القای اکسیداسیون پروتئین‌، فعالیت پروتئاز، تغییرات گروه‌های تیولی و ظرفیت آنتی‌اکسیدانتی کل در گیاه سیب‌زمینی(Solanum tuberosum) توسط نانو نقره و نیترات نقره در شرایط کشت در شیشه

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی، اصفهان، ایران

1

چکیده

هدف: در این تحقیق، به‏منظور مقایسه سمیت و تنش اکسیداتیو احتمالی ناشی از اعمال نانو نقره و یون نقره، اثر غلظت‌های مختلف آن‏ها بر بعضی از شاخص‏های بیوشمیایی مرتبط با اکسیداسون پروتئین‏ها در گیاه سیب‌زمینی مورد مطالعه قرار گرفته است.
مواد و روش‌ها: گیاهچه‌های سیب‌زمینی حاوی یک گره، به محیط کشت پایه MS حاوی غلظت‌های 10،2،0، و 20 میلی‌گرم بر لیتر از نانو نقره و نیترات نقره منتقل شدند. پس از 4 هفته، جدا کشت‌های رشد یافته به‏‌منظور اندازه‌گیری شاخص‏های موردنظر برداشت شدند.
نتایج: محتوی پروتئین کل برگ در جدا کشت‌های تیمارشده با  نانو نقره  یا یون نقره، به‏جز در غلظت 2 میلی‏گرم بر لیتر از تیمار یون نقره، با افزایش غلظت کاهش نشان دادند. همچنین، تغییرات قابل ملاحظه‌ای در الگوی الکتروفورزی پروتئین‏های برگ در 5 باند پروتئینی مشاهده شد. محتوی گروه‌های کربونیل در تیمارهای نانو نقره و یون نقره با افزایش غلظت نقره افزایش یافت. محتوی تیول‏های پروتئینی و غیر پروتئینی به‏ترتیب کاهش و افزایش را نشان دادند. به‏علاوه، افزایش بیشتری در فعالیت پروتئاز و توان آنتی‌اکسیدانتی کل در جدا کشت‌های تحت تیمار یون نقره در مقایسه با نانو نقره مشاهده شد.
نتیجه‌گیری: بر اساس نتایج به‌دست‌آمده می‌توان نتیجه گرفت که آسیب اکسیداتیو  در جدا کشت‌های تحت تیمار با نانو نقره بسیار بیشتر از جدا کشت‌های تیمارشده با یون نقره است و علاوه بر آزادسازی یون نقره، اثرات ویژه مرتبط با نانو ذرات هم می‌تواند در القای تنش اکسیداتیو ناشی از نانو نقره در گیاه سیب‌زمینی دخالت داشته باشد.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

پیشرفت‌های اخیر در دست ورزی مواد و تولید محصولات مبتنی بر فناوری نانو، قلمرو کاربرد نانو مواد در زمینه‌های مختلف از جمله کشاورزی را افزایش داده است (1). نانو نقره به‏دلیل دارا بودن خواص ضد باکتریایی، در مقایسه با سایر نانو مواد بیشتر مورد توجه بوده است (2). گزارش‏های متعددی مبنی بر اثرات سودمند نانو نقره بر رشد نمو گیاهان وجود دارد. مصطفی و همکاران (3) گزارش دادند که دانه رست‌های سویا تیمارشده با نانو نقره در غلظت 2 میلی‌گرم بر لیتر، رشد نمو بهتری را در شرایط غرقابی از خود نشان دادند. بهبود بعضی از شاخص‌های رشد نظیر افزایش سطح برگ و تولید بیوماس بیشتر در گیاه سیب‌زمینی تیمارشده با نانو نقره، نیز به اثبات رسیده است (4). از آنجایی‌که یون نقره بازدارنده عمل اتیلن محسوب می‌شود، رشد و نمو بهتر گیاه سیب‌زمینی در شرایط کشت در شیشه تحت تیمار نانو نقره با غلظت بهینه، ممکن است با مهار اتیلن مرتبط باشد. شارما و همکاران (5) گزارش داده‌اند که تیمار گیاهان براسیکا ژونسه آ با 50 میلی‌گرم بر لیتر از نانو نقره، باعث افزایش بعضی از شاخص‌های فیزیولوژیکی نظیر وزن‌تر، طول ساقه و ریشه، محتوی کلروفیل و بهبود وضعیت آنتی‌اکسیدانت‌ها شده است. بااین‌وجود، کاربرد نانو نقره در گیاهان زراعی نیاز به تامل بیشتری دارد.

امروزه به‏دلیل کاربرد‏های گسترده‌ای که محصولات حاوی نانو نقره در زندگی ما دارند، در آینده نزدیک ممکن است نانو نقره به‌عنوان یک آلاینده خود را نشان دهد. در کشاورزی آفت‌کش‌های حاوی نانو نقره هم امروزه استفاده می‌شود، بنابراین با گذشت زمان آلودگی زمین‌های کشاورزی به این ماده افزایش می‏یابد (6). اثرات مثبت یا منفی نانو نقره بر گیاهان به عوامل مختلفی از جمله اندازه ذرات، شکل، پوشش سطحی، مدت‌زمان تیمار، گونه گیاه و مرحله نموی بستگی دارد (7 و 8). نتایج حاصل از اثر نانو نقره بر گیاه باقلا نشان داده است که نانو نقره باعث القای بعضی از ناهنجاری‌های کروموزومی و کاهش شاخص میتوزی در سلول‌های نوک ریشه شده است (9). در گیاه آرابیدوپسیس تالیانا، نانو نقره سبب القای از هم‌گسیختگی غشای تیلاکوئیدهای کلروپلاست، کاهش محتوی کلروفیل، افزایش بیان ژن‌های اکواپورین‏ها و ژن‌های مربوط به آنتی‌اکسیدانت‌‏های آنزیمی شده است (10). افزایش بیان ژن‌‏های مرتبط با ترکیبات فنلی، گلوکوزینولات‏ها، تخریب DNA و افزایش تولید گونه‌های اکسیژن واکنش‏گر (ROS) در گیاه براسیکا راپا تحت تیمار نانو نقره نیز گزارش ‌شده است (11).

