تمایز عصبی سلول‌های بنیادی کارسینومای جنینی در سیستم کشت سه‌بعدی

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی، اصفهان، ایران، کد پستی: 8174673441

2 2- دانشگاه شهرکرد، دانشکده فنی و مهندسی، گروه مهندسی مواد، شهرکرد، ایران

3 1- دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی، اصفهان، ایران، کد پستی: 8174673441

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه استفاده از داربست نانولوله کربنی ترکیب شده با پلی­وینیل­الکل/کیتوزان  (CS/PVA/CNT)الکتروریسی شده  به‏ منظور تمایز عصبی سلول­های بنیادی برای کاربردهای بالقوه مهندسی بافت عصبی بود.
مواد و روش‏ها: به‏منظور القای تمایز عصبی، سلول­های بنیادی کارسینومای جنینی P19 روی داربست CS/PVA/CNT کشت داده شدند. جهت بررسی فنوتیپ عصبی از رنگ ­آمیزی کرزیل ­ویوله و برای ارزیابی بیان نشانگر ویژه عصبی بتاتوبولین از روش ایمنوفلورسنس استفاده شد.
نتایج: شکل ظاهری عصبی سلول­های متمایز شده به‏­وسیله رنگ­آمیزی کرزیل ­ویوله تایید شد. سلول­های مذکور به نشانگر ویژه عصبی بتاتوبولین واکنش ایمنی دادند.
نتیجه­گیری: این بررسی استفاده بالقوه از ترکیب مهندسی بافت و درمان با سلول بنیادی را به‏منظور بهبود بیماری­های زوال عصبی پیشنهاد می­کند.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

