کبدی موجود در سرم خون رَت­های تیمار شده با اتانول به‏طور معنی­داری نسبت به گروه­های دیگر، افزایش می­یابد. همچنین نتایج حاصل از مطالعات هیستولوژیکی مشخص کرد که بافت کبدی رَت­های تیمار شده با اتانول، در مقایسه با رَت­های گروه کنترل، دچار آسیب­های شدیدی شدند. فعالیت­های بیوشیمیایی و آسیب­های بافتی بوسیله تیمار با عصاره و سیلی‏مارین کاهش یافت.
نتیجه گیری: این مطالعه اثبات کرد که عصاره M. xanthioides می­تواند نقش حفاظتی بر علیه سمیت کبدی القا شده با الکل داشته باشد و به‏عنوان یک منبع طبیعی برای مکمل­ها غذایی و دارویی به‏شمار آید.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

گزارش‏های سازمان بهداشت جهانی حاکی از آن است که 6 درصد از کل مرگ و میرها وابسته به مصرف الکل می‏باشد (1). مصرف الکل تغییرات مخربی را در فرآیندهای بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی تمامی ارگانیسم ایجاد می­کند (2). اتانول موجود در مشروبات الکلی به‏طور عمده از طریق روده جذب می­شود و قبل از ورود به سیستم گردش خونی، نخست وارد کبد می­‏شود. کبد مهم‏ترین اندام جهت متابولیسم، سمیت­زدایی و ذخیره­ی و ترشح مواد گزنوبیوتیک و متابولیت­های آن­ها می­باشد. چون بسیاری از این مواد و متابولیت­های حاصل از فرآیندهای متابولیکی آسیب­زا هستند در نتیجه کبد مستعد آسیب­های مختلف می­باشد (3). اتانول نیز همچون دیگر مواد گزنوبیوتیک در کبد متابولیزه می‏شود. مکانیسمی که اتانول و متابولیت­های حاصل از آن موجب آسیب کبدی می­شوند به‏طور کامل روشن نیست. با این‏حال، مطالعات چندی نشان داده­اند که اتانول با القای تولید رادیکال­های آزاد می­تواند سبب آسیب­های بافتی و سلولی ­شود. رادیکال­های آزاد مانند گونه­های فعال اکسیژن به‏طور طبیعی در سلول­های زنده­ تولید می­شوند و نقش مهمی در فرآیند علامت رسانی سلول­ها دارند. همچنین در طبیعت عواملی وجود دارند که ممکن است رادیکال آزاد داشته باشند یا سلول­ها را برای تولید رادیکال آزاد تحریک کنند (4). مقادیر بالای این ترکیبات برای سلول­ها خطرناک می­باشند و ممکن است به کل اجزای آن از جمله: پروتئین­ها و نوکلئیک اسیدها، فسفولیپیدها، و غشاهای سلولی آسیب برسانند و نقش مهمی در پیشرفت بیماری­هایی مانند سرطان، مسمومیت کبدی و... دارند (5). در مشروبات الکلی در واقع، اکسیداسیون اتانول پس از جذب از طریق لوله گوارشی، در کبد، توسط چندین سیستم آنزیمی که مهم‏ترین آن­ها، الکل دهیدروژناز می‏باشد، صورت می­گیرد و در نهایت موجب ایجاد رادیکال­های آزاد مانند پراکسید هیدروژن، در بافت کبدی و آسیب به آن می­شود (6 و 7).  آنتی اکسیدانت­ها ترکیباتی مهمی هستند که می­توانند برای پیش‏گیری و درمان این آسیب­ها مفید باشند. تحقیقات در زمینه پیشرفت­ بر روی شناسایی و کاربرد این ترکیبات در جلوگیری و درمان بیماری­های مختلف از جمله انواع سرطان متمرکز شده است (8). آنتی ­اکسیدانت­ها ممکن است به‏عنوان یک جاروب کننده، احیا کننده و یا فعال کننده آنزیم­های آنتی اکسیدانتی سلول برای جلوگیری از آسیب رادیکال­های آزاد در سیستم­های زیستی ایفای نقش کنند (9-11). گیاهان منبع طبیعی برای این ترکیبات هستند (12). آنتی اکسیدانت­های مهمی که در گیاهان وجود دارند عبارتند از: توکوفرون­ها (ویتامین E)، فولیک اسید (ویتامین B9)، آسکوربیک اسید (ویتامین C)، کاروتنوئیدها، فنیل آکریلیک اسیدها و فلاونوئیدها مانند آنتوسیانین­ها که به‏عنوان بزرگ‏ترین گروه فنل­های طبیعی می­باشند. جنس شیرین بیان شامل 20 گونه متعلق به خانواده بقولات و بومی بیشتر نقاط جهان، مخصوصا آسیا می­باشد (13). گونه .Merstotropis xanthioides Vassilcz متعلق به جنس شیرین بیان است. این گونه شامل ترکیبات مختلفی مانند اسانس­ها، ترکیبات فنلی و ساپونین­های گلیکوزید می­باشد (14، 15). هدف از این مطالعه تعیین محتوای فنلی در عصاره گونه M. xanthioides  و نقش حفاظتی آن در برابر سمیت کبدی القا شده با الکل می­باشد.