پروتئین‌ها به‏‌عنوان یکی از اجزای تشکیل‌دهنده غالب در سلول، توسط رادیکال‌های آزاد مورد حمله قرار می‌گیرند. پروتئین‌ها در سلول نقش‌های متنوع ساختاری، کاتالیزوری و کارکردی را بر عهده ‌دارند و اکسیداسیون پروتئین‌ها عملکرد آن‌ها را تحت تاثیر قرار می‌دهد (12). اکسیداسیون پروتئین‌ها یک رویداد مخرب سلولی و یکی از نشانگرهای تنش اکسیداتیو محسوب می‌شود. از بین تغییرات اکسیداتیو متعدد پروتئین‌ها، اکسیداسیون گروه‌های تیولی وتشکیل گروه‌های کربونیل بیشتر مورد توجه قرارگرفته‌اند. اکسیداسیون گروه‏های تیولی روی گروه‌های سولفیدریل آزاد آمینواسیدهای گوگردی نظیر متیونین و سیستئین صورت می‌گیرد و یک رویداد برگشت‌پذیر است. کربونیلی شدن که فرم دیگر اکسیداسیون پروتئین‌ها است، غیر قابل ‌برگشت بوده و بر روی اسید آمینه‏های هیستیدین، آرژنین و لیزین صورت می‌گیرد (13). اکسیداسیون غیرقابل‌برگشت پروتئین‌ها به‏دلیل تولید ترکیبات واکنش‏گر، به‌شدت مخرب بوده و باعث آسیب سایر پروتئین‌ها و DNA می‌شود. بنابراین، سرنوشت نهایی پروتئین‌های آسیب‌دیده پروتئولیز و تجزیه توسط پروتئازهاست (14).

در این تحقیق، به‏منظور مقایسه سمیت سلولی و تنش اکسیداتیو احتمالی ناشی از اعمال نانو نقره و یون نقره، اثر غلظت‌های مختلف آن‏ها بر القای اکسیداسیون پروتئین‌ها، فعالیت پروتئازها، تغییرات گروه‌های تیولی، پروتئین محلول و ظرفیت آنتی‌اکسیدانتی کل در گیاه سیب‌زمینی کشت شده در شرایط کشت بافت مورد مطالعه قرارگرفته است.

مواد و روش‌ها

خصوصیات نانو نقره و نحوه آماده‌سازی

در این تحقیق از نانوذرات نقره پوشش داده شده با پلی وینیل پیرولیدون (PVP) خریداری شده از شرکت نانومواد تحقیقاتی ایالات متحده (هوستون، تگزاس)، با اندازه متوسط ذرات 20 نانومتر، دارای شکل کروی و مساحت m2.g-1 22-18 استفاده شد. برای تهیه استوک نانونقره، نانوپودر را در آب دوبار تقطیر بصورت سوسپانسیون درآورده و به‏مدت 10 دقیقه تحت اثر امواج فراصوت قرار گرفت.

تهیه مواد گیاهی و شرایط رشد: گیاه سیب زمینی (Solanum tuberosum L.)، رقم وایت دزیره، از قطب تنش‏های گیاهی غیر زیستی ایران واقع در دانشگاه اصفهان تهیه شد. برای تکثیر، گیاهچه‏های حاوی یک گره به محیط کشت پایه MS (15) منتقل شدند. پس از گذشت چهار هفته، جدا کشت‏های رشد یافته به محیط کشت پایه MS حاوی غلظت‏های 10،2،0 و 20 میلی‏گرم بر لیتر از نانونقره و معادل آن نیترات نقره منتقل شدند. دمای اتاق رشد 1± 25 درجه سانتی‏گراد، دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و از شدت نور 50 میکرمول فوتون بر مترمربع بر ثانیه استفاده شد. تمام آزمایش‏ها با حداقل 3 تکرار انجام و پس از 4 هفته، جدا کشت‏های رشدیافته به‏منظور اندازه گیری شاخص‏های بیوشیمیائی مورد نظر برداشت شدند.

اندازه گیری پروتئین محلول کل: به‏منظور استخراج پروتئین‏های محلول برگ، 1/. گرم از بافت تر برگ با 1 میلی‏لیتر از بافر فسفات 100 میلی مولار، 8/7pH= ، حاوی EDTA(1mM)، DTT(4mM) و گلیسرول 10 درصد، درون یک هاون و روی یخ همگن شد. مخلوط بدست آمده، به‏مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‏گراد با دور g21000 سانتریفیوژ (Eppendorf Model 5417R)  شد. از محلول رویی به‏منظور اندازه گیری پروتئین محلول کل استفاده شد. اندازه گیری پروتئین کل بر اساس روش برادفورد (16) انجام شد. برای اندازه گیری مقدار پروتئین نمونه‏ها، 5 میلی‏لیتر از معرف برادفورد را در لوله آزمایش ریخته، 100 میکرولیتر از عصاره نمونه مورد نظر را به آن افزوده و مخلوط شد. نمونه‏ها به‏مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه، سپس جذب نمونه‏ها با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر مدل AE-UV1600 در طول موج 595 نانومتر خوانده شد. محاسبات با استفاده ازمنحنی استاندارد تهیه شده با پروتئین آلبومین سرم گاوی (BSA) انجام و میزان پروتئین محلول کل، بر حسب میلی‏گرم پروتئین بر گرم وزن تر گزارش شد.

الکتروفورز پروتئین :(SDS-PAGE) الکتروفورز پروتئین‏های محلول برگ با استفاده از دستگاه الکتروفورز با سیستم عمودی  Mini VERTI GEL2 و منبع تغذیه PS 304 XL شرکت APELEX انجام شد. از ژل جدا کننده (separating gel) با غلظت 12.5 درصد و ژل متراکم کننده (stacking gel) با غلظت 8 درصد استفاده شد. به‏منظور آماده سازی نمونه‏ها، ابتدا غلظت عصاره‏های پروتئینی یکسان سازی و برای هر نمونه مقدار تقریبی 100 میکروگرم عصاره با 20 میکرولیتر بافر نمونه مخلوط شد. پس از آماده سازی نمونه‏ها، مقدار 50 میکرولیتر از نمونه به هر چاهک تزریق شد. از نشانگر پروتئینی شرکت Thermo Scientific برای تخمین محدوده وزن مولکولی باندها استفاده شد. الکتروفورز تحت میدان الکتریکی با ولتاژ   100 ولت، شدت جریان 40 میلی‏آمپر و زمان تقریبی 3 ساعت انجام شد. پس از اتمام الکتروفورز، ژل توسط کوماسی بریلیانت بلو R-250 رنگ آمیزی شد (17). پس از رنگ آمیزی و سپس رنگ بری ژل، شدت بیان نسبی باندهای پروتئینی با نرم افزار Image J مورد بررسی قرار گرفت.