آسیب­های سیستم عصبی از علل عمده مرگ و میر در جهان محسوب می­شوند. تاکنون روش­های مختلفی برای درمان بیماری­های عصبی کشف شده است. برخی از این روش­ها عبارتست از کاهش سطح پروتئین­های تجمع یافته با استفاده از محدودسازی نفوذپذیری سد خونی-مغزی، استفاده از فاکتورهای رشد به‏منظور حمایت از نورون­های آسیب دیده و همچنین دارو درمانی (1-3). از جمله روش­های درمانی دیگر استفاده از سلول­های بنیادی است که امیدهای تازه­ای را برای ترمیم بافت‏های عصبی مرکزی آسیب دیده فراهم آورده است. تمایز سلول­های بنیادی به سلول­های عصبی نیاز به تحقیق و پژوهش فراوان دارد. در سال­های اخیر روش­های بسیاری برای تولید سلول­های عصبی از سلول­های چند توان در محیط آزمایشگاه به‏کار گرفته شده است (4-6). مهندسی بافت عصب یکی از امیدوار کننده­ترین روش­ها برای درمان ضایعات سیستم عصبی مرکزی است. در سیستم کشت ­سه­بعدی، کشت و رشد سلول روی بستری که ماتریکس خارج سلولی (ECM) Extracellular) matrix) را شبیه­سازی می­کند و داربست نامیده می­شود، انجام می­گیرد. توزیع سه­ بعدی و رشد سلول­ها درون داربست متخلخل از اهمیت بالینی بسیاری برای مهندسی بافت عصب برخوردار است. در این زمینه داربست­های قابل کاشت در درمان بسیاری از بیماری­های سیستم عصبی مرکزی از جمله پارکینسون، آلزایمر و آسیب­های وارده به مغز به‏کار برده شده­اند (7). ساختار و خواص داربست به اهمیت و حساسیت بافت و بارهایی که در بدن موجود زنده روی آن وارد می­شود وابسته است. از آنجایی‏که داربست به‏عنوان زمینه متخلخل مصنوعی و موقت برای هدایت رشد ­سه­بعدی بافت به‏کار می­رود، موادی که شباهت زیادی با بافت آسیب دیده دارند به‏عنوان مهم­ترین کاندید برای تعویض بافت مطرح می­شوند (8). چالشی که در برابر مهندسین بافت قرار دارد مربوط به ترکیب پیچیده خواص مورد نیاز برای داربست‏های ایده­آل است. این مسئله به‏خصوص در مهندسی بافت استخوان یعنی جایی‏که توان داربست و قابلیت تحمل بار مکانیکی مورد نیاز است اهمیت دارد (9). استفاده از مواد طبیعی به‏عنوان داربست مشکلاتی مثل خطرات عفونت­زایی، پایداری زیستی و مکانیکی، زیست ­سازگاری و تحمیل هزینه­ را در پی دارد. مواد و سرامیک­های متخلخل استفاده­های زیادی در کاربردهای زیستی- پزشکی از جمله بازسازی بافت استخوان پیدا کرده­اند. اما با وجود پیشرفت­های فراوانی که در زمینه تولید داربست­های زیست­سازگار برای تکثیر انواع سلول‏های موجود در بافت­های مختلف حاصل شده است، تولید داربستی که قادر باشد کلیه­ی شرایط ماتریکس ­خارج ­سلولی طبیعی را درسیستم عصبی مرکزی به‏طور مصنوعی ایجاد کند هنوز با مشکلات بیشماری روبه­روست. در این میان، ظهور و گسترش علوم و فناوری نانو موجب شده است تا راهکارهای موثری برای ساخت داربست­های سه­بعدی با پایه نانوکامپوزیت پلیمرهای زیست­تخریب‏‏پذیر زیست­سازگار به‏وجود آید. نانومواد ساختارهایی با اندازه یک تا صد نانومتر هستند که در صورت طراحی درست قادرند خصوصیات فیزیکی و شیمیایی مناسب ارائه دهند. خواص ایده­آل داربست برای بازسازی عصب
زیست­سازگاری، التهاب کمتر، زیست ­تخریب­پذیری قابل کنترل، تولید محصولات غیرسمی، تخلخل برای عروق و مهاجرت سلول و ماتریکس سه­بعدی با خواص مکانیکی مناسب مشابه ماتریکس خارج سلولی است (10و11). در این پژوهش از میان طیف وسیع پلیمرهای قابل استفاده در مهندسی بافت عصبی، ترکیب کیتوسان / پلی­وینیل الکل / نانولوله کربنی (CS/PVA/CNT) (Chitosan/polyvinyl alcohol/carbon nanotube  به‏عنوان داربست انتخاب شد. استفاده از ترکیب پلیمری دو ماده مذکور به علت تشکیل ساختار هیدروژلی (Hydrogel structure) مشابه ECM و نرخ مناسب زیست­ تخریب­پذیری از اهمیت بی‏شماری برخوردار است. با استفاده از نانوکامپوزیت CS/PVA به‏دلیل زیست­سازگاری مناسب و عدم سمیت، امکان رشد سلول­های U373 و اتصال مناسب آن‏ها به نانوکامپوزیت برای ترمیم آسیب وارده به اعصاب محیطی فراهم شده ­است (12). کیتوسان پلیمری خطی با ساختاری ساکاریدی است که از هیدرولیز پلیمر طبیعی کیتین  به‏دست می­آید. به‏دلیل وجود گروه­های آمینی در کیتوسان این پلیمر دارای خصوصیات منحصر به‏فردی است که از آن جمله می­توان به قابلیت زیستی، غیرسمی بودن و سازگاری با سلول­ها و بافت­ها اشاره نمود (13و 14). با وجود این، به‏دلیل نامناسب بودن پاره­ای از خصوصیات فیزیکی این پلیمر از جمله قابلیت کششی و ارتجاعی، استفاده از کیتوسان در برخی از زمینه­های مهندسی بافت با محدودیت‏‏هایی مواجه است. از این رو می­بایست برای ارتقای خصوصیات  فیزیکی و شیمیایی آن از ترکیب کیتوزان و نوعی پلیمر سنتتیک همچون PVA استفاده شود. از PVA به‏دلیل نرخ زیست­سازگاری/زیست­تخریب­پذیری مناسب می­توان در زمینه­های مختلف پزشکی بهره گرفت. PVA دارای خصوصیات آب­دوستی مناسب بوده و قابلیت بالایی در تشکیل فیبر دارد. سلول کشت شده روی داربست کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/نانولوله­کربنی در این پژوهش، سلول­های سرطانی جنینی P19 بود. سلول­های کارسینومای جنینی (EC)(Embryonal carcinoma cells) مانند دیگر سلول­های بنیادی نامیرا بوده و قدرت تکثیر بالایی در محیط کشت دارند (15). از ویژگی­های بارز این سلول­ها پرتوان (Pluripotent) بودن و همچنین تکثیر و تمایز آن‏ها در محیط کشت است. بنابراین سلول‏های P19 کاندید خوبی برای تمایز عصبی هستند. هدف از این مطالعه استفاده از داربست کیتوسان/پلی‏وینیل­الکل/نانولوله­کربنی به‏منظور تمایز عصبی سلول­های بنیادی برای کاربردهای بالقوه مهندسی بافت عصبی بود. سلول­های تمایز یافته سپس از نظر بروز فنوتیپ عصبی و بیان نشانگر ویژه عصبی بتاتوبولین بررسی شدند.

مواد و روش­ها

کشت و تکثیر سلول­های بنیادی P19: رده سلولی P19 در محیط کشت α-MEM ( α-modified Eagle's medium:Gibco, 11900- 073) و غلظت ده درصد سرم جنینی گاو (fetal bovine serum: Sigma, 10270-106) و مخلوط آنتی­بیوتیکی پنی­سیلین /استرپتومایسین (Penicillin G: Sigma, P3032/ Streptomycin: Sigma, S1277) کشت و در دمای 37 درجه سانتی­گراد و فشار پنج درصد CO2  انکوبه شد. سلول­ها­ پس از رسیدن به تراکم مناسب واکشت شدند.