مواد و روش­ها

موادشیمیایی: همه مواد شیمیایی و حلال­های استفاده شده در این پژوهش از شرکت مرک آلمان و سیگما (آمریکا) با درصد خلوص بالا تهیه شده است.

مواد گیاهی: گونه­های مطالعه شده از زیستگاه­های طبیعی خود (خراسان) در سال 1394 جمع آوری شد و در هرباریوم دانشگاه بوعلی سینا (BASU) نگه‏داری شدتد.

استخراج عصاره­ گیاهی: برای تهیه عصاره، بخش هوایی گونه مورد مطالعه توسط آسیاب برقی، سه بار و در هر بار به‏مدت 10 ثانیه آسیاب شد. استخراج عصاره از 25 گرم پودر خشک گیاه توسط 250 میلی­لیتر متانول خالص و به‏وسیله دستگاه استخراج کننده سوکسله به‏مدت 6 ساعت انجام شد. به‏منظور حذف ذرات ریز عصاره از کاغذ صافی وات من استفاده شد. سپس عصاره­ها تا زمان استفاده داخل فریزر (20- درجه سانتی‏گراد) ذخیره شدند.

محتوای فنل کل: 125/0 میلی­لیتر عصاره گونه مورد مطالعه شده با 5/0 میلی­لیتر آب مقطر مخلوط شد. سپس مقدار 125/0 میلی­لیتر معرف فولین سیوکالتو همراه با 25/1 میلی­لیتر کربنات سدیم 7 درصد به نمونه اضافه شد و به‏مدت 5 دقیقه در دمای اتاق نگه‏داری گردید. مخلوط حاصل را  با آب مقطر به حجم 3 میلی­لیتر رسانده و به‏مدت 90 دقیقه در دمای اتاق نگه‏داری شد و در نهایت جذب نمونه­ها در طول موج 760 نانومتر اندازه­گیری شد. مقدار فنل کل از طریق منحنی استاندارد گالیک اسید محاسبه گردید و مقادیر آن بر حسب میلی­گرم بر گرم وزن خشک عصاره گزارش شد (16).

محتوای فلاونوئید کل: 5/0 میلی­لیتر عصاره با 5/0 میلی‏لیتر کلرید آلومینیوم 2 درصد متانولی مخلوط گردید و به‏مدت 10 دقیقه در دمای اتاق نگه‏داری شد و پس از این مدت جذب در طول موج 368 نانومتر خوانده شد. مقدار فلاونوئید کل از طریق منحنی استاندارد کوئرستین محاسبه گردید و مقادیر آن بر حسب میلی­گرم بر گرم وزن خشک عصاره گزارش شد (17).

حیوانات آزمایشگاهی و گروه­بندی حیوانات: در این مطالعه رَت نژاد ویستار با وزن تقریبی 150 تا 200 گرم استفاده شد. حیوانات در شرایط استاندارد از نظر دوره­ روشنایی-تاریکی، دما و رطوبت نگه‏داری شدند و دسترسی نامحدود به آب و غذا داشتند. موازین اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی که مورد تایید کمیته اخلاق گروه زیست شناسی دانشگاه بوعلی سینا همدان بود، هنگام کار با رت­ها رعایت شد. رت­ها به سه گروه، که هر گروه شامل 6 سر بود تقسیم شدند. گروه اول (گروه کنترل): روزانه 1 میلی­لیتر آب با گاواژ دریافت نمود. گروه دوم (گروه اتانول): روزانه 1 میلی­لیتر اتانول 50 در­صد به روش گاواژ دریافت نمودند. گروه سوم (گروه اتانول و عصاره): که به‏صورت روزانه ابتدا 500 میلی­گرم به‏ازای هر کیلوگرم وزن بدن عصاره دریافت نمود و با فاصله زمانی 4 ساعت، 1 میلی­لیتراتانول 50 درصد نیز از طریق دهانی دریافت نمود. یک گروه از رَت­ها نیز به همراه اتانول 50 درصد، داروی استاندارد سیلی­مارین را با دوز 20 میلی­گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن، به‏صورت دهانی دریافت نمود. پس از طی شدن دوره مطالعه (14 روز)، حیوانات با تنفس دوز بالای اتر کشته­ شدند. کبدها بلافاصله خارج شدند و پس از شستشو، وزن شدند. بخشی از کبد هر حیوان جهت مطالعات بیوشیمیایی در دمای 70- درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شد و بخش دیگر جهت مطالعات هیستوپاتولوژیکی در فرمالین 10 درصد نگه‏داری شد.

بررسی پارامترهای مورفولوژیکی: پارامترهای مورفولوژیکی مانند وزن کبد و نسبت وزن کبد به 200 گرم وزن بدن نیز به‏عنوان یکی از شاخص­های مورد نظر برای بررسی اثر حفاظتی عصاره­ گونه مورد مطالعه بر سمیت کبد ارزیابی شد.