اندازه گیری اکسیداسیون پروتئین‏ها: برای اندازه گیری اکسیداسیون پروتئین‏ها از روش  Reznick و Packer )18) استفاده شد. به 1/. گرم از بافت تازه برگ، 1 میلی‏لیتر از بافر فسفات سدیم 10 میلی مولار، 4/7 pH=حاوی  EDTA1 میلی‏مولار  و DTT 2 میلی‏مولار اضافه شد و استخراج روی یخ انجام گرفت. مخلوط به‏دست آمده در دور g 22000، در دمای 4 درجه سانتی‏گراد و به‏مدت 20 دقیقه سانتریفوژ شد. به 5/0 میلی‏لیتر از روشناور به‏دست آمده، 1 میلی‏لیتر از دی نیتروفنیل هیدرازین (DNPH) 10 میلی مولار (حل شده در Hcl 1M) اضافه نموده و در دمای اتاق به‏مدت 1 ساعت انکوبه شد. سپس به‏منظور رسوب دادن پروتئین‏ها، 1 میلی‏لیتر از TCA 10 درصد (تری کلرواستیک اسید) به نمونه‏ها افزوده و در g 3000 به‏مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند. رسوب به‏دست آمده 3 بار با 2 میلی لیتر اتیل استات- اتانول (1:1,v/v) شستشو داده شد و سپس در 1 میلی‏لیتر گوانیدین هیدروکلراید 6 مولار، 3/2pH= حل شد. جذب نمونه‏ها با دستگاه اسپکتروفتومتر مدل AE-UV1600 در طول موج 370 نانومتر خوانده شد. از ضریب خاموشی مولی DNPH M-1cm-1 22000، برای محاسبه محتوی کربونیل نمونه‏ها استفاده شد. بر این اساس با توجه به ضریب خاموشی مولی و استفاده از قانون بیر-لامبرت، محتوی کربونیل بر حسب نانومول بر میلی‏گرم پروتئین محاسبه و گزارش شد.

سنجش فعالیت پروتئاز: فعالیت پروتئازی بر اساس روش Polge و همکاران انجام شد (19). به‏منظور تعیین فعالیت پروتئازی، ابتدا 2/. گرم از بافت برگ به کمک 2 میلی‏لیتر از بافر Tris-HCl، 50 میلی مولار (5/7PH= حاوی DTT (2 میلی مولار) و روی یخ همگن شد. سپس مخلوط حاصل در دمای 4 درجه سانتی‏گراد و در g 22000 به‏مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. از محلول رویی برای اندازه گیری فعالیت پروتئازی عصاره استفاده شد. به 250 میکرولیتر از عصاره آنزیمی 250 میکرولیتر آزوکازئین 2 درصد اضافه و این مخلوط به‏مدت 10 دقیقه در 28 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد. سپس واکنش را با اضافه کردن 1 میلی‏لیتر از TCA 10 درصد متوقف شد. مخلوط واکنش در g 4000 و به‏مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد سپس به 1 میلی‏لیتر از محلول رویی 1 میلی‏لیتر از NaOH 1 مولار اضافه و پس از 30 دقیقه انکوباسیون در دمای اتاق جذب نمونه‏ها در 440 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر مدل AE-UV1600 خوانده شد. محاسبات بر اساس ضریب خاموشی آزوکازئین Lcm-1g-137 و بر اساس میلی‏گرم آزوکازئین تجزیه شده در دقیقه بر میلی‏گرم پروتئین گزارش شد. فرمول محاسبه فعالیت آنزیم پروتئاز به‏صورت زیر است:

فعالیت آنزیم پروتئاز= [

Abs، جذب نور در طول موج 440 نانومتر. ∆t، زمان بر حسب دقیقه. V، حجم بافر واکنش (میلی‏لیتر). v، حجم نمونه (میلی‏لیتر). P، میلی‏گرم پروتئین در میلی‏لیتر و ε، ضریب خاموشی آزوکازئین می‏باشد.

اندازه گیری تیول‏های پروتئینی، غیر پروتئینی و تیول کل: برای استخراج، 1/0 گرم بافت برگ به‏کمک 2 میلی‏لیتر از اسکوربات سدیم 15 درصد و روی یخ همگن شد. عصاره به‏دست آمده در دمای 4 درجه سانتی‏گراد و g 20000 به‏مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد. از محلول رویی برای اندازه‏گیری گروه‏های تیولی کل و تیول‏های غیر پروتئینی استفاده شد. اندازه‏گیری گروه‏های تیولی بر اساس روش دی کوک و کویپر و (20) انجام شد. برای اندازه گیری تیول کل 500 میکرولیتر از محلول رویی با 1 میلی‏لیتر از بافر Tris-HCl 200 میلی مولار، 8pH= مخلوط شد. سپس 500 میکرولیتر از SDS 8 درصد و در پایان 100 میکرولیتر DTNB (دی تیوبیس نیتروبنزوئیک اسید) 10 میلی مولار (DTNB در بافر فسفات 20 میلی مولار (7pH=) اضافه شد. مخلوط واکنش به‏مدت 15 دقیقه در دمای 30 درجه سانتی‏گراد انکوبه و سپس جذب محلول در طول موج  415 نانومتر خوانده شد. برای اندازه‏گیری گروه‏های تیولی غیرپروتئینی، عصاره حاوی گروه‏های تیولی کل را به‏منظور حذف تیول‏های پروتئینی به‏مدت 15 دقیقه در دمای 100 درجه سانتی‏گراد انکوبه نموده و دوباره در g 20000 به‏مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شدند. از محلول رویی برای اندازه‏گیری گروه‏های تیولی غیر پروتئینی استفاده شد. تیول‏های پروتئینی را با کم کردن مقدار تیول‏های کل از تیول‏های غیر پروتئینی به‏دست آمد. محاسبات براساس ضریب خاموشی M-1cm-113600 و استفاده از قانون بیر-لامبرت انجام و مقدار گروه‏های تیولی بر اساس نانومول بر گرم وزن تر بافت گزارش شد.

