مطالعه هیستومورفومتریک اثر عصاره الکلی دانه انگور (Vitis Vinifera) بر روی ترمیم زخم‏های دیابتی موش صحرائی نر نژاد ویستار

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان، گروه زیست شناسی، دامغان، ایران

چکیده

هدف: هدف از این تحقیق بررسی اثرات دارویی هسته انگور سیاه  بر تغییرات هیستومورفومتریک ترمیم پوست در موش‏های صحرایی نر دیابتی بود.
مواد و روش‏ها: در این مطالعه 48 سر موش  نر نژاد ویستار را  به 4  گروه (کنترل منفی، کنترل مثبت، تجربی یک ، تجربی دو) تقسیم شدند. در گروه‏های مورد آزمایش زخمی به‏طول سه سانتی‏متر در سمت چپ  ستون فقرات ایجاد شد. روند ترمیم زخم به‏صورت میکروسکوپی و ماکروسکوپی بررسی شد.
نتایج: زخم گروه‏های  دیابتی در مقایسه با گروه سالم ترمیم دیرتری نشان داد و التیام زخم در گروه‏های تجربی تیمار شده با عصاره الکلی هسته انگور  نسبت به گروه کنترل از سرعت بیشتری برخوردار بود. در این تحقیق از نرم افزار spss  ویرایش 16 به روش Mann- whitney, kruskal-wallis آزمون شد و نتایج در سطح (05/0p<) معنی‏دار تلقی شد.
نتیجه گیری: نتایج نشان داد که عصاره الکلی هسته انگور موجب تسریع ترمیم زخم‏های پوستی نمونه‏های سالم و دیابتی می‏شود.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

زخم پوستی روندی است که با هماهنگی بافت‏ها، سلول‏ها و فاکتورهای مختلف التیام می‏یابد‏. ترمیم زخم عبارت است از پاسخ‏های ترمیمی هماهنگ سلول‏های خونی ماتریکس خارج سلولی و سلول‏های پارانشیمال که پس از اعمال جراحی و یا آسیب‏های حاصل از ضربه که منجر به پارگی بافت شوند، در بدن انجام می‏شود (1).

 ترمیم زخم را به سه فاز التهاب، تکثیر و تجدید ساختار تقسیم می‏کنند .در فاز التهاب طی 24 ساعت اول پس از آسیب تعداد  نوتروفیل‏ها به حداکثر رسیده و پس از 3 روز کاهش می‏یابند. در عرض 24 تا ‏48  ساعت تعداد ماکروفاژها به حداکثر می‏رسند و در روز پنجم اکثریت سلول‏های زخم را تشکیل می‏دهند. فاز تکثیر از انتهای دیررس فاز التهاب شروع می‏شود که روز سوم پس از آسیب است. فیبروبلاست کلاژن و گلیکوزآمینوگلیکان را می‏سازد. میزان سنتز کلاژن تا سه هفته به‏طور مداوم زیاد می‏شود تا یک نقطه تعادل به‏دست آید. یعنی نقطه ای که سنتز و تجزیه کلاژن برابر است (2). فاز تجدید ساختار سه هفته بعد از آسیب شروع می‏شود که در آن تعادل بین سنتز و تجزیه کلاژن وجود دارد (2). با توجه به اهمیت ترمیم زخم و این که عدم درمان زخم‏های باز ممکن است منجر به عفونت موضعی و در نهایت سرطان شود، پژوهش‏های مختلفی روی ترمیم زخم انجام شده و در نتیجه‏ی آن، مواد مختلفی به‏صورت مرهم زخم‏ها تهیه و معرفی شده اند که اغلب این مواد به‏صورت ترکیبات گیاهی و گاهی شیمیایی بوده اند، ولی تا این زمان هیچکدام نتوانسته‏اند به‏عنوان یک داروی موثر توصیه شوند (3).