آنالیزها بیوشیمیای

آنزیم­های کبدی: پس از بی‏هوش نمودن حیوانات با تزریق کتامین/زایلزین، نمونه­های خونی از حیوانات متعلق به تمامی گروه­ها جمع­آوری شد، سپس سرم خون جدا شد برای آنالیزهای بیوشیمیایی بلافاصله به فریزر 70- درجه سانتی­گراد منتقل شدند. پارامترهای کبدی سرم، شامل آلانین­ آمینو­ ترانسفراز (Alanine aminotransferase = ALT)، آسپارتات آمینو ترانسفراز (Spartat amino transferase = AST) و آلکالین ­فسفاتاز (Alkaline phosphatase = ALP) با استفاده از کیت­های تشخیصی مورد ارزیابی قرار گرفت و مقادیر آن­ها بر حسب واحد بین­المللی آنزیمی بر لیتر (U/L) گزارش شد.

سنجشمالون­دی­آلدئید (MDA): نمونه‌ها در هاون چینی و حاوی ازت مایع 5 دقیقه سائیده شدند. 1/0 گرم بافت کبد سائیده شده درون میکروتیوب 2 میلی­لیتری ریخته و 1 میلی­لیتر تری­کلرواستیک اسید (TCA) 1/0 درصد (w/v)  به آن اضافه شد. پس از گذشت 30 دقیقه نمونه‌ها با دور 10000 به‏مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شدند. محلول روشناور به لوله آزمایش منتقل شد و 4 میلی­لیتر TCA 20 درصد محتوای 5/0 درصد تیوباربیتوریک اسید به آن اضافه شد. نمونه‌ها در بن ماری و در دما‌ی 95 درجه سانتی­گراد به‏مدت 15 دقیقه قرار داده شدند. سپس بلافاصله نمونه­ها را در حمام آب یخ گذاشته و پس از سرد شدن با دور 10000 به‏مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شدند. جذب نمونه‌ها در 532 نانومتر خوانده شد. مقادیر MDA بر حسب میلی­گرم بر گرم وزن بافت گزارش شد (18).

سنجشپراکسیدهیدروژن:برای سنجش مقادیر پراکسید هیدروژن، 1/0 گرم از بافت کبد در 1 میلی­لیتر تری کلرو استیک اسید 1/0 مولار (TCA) سائیده شد و بعد عصاره‏های حاصل با دور 10000 به‏مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شدند. سپس 5/0 میلی­لیتر از محلول سانتریفوژ شده به 5/0 میلی­لیتر بافر فسفات پتاسیم 10 میلی­مولار (7pH=) و 5/0 میلی­لیتر یدید پتاسیم 1 مولار اضافه شد و جذب مخلوط واکنش در طول موج 390 نانومتر خوانده شد. مقادیر پراکسید هیدروژن در هر نمونه با استفاده از ضریب خاموشی M-1cm-1  28/0 محاسبه گردید و بر حسب میکرو مول بر گرم وزن بافت گزارش شد (19).

 H2O2 غلظت = ضریب خاموشی/ تغییرات جذب نمونه

بررسی­های هیستولوژیکی: بافت کبد جدا شده با استفاده از سرم فیزیولوژیکی شستشو شد و در فرمالین 10 در­صد تثبیت شد. سپس با درجات صعودی اتانول، آبگیری و توسط پارافین قالب­گیری شد. نمونه­های قالب­گیری شده با پارافین توسط دستگاه میکروتوم با ضخامت 5 میکروگرم برش­گیری و با رنگ هماتوکسیلین-ائوزین رنگ ­آمیزی شد. برش­های رنگ ­آمیزی شده توسط میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرار گرفت و عکس­برداری شد. پارامترهای مانند نکروز هپاتوسیت­ها، اتساع ورید مرکزی، ارتشاح سلول­های التهابی، به­‏هم ریختگی آرایش بافتی و انباشت چربی در هپاتوسیت­ها (میکرو وزیکولار استاتوزیس) در تصاویر مورد نظر از مقاطع بافتی مورد بررسی قرار گرفت.

آنالیز آماری: داده­های حاصل از آزمایش با نرم افزار Excel تحلیل شد. سپس، مقایسه میانگین­ها به‏روش دانکن در سطح  05/0p<  انجام شد. نتایج حاصل از این بررسی به‏صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شد.

نتایج

محتوای فنل و فلاونوئید کل

پلی­فنل­ها به‏ویژه فلاونوئیدها دارای فعالیت­های زیستی فراوانی هستند. گونه مطالعه شده دارای محتوای فنل (6/1 ± 9/9 میلی­گرم گالیک اسید بر گرم وزن خشک عصاره) و فلاونوئید (5/0 ± 2/3 میلی­گرم کوئرستین بر گرم وزن خشک عصاره) بالایی می­باشد (شکل 1).