اندازه گیری ظرفیت آنتی اکسیدانتی کل: فعالیت آنتی اکسیدانتی کل با استفاده از روش FRAP (Ferric reducing antioxidant power) اندازه گیری شد. در این روش کمپلکس فریک- تری پیریدیل تریازن  (Fe3+-TPTZ)در pH پایین، تحت تاثیر آنتی اکسیدانت‏ها احیا شده و رنگ آبی تیره با حداکثر جذب در طول موج 593 نانومتر ایجاد می‏شود (21). استخراج عصاره از برگ و با استفاده از بافر فسفات 100 میلی مولار، 8/7pH= انجام شد. به 1/0 گرم از بافت برگ، 1 میلی‏لیتر بافر فسفات سدیم اضافه و استخراج بر روی یخ انجام شد. مخلوط به‏دست آمده به‏مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‏گراد و در دور rpm 13000 سانتریفیوژ شد. محلول رویی برای تعیین فعالیت آنتی اکسیدانتی کل مورد استفاده قرار گرفت. به 50 میکرولیتر عصاره، 5/1 میلی‏لیتر محلول کار FRAP که حاوی بافراستات 300 میلی مولار
(6/3 pH=). تری پیریدیل تریازن 10 میلی مولار و FeCl3 20 میلی مولار می‏باشد اضافه شد. سپس جذب نمونه‏ها در طول موج 593 نانومتر خوانده شد. محاسبات با استفاده از منحنی استاندارد تهیه شده به‏کمک اسکوربیک اسید انجام و ظرفیت آنتی اکسیدانتی کل بر حسب میکرومول آهن احیا شده به وزن تر نمونه‏ها گزارش شد.

آنالیز آماری: آزمایش‏های انجام شده در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار برای هر تیمار انجام شد. میانگین‏ها با استفاده از آنـالیز واریـانس یک طرفه  (ANOVA) و آزمون دانکن آنالیز و با یکدیگر مقایسه شدند. در هـر انـدازه گیـری ارتبـاط بـین گروه‏ها بررسی و محدوده معنی داری 05/0p< در نظر گرفته شد.

نتایج

داده‏های حاصل از اندازه‏گیری محتوی پروتئین کل برگ در جدا کشت‏های تیمارشده با نانو نقره، در غلظت‏های 2 و 10 میلی‏گرم بر لیتر نسبت به کنترل تغییر معنی‏داری (05/0p<) را نشان ندادند (شکل 1).

 

شکل 1: اثر غلظت‌های مختلف نانو نقره و یون نقره بعد از چهار هفته تیمار، بر محتوی پروتئین کل (میانگین سه تکرار±انحراف معیار) در جدا کشت‌های سیب‌زمینی رقم وایت دزیره. حروف غیرمشترک بیانگر وجود اختلاف معنی‌دار بین تیمارها بر اساس آزمون دانکن 05/0p< است.

با این‏حال، در غلظت 20 میلی‏گرم بر لیتر نسبت به کنترل 6/31 درصد کاهش در محتوی پروتئین کل مشاهده شد. داده‏های حاصل از اندازه‏گیری محتوی پروتئین کل برگ در جدا کشت‏های تیمارشده با یون نقره، در غلظت 2 میلی‏گرم بر لیتر نسبت به کنترل 10 درصد افزایش و در غلظت 10 میلی‏گرم بر لیتر نسبت به کنترل تغییر معنی‏داری 05/0p< را نشان نداد. محتوی پروتئین کل برگ در جدا کشت‏های تیمارشده با یون نقره، در غلظت 20 میلی‏گرم بر لیتر نسبت به کنترل 23 درصد کاهش را نشان داد.

نتایح الکتروفورز پروتئین‏های برگ جدا کشت‏های تحت تاثیر تیمار نانو نقره و یون نقره، وجود 5 باند پروتئینی مشخص را نشان داد (شکل 2).

 

 

 

 شکل 2: اثر غلظت‌های مختلف نانو نقره و یون نقره بعد از چهار هفته تیمار، بر الگوی الکتروفورزی پروتئین‌های برگ  (A)و آنالیز میزان بیان نسبی چند باند پروتئینی  (B)در برگ جدا کشت‌های سیب‌زمینی رقم وایت دزیره.

باند پروتئینی 1 با وزن مولکولی 116 کیلودالتون در جدا کشت‏های تحت تاثیر تیمار نانو نقره و یون نقره در غلظت 2 میلی گرم بر لیتر نسبت به کنترل تغییر محسوسی نداشت اما با افزایش غلظت نقره، کاهش بیان قابل ملاحظه ای در این باند پروتئینی به‏ویژه در جدا کشت‏های تیمارشده با نانو نقره مشاهده شد (شکل 2). باند پروتئینی 2 در محدوده 116 و 66 کیلودالتون در جدا کشت‏های تیمار شده با یون نقره در غلظت 2 میلی‏گرم بر لیتر نسبت به کنترل از شدت نسبی بیشتری برخوردار بود، در حالی‏که در جدا کشت‏های تیمار شده با نانو نقره نسبت به کنترل افزایشی در میزان بیان نسبی مشاهده نشد. باند پروتئینی 3 با وزن مولکولی 35 کیلودالتون در جدا کشت‏های تحت تاثیر تیمار نانو نقره و یون نقره در غلظت 2 میلی‏گرم بر لیتر نسبت به کنترل تغییر چندانی از نظر بیان نسبی نداشت اما با افزایش غلظت نقره کاهش یافتند. باند پروتئینی 4 با وزن مولکولی 4/18 کیلودالتون در جدا کشت‏های تحت تاثیر تیمار نانو نقره و یون نقره به‏صورت وابسته به غلظت با افزایش غلظت نقره نسبت به کنترل کاهش بیان محسوسی را نشان دادند. باند پروتئینی 5 در جدا کشت‏های تحت تاثیر یون نقره در غلظت 2 میلی‏گرم بر لیتر نسبت به کنترل افزاش بیان نشان داد در حالی‏که در جدا کشت‏های تیمار شده با نانو نقره در همین غلظت از شدت بیان نسبی کمتری برخوردار بود (شکل 2).

نتایج حاصل از اندازه گیری اکسیداسیون پروتئین‏ها در جدا کشت‏های تیمارشده با نانو نقره، در غلظت 2 میلی‏گرم بر لیتر نسبت به کنترل تغییر معنی داری (05/0p<) را نشان نداد. اما در غلظت‏های 10 و 20 میلی‏گرم بر لیتر نسبت به کنترل، به‏ترتیب 6/29 و 6/69 درصد افزایش مشاهده شد (شکل 3).