 گیاهان بسیار زیادی وجود دارند که در طب سنتی ملل مختلف برای درمان دیابت مورد استفاده قرار می‏‏گیرند که تاثیر هیپوگلیسمیک بسیاری از آن‏ها مورد بررسی
 قرار گرفته و تائید شده است (4). انگور از خانواده
(Vitis vinifera) تیره Ampelidaceae جنس Vitis زیر جنس Euvitis و گونه انگور ایرانی است. هسته انگور که ترکیبی از چربی، پروتئین، کربوهیدرات و 5 الی 8 درصد پلی فنل بوده که مقادیر آن بسته به جنس و گونه انگور دارد. پلی فنل‏های موجود در عصاره هسته انگور شامل فلانوئیدها، اسید گالیک، مونومریک فلاوان -3کاتچین، اپی کاتچین3-گالیت و دیمریک، مونومریک و پلی مریک پروآنتوسیانیدین می‏باشد. پروآنتوسیانیدین دیمر موجود در هسته انگور موثرترین ترکیب آنتی اکسیدانتی می‏باشد (5). هسته انگور دارای پتانسیل بسیار بالایی در از بین بردن رادیکال‏های آزاد و مهار استرس اکسیداتیو می‏باشد که نقش مهاری آن در مهار استرس اکسیداتیو به اثبات رسیده است (6). با توجه به موارد ذکر شده عوامل آنتی اکسیدانتی نقش به‏سزایی درکاهش عوارض ناشی از بیماری دیابت خواهد شد و در این بین استفاده از ترکیبات با منشا گیاهی که معمولا با عوارض جانبی کمتری همراه است، اهمیت خاص دارد. به‏نظر می‏رسد که احتمالا عصاره هسته انگور در درمان زخم در شرایط دیابت موثر و حائز اهمیت باشد، چرا که نقش آن در درمان قند خون و همچنین استرس اکسیداتیو حاصل از روند التهاب به اثبات رسیده است (7). از آنجایی‏که گیاهان دارویی منابع غنی از آنتی­اکسیدانت‏های طبیعی هستند در طب سنتی برای کنترل و درمان بسیاری از بیماری‏ها به‏کار می­روند. در این تحقیق هم با توجه به خواص هسته انگور راهی برای پیشبرد و التیام زخم­های دیابتی و نیز با توجه به خاصیت آنتی اکسیدانتی عصاره هسته انگور اثر آن بر التیام و تسریع بهبودی زخم در شرایط دیابت مورد مطالعه قرار گرفته است (7).

مواد و روش‏ها

در این مطالعه تجربی 48 سر موش صحرایی نر از نژاد ویستار، با محدوده وزنی  210 تا 240 گرم، انتخاب و  به 4 گروه تقسیم شدند. حیوانات در شرایط کنترل شده (به‏منظور تطابق با محیط آزمایشگاه) از نظر نور(12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی) و دمای محیط 20 تا 22 درجه سانتی‏گراد و رطوبت نسبی 40 تا 60 درصد در اتاق حیوانات دانشگاه آزاد اسلامی واحد دامغان نگه‏داری شدند و هیچ‏گونه محدودیتی از نظر مصرف آب و غذا نداشتند. قفس‏های نگه‏داری حیوانات هفته ای 4 بار ضد عفونی شده و با خرده‏ها‏ی چوب تعویض شد. شرایط نگه‏داری و انجام  کلیه مراحل آزمایش از قوانین و اصول اخلاقی ثبت شده در منشور اخلاق در نگه‏داری حیوانات ازمایشگاهی رعایت شده است. تقسیم‏بندی حیوانات به‏ترتیب زیر انجام گرفت:

1- گروه کنترل منفی‏: شامل 8 سر موش که به آن‏ها بافرستیرات به‏صورت درون صفاتی تزریق شد و پس از ایجاد زخم در این گروه هیچ مرهمی استفاده نشد.

2- گروه کنترل مثبت: شامل 8 سر موش که با تزریق درون صفاتی استرپتوزوتوسین 55 میلی‏گرم بر کیلوگرم دیابتی شدند و سنجش قند ‌خون برای القای دیابت، 72 ساعت بعد از تزریق (STZ) و با استفاده از خون سیاهرگ دمی، به‏کمک دستگاه کلوگوکارد صفر و یک انجام شد و موش‌های با قندخون بالاتر از (300 میلی‏گرم بر دسی‏لیتر) دیابتی در نظر گرفته شدند و پس از گذشت یک ماه پس از تزریق استرپتوزوتوسین و القای دیابت، زخم در این گروه ایجاد شد اما از هیچ مرهمی برای ترمیم استفاده نشد.

3-گروه تجربی اول: شامل 8 سر موش که پس از ایجاد زخم روزانه دو بار با اوسرین تیمار شدند.

 4- گروه تجربی دوم: شامل 8 سر موش دیابتی که پس از گذشت یک ماه از دیابتی بودن با  ایجاد زخم،  روزانه دو بار با پماد عصاره الکلی هسته انگور تیمارشدند.