 

شکل 1: محتوای فنل و فلاونوئید عصاره گونهM. xanthioides.

بررسی پارامترهای مورفولوژیکی

نتایج حاصل از مطالعات مورفومتریک در این تحقیق نشان داد که نسبت وزن کبد به وزن بدن در رت­های تیمار شده با اتانول، به‏طور معنی­داری نسبت به رت­های گروه کنترل و تیمار شده با عصاره و سیلی‏مارین افزایش پیدا کرده است (جدول 1).

 

جدول 1: تغییرات وزن کبد در رت­های کنترل و تیمار شده را نشان می­دهد.

 

نمونه­ها

وزن (گرم)

کبد

نسبت وزن کبد

به بدن (%)

اتانول

64/11 ± 5/0

82/5 ± 3/0

اتانول + عصاره

50/8 ± 0/1

25/4 ± 5/0

کنترل

96/9 ± 5/1

98/4 ± 7/0

سیلیمارین + اتانول

90/7 ± 1/1

95/3 ± 5/0

مقادیر،میانگین3تکرار±SDاست .

 

این افزایش وزن می­تواند ناشی از التهاب، ارتشاح و تجمع چربی­ها در هپاتوسیت­های بافت کبد رَت­های تیمار شده با اتانول باشد.

آنالیزهای بیوشیمیایی

آنالیزهای بیوشیمیایی نشان دادند که مقادیر MDA  و پراکسید هیدروژن بافت کبد و همچنین مقادیر سه آنزیم کبدی ALT، AST و ALP در سرم خون رت­های تیمار شده با اتانول به‏طور معنی­داری (05/0p ≤ ) نسبت به گروه کنترل، گروه تیمار شده با عصاره و اتانول و همچنین گروه تیمار شده با داروی استاندارد کبدی (سیلی‏مارین)، افزایش نشان دادند (جدول 2).

 

جدول 2: تاثیر عصاره گیاه  M. xanthioides بر پارامترهای بیوشیمیایی بافت کبد رَت­ها در آسیب ناشی از اتانول.

 

نمونه­ها

پارامترهای بیوشیمیایی

ALP

(U/L)

AST

(U/L)

ALT

(U/L)

MDA

(mg/g wt)

H2O2

(µM/g wt)

اتانول

753 ± 7/11a

60 ± 2/2a

146 ± 7/0a

102/0 ± 005/0a

52/0 ± 09/0a

اتانول + عصاره

685 ± 2/12b

51 ± 5/2b

133 ± 0/1b

100/0 ± 002/0a

26/0 ± 08/0b

کنترل

490 ± 7/6d

41 ± 2/1c

100 ± 9/0c

081/0 ± 007/0b

23/0 ± 04/0b

سیلیمارین + اتانول

591 ± 4/9c

46 ± 9/0c

134 ± 4/1b

094/0 ± 001/0ab

31/0 ± 03/0b

مقادیر،میانگین3تکرار±SDاست .حروف یکسانبیانگرعدماختلافمعنی­داردرسطحP ≤ 0.05 است.

 

 

افزایش میزان MDA (005/0 ± 102/0 میلی­گرم بر گرم بافت) و پراکسید هیدروژن ( 09/0 ± 52/0 میکروگرم بر گرم بافت) می‏تواند نشان دهنده القا و افزایش استرس اکسیداتیو در بافت کبد رت­های تیمار شده با اتانول باشد که در نهایت منجر به تخریب هپاتوسیت­ها می­شود. به‏دنبال تخریب هپاتوسیت­ها مقادیر سرمی سه آنزیم کبدی ALT، AST و ALP نیز افزایش نشان می­د­هد (جدول 2). تیمار رت­ها با عصاره گونه مورد مطالعه در این تحقیق باعث کاهش معنی­دار مقادیر فاکتورهای بیوشیمیایی مذکور شده که نشان دهنده نقش حفاظتی عصاره در کاهش استرس اکسیداتیو و تخریب هپاتوسیت­ها می­باشد (جدول 2).

بررسی­های هیستولوژیکی

بررسی­ نتایج حاصل از مطالعات هیستولوژیکی بافت کبد در گروه رت­های تیمار شده با اتانول، در مقایسه با ساختار طبیعی بافت کبد رت­های گروه کنترل (شکل2، الف و ب)، به‏­هم­ ریختگی شدید در چیدمان سلول­ها در بافت کبد، نکروز بافتی، اتساع و تخریب ونول مرکزی (علامت ستاره سیاه رنگ) و ارتشاح سلول­های التهابی (پیکان مشکی ضخیم) و همچنین انباشت چربی در هپاتوسیت­ها (با نوک پیکان) را نشان می­دهد (شکل 2، ب).  بافت کبدی تیمار شده با عصاره به‏همراه اتانول، کاهش سلول­های پیکنوتیک (پیکان باریک)، ساختار ونول نرمال (ستاره سیاه رنگ) و همچنین چیدمان طبیعی سلول­های کبدی را نشان داد (شکل 2، ب و پ)، که از این لحاظ مشابه با ساختار بافتی گروه کنترل (بدون هیچگونه تیمار) و گروه تیمار با سیلی‏مارین می­باشد (شکل 3). در مطالعات هیستولوژیکی تجمع قطرات چربی در هپاتوسیت­ها یا همان ساختارهای میکرو وزیکولار یکی از علایم مهم آسیب به کبد می­باشد که در برش­ها به شکل واکوئل­های ریزی دیده می­شوند. در این تحقیق، این‏حالت پاتولوژیکی فقط در گروه­ رت­های تیمار شده با اتانول دیده شد و عصاره از انباشت چربی در هپاتوسیت­ها ممانعت کرد، به‏صورتی‏که ساختار بافت کبد در گروه رت­های تیمار شده با عصاره مشابه با کنترل بود (شکل 2، الف و پ).