تولید اجسام شبه­جنینی: برای تولید اجسام شبه­جنینی (Embryoid bodies) از روش کشت معلق استفاده شد. بدین‏منظور سلول­های P19 در پتری ­دیش­های باکتریولوژی محتوی محیط کشت α-MEM همراه با ده درصد سرم کشت داده شدند (104×5/2 سلول در یک میلی­لیتر)(6). از آنجایی‏که در این پتری­دیش­ها سلول به بستر کشت نمی­چسبد، سلول­ها تمایل دارند به یکدیگر چسبیده و تجمعات سلولی یا اجسام شبه­جنینی تشکیل دهند.

تمایز عصبی سلول­های P19 با استفاده از سیستم کشت  ­سه­بعدی: رده سلول بنیادی P19 در محیط کشت α-MEM همراه با سه درصد سرم جنینی گاو روی داربست کشت داده شد. تشکیل اجسام شبه­جنینی گامی ضروری در پروتکل‌های تمایزی سلول‌های بنیادی است. به‏همین دلیل در ابتدا سلول‌ها به‏صورت معلق و بدون حضور داربست کشت شدند تا این اجسام تولید شوند. سپس تعداد سه تا پنج جسم شبه­جنینی روی هر داربست منتقل و تحت شرایط میزان 5 درصد، CO2و دمای 37 درجه سانتی­گراد انکوباتور نگه‏داری شد. بعد از اطمینان از چسبندگی اجسام شبه­جنینی، محیط کشت با محیط حاوی سه درصد سرم تعویض شد. نگه‏داری از سلول‌ها تا رسیدن تراکم سلولی به هفتاد تا هشتاد درصد ادامه داشت.

رنگ­آمیزی کرزیل ­ویوله: به‏‌منظور بررسی شکل ظاهری سلول­های عصبی حاصل از تمایز سلول­های بنیادی در کشت سه­بعدی از رنگ‌آمیزی اختصاصی کرزیل ­ویوله (cresyl violet: Merck, 3653684) که اجسام نیسل (Nissl bodies) را در سلول­های عصبی رنگ‌آمیزی می‏کند، استفاده شد. پس از شستشو با PBS سلول­ها با استفاده از اتانول 70 درصد به‏مدت ده دقیقه در دمای اتاق تثبیت شدند. سپس به‏مدت سه تا ده دقیقه در محلول کرزیل­ ویوله (کرزیل ­ویوله 25/0 درصد، اسید استیک­ گلاسیال 8/0 درصد، استات­سدیم 6/0 میلی­مولار، آب مقطر 100 سانتی­مترمکعب) انکوبه شدند. برای مشاهده مستقیم و تصویربرداری سلول­های رنگ شده از میکروسکوپ واژگون (Inverted microscope) استفاده شد. پس از رنگ­آمیزی،سلول­هایی که به کرزیل ­ویوله پاسخ مثبت دادند با استفاده از میکروسکوپ نوری شمارش و درصد آن­ها نسبت به تعداد کل سلول­ها محاسبه شد. رنگ­آمیزی و شمارش سلولی حداقل پنج بار تکرار شد. اعداد حاصله با استفاده از آزمون آنالیز واریانس یک­طرفه و دانکن تجزیه و تحلیل و نتایج به صورت میانگین± انحراف معیار گزارش شد.

ایمنوفلورسنس: ایمنوفلورسنس روشی دیگر جهت شناسایی نشانگرهای اختصاصی سلول­های عصبی در محیط کشت است. آنتی­بادی­ اولیه مورد استفاده در این روش آنتی­بادی مونوکلونال ضد بتاتوبولین­III موش (mouse anti β-III tubulin monoclonal antibody: Abcam, ab7751) بود. ایمنوگلوبولینIgG) G) کونژوگه شده با فلورسئین­ایزوتیوسیانات (FITC-conjugated anti-mouse IgG: Sigma, F9137FITC: ) به‏عنوان آنتی­بادی­ ثانویه استفاده شد. برای انجام ایمنوفلورسنس در ابتدا سلول­ها در پلیت­های 12 خانه­ای حاوی داربست کشت شدند. سپس با استفاده از محلول چهار درصد پارافرمالدئید به‏مدت نیم ساعت در درجه حرارت اطاق تثبیت و بعد از آن سه بار با محلول PBS ایمنوهیستوشیمی شستشو شدند. از محلول بلاک­کننده برای پوشاندن جایگاه­های آنتی­ژن­ غیراختصاصی استفاده شد. جهت ایجاد نفوذپذیری، سلول­ها به‏مدت نیم ساعت با محلول 3/0 درصد تریتون X-100 در PBS و در دمای 37 درجه سانتی­گراد انکوبه شدند. پس از سه بار شستشو با PBS، انکوباسیون سلول­ها به‏مدت نیم ساعت با محلول ده درصد سرم نرمال بز در PBS انجام شد. نمونه­ها بعد از چسباندن با گلیسرول 70 درصد در محلول PBS با میکروسکوپ فلورسنس مشاهده شدند. جهت اطمینان از درستی نتایج حاصله، در نمونه­های کنترل آنتی­بادی­ اولیه حذف شد.