نحوه ایجاد زخم: ابتدا با تزریق داخل صفاقی کتامین  (K113 ) و زایلزین (X1251) موش‏ها را بی‏هوش کرده سپس موهای سمت چپ ستون فقرات را تراشیده و نواحی مورد نظر توسط محلول بتادین 10 درصد ضد عفونی شد. سپس با کمک خط کش شابلون، زخمی به‏طول 3 سانتی‏متر با استفاده از تیغ اسکالپل و تیغ جراحی ایجاد شد و در روز‏های 7 و14 جهت بررسی‏های هیستولوژی از زخم‏ها نمونه‏گیری انجام شد.

نحوه تهیه پماد عصاره الکلی هسته انگور: به‏منظور تهیه‏ی پماد1000 میلی‏لیتر الکل 96 درصد را با 300 گرم  پودر هسته انگور حل کرده و 72 ساعت در بن ماری نگه داشته شد و بعد از آن با دستگاه عصاره گیری (دستگاه سوکسله) عصاره هسته انگور جدا گشته و با اوسرین  به نسبت سه (اوسرین) به دو (عصاره) مخلوط شد.

روش اندازه گیری طول زخم: بهبود زخم با اندازه گیری طول زخم، درصد بهبودی و مدت لازم برای بسته شدن کامل زخم ارزیابی شد.

طول زخم در روزهای 5/3، 7، 14 و 21بعد از عمل به‏وسیله کولیس اندازه‏گیری شد. سپس اعداد به‏دست آمده از طول زخم، در فرمول در صد بهبودی به‏شرح زیر قرار داده شدند: X) :روز اندازه‏گیری طول زخم)

 

 

به‏منظور ثبوت بافت، نمونه‏های تهیه شده، به‏مدت 48 ساعت در محلول فرمالین 10 درصد قرار داده شد.  پس از آنکه بافت ثابت شد توسط الکل اتیلیک با درجه الکلی 30، 50 ،70 ، 90 ، و100مراحل آب گیری از نمونه‏ها انجام شد و سپس توسط گزیلول شفاف سازی و سپس قالب‏گیری آن‏ها در پارافین انجام شد. با استفاده از میکروتوم با تیغه ثابت، برش‏هایی به ضخامت 5 میکرون به‏صورت متوالی تهیه شد. برش‏ها به بن ماری منتقل شده و بر روی لام آغشته به چسب آلبومین قرار داده شد. نمونه‏ها در دمای معمولی اتاق خشک شده و بعد از گذشت 24 ساعت لام‏ها آماده رنگ آمیزی بود. در این تحقیق از روش رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین استفاده شد.

 

آنالیز آماری: داده‏ها با استفاده از نرم افزار spss  ویرایش 16 به‏روش Mann- whitney, kruskal-wallis آزمون شد و (05/0p<) معنی‏دار تلقی شد.

نتایج

بررسی نشان می‏دهد در روزهای 5/3، 7 و 14 آزمایش طول زخم در گروه تجربی دو نسبت به کنترل و تجربی یک کاهش معنی‏داری دارد. همچنین نتایج نشان می‏دهدکه درصد بهبودی در گروه تجربی دو در روزهای مورد آزمایش نسبت به گروه کنترل و تجربی یک افزایش معنی‏داری را از خود نشان می‏دهد (‏جدول و نمودارهای 1 و 2). همچنین شکل های 1 و 2 تغییرات بافتی را در روزهای  7 و 14 در گروه‏های مختلف نشان می‏دهند. همان‏طوری‏که مشاهده می‏شود در تمام گروه‏های مورد آزمایش روند ترمیم زخم در روزهای 7 و 14 مشاهده می‏شود ولی نتایج نشان می‏دهد که تسریع بهبودی زخم در گروه تجربی دو نسبت به گروه تجربی یک به‏طور معنی‏داری بیشتر است.

 

 

طول زخم (میلی‏متر)

مقایسه طول زخم در گروه‏های مورد آزمایش

 

نمودار 1: میانگین مقایسه میانگین ± انحراف معیار طول زخم  در گروه‏های مختلف و در روزهای مورد ارزیابی. حروف نامشابه به معرف اختلاف معنی‏دار را در حد 05/0≥‏p را نشان می‏دهند. (حروف غیر مشابه اختلاف معنی‏دار و مشابه غیر معنی‏‏دار را نشان می‏دهد)