 

بحث

پلی­فنل­ها از جمله فلاونوئیدها در ساختار شیمیایی خود دارای گروه­های هیدروکسیل می­باشند که دهنده قوی هیدروژن به‏حساب می­آیند و به‏عنوان عوامل آنتی اکسیدانتی شناخته می­شوند. این ترکیبات با توانایی احیا کنندگی بالا می­تواند با گونه‏های فعال اکسیژن و نیتروژن واکنش دهند و از خسارات استرس اکسیداتیو در بدن جلوگیری کنند (20-22). ساختار این ترکیبات دارای پتانسیل بالایی برای واکنش دادن با پروتئین­های مختلف از جمله آنزیم­ها می­باشند. به این دلیل آن­ها می­توانند باعث ممانعت از فعالیت آنزیم­هایی مانند ایزوفرم­های مختلف سیتوکرم  P450، سیکلواکسیژناز، الکل دهیدروژناز، لیپو اکسیژناز و زانتین اکسیداز شوند که در تولید رادیکال­های آزاد دخالت دارند (23). همچنین اثرات هم‏سو و غیر هم‏سو پلی­فنل­ها با دیگر عوامل آنتی اکسیدانتی و سطوح گلوتاتیون (به‏عنوان عامل آنتی اکسیدانتی در جانوران، گیاهان، قارچ­ها و باکتری­ها هستند) درون سلولی نیز بحث شده است (24، 25). نتایج این تحقیق نشان داد که گونه مورد مطالعه دارای محتوای فنل و فلاونوئید بالایی می­باشد (شکل 1). تاکنون مطالعه‏ای پیرامون محتویات فیتوشیمیایی عصاره گونهM. xanthioides صورت نگرفته است. اکسیدانت­­ها مانند پراکسید هیدروژن به طور طبیعی در سلول­های زنده­ تولید می­شوند و نقش مهمی در فرآیندهای مختلف سلول از جمله علامت رسانی دارند. همچنین عوامل برون سلولی ممکن است رادیکال آزاد داشته باشند یا سلول­ها را برای تولید رادیکال آزاد تحریک کنند (4). اتانول بعد از مصرف به‏عنوان عامل بیرونی و یک گزنوبیوتیک در کبد به‏وسیله آنزیم الکل دهیدروژناز متابولیزه می­‏شود و منجر به تولید رادیکال­ها­ی آزاد می­‏شود که مقادیر بالای این ترکیبات می­تواند سبب آسیب­های جدی بافتی و سلولی ­شود (6 و 7). یکی از مشخص­ترین علامت­های آسیب کبدی، افزایش آنزیم­های سلولی در سرم خون می­باشد. افزایش سطح آنزیم­های کبدی نظیر ALT، AST وALP  در سرم نشان ­دهنده تخریب ناشی از مصرف اتانول می­باشد که در نتیجه­ نکروز هپاتوسیت­ها (سلول­های پیکنوتیک) و نشت آنزیم­های درون سلولی است. در واقع آسیب غشا سلول باعث رها شدن این آنزیم­ها در خون می­شود (26-29). در این تحقیق تیمار دهانی رت­ها با عصاره­ گونه مورد مطالعه و داروی سیلی‏مارین باعث کاهش سطح آنزیم­های کبدی سرم شدند که مشابه با نمونه­های کنترل می­باشد (جدول 2). این امر ممکن است به‏واسطه­ تاثیر و بر هم کنش ترکیبات آنتی­کسیدانتی عصاره­ گونه مورد مطالعه بر فعالیت و مقادیر  آنزیم الکل دهیدروژناز کبدی و کاهش رادیکال­های آزاد مانند پراکسید هیدروژن باشد که در نهایت باعث افزایش پایداری غشا هپاتوسیت‏ها و لیزوزوم‏های حاوی آنزیم­ها می­شود (جدول 1)، (23-30، 31 و 32).