 

 شکل 3: اثر غلظت‌های مختلف نانو نقره و یون نقره بعد از چهار هفته تیمار، بر محتوی کربونیل (میانگین سه تکرار±انحراف معیار) در جدا کشت‌های سیب‌زمینی رقم وایت دزیره. حروف غیرمشترک بیانگر وجود اختلاف معنی‌دار بین تیمارها بر اساس آزمون دانکن 05/0p<  است.

نتایج حاصل از اندازه‏گیری اکسیداسیون پروتئین‏ها در جدا کشت‏های تیمارشده با یون نقره، در غلظت‏های 2 و 10 میلی‏گرم نسبت به کنترل تغییرات معنی‏داری (05/0p<) را نشان ندادند. با این وجود، در غلظت 20 میلی‏گرم بر لیتر 45 درصد افزایش مشاهده شد.  نتایج حاصل از اندازه گیری فعالیت آنزیم پروتئاز در جدا کشت‏های تیمارشده با نانو نقره و یون نقره، در غلظت 2 میلی‏گرم بر لیتر نسبت به کنترل تغیر معنی‏داری (05/0p<) را نشان ندادند (شکل 4).

 

شکل 4: اثر غلظت‌های مختلف نانو نقره و یون نقره بعد از چهار هفته تیمار، بر فعالیت پروتئاز (میانگین سه تکرار±انحراف معیار) در جدا کشت‌های سیب‌زمینی رقم وایت دزیره. حروف غیرمشترک بیانگر وجود اختلاف معنی‌دار بین تیمارها بر اساس آزمون دانکن 05/0p<  است.

با این‏حال در جدا کشت‏های تیمارشده با نانو نقره و یون نقره، در غلظت 10 میلی گرم بر لیتر نسبت به کنترل، به‏ترتیب 43 و 42 درصد افزایش در فعالیت این آنزیم مشاهده شد. فعالیت آنزیم پروتئاز در جدا کشت‏های تیمارشده با نانو نقره و یون نقره در غلظت 20 میلی‏گرم بر لیتر به‏ترتیب 36.3 و 3/61 درصد افزایش نشان دادند.

محتوی تیول کل در جدا کشت‏های تیمار شده با نانو نقره و یون نقره در غلظت 2 میلی‏گرم بر لیتر نسبت به کنترل، به‏ترتیب 6/7 و 8 درصد افزایش را نشان دادند (شکل 5).

 

 

شکل 5: اثر غلظت‌های مختلف نانو نقره و یون نقره بعد از چهار هفته تیمار، بر تیول کل (میانگین سه تکرار±انحراف معیار) در جدا کشت‌های سیب‌زمینی رقم وایت دزیره. حروف غیرمشترک بیانگر وجود اختلاف معنی‌دار بین تیمارها بر اساس آزمون دانکن 05/0p<  است.

اما در غلظت‏های 10 و 20 میلی‏گرم در مقایسه با کنترل تفاوت معنی‏داری (05/0p<) مشاهده نشد. محتوی تیول‏های غیر پروتئینی در جدا کشت‏های تیمار شده با نانو نقره و یون نقره، نسبت به کنترل افزایش معنی‏داری (05/0p<) را نشان دادند (شکل 6).

 

 

شکل 6: اثر غلظت‌های مختلف نانو نقره و یون نقره بعد از چهار هفته تیمار، بر تیول غیر پروتئینی (میانگین سه تکرار± انحراف معیار) در جدا کشت‌های سیب‌زمینی رقم وایت دزیره. حروف غیرمشترک بیانگر وجود اختلاف معنی‌دار بین تیمارها بر اساس آزمون دانکن 05/0p< است.

 

به‏طوری‏که مقدار این شاخص در جدا کشت‏های تیمار شده با نانو نقره در غلظت‏های 2، 10 و 20 میلی‏گرم بر لیتر نسبت به کنترل به‏ترتیب، 7/24، 24 و 2/18 درصد افزایش یافت. به‌علاوه، در جدا کشت‏های تیمار شده با یون نقره، مقدار این شاخص نسبت به کنترل، به‏ترتیب 32.2، 29 و 25 درصد افزایش نشان داد. مقدار تیول‏های پروتئینی در جدا کشت‏های تیمار شده با نانو نقره و یون نقره، نسبت به کنترل کاهش قابل ملاحظه‏ای را نشان داد، به‌طوری‏که مقدار تیول‏های پروتئینی در جدا کشت‏های تیمار شده با نانو نقره در غلظت‏های 2، 10 و 20 میلی‏گرم بر لیتر نسبت به کنترل به‏ترتیب، 5/12، 3/21 و 5/28 درصد کاهش یافت (شکل 7).

 

شکل 7: اثر غلظت‌های مختلف نانو نقره و یون نقره بعد از چهار هفته تیمار، بر تیول‏های پروتئینی (میانگین سه تکرار±انحراف معیار) در جدا کشت‌های سیب‌زمینی رقم وایت دزیره. حروف غیرمشترک بیانگر وجود اختلاف معنی‌دار بین تیمارها بر اساس آزمون دانکن 05/0p< است.

همچنین، مقدار این شاخص درجدا کشت‏های تیمار شده با یون نقره در غلظت‏های 2، 10 و 20 میلی‏گرم بر لیتر نسبت به کنترل به‏ترتیب، 7/19، 2/20 و 7/32 درصد کاهش نشان داد. ظرفیت آنتی اکسیدانتی کل در جدا کشت‏های تیمار شده با نانونقره و یون نقره در غلظت‏های 2 و 10 میلی گرم برلیتر، نسبت به کنترل افزایش معنی‏داری (05/0p<) را نشان داد (شکل 8).

 

شکل 8: اثر غلظت‌های مختلف نانو نقره و یون نقره بعد از چهار هفته تیمار، بر توان آنتی‌اکسیدانتی کل (میانگین سه تکرار±انحراف معیار) در جدا کشت‌های سیب‌زمینی رقم وایت دزیره. حروف غیرمشترک بیانگر وجود اختلاف معنی‌دار بین تیمارها بر اساس آزمون دانکن 05/0p< است.