نتایج

کشت و تکثیر سلول­های بنیادی P19

سلول­های P19 پس از انتقال به ظروف مخصوص کشت به کف آن چسبیده و به سرعت شروع به تکثیر نمودند. این سلول­ها که دارای شکل چندوجهی هستند (شکل 1 الف و ب) حدود 24 ساعت بعد از ذوب یا واکشت در ظرف کشت تشکیل کلونی‏های سلولی را آغاز کردند (شکل 1 ج و د). پس از رسیدن کلونی­ها به نقطه تلاقی با هم، سلول‏ها واکشت شدند.

 

 شکل 1: تصویر میکروسکوپ نوری واژگون از کشت و تکثیر تدریجی سلول­های بنیادی کارسینومای جنینی P19 (پیکان) در محیط کشت 𝛂-MEM و ده درصد سرم جنینی گاو. سلول­ها بلافاصله بعد از کشت به‏صورت انفرادی به بستر کشت می‏چسبند. الف: بعد از مدتی سلول­ها شروع به تکثیر می­کنند، ب: کلونی­هایی که پس از تکثیر سلول­های P19 در محیط کشت ظاهر می­شوند، ج و د: کلونی سلولی حدود 24 ساعت بعد از ذوب یا واکشت در ظرف کشت حاوی 𝛂-MEM و ده درصد سرم جنینی گاو. بزرگنمایی: الف و ب، ×400، ج، ×100، ، د، ×250،

تولید اجسام شبه­جنینی

کشت معلق سلول­های سرطانی جنینی P19 در پتری دیش­های باکتریولوژی منجر به تشکیل اجسام شبه­جنینی شد. سلول‏های P19 در محیط کشت α-MEM ده درصد سرم به بستر کشت نمی­چسبند، بلکه به یکدیگر ­چسبیده و تجمعات سلولی تحت عنوان اجسام شبه­جنینی ایجاد می­کنند (شکل2).

 

 

شکل 2: تصویر میکروسکوپ نوری از تجمعات سلولی یا جسم شبه­جنینی (پیکان) تشکیل شده از سلول­های P19 در محیط کشت  𝛂-MEM و ده درصد سرم جنینی گاو. الف: یک جسم شبه­جنینی پیش از چسبیدن به بستر کشت، ب: یک جسم شبه­جنینی پس از چسبیدن به بستر کشت. سر پیکان سلول­هایی را که از اطراف جسم جنینی در حال تکثیر هستند نشان می‏دهد. بزرگنمایی: الف، ×40، ب، ×100.

 

داربست  

داربست­های مورد استفاده در مهندسی بافت به‏عنوان مشابهی از ماتریکس خارج سلولی نقش مهمی ایفا می‏کنند. مهندسی بافت به معنی استفاده از داربستی است که می­تواند در محل نقص کاشته شده و بافت آسیب دیده را در مکان ترمیم کند. این داربست­ باید به‏عنوان الگوی سه­بعدی موقتی برای چسبیدن سلول­ها، تکثیر و مهاجرت آن­ها و سرانجام شکل­گیری بافت جدید عمل نماید. برای ساخت داربست از روش الکتروریسی استفاده شد. تصویر میکروسکوپ الکترونی اسکنینگ داربست نانوکامپوزیتی الکتروریسی شده کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/نانولوله­کربنی در شکل 3 نشان داده شده است.

 

 

 

شکل 3: تصویر میکروسکوپ الکترونی اسکنینگ از نمونه داربست نانوکامپوزیتی الکتروریسی شده کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/ نانولوله­کربنی در دو بزرگنمایی­ مختلف. نانولوله­کربنی در داربست­های مهندسی بافت عصب به‏عنوان جزء رسانا و هدایت­کننده پیام عصبی نقش ایفا می­کند.

 

 

کشت سه­بعدی سلول­های بنیادی P19

سلول­های بنیادی P19 در پتری­دیش­ محتوی داربست در محیط کشتα-MEM  و سه درصد سرم جنینی گاو کشت داده شدند. شکل 4 الف اتصال و چسبندگی اجسام شبه­جنینی روی داربست نانوکامپوزیتی و سلول­هایی که از اطراف این اجسام در حال تکثیر هستند را نشان می­دهد. تصویر سلول­های بنیادی کشت شده روی داربست­ نانوکامپوزیتی کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/نانولوله­کربنی در شکل 4 ب نشان داده شده است. گستردگی و شیوه قرارگیری سلول­ها بر روی داربست دلیل بر مناسب بودن بستر نانوالیاف کامپوزیتی برای سلول­ها است. این نتایج نشان می­دهد داربست­های تهیه شده محیط و بستر بسیار مطلوبی را برای اتصال و رشد سلول­ها فراهم کرده­اند.

 

 

 

شکل 4: تصویر میکروسکوپ نوری از اتصال و چسبندگی الف: جسم شبه­جنینی (پیکان) روی داربست نانوکامپوزیتی (ستاره). سلول­هایی­که از اطراف جسم شبه­جنینی در حال تکثیر هستند به‏خوبی درون داربست جای گرفتند (سر پیکان)، ب: سلول­های بنیادی P19 (پیکان) روی داربست نانوکامپوزیتی (ستاره) که به‏خوبی درون داربست جای گرفتند. بزرگنمایی: الف، ×100، ب، ×250.