 

 

 

 

 

 

 شکل 2: مطالعات هیستولوژیکی بافت کبد در گروه رت­های کنترل (بدون تیمار)، اتانول و عصاره + اتانول را نشان می­دهد. الف: ساختار بافت کبد رَت‏های گروه کنترل، ب: به‏­هم­ ریختگی شدید در چیدمان سلول­ها بافت کبد، نکروز بافتی، اتساع ونول مرکزی (با علامت ستاره سیاه رنگ)، ارتشاح سلول­های التهابی (با پیکان مشکی ضخیم)، همچنین انباشت چربی در هپاتوسیت­ها که به‏شکل واکوئل­های ریز (با نوک پیکان) و سلول­های پیکنوتیک (پیکان باریک)، را در گروه تیمار شده با اتانول نشان می­دهد. پ: بافت کبدی در گروه تیمار شده با عصاره و اتانول را نشان می­دهد.

 

شکل 3: مطالعات هیستولوژیکی بافت کبد در گروه رت­های کنترل (بدون تیمار) و سیلی‏مارین + اتانول را نشان می­دهد. الف: ساختار بافت کبد رَت­های گروه کنترل، ب: بافت کبدی در گروه تیمار شده با سیلی‏مارین و اتانول را نشان می­دهد.

 

 

مطالعات تکمیلی بیوشیمیایی از جمله سنجش مقادیر مالون دی آلدئید (MDA) و مقادیر پراکسید هیدروژن بافتی با نتایج مطالعات آنزیمی به‏دست آمده در این تحقیق هم­خوانی داشته و آن­ها را مورد تائید قرار می‏دهد. در بررسی حاضر، میزان MDA و پراکسید هیدروژن در بافت کبدی تیمار شده با اتانول افزایش معنی­داری (05/0p ≤ ) را نسبت به گروه کنترل و تیمار شده با عصاره نشان می­دهد. نتایج فوق را همچنین می‏توان به اثرات آنتی اکسیدانتی ترکیبات فنلی عصاره گونه مورد مطالعه نسبت داد که از طریق کاهش استرس اکسیداتیو از جمله جلوگیری از پراکسیداسیون لیپیدهای غشا سلولی باعث کاهش مقادیر MDA و رادیکال آزاد پراکسید هیدروژن می­شود (33 و 34).تاکنون مطالعه­ای برجسته پیرامون عصاره گونهM. xanthioides و نقش حفاظتی آن از جمله تاثیر بر فاکتورهای بیوشیمیایی و هیستولوژیکی در آسیب کبدی القا شده با اتانول صورت نگرفته است. هرچند نقش حفاظتی عصاره­های گیاهی یا داروهای دیگر بر سمیت کبدی القا شده با عوامل مختلف مانند اتانول، عصاره گیاه، سلی‏مارین، آرسنیک و داروهای شیمیایی مورد مطالعه قرار گرفته است (30-35). مطالعات قبلی هسیتولوژیکی نشان دادند که اتانول باعث نکروز هپاتوسیت­ها (سلول­های پیکنوتیک)، اتساع ورید مرکزی و ارتشاح سلول­های التهابی به درون پارانشیم کبد می‏شود که این ویژگی­های پاتولوژیکی در بسیاری از مدل‏های مسمومیت کبدی عمومیت دارد (36 و 37). در مطالعه حاضر گروه رت­های تیمار شده با اتانول تمام ویژگی­های پاتولوژیکی مذکور را نشان دادند (شکل 2، ب). هرچند افزودن عصاره­ گونه مورد مطالعه به رت­ها تیمار شده با اتانول، علایم پاتولوژیکی را به‏شکل معنی­داری کاهش داد (شکل 2، پ). نتایج نشان داد که چیدمان بافت کبد که در گروه تیمار با اتانول بر هم­ ریختگی شدیدی را نشان داده بود، در گروه رت­های تیمار شده با عصاره­ این آسیب بافتی دیده نشد و آرایش بافت کبد مشابه آرایش بافتی کبد گروه کنترل و تیمار شده با سیلی‏مارین بود (شکل 2، پ و  شکل 3). استاتوزیس میکرو واسکولار که با انباشت چربی در هپاتوسیت­ها آشکار می­شود یک ویژگی بسیار مهم هیستو پاتولوژیکی است که در بسیاری از آسیب­های بافت کبدی مشاهده می­شود و در مدل مسمومیت کبدی القا شده با اتانول نیز گزارش شده است (30، 38، 39). بررسی هیستولوژیک بافت­های گروه­های مختلف نشان داد که در گروه تیمار با اتانول، قطرات چربی در هپاتوسیت­ها انباشته شدند که نشان دهنده­ شروع تغییرات پاتولوژیکی حاصل از انباشت چربی در بافت کبدی می­باشد (شکل 2، ب). در مطالعه ­حاضر، در گروه تیمار با عصاره هیچ اثری از ساختارهای مربوط به انباشت چربی در هپاتوسیت­ها دیده نشد (شکل 2، پ). مطالعات هیستولوژیکی بافت کبد در این تحقیق نتایج حاصل از مطالعات بیوشیمیایی و مورفولوژیکی به‏دست آمده را تائید می­کنند. از طرفی مطالعات قبلی نشان ­دادند که مواد شیمیایی دارای اثر حفاظتی بر کبد، باعث کاهش نسبت وزن کبد به وزن بدن می‏شوند (39). در بسیاری از مطالعات مربوط به مسمومیت­های اندام­های مختلف مشخص شده است که وزن اندام افزایش معنی­داری پیدا می­کند که این امر احتمال می­رود که به ­‏واسطه­ ارتشاح سلول­های التهابی به درون بافت و در ادامه­ آن خیز بافتی و در نتیجه افزایش وزن بافت می­‏شود (36 و 37). در مطالعه­ی حاضر نیز وزن کبد در گروه تیمار با اتانول به‏شکل معنی‏داری نسبت به گروه کنترل افزایش پیدا کرد. این افزایش وزن با افزودن عصاره­ گونه مطالعه شده تعدیل شد که این امر نیز نشان دهنده­ تاثیر ضد ­التهابی عصاره مطالعه شده بر بافت کبد می­باشد. اثرات حفاظتی عصاره گونه مطالعه­ شده بر مسمومیت کبدی القا شده با اتانول در موافقت با نتایج دیگر محققان می­باشد که اثرات حفاظتی عصاره­ گونه­های گیاهی دیگر و مواد دارویی مختلف را در مدل­های متنوع مسمومیت کبدی مورد ارزیابی قرار­ داده­اند (30-39).