با این‏حال، در جدا کشت‏های تیمار شده با نانو نقره و یون نقره در غلظت 20 میلی‏گرم بر لیتر، نسبت به کنترل، تغییر معنی‏داری (05/0p<) مشاهده نشد. ظرفیت آنتی اکسیدانتی کل در جدا کشت‏های تیمار شده با نانو نقره در غلظت‏های 2 و 10 میلی‏گرم برلیتر، نسبت به کنترل به‏ترتیب 2/39 و 3/11 درصد افزایش نشان داد. درحالی‏که مقدار این شاخص در جدا کشت‏های تیمار شده با یون نقره، نسبت به کنترل به‏ترتیب 3/40 و 6/24 درصد افزایش یافت.

بحث

آسیب اکسیداتیو ناشی از فلزات سنگین از جمله نقره، در گیاهان پیامد‌های مخرب متعددی را به‏دنبال دارد. پروتئین‏ها به‏دلیل فراوانی آن‏ها در سیستم‏های زنده، تحت تاثیر تنش دامنه وسیعی از تغییرات را متحمل می‏شوند. اکسیداسیون پروتئین‏ها و حساسیت آن‏ها به پروتئولیز یکی از این تغییرات و نوعی تنش اکسیداتیو ناشی از فلزات سنگین محسوب می‏شود (22). در این تحقیق، اگرچه، جدا کشت‏های تیمار شده با یون نقره در غلظت 2 میلی‏گرم بر لیتر افزایش معنی‏داری را در محتوی پروتئین کل نشان دادند، ولی محتوی پروتئین کل در جدا کشت‏های تیمار شده با نانونقره و یون نقره در غلظت‏های بالاتر در مقایسه با کنترل کاهش یافت. فلزات سنگین به‏روش‏های مختلفی ستنز و بیان پروتئین‏ها را تحت تاثیر قرار می‏دهند که می‏توان به اتصال فلز به گروه‏های تیولی و سایر گروه‏های عاملی موجود در ساختار پروتئین‏ها، جایگزینی فلز سنگین با سایر عناصر فلزی ضروری در متالوپروتئین‏ها یا آنزیم‏ها و مصرف آمینواسیدها در فرآیند سم زدایی فلزات سنگین اشاره کرد. تغییرات در محتوی پروتئین کل مشاهده شده در این تحقیق با مطالعات قبلی در گیاهان Spinacia oleracea و Aeluropus littoralisمطابقت دارد (23 و 24). علاوه براین تاثیر نقره به‏صورت یون و یا به‏صورت ذرات نانو در غلظت‏های بالا می‏تواند ناشی از اختلال در متابولیسم سلول‏های گیاهی باشد که در نهایت فرآیند رشد را دچار اختلال می‏کند. با توجه به الگوی الکتروفورزی پروتئین‏های برگ در جدا کشت‏های تیمار شده با نانو نقره و یون نقره، در بالاترین غلظت نقره اعمال شده (20 میلی‏گرم بر لیتر) شدت بیان نسبی اکثر باند‏های پروتئینی کاهش یافته است. با این وجود، در جدا کشت‏های تیمارشده با یون نقره در غلظت 2 میلی‏گرم برلیتر در باند پروتئینی 3 و 5 افزایش بیان مشاهده شد. بیان نسبی باند پروتئینی 5 با اندازه تقریبی بین 4/18 و 4/14 کیلودالتون در جدا کشت‏های تیمار شده با نانو نقره در مقایسه با کنترل کاهش یافته در حالی‏که در جدا کشت‏های تیمار شده با یون نقره افزایش قابل ملاحظه ای داشت. چنین روندی در باند پروتئینی 3 با اندازه تقریبی 35 کیلودالتون هم با شدت کمتری مشاهده می‏شود. در مجموع بیان نسبی پروتئین‏ها در تیمارهای نانو نقره و یون نقره روند کم و بیش متفاوتی را نشان می‏دهد که می‏تواند نشان دهنده سطوح متفاوتی از تنش اعمال شده بر گیاه باشد. در توافق با نتایج حاصل از الگوی الکتروفورزی، تغییر بیان پروتئین در گیاه کلزا (Brassica napus L.) تیمار شده با نانو نقره هم قبلا توسط پژوهشگران گزارش شده است (25).

 نتایج حاصل از اندازه‌گیری گروه‌های کربونیل، به‌عنوان یکی از نشانگرهای تنش اکسیداتیو، در جدا کشت‌های تحت تیمار نانو نقره و یون نقره در غلظت بسیار کم، نسبت به کنترل تغییر معنی‌داری را نشان نداد. درحالی‌که در غلظت‌های بالاتر در جدا کشت‌های تحت تیمار نقره افزایش قابل ملاحظه ای در این شاخص مشاهده شد. در بالاترین غلظت نقره اعمال‌شده روی جدا کشت‌ها، محتوی گروه‌های کربونیل در تیمارهای نانو نقره و یون نقره به‏ترتیب 6/69 و 45 درصد افزایش یافت. افزایش بیشتر در اکسیداسیون پروتئین‌ها در جدا کشت‌های تیمارشده با نانو نقره در مقایسه با یون نقره، می‌تواند ناشی از سمیت بیشتر نانو نقره نسبت به یون نقره باشد. نقره در حالت نانو، فاقد بار الکتریکی بوده و در واقع شکل احیا شده نقره هست، بنابراین ممکن است مکانیسم انتقال و میزان آن به‏درون سلول‌های گیاهی نسبت به یون نقره متفاوت باشد. از طرفی نانو نقره پس از ورود به سلول‌ها ممکن است مقدار زیادی از نقره را به‏شکل یونی آزاد نماید که این خود می‌تواند دلیلی بر سمیت بیشتر نانو نقره نسبت به فرم یونی آن باشد. تحقیق صورت گرفته بر روی گیاه multiflorumLoliumقبلانشان داده که نانو نقره سمیت شدیدتری را نسبت به یون نقره در این گیاه القا می‌نماید، بنابراین نتایج حاصل از تحقیق حاضر با این نتایج مطابقت دارد (26).