درصد بهبودی زخم

نمودار 2: میانگین مقایسه میانگین ± انحراف معیار درصد طول زخم در گروه‏های مختلف و در روزهای مورد ارزیابی. حروف نامشابه به معرف اختلاف معنی‏دار را در حد 05/0≥p را نشان می‏دهند (حروف غیر مشابه اختلاف معنی‏دار و مشابه غیر معنی‏دار را نشان می‏دهد )

جدول 1:  مقایسه میانگین ± انحراف معیار طول زخم  (میلی‏متر) در روز های مختلف

21

14

7

5/3

گروه   روز

0

07/0±21/0a

08/0±29/2a

2/0±8/2a

کنترل منفی

0

04/0±17/0bd

1/0±92/1bd

1/0±7/2bd

کنترل مثبت

01/0±11/0

02/0±19/0c

1/0±15/2c

3/0±9/2c

تجربی1

0

02/0±15/0d

06/0±7/1d

1/0±6/2d

تجربی2

 

 

جدول 2: مقایسه میانگین ± انحراف معیار درصد بهبودی  زخم در روز‏های مختلف

21

14

7

5/3

گروه روز           روز

8/0 ± 87/98a

9/0 ±87/93a

14/3 ±45/46a

62/3 ±75/10a

کنترل منفی

 5/0± 87/88bd

02/1±56/74bd

1/3±68/43bd

14/4±37/8bd

کنترل مثبت

00±100 c

96/1±06/96c

7/1±08/68c

74/2±18/31c

تجربی1

1/0± 12/97d

02/1±12/86d

7/2±5/52d

9/1±62/14d

تجربی2

 

   
   

شکل 1: نشان‏دهنده بافت پوست پس از 7 روز پس از ایجاد زخم می‏باشد) بزرگنمایی ×400‏(.

A: گروه کنترل منفی،B  گروه کنترل مثبت C: گروه تجربی اول D: گروه تجربی دوم

E: اپی‏درم D: درم F: فولیکول مو، L: بافت چربی

 

   
   

شکل 2: نشان‏دهنده بافت پوست پس از 14روز پس از ایجاد زخم می‏باشد ) بزرگنمایی ×400‏(.

E: گروه کنترل منفی،F  گروه کنترل مثبت G: گروه تجربی اول H: گروه تجربی دوم

E: اپی‏درم، D: درم F: فولیکول مو، L: بافت چربی، C: کلاژن

 

بحث

زخم‏های پوستی و کاهش زمان بهبود آن‏ها، یکی از جنبه‏های بسیار مهم در علوم پزشکی محسوب می‏شود. آلودگی زخم و التهاب مزمن سبب تاخیر التیام می‏شود. اما تاثیرات ضد میکروبی و ضد التهابی می‏تواند در تسریع التیام موثر باشد. روند فرآیند ترمیم و التیام زخم، بستگی به عواملی از جمله تولید، ذخیره سازی و نحوه اتصال کلاژن، نحوه عملکرد سلول‏های گوناگون بافت پوششی و همبند، میزان ترشح کلاژناز و عوامل دیگر دارد. فلذا تشخیص اختصاصی زخم، مشخص نمودن مراحل بیولوژیک آن و مکانیسم موثر بر ترمیم زخم، راه گشای مناسبی برای مداوای هر چه بهتر زخم‏ها وجراحت‏های گوناگون است (8). اختلال در جریان خون موضعی و اکسیژن گیری، همراه با سایر عوامل، نظیر سن، چاقی، سوء تغذیه، عفونت، بعضی از داروها، بعضی از بیماری‏ها نظیر دیابت و ... می تواند فرآیند التیام زخم را به تاخیر بیاندازد.

نتایج مقایسه میانگین طول زخم‏ها در گرو‏ه‏های تحقیق نشان می‏دهد که کاهش معنی‏داری در گروه دو نسبت به سه گروه دیگر در حد 01/0 p≤ و طول زخم در هر چهار دوره بررسی یعنی روزها ی 5/3 ،7، 14 و 21 همواره  نسبت به  سایر گروه‏ها ی دیگر کاهش معنی‏داری داشته است (جدول 1 و 2).

بهبودی زخم از روز هفتم به بعد قابل بررسی بوده است. با توجه به نمودار 1 و 2 در روزهای هفتم و چهاردهم، سرعت بهبودی گروه تجربی 2 در بعضی از رت‏ها نزدیک و حتی زودتر از گروه کنترل و بهبودی گروه دیابتی نسبت به همه گروه‏ها دیرتر بود است. ولی در دراز مدت درهمه گرو‏ه‏ها بهبودی حاصل شد است. این نتایج نشانگر این است که عصاره الکلی هسته انگور توانسته سرعت بهبود‏ی زخم را افز ایش دهد.