نتیجه گیری

نتایج این تحقیق نشان داد که عصاره گونهM. xanthioides دارای محتوای فیتوشیمیایی بالایی می‏باشد و پتانسیل حمایتی بالایی در مقابل مسمومیت کبدی القا شده با اتانول دارد. عصاره این گونه گیاهی می‏تواند به‏عنوان منابع امید بخشی در جهت تولید داروهایی برای جلوگیری و درمان اغلب بیماری­های مرتبط با استرس اکسیداتیو به‏ویژه مسمومیت­های کبدی مورد توجه قرار بگیرد.

  1. World Health Organization, Global Status Report on Alcohol and Health, World Health Organization, Geneva, 2014.
  2. Poschl G, Seitz HK. Alcohol and cancer. Alcohol. 2004; 39(3): 155-165.
  3. Lieber CS. Biochemical and molecular basis of alcohol induced injury to liver and others tissues. N. Engl. J. Med. 1988; 319(25): 1639-1650.
  4. Aruoma OI, Cuppette SL. Antioxidant methodology, in vivo and in vitro concept. Champaign, IL: AOCS Press. 1997; (1): 141-172.
  5. Valko M, Leibfritz D, Moncol J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2007; 39(1): 44-84.
  6. Lieber CS. Metabolism of alcohol. Clin. Liver Dis. 2005; 9(1): 1-35.
  7.  Kehrer JP. Free radicals as mediators of tissue injury and disease. Crit. Rev. Toxicol. 1993; 23(1): 21-48.
  8. Zhang HY, Yang DP, Tang GY. Multipotent antioxidants: from screening to design. Drug Discovery Today. 2006; 11(15-16): 749-54.
  9. Yu L, Perret J, Davy B, Wilson J, et al. Antioxidant properties of cereal products. J. Food Chem. Sci. 2002; 67(7): 2600-2603.
  10.  Prior RL, Wu XM, Schaich K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. J. Agricul. Food Chem. 2005; 53(10): 4290-302.
  11.  Shoeb M. Anticancer agents from medicinal plants. Bangladesh J. Pharmacol. 2006; 1(2): 35-41. Walton NJ, Brown DE. Chemicals from plants perspectives on plant secondary products. London, UK: Imperial College Press, 1999; 1-25.
  12.  Bown D. The royal horticultural society encyclopedia of herbs and their uses. Dorling Kindersley Ltd. London. 1995; 424.
  13.  
  14. Hakimeh O, Neda H. Study the correlation between some climate parameters and the content of phenolic compounds in roots of Glycyrrhiza glabra. J. Med. Plant Res. 2011; 5(25): 6011-6016.
  15.  
  16. Farag MAPorzel AWessjohann LA. Unequivocal glycyrrhizin isomer determination and comparative in vitro bioactivities of root extracts in four Glycyrrhiza species. J. Advan. Res. 2015; 6(1): 99-104.
  17. Wolfe K, Wu X and Liu RH. Antioxidant activity of apple peels. J. Agri. Food Chem. 2003; 51(3): 609-614.
  18. Luximon-Ramma A, Bahorun T, Soobrattee MA, Aruoma OI. Antioxidant activities of phenolic, proanthocyanidin, and flavonoid components in extracts of Cassia fistula. J. Agri. Food Chem. 2002; 50(18): 5042-5047.
  19. Baryla A, Laborde C, Montillet JL, Triantaphylides C, et al. Evaluation of lipid peroxidation as a toxicity bioassay for plants exposed to copper. Environ. Pollut. 2000; 109(1): 131-135.
  20. Velikova V, Yordanov I, Edreva A. Oxidative Stress and Some Antioxidant Systems in Acid Rain- Treated Bean Plants: Protective Role of Exogenous Polyamines. Plant Sci. 2000; 151(1): 59-66.
  21. Shahidi F, Wanasundara PKJPD. Phenolic antioxidants. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 1992; 32(1): 67-103.
  22. Karamian R, Asadbegy M. Antioxidant activity, total phenolic and flavonoid contents of three Onobrychis species from Iran. Pharm. Sci. 2016; 22(1): 112-119.
  23. Valentao P, Fernandes E, Carvalho F, Andrade PB, et al. Hydroxyl radical and hypochlorous acid scavenging activity of small centaury (Centaurium erythraea) infusion. A comparative study with green tea (Camellia sinensis). Phytomedicin. 2003; 10(6-7): 517-22.