 

 

 

بررسی شکل ظاهری سلول­های عصبی توسط رنگ­آمیزی کرزیل ­ویوله

جهت شناسایی سلول­های عصبی حاصل از تمایز از روش‏های مختلف استفاده می­شود. از جمله این روش­ها رنگ­آمیزی اختصاصی کرزیل­ویوله است که اجسام نیسل سلول­های عصبی را به رنگ بنفش در می­آورد (شکل 5). پس از رنگ­آمیزی با کرزیل­ ویوله، سلول­های عصبی همراه با زواید سلولی خود به‏رنگ بنفش درآمدند. سلول­های کشت روی داربست که به این رنگ پاسخ مثبت داده­اند با دو بزرگنمایی پایین (شکل 5 الف) و بالا (شکل 5 ب) نشان داده شده­اند.

 

 

شکل 5: تصویر میکروسکوپ نوری از رنگ­آمیزی کرزیل ­ویوله جهت شناسایی سلول­های عصبی (پیکان) و غیرعصبی (سرپیکان) در داربست­ نانوکامپوزیتی (ستاره) کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/نانولوله­کربنی. بزرگنمایی: الف، ×100، ، ب، ×400.

 

 

پس از رنگ­آمیزی،سلول­هایی که به کرزیل ­ویوله پاسخ مثبت دادند با استفاده از میکروسکوپ نوری شمارش و درصد آن­ها نسبت به تعداد کل سلول­ها محاسبه شد. رنگ­آمیزی و شمارش سلولی حداقل پنج بار تکرار شد. اعداد حاصله با استفاده از آزمون آنالیز واریانس یک­طرفه و دانکن تجزیه و تحلیل و نتایج به‏صورت میانگین ± انحراف معیار گزارش شد (نمودار 1).نتایج نشان داد که میانگین درصد سلول­های عصبی در گروه کشت شده روی داربست­ نانوکامپوزیت (CNT) بیشتر از  میانگین درصد سلول­های عصبی در گروه کنترل (WS) بوده و این اختلاف از نظر آماری معنادار است (3=n و 5/0>ρ).

 

 

نمودار 1: مقایسه­ی درصد سلول­های عصبی در داربست­ نانوکامپوزیتی کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/نانولوله­کربنی (CNT) و بدون داربست (WS) توسط رنگ‏آمیزی کرزیل­ویوله. میانگین درصد سلول­های عصبی در گروه کشت سه­بعدی بیشتر از میانگین درصد سلول­های عصبی در گروه کنترل (بدون داربست) بود و از نظر آماری اختلاف معناداری نشان داد (3=n و 5/0>ρ). حروف کوچک انگلیسی نشان دهنده اختلاف معنی‏دار بین گروه­های مختلف است.

 

 

بررسی بیان پروتئین­های اختصاصی عصبی در سلول­های تمایزیافته به روش ایمنوفلورسنس

ایمنوفلورسنس روش مناسبی جهت شناسایی سلول­های عصبی در محیط کشت است. سلول­های حاصل از تمایز در معرض آنتی­بادی­ اولیه (ضد بتاتوبولین3) و ثانویه (کونژوگه شده با ماده فلورسنت) قرار گرفتند تا بیان نشانگر بتاتوبولین3 در آن­ها ارزیابی شود. بتاتوبولین3 ویژه مغز در بیشتر زواید عصبی بافت­های بالغ وجود داشته و نشانگر اختصاصی برای نورون­هاست. مقاطع رنگ­آمیزی شده به‏­وسیله­ میکروسکوپ فلورسنس بررسی و تصویربرداری شدند (شکل 6). همچنین برای اطمینان از درستی نتایج به‏دست آمده گروهی به‏عنوان گروه کنترل منفی که در آن آنتی­بادی اولیه حذف شده بود در نظر گرفته شد (شکل 7). در این گروه سلول­ها هیچگونه واکنش فلورسنتی از خود نشان ندادند. 

 

 

شکل 6: تصویر میکروسکوپ فلورسنس از سلول­های تمایزیافته (پیکان) حاصل کشت سلول­های بنیادی کارسینومای جنینی رده P19 روی داربست­ نانوکامپوزیتی (ستاره). این تصاویر بیان نشانگر عصبی بتاتوبولین3 را نشان می­دهد. بتاتوبولین3 ویژه مغز است و در بیشتر زواید عصبی بافت­های بالغ وجود داشته و نشانگر مناسبی برای شناسایی نورون­هاست. الف: سلول P19 تمایز یافته با استفاده از نور مرئی، ب: بیان بتاتوبولین3 با استفاده از آنتی­بادی ضد بتاتوبولین3 ، ج: رنگ­آمیزی هسته با استفاده از هوخست، د: تصویر مرکب از (ب) و (ج).  بزرگنمایی ×1000.