همچنین التهاب به‏وسیله پروستاگلاندین در جایی‏که سیکلواکسیژناز 2 در سنتز آن‏ها نقش کلیدی ایفا می‏کند ایجاد می‏شود، احتمالا عصاره الکلی هسته انگور با خاصیت سرکوب کنندگی سیکلواکسیژناز 2 باعث بهبود زخم در موش‏های سالم شد که نقطه عطفی در پژوهش حاضر می‏باشد (9).

هسته انگور غنی از ویتامین‏های A، B ، Cو املاحی چون قند، آهن ،کلسیم، فسفر، پتاسیم، ید، منیزیم است. همچنین دارای تانن‏ها و اسیدهای آلی، گلوکوزیدهای آربوتین و متیل آربوتین، اسید اورسولیک‏، اسید گالیک، اسید سیتریک و کوئرستین می‏باشد که وجود این عوامل در خاصیت آنتی اکسیدانتی هسته انگور موثر بوده و سبب تسریع بهبود زخم می‏شود (10).

یکی از علل ترمیم زخم را با پماد هسته انگور می‏توان به اسید لینولیئک نسبت داد. اسید لینولئیک یا امگا 6 موجود در هسته انگور سبب ترمیم بافت‏های آسیب دیده و سلامتی پوست و شرکت در مکانیسم رشد و تکامل می‏شود، همچنین ویتامین E یکی از ویتامین‏های  محلول در چربی است. دلیل شهرت ویتامین E خاصیت آنتی اکسیدانتی آن است که عبار ت است از کاهش عوامل شیمیایی مخربی که در اثر استرس‏های فیزیولوژیکی و محیطی در خون به‏وجود آمده است. همچنین خاصیت ضد التهابی، ضد انباشته شدن پلاکت، تنظیم ژن‏ها، تقسیم سلولی دارد (10).

یکی دیگر از ترکیبات هسته انگور که در فرآیند ترمیم دخالت دارد پروآنتوسیانیدین می‏باشد که خاصیت آنتی اکسیدانتی، کاهش تولید هیستامین و کاهش پاسخ‏های آلرژیک، افزایش استحکام عروق، شادابی پوست، شرکت در ساختار کلاژن، جلوگیری از تخریب DNA خاصیت آنتی اکسیدانتی آن به‏مراتب بیشتر از ویتامین E و C است (10).

در نتایج به‏دست آمده از مطالعات بافت‏شناسی نشان داد که در گروه تجربی 2 فاز تجدید سنتز کلاژن نسبت به سایر گروه‏ها زودتر و دسته‏های کلاژن با قطر بیشتر تشکیل شده است. علاوه بر این افز ایش فیبروز و کاهش التهاب در نمونه‏های گروه تجربی 2 با سایر گروه‏ها با ملاحظه نقش فیبروبلاست که عبارت است از سنتز برخی از اجزای ماتریکس خارج سلولی اولیه بستر زخم نظیر فیبرونکتین و پروتئوگلیکان‏ها جهت ایجاد بستر مناسبی برای مهاجرت و تکثیر سلو‏ل‏ها فراهم می‏آورند و سنتز کلاژن که موجب ایجاد قدرت کشش در بستر زخم می‏شود مهم تلقی می‏شود(شکل 1 و 2 ). در روز پایان درمان، در گروه‏های تجربی 1 و شم با آن‏که اپی‏درم به‏وجود آمد اما ضمایم پوستی مشاهده نشد در صورتی‏که در گروه تجربی 2 مانند گروه کنترل قسمتی از اپی‏درم همراه ضمایم پوستی و قسمتی دیگر بدون ضمایم پوستی در درم دیده شد.

در زمینه ترمیم زخم‏های افراد دیابتی تحقیقات گسترده ای انجام شده از جمله در تحقیقی که خاکسار و همکاران (11) به بررسی استفاده موضعی استروژن در روند ترمیم زخم در موش‏های صحرای دیابتی پرداخته است که روند التیام زخم در گروه‏های دیابتی نسبت به گروه سالم از ترمیم دیرتری برخوردار بوده است و روند التیام زخم در هفته اول تغییر چشم‏گیری داشته است، که با نتایج  این پروژه همخوانی دارد.

بخش مهمی از ترمیم زخم، مدیون رگ‏زایی مجدد است. رگ‏زایی برای تغذیه زخم و تامین اکسیژن ضروری است. تشکیل عروق خونی در گروه تیمار و کنترل سالم تا روز هشتم، روند افزایشی داشته و بعد از آن به‏تدریج سیر نزولی پیدا می‏کند.