  24. Parr AJ, Bolwell JP. Phenols in the plant and in man. The potential for possible nutritional enhancement of the diet by modifying the phenols content or profile. J. Sci. Food Agric. 2002; 80(7): p. 985-1012.
  25. Seabra RM, Andrade PB, Valentao P, Fernandes E, et al. Biomaterials from aquatic and terrestrial organisms. In: Fingerman M, Nagabhushanam R, editors. Antioxidant compounds extracted from several plant materials. Enfield, NH: Science Publishers; 2006; 115-74.
  26. Cao G, Booth SL, Sadowski JA, Prior RL. Increases in human plasma antioxidant capacity after consumption of controlled diets high in fruit and vegetables. Am. J. Clin. Nutr. 1998; 68(5):1081-7.
  27.  Goldberg DM, Watts C: Serum enzyme changes as evidence of liver reaction to oral alcohol. Gastroenterology. 1965; 49(3): 256–261.
  28. Kalegari M, Gemin CA, Araujo-Silva G, Brito NJ, et al. Chemical composition, antioxidant activity and hepatoprotective potential of Roureainduta Planch. (Connaraceae) against CCl 4-induced liver injury in female rats. Nutrition. 2014; 6: 713-718.
  29. Bishayee A, Sarkar A, Chatterjee M. Hepatoprotective activity of carrot (Daucuscarota L.) against carbon tetrachloride intoxication in mouse liver. J. Ethnopharmacol. 1995; 47(2): 69-74.
  30. Song Z, Deaciuc I, Song M, Lee DY, et al. Silymarin protects against acute ethanol-induced hepatotoxicity in mice. Alcoholism: Clin. Exp. Res. 2006; 30(3): 407-13.
  31. Lin SC, Lin CH, Lin CC, Lin YH, et al. Hepatoprotective effects of Arctium lappa Linne on liver injuries induced by chronic ethanol consumption and potentiated by carbon tetrachloride. J. Biomed. Sci. 2002; 9(5): 401-409.
  32. Jung JC, Lee YH, Kim SH, Kim KJ, et al. Hepatoprotective effect of licorice, the root of Glycyrrhiza uralensis Fischer, in alcoholinduced fatty liver disease. BMC Comp. Alternative Med. 2016; 16(19): 1-10.
  33. Hautekeete ML, Degott C, Benhamou JP. Microvesicularsteatosis of the liver. Acta Clinica Belgica. 1990; 45(5): 311-26.
  34. Yousef MI, Saad AA, El-Shennawy LK. Protective effect of grape seed proanthocyanidin extract against oxidative stress induced by cisplatin in rats. Food Chem. Toxicol. 2009; 47(6): 1176-83.
  35. Mathews V, Binu P, Paul MS, Abhilash M, Manju A, Nair RH, Hepatoprotective efficacy of curcumin against arsenic trioxide toxicity. Asian Pacific J. Tropical Biomed.  2012; 2: 706-711.
  36. Tasduq SA, Peerzada K, Koul S, Bhat R, Johri RK. Biochemical manifestations of anti-tuberculosis drugs induced hepatotoxicity and the effect of silymarin. Hepatol. Res. 2005; 31: 132-35.
  37. Rolfes DB, Ishak KG. Acute fatty liver of pregnancy: a clinicopathologic study of 35 cases. Hepatol. 1985; 5(6): 1149-58.
  38. Avadhoot V, Rana V. Hepatoprotective effect of Vitexnegundo against carbon tetrachloride-induced liver damage. Arch. Pharm. Res. 1991; 14(1): 96-98.
  39. Zhao J, Chen H, Li Y. Protective effect of bicyclol on acute alcohol-induced liver injury in mice, Europ. J. Pharm. 2008; 586(1-3): 322-331.
  40. Song Z, Zhou Z, Chen T, Hill D, et al. S-adenosylmethionine (SAMe) protects against acute alcohol induced hepatotoxicity in mice. J. Ntrit. Biochem. 2003; 14(10): 591-597.
  41. Thwala M, Musee N, Sikhwivhilu L, Wepener V. The oxidative toxicity of Ag and ZnO nanoparticles towards the aquatic plant Spirodela punctuta and the role of testing media parameters. Environ. Sci.: Processes Impacts. 2013; 15(10): 1830-43.