گیاهان برای مقابله با تنش اکسیداتیو، راه‏کارهای متنوعی را در پیش می‌گیرند که تخریب یا ترمیم پروتئین‌های آسیب‌دیده یکی از آن‌ها محسوب می‌شود. گونه‌های مختلف اکسیژن واکنش‌گر از جمله پراکسید هیدروژن قادرند با پروتئین‌ها واکنش داده و باعث اکسیداسیون پروتئین‌ها شوند. کربنیلی شدن پروتئین‌ها یک واکنش برگشت‌ناپذیر بوده و سیگنالی قوی برای شناسایی و تجزیه پروتئین‌ها توسط پروتئازهای سلولی است (27). فعالیت آنزیم پروتئاز در گیاهان سیب‌زمینی تیمارشده با نیترات نقره نسبت به نانو نقره افزایش نشان داد. بنابراین، جدا کشت‌های تیمارشده با یون نقره نسبت به جدا کشت‌های تیمار شده با نانو نقره، محتوی پروتئین بالاتر، گروه‏های کربونیل کمتر و فعالیت بالاتری از آنزیم پروتئاز را نشان دادند. با توجه به مقدار پایین‌تر گروه‌های کربونیل در جدا کشت‌های تحت تیمار یون نقره و فعالیت بالاتر پروتئاز، می‌توان نتیجه گرفت که جدا کشت‌های تحت تیمار یون نقره توانایی بهتری در حذف پروتئین‌های آسیب‌دیده داشته و این مانع از انباشت پروتئین‌های معیوب و سمیت سلولی شده است. گروه‌های تیولی موجود در ساختار پروتئین‌ها دارای تمایل بالایی به اتصال با یون نقره دارند. بنابراین، جدا کشت‌های تحت تاثیر تیمار نانو نقره یا یون نقره، ممکن است اکسیداسیون گروه‌های تیولی پروتئینی را از خودشان نشان دهند. در این تحقیق محتوی تیول‏های پروتئینی و تیول‏های غیر پروتئینی، نسبت به گروه کنترل به‏ترتیب، کاهش و افزایش معنی‌داری نشان دادند. مقدار تیول‏های پروتئینی در غلظت بالای نانو نقره و یون نقره، نسبت به کنترل، کاهش نشان دادند. کاهش محتوی تیول‏های پروتئینی در گیاهان تحت تیمار با فلزات سنگین نیز توسط پژوهشگران گزارش ‌شده است (28 و 29). از طرف دیگر، مقدار تیول‏های غیر پروتئینی در غلظت بالای نانو نقره و یون نقره، نسبت به کنترل، افزایش یافتند. از آنجایی‌که اکسیداسیون گروه‌های تیولی پروتئینی به‌عنوان سیگنالی جهت فعال شدن مکانیسم‌های حفاظتی عمل کرده تا از اکسیداسیون بیشتر گروه‌های تیولی پروتئینی جلوگیری شود، بنابراین افزایش تیول‏های غیر پروتئینی در تیمار با نقره قابل توجیه است. به‌علاوه، یون نقره نسبت به نانو نقره، ممکن است به‌عنوان القاکننده قوی‌تری برای اکسیداسیون گروه‌های تیولی عمل نموده و کاهش بیشتر محتوی تیول‏های پروتئینی در تیمارهای یون نقره نسبت به نانو نقره ممکن است به‏همین دلیل باشد.

ظرفیت آنتی‌اکسیدانتی کل، یکی از نشانگرهای بیوشیمیایی مهم در ارزیابی مقاومت گیاهان در برابر تنش‌های محیطی از جمله فلزات سنگین محسوب می‌شود. در این تحقیق، ظرفیت آنتی‌اکسیدانتی کل جدا کشت‌های تیمارشده با نانو نقره و یون نقره در غلظت پایین نقره، بیشترین افزایش را در مقایسه با کنترل از خودشان نشان دادند. این در حالی است که مقدار این شاخص در جدا کشت‌های تیمارشده با نانو نقره و یون نقره در غلظت بالای نقره نسبت به کنترل تفاوت معنی‌داری را نشان ندادند. به‏نظر می‌رسد افزایش یا کاهش توان آنتی‌اکسیدانی کل جدا کشت‌های تیمارشده با نانو نقره و یون نقره، بیانگر درجات مختلفی از تنش اکسیداتیو در غلظت‌های مختلف نقره است. با این دیدگاه، از آنجایی‌که در غلظت بالای نانو نقره، بیشترین کاهش در محتوی آنتی‌اکسیدانت کل مشاهده شد، می‌تواند نشان‌دهنده آسیب شدیدتر سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانتی در جدا کشت‌های تیمارشده با نانو نقره در مقایسه با یون نقره در همین غلظت باشد. این نتایج در توافق با مطالعات صورت گرفته بر روی گیاهان Allium cepa و Spirodela punctutaتیمارشده با نانو نقره هست (30 و 31).

نتیجه‌گیری

در این تحقیق، اندازه‌گیری نشانگرهای تنش اکسیداتیو سلولی نظیر محتوی پروتئین کل، محتوی کربونیل، فعالیت پروتئاز، گروه‌های تیولی و توان آنتی‌اکسیدانتی کل در گیاه سیب‌زمینی تحت تیمار با نانو نقره و یون نقره، حاکی از القای آسیب اکسیداتیو شدیدتر در جدا کشت‌های تحت تیمار با نانو نقره است. همچنین، جدا کشت‌های تحت تیمار با یون نقره، فعالیت پروتئازی بالاتری نسبت به تیمار نانو نقره از خودشان نشان دادند که تصور می‌شود جدا کشت‌های تحت تیمار با یون نقره در مقایسه با نانو نقره دارای توانایی بیشتری در حذف پروتئین‌های آسیب‌دیده داشته و این خود مانع از انباشت این پروتئین‌ها در سلول و ایجاد اتصالات متقاطع و تشکیل مجتمع‌های پروتئینی بزرگ و سمی شده است. از طرفی، از نتایج حاصل از این تحقیق، این‌طور استنباط می‌شود که تنش ناشی از نانو نقره باید از طریق مکانیسمی متفاوت از آزادسازی ساده یون نقره در سلول حاصل‌شده باشد؛ بنابراین وجود اثرات ویژه مرتبط با نانو ذرات هم در سمیت نانو نقره در گیاه سیب‌زمینی محتمل است.

تشکر و قدردانی

نویسندگان صمیمانه از معاونت پژوهشی دانشگاه اصفهان، قطب تنش‌های غیر زیستی گیاهی و ستاد توسعه فناوری نانو به‏خاطر حمایت‌های مالی تشکر می‌نمایند.