در مقاله ای دیگر عبادی و همکارانش (12) به بررسی اثر نیفدیپین در التیام زخم‏های پوستی در موش‏های دیابتی شده با استرپتوزوتوسین پرداخته است که نتایج حاصل از پروژه وی با نتایج کار ما نیز هم‏خوانی دارد، که آن‏ها بیان داشته‏اند که نیفدیپین نیز با تسریع جریان خون موضعی زیر جلدی به‏عنوان یک درمان حمایتی سبب ترمیم زخم و تسریع سرعت بهبود زخم می‏شود که  احتمالا عصاره الکلی هسته انگور هم بدین‏ترتیب سبب التیام زخم شده است.

از مقایسه نتایج تحقیق حاضر با نتایج دیگر به‏نظرمی رسد. هسته انگور احتمالا به‏دلیل دارا بودن آنتوسیانین با اثرات آنتی اکسیدانتی، فلاونوئیدها با اثرات آنتی التهابی و تانن‏ها با اثرات تکثیر سلولی و رگ‏زایی در فرآیند ترمیم و بازسازی زخم‏های دیابتی از طریق تسریع التهاب‏، تکثیرسلولی و نیز هیپوگلیسمی بر ترمیم زخم‏های دیابتی دخالت دارند.

 نتیجه‏گیری

با توجه به نتایج به‏دست آمده در این پروژه، برای افرادی که مشکلات زخم‏های نوروپاتی یا آنژیووپاتی و پوستی دارند، عصاره الکلی هسته انگور را  به‏عنوان دارویی جدید به‏صورت پماد معرفی کرد.

تشکر و قدردانی

از مسئولین و اساتید و کارشناس آزمایشگاه جنین شناسی و بافت شناسی دانشگاه آزاد اسلامی واحد دامغان که در انجام این تحقیق همکاری نموده اند تشکر و قدردانی می‏شود.

  1. Chakrabarty A, Norman RA, Phillips TJ. Cutaneous manifestations of diabetes. Wounds 2002; 2(14): 267-74.
  2. Lujiang Y, Dawei TU, Xiaoli YE, Jianping WU. Hypoglycemic and Hypocholesterolemic Effects of Coptis chinensis Franch Inflorescence. Plant Foods for Human Nutrition. 2006; 61(3): 139-144.
  3. Singh J, Kakkar P. Antihyperglycemic and antioxidant effect of Berberis aristata root extract and its role in regulating carbohydrate metabolism in diabetic rats. Phytomedicine. 2011; 18(12): 1045-1050.
  4. Gupta J.K, Mishra P, Rani A, Mazumder PM. Blood Glucose Lowering Potential of Stem Bark of Berberis aristata Dc in Alloxan-Induced Diabetic Rats. Iranian Journal of Pharmacology & Therapeutics. 2010; 9(1): 21-24.
  5. Kim MK, Ha YM, Jin YC, Shi LY, et al. Palmatine from Coptidis rhizoma reduces ischemia–reperfusion-mediated acute myocardial injury in the rat. Food and Chemical Toxicology. 2009; 47(12): 2097–2102.
  6. Tripathi BK, Srivastava AK. Diabetes mellitus: complications and therapeutics. Med Sci Monit. 2006; 12(5): 130-47.
  7. Wandell PE. Quality of 1ife of patients with diabetes mellitus. An overview of research in primary health care in the Nordic countries. Scand J Prim Health Care 2005; 23(8): 68-74
  8. Suji G, Sivakami S. Approaches to the treatment of diabetes mellitus: an overview. Cell Mol Biol 2003; 49(15): 635-39.
  9. Shapiro K, Gong WC. Natural products used for diabetes. J Am Pharmacol Assoc 2002; 42(10): 217-26.
  10. Sari V, Babaii H. Short-term effects of grape seed extract supplementation Black
    GSE on D. Malone and serum creatine kinase . After a session of aerobic exercise in men,Olampic Novin. 1393; 2(2):105-115.
  11. Khaksar S, Kasmaki M. Use of topical estrogen can accelerate wound healing in diabetic rats Iranian Journal of Endocrinology and Metabolism,1389; 12(14): 551-542.
Ebadi A, Ghashoni H. The effect of nifedipine on skin wound healing in diabetic mice  physiology and pharmacology. 1380; 2(9):15-21.