 

 

شکل7: تصویر میکروسکوپ فلورسنس از سلول­های تمایزیافته (پیکان) حاصل کشت سلول­های بنیادی کارسینومای جنینی رده P19 روی داربست­ نانوکامپوزیتی (ستاره) به‏عنوان گروه کنترل منفی که بدون آنتی­بادی اولیه انجام گرفت. الف: سلول P19 تمایز یافته با استفاده از نور مرئی، ب: همان میدان دید با فیلتر فلورسنس و بدون استفاده از آنتی­بادی اولیه‏، ج: رنگ‏آمیزی هسته با استفاده از رنگ اختصاصی هوخست انجام شد. بزرگنمایی ×100.

 

 

 بحث

کشت و تمایز سلول­های بنیادی در محیط آزمایشگاه و سپس پیوند سلول­های تمایز یافته امیدهای تازه­ای را برای درمان بسیاری از بیماری­ها از جمله اختلالات سیستم عصبی فراهم نموده است. از طرف دیگر استفاده از ساختارهای سه­بعدی برای کشت سلول­های پیوندی، شرایط رشد، تکثیر و تمایز سلولی را به وضعیت طبیعی درون بدن نزدیک­تر می­نماید (16). به‏منظور تولید داربست مناسب برای پیوند و نیل به درمان موثر با استفاده از آن هنوز انجام تحقیقات پایه­ای گسترده­ای مورد نیاز است. پروژه حاضر در این راستا طراحی و ارائه شده است. در این پروژه پس از کشت ­سه­بعدی سلول­های P19 و بررسی میزان زنده‏مانی و تمایز آن­ها روی داربست، این سلول­ها از نظر بروز فنوتیپ عصبی مورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج حاصل از این پروژه نشان داد که داربست کیتوسان /پلی­وینیل­الکل/نانولوله­کربنی برای تمایز عصبی سلول­های P19 مفید است؛ زیرا این داربست می­تواند باعث برقراری اتصالات ­سلولی و همچنین تکثیر، سازمان­یابی و تمایز عصبی سلول­ها شود. سلول­های P19، همانند سایر سلول­های بنیادی نامیرا و فناناپذیر هستند. این سلول­ها به سرعت در محیط کشت تکثیر شده و می­توانند تحت شرایط مناسب به تمام انواع سلول­ها تمایز یابند. سلول­های P19  در مطالعات گسترده­ای به‏منظور تمایز به انواع سلول­ها به‏ویژه سلول عصبی مورد استفاده قرار گرفته­اند (6، 17، 18). اجتماعات سلولی P19 پس از انتقال به ظروف کشت به بستر چسبیده و بعد از 12 تا 24 ساعت کلونی­های سلولی را تشکیل می­دهند. در مهندسی بافت عصبی به داربست­هایی نیاز است که با وجود داشتن ساختار فیزیکی و شیمیایی مناسب، از پایداری مطلوب نیز برخوردار باشند (19). در این پژوهش از نانو لوله­های­ کربنی تک جداره به‏دلیل خواص منحصر به فرد آن‏ها برای تقویت و پایداری نانوکامپوزیت کیتوسان/­پلی­وینیل­ا­لکل استفاده شد. استفاده از نانو لوله­های‏ کربنی در داربست­های مهندسی بافت عصب علاوه بر ارتقای خواص مکانیکی داربست، رفتار سلول­های عصبی را نیز بسیار تحت تاثیر قرار می­دهد. در پروژه حاضر سازگاری زیستی داربست­ نانوکامپوزیتی با سلول­های بنیادی کارسینومای جنینی (رده P19) مورد بررسی قرار گرفت. گستردگی و شیوه قرارگیری سلول­ها روی داربست، نشان از مناسب بودن بستر نانو الیاف کامپوزیتی برای سلول­ها است. وجود نانو لوله­های ­کربنی، علاوه بر ارتقای خواص مکانیکی، رسانایی لازم را نیز برای بدنه داربست ایجاد می­کند و به این ترتیب امکان برقراری ارتباط میان سلول­های عصبی را تسهیل می­نماید. ساخت کانال هدایت عصبی زیست­تخریب­پذیر بر اساس کیتین/کیتوسان مهندسی بافت عصبی را بهبود بخشیده است (20). در مدل حیوانی نقص عصب سیاتیک توسط پیوند عصب مصنوعی، پلی از مخلوط کیتوسان/پلی­گلیکولیک­اسید به اندازه سی میلی‏متر زده شد (21). جایو و همکاران (22) با استفاده از داربست زیست­تخریب­پذیر کیتوسان/پلی­گلیکولیک­اسید اقدام به ایجاد پل دراز مدت در عصب سیاتیک آسیب دیده موش صحرایی نمودند و با بهره­گیری از بررسی­های بافت­شناسی و سنجش الکتروفیزیولوژی بازیابی عملکردی آن را بررسی کردند. نتایج نشان داد که نقص عصب سیاتیک بعد از مدتی برطرف شد. اولین بار در ایران متقی طلب و همکاران (12)، داربست کامپوزیتی کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/نانولوله­کربنی را برای کاربرد در مهندسی بافت عصب معرفی کردند. در پژوهش آن­ها رشد سلول­های عصبی طبیعی مشتق از مغز انسان روی داربست مذکور بررسی و تایید شد. سپس داربست کامپوزیتی کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/نانولوله­کربنی به‏روش الکتروریسی ساخته و مشخص شد که سلول­های L929 نسبت به این داربست پاسخ مناسبی از خود نشان می­دهند. همچنین تکثیر سلولی روی داربست­های دارای نانولوله­های­کربنی بیشتر از داربست­های بدون نانولوله بود (23). بر اساس برخی گزارش­ها نانولوله­های­کربنی سمی هستند (24). ولی برخی عقیده دارند که این نانولوله­ها نه تنها اثر سمی ندارند، بلکه برای رشد سلولی بسیار مفیدند (25). نتایج حاصل از این مطالعه نیز مفید بودن نانو لوله­های مذکور در کشت سلول­های بنیادی و القای تمایز در آن­ها را به اثبات رساند. در پژوهش حاضر بعد از القای عصبی در سلول­های بنیادی توسط داربست­ نانوکامپوزیتی کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/نانولوله­کربنی و تایید اولیه فنوتیپ عصبی این سلول­ها، تعداد سلول­های تمایز یافته روی داربست با استفاده از رنگ­آمیزی کرزیل ­ویوله شمارش شد. کرزیل­  ویوله اجسام نیسل که ویژه سلول عصبی است را رنگ­آمیزی می­کند. مطالعه­ای که توسط اسماعیلی و همکاران (5) صورت گرفت، نشان داد که سلول­های بنیادی P19 پس از تمایز به سلول­های عصبی به رنگ­آمیزی کرزیل ­ویوله پاسخ مثبت دادند. با استفاده از این رنگ­آمیزی اختصاصی تمایز سلول­های کارسینومای جنینی P19 به سلول­های عصبی روی داربست­ نانوکامپوزیتی تایید و مشاهده شد که این داربست نقش به‏سزایی در تمایز عصبی دارد. در این پژوهش میزان تمایز سلول­های P19 به سلول­های عصبی روی داربست و گروه کنترل (بدون داربست) تفاوت چشم‏گیری داشت و مشاهده شد که داربست باعث القای تمایز عصبی شده است.