  1. Khot LR, Sankaran S, Maja JM, Ehsani R, et al. Applications of nanomaterials in agricultural production and crop protection: A review.Crop Prot. 2012; 35: 64-70.
  2. Tolaymat TM, El Badawy AM, Genaidy A, Scheckel KG, et al. An evidence-based environmental perspective of manufactured silver nanoparticle in syntheses and applications: A systematic review and critical appraisal of peer-reviewed scientific papers. Sci. Total Environ. 2010; 408(5): 999-1006
  3. Mustafa G,  Sakata K, Hossain Z, Komatsu S. Proteomic study on the effects of silver nanoparticles on soybean under flooding stress. J. Proteomics. 2015; 122: 100-18.
  4. Bagherzadeh Homaee M, Ehsanpour AA. Physiological and biochemical responses of potato (Solanum tuberosum) to silver nanoparticles and silver nitrate treatments under in vitro conditions. Ind J Plant Physiol. 2015; 20(4): 353-9.
  5. Sharma P, Bhatt D, Zaidi MGH, Saradhi PP, et al. Silver Nanoparticle-Mediated Enhancement in Growth andAntioxidant Status of Brassica juncea. Appl. Biochem. Biotechnol. 2012; 167(8): 2225-33.
  6. Bergeson LL. Nanosilver pesticide products: What does the future hold? Environmental Quality Management. 2010; 19(4): 73-82.
  7. Remédios C, Rosário F, Bastos V. Environmental nanoparticles interactions with plants: morphological, physiological, and genotoxic aspects. J. Bot. 2012; 2012: 1-8.
  8. Vannini C, Domingo G, Onelli E, De Mattia F, et al. Phytotoxic and genotoxic effects of silver nanoparticles exposure on germinating wheat seedlings. J. Plant Physiol. 2014; 171(13): 1142-8.
  9. Patlolla AK, Berry A, May L, Tchounwou PB. Genotoxicity of silver nanoparticles in Vicia faba: a pilot study on the environmental monitoring of nanoparticles. Int. J. Environ. Res. Public Health. 2012; 9(5): 1649-62
  10. Qian H, Peng X, Han X, Ren J, et al. Comparison of the toxicity of silver nanoparticles and silver ions on the growth of terrestrial plant model Arabidopsis thaliana. J. Environ. Sci. 2013; 25(9): 1947-56.
  11. Thiruvengadam M, Gurunathan S, Chung I-M. Physiological, metabolic, and transcriptional effects of biologically-synthesized silver nanoparticles in turnip (Brassica rapa ssp. rapa L). Protoplasma. 2015; 252(4): 1031-46.
  12. Møller IM, Jensen PE, Hansson A. Oxidative Modifications to Cellular Components in Plants. Annu. Rev. Plant Biol. 2007; 58(1): 459-81.
  13. Ghezzi P, Bonetto V. Redox proteomics: Identification of oxidatively modified proteins. Proteomics. 2003; 3(7): 1145-53.
  14. Davies MJ. The oxidative environment and protein damage. Biochim. Biophys. Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 2005; 1703(2): 93-109.
  15. Murashige T, Skoog F. A revised mediumfor rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962; 15(3): 473-97.
  16. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72(1): 248-54.
  17. Chen HY, Cheng H, Bjerknes M. One-Step coomassie brilliant blue R-250 staining of proteins in polyacrylamide gel. Anal. Biochem. 1993; 212(1): 295-6.
  18. Reznick AZ, Packer L.  Oxidative damage to proteins: Spectrophotometric method for carbonyl assay. Methods Enzymol. Academic Press; 1994. 233: 357-63.
  19. Polge C, Jaquinod M, Holzer F, Bourguignon J, et al. Evidence for the Existence in Arabidopsis thaliana of the proteasome proteolytic pathway: activation in response to cadmium. J. Biol. Chem. 2009; 284(51): 35412-24.
  20. de Kok LJ, Kuiper PJC. Effect of short-term dark incubation with sulfate, chloride and selenate on the glutathione content of spinach leaf discs. Physiol. Plant. 1986; 68(3): 477-82.
  21. Benzie IFF, Strain JJ. Ferric reducing/antioxidant power assay: Direct measure of total antioxidant activity of biological fluids and modified version for simultaneous measurement of total antioxidant power and ascorbic acid concentration. Methods Enzymol. Academic Press; 1999. 299: 15-27.
  22. Romero-Puertas MC, Palma JM, Gómez M, Del Río LA, et al. Cadmium causes the oxidative modification of proteins in pea plants. Plant, Cell Environ. 2002; 25(5): 677-86.
  23. Alia N, Sardar K, Said M, Salma K, et al. Toxicity and bioaccumulation of heavy metals in spinach (Spinacia oleracea) grown in a controlled environment. Int. J. Environ. Res. Public Health. 2015; 12(7): 7400.
  24. Rastgoo L, Alemzadeh A. Biochemical responses of Gouan (Aeluropus littoralis) to heavy metals stress. Aust. J. Crop Sci. 2011; 5(4): 375-83.
  25. Yin L, Cheng Y, Espinasse B, Colman BP, et al. More than the Ions: The Effects of Silver Nanoparticles on Lolium multiflorum. Environ. Sci. Technol. 2011; 45(6): 236- 7.
  26. TabatabaeePozveh Z, Razavizadeh R, Rostami F. Changes occurring in canola (Brassica napus L.) in response to silver nanoparticles treatment under in vitro conditions. Ind. J. Fund. Appl Life Sci. 2014; 4(S3): 797-807.
  27. Nyström T. Role of oxidative carbonylation in protein quality control and senescence. The EMBO Journal. 2005; 24(7): 1311-7.
  28. Srivastava S, Dubey RS. Manganese-excess induces oxidative stress, lowers the pool of antioxidants and elevates activities of key antioxidative enzymes in rice seedlings. Plant Growth Regul. 2011; 64(1): 1-16.
  29. Bhoomika K, Pyngrope S, Dubey RS. Effect of aluminum on protein oxidation, non-protein thiols and protease activity in seedlings of rice cultivars differingin aluminum tolerance. J. Plant Physiol. 2014; 171(7): 497-508.
  30. Juárez-Maldonado A, Rosales-Velázquez J, Ortega-Ortiz H, Cabrera-De-la-Fuente M, et al. Accumulation of silver nanoparticles and its effect on the antioxidant capacity in Allium cepa L. phyton. 2013; 82: 91-7.
  31. Thwala M, Musee N, Sikhwivhilu L, Wepener V. The oxidative toxicity of Ag and ZnO nanoparticles towards the aquatic plant Spirodela punctuta and the role of testing media parameters. Environ. Sci.: Processes Impacts. 2013; 15(10): 1830-43.