علاوه بر بررسی مورفولوژیکی، سلول­های عصبی حاصله در این پژوهش از نظر بیان نشانگر اختصاصی بتاتوبولین3، مورد ارزیابی قرار گرفتند. با استفاده از روش ایمنوفلورسنس بیان این پروتئین در این سلول­ها ارزیابی شد. سلول­های P19 تمایز نیافته دارای شکل چندوجهی هستند و آنتی­ژن­های جنینی را در سطح خود بیان می‏کنند. بسیاری از این آنتی­ژن­ها در سلول­های زایای نورواپیتلیال بیان می­شوند. بتاتوبولین3 ویژه مغز است. ایزوفرم پروتئین بتاتوبولین3 در بیشتر زواید عصبی بافت‏های بالغ وجود داشته و نشانگر دیگری برای نورون‏هاست. در مطالعه­ای که توسط بخشعلی­زاده و همکاران (6) صورت گرفت، ردیابی پروتئین ویژه سلول‏های عصبی بتاتوبولین3 به‏روش ایمنوفلورسنس بیان این پروتئین­ اختصاصی عصبی را در سلول­های تمایز یافته نشان داد.

نتیجه گیری

نتایج این مطالعه نشان داد که نانو لوله­های کربنی ترکیب شده با داربست نانوالیاف کیتوسان/پلی­وینیل­الکل با قطر نانومتری و تخلخل بالا می­تواند ضمن تامین خواص مکانیکی مناسب، بستری مفید برای رشد سلولی فراهم کند و به‏طور بالقوه گزینه­ای بسیار مطلوب جهت استفاده در مهندسی بافت عصب باشد. وجود نانو لوله ­کربنی، علاوه بر ارتقای خواص مکانیکی، رسانایی لازم را نیز برای بدنه داربست ایجاد می­کند و به این ترتیب امکان برقراری ارتباط میان سلول­های عصبی را تسهیل می­نماید.

تشکر و  قدردانی

این پژوهش در دانشکده علوم دانشگاه اصفهان انجام شده است. بدین­وسیله از تمام کسانی که ما را در انجام این طرح یاری نمودند به‏ویژه سرکار خانم قربانی کارشناس محترم آزمایشگاه قدردانی می­شود.

  1. Brandt R. Cytoskeletal mechanisms of neuronal degeneration. Cell Tissue Res. 2001; 305(2): 255-65.
  2. Skovronsky DM, Lee VMY, Trojanowski JQ. Neurodegenerative diseases: new concepts of pathogenesis and their therapeutic implications. Annu Rev Pathol Mech Dis. 2006; 1: 151-70.
  3. Vickers JC, King AE, Woodhouse A, Kirkcaldie MT, et al. Axonopathy and cytoskeletal disruption in degenerative diseases of the central nervous system. Brain Res Bull. 2009; 80(4): 217-23.
  4. Mansergh FC, Wride MA, Rancourt DE. Neurons from stem cells: implications for understanding nervous system development and repair. Biochem Cell Biol. 2000; 78(5): 613-28.
  5. Esmaeili F, Tiraihi T, Movahedin M, Mowla SJ. Selegiline induces neuronal phenotype and neurotrophins expression in embryonic stem cells. Rejuv Res. 2006; 9(4): 475-84.
  6. Bakhshalizadeh S, Esmaeili F, Houshmand F, Shirzad H, et al. Effects of selegiline, a monoamine oxidase B inhibitor, on differentiation of P19 embryonal carcinoma stem cells, into neuron-like cells. In Vitro Cell Dev-An. 2011; 47(8): 550-7.
  7. Orive G, Anitua E, Pedraz JL, Emerich DF. Biomaterials for promoting brain protection, repair and regeneration. Nat Rev Neurosci. 2009; 10(9): 682-92.
  8. Zhang L, Webster TJ. Nanotechnology and nanomaterials: promises for improved tissue regeneration. Nano today. 2009; 4(1): 66-80.
  9. Dhariwala B, Hunt E, Boland T. Rapid prototyping of tissue-engineering constructs, using photopolymerizable hydrogels and stereolithography. Tissue Eng. 2004; 10(9-10): 1316-22.
  10. Amado S, Simoes MJ, da Silva PASA, Luis AL, et al. Use of hybrid chitosan membranes and N1E-115 cells for promoting nerve regeneration in an axonotmesis rat model. Biomaterials. 2008; 29(33): 4409-19.
  11. Wen X, Tresco PA. Fabrication and characterization of permeable degradable poly (DL-lactide-co-glycolide)(PLGA) hollow fiber phase inversion membranes for use as nerve tract guidance channels. Biomaterials. 2006; 27(20): 3800-9.
  12. Mottaghitalab F, Mottaghitalab V, Farokhi M, Amiralian N, et al. Fabrication of chitosan/poly (vinyl alcohol)-carbon nanotube nanocomposites for neural tissue regeneration. Modares J Med Sci: Pathobiol. 2010; 12(4): 59-69.
  13. Lee JS, Choi KH, Ghim HD, Kim SS, et al. Role of molecular weight of atactic poly (vinyl alcohol)(PVA) in the structure and properties of PVA nanofabric prepared by electrospinning. J Appl Polym Sci. 2004; 93(4): 1638-46.
  14. Naebe M, Lin T, Tian W, Dai L, et al. Effects of MWNT nanofillers on structures and properties of PVA electrospun nanofibres. Nanotechnology. 2007; 18(22): 225605.
  15. Rudnicki MA, McBurney MW. Cell culture methods and induction of differentiation of embryonal carcinoma cell lines. In Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson EJ (ed.). IRL Press: Oxford; 1987; 19–49.
  16. Kumari A, Yadav SK, Yadav SC. Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems. Colloids Surf B Biointerfaces. 2010; 75(1): 1-18.
  17. Ebrahimie M, Esmaeili F, Cheraghi S, Houshmand F, et al. Efficient and Simple Production of Insulin-Producing Cells from Embryonal Carcinoma Stem Cells Using Mouse Neonate Pancreas Extract, As a Natural Inducer. PloS one. 2014; 9(3): e90885, Doi:10.1371/journal.pone.0090885.
  18. Mansouri A, Esmaeili F, Nejatpour A, Houshmand F, et al. Differentiation of P19 embryonal carcinoma stem cells into insulin-producing cells promoted by pancreas-conditioned medium. J Tissue Eng Regen Med.  2016; 8, DOI: 10.1002/term.1927:600-12.
  19. Leipzig ND, Wylie RG, Kim H, Shoichet MS. Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds. Biomaterials. 2011; 32(1): 57-64.
  20. Freier T, Montenegro R, Koh HS, Shoichet MS. Chitin-based tubes for tissue engineering in the nervous system. Biomaterials. 2005; 26(22): 4624-32.
  21. Wang X, Hu W, Cao Y, Yao J, et al. Dog sciatic nerve regeneration across a 30-mm defect bridged by a chitosan/PGA artificial nerve graft. Brain. 2005; 128(8): 1897-910.
  22. Jiao H, Yao J, Yang Y, Chen X, et al. Chitosan/polyglycolic acid nerve grafts for axon regeneration from prolonged axotomized neurons to chronically denervated segments. Biomaterials. 2009; 30(28): 5004-18.
  23. Liao H, Qi R, Shen M, Cao X, et al. Improved cellular response on multiwalled carbon nanotube-incorporated electrospun polyvinyl alcohol/chitosan nanofibrous scaffolds. Colloids Surf B Biointerfaces. 2011; 84(2): 528-35.
  24. Jia G, Wang H, Yan L, Wang X, et al. Cytotoxicity of carbon nanomaterials: single-wall nanotube, multi-wall nanotube, and fullerene. Environ sci technol. 2005; 39(5): 1378-83.
  25. Shi Kam NW, Jessop TC, Wender PA, Dai H. Nanotube molecular transporters: internalization of carbon nanotube-protein conjugates into mammalian cells. J Am Chem Soc. 2004; 126(22): 6850-1.