بررسی پتانسیل آنتی اکسیدانتی کروسین بر روی سلول‏های بنیادی اسپرماتوگونی نوزاد موش کوچک آزمایشگاهی نژاد Balb/C

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد زیست شناسی سلولی تکوینی جانوری، دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد، مشهد، ایران

2 دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد، مرکز تحقیقات بیولوژی کاربردی تکوین جانوری و گروه زیست شناسی، مشهد، ایران

3 دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه سلولی و مولکولی، تهران، ایران

چکیده

هدف: هدف از­ این پژوهش بررسی اثر کروسین به‏عنوان یکی از مواد فعال زیستی زعفران بر­روی سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز موش است. 
مواد و روش‏ها: در­این مطالعه آزمایشگاهی سلول‏های ­بنیادی اسپرماتوگونی موش نوزاد نژاد ­Balb/C در محیط­کشت DMEM/F12 کشت داده شده با غلظت‏های کروسین (40، 20، 10،5، 5/2 میکروگرم بر میلی لیتر) به­مدت 6 و 12 روز تیمار شدند برای شناسایی سلول‏های بنیادی از آزمون آلکالین فسفاتاز، بررسی سمیت از­ تست MTT، تشخیص سلول‏های زنده از آزمون اکریدین اورنج، DAPI و پتانسیل آنتی اکسیدانت از آزمون DCF-DA استفاده شد. آنالیز آماری توسط نرم افزار SPSS، آزمون ANOVA تست دانکن صورت گرفته و 05/0 p<معنی‏دار در نظر گرفته شد.
نتایج: کروسین در غلظت­های زیر ­20 میکروگرم بر میلی­لیتر سمیت چشم‏گیری بر روی سلول‏های بنیادی اسپرم­ساز اعمال نکرد. این در‏حالی است که زیستایی سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز تحت تاثیر دوزهای20 و 40 میکروگرم بر میلی‏لیتر کروسین در روز 6 پس ­از کشت به‏میزان 21 و 24 درصد و در روز 12 به‏میزان 29 و 41 درصد کاهش یافت. هچنین بررسی زنده بودن سلول‏ها توسط میکروسکوپ فلورسانس و بررسی پتانسیل آنتی­اکسیدانتی توسط فلوریمتری اثر محافظتی و آنتی­اکسیدانتی کروسین را در غلظت‏های (5، 10، 5/2 میکروگرم بر میلی‏لیتر) کروسین بعد از 6 روز نشان داد.
نتیجه گیری: کروسین می‏تواند اثر حفاظتی بر­روی سلول‏های بنیادی اسپرم­ساز موشی داشته باشد که از­ طریق حداقل تاثیر بر زیستایی سلول‏ها و کاهش مرگ و میر سلولی اثر خود را ایفا می‏کند.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

 ناباروری یکی از مشکلات مهم در مردان و زنان به‏شمار می‏رود، به گونه‏ای که شواهد بالینی و اپیدمیولوژیک افزایش ناباروری در مردان را تائید نموده‏اند (1). عوامل متعددی همچون میدان‏های مغناطیسی، پرتوهای یونیزان و استعمال دخانیات و برخی داروها منجر به افزایش ناباروری در مردان می‏شوند. از طرفی با توجه به موثر بودن برخی داروهای گیاهی در افزایش میزان باروری مردان، تحقیقات گسترده‏ای برای کشف مواد فعال زیستی که بتوانند بر مشکل ناباروری مردان غلبه کنند، صورت گرفته است (2 و 3). از جنبه دیگر، در بیمارانی که مبتلا به سرطان هستند و تحت روش‏های درمانی شیمی درمانی و پرتو درمانی قرار می گیرند، اسپرم آسیب دیده افزایش یافته که منجر به ناباروری می‏شود، از این‏رو دانشمندان در تلاشند که با غنی سازی سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز راه حلی برای رفع  این مشکل پیدا کنند (4).

لوله‏های اسپرم‏ساز بیضه دارای پتانسیل خود بازسازی و تولید سلول‏های زایای اسپرم هستند، بنابراین این سلول‏ها می‏توانند نقش مهمی در درمان ناباروری داشته باشند (2)‏. جداسازی و کشت سلول‏های بنیادی اسپرماتوگونی می‏تواند نقش مهمی در درمان ناباروری بیماران مبتلا به سرطان بوده و تحت درمان با روش‏های شیمی درمانی و پرتو درمانی هستند ایفا  کند (5). از این‏رو دانشمندان برای جداسازی سلول‏های اسپرماتوگونی و تمایز نیافته بسیار تلاش کرده و برای شناسایی آن‏ها از مارکرهای خاصی استفاده کرده‏اند (6).

حدود هشت درصد از جمعیت کشور ایران دچار مشکل ناباروری بوده و حدود نیمی از مشکلات ناباروری به‏علت نقص در فاکتورهای مردانه می‏باشد (7 و 8). در پیشرفت‏های اخیر طب باروری، مطالعات نشان می‏دهند تولید بالایROS  (گونه‏های فعال اکسیژن) فاکتور مهمی است که باعث اختلال در عملکرد اسپرم شده و یکی از معضلات ناباروری در مردان به‏حساب می‏آید. در مردان نابارور مقدار زیادی از فاکتور ROS  در مایع منی وجود دارد که ممکن است یکی از دلایل ناباروری آن‏ها به‏حساب آید (9 و 10).

اسپرم در شرایط فیزیولوژیک تولید کننده ROS بوده که نقش مهمی در عملکرد اسپرم در طی ظرفیت یابی اسپرم، واکنش آکروزومی و الحاق اووسیت ایفا می‏کند. در طی شرایط استرس، میزان تولید این رادیکال‏ها در مایع منی افزایش یافته که عدم تعادل در تولید این رادیکال‏ها و سیستم آنتی اکسیدانتی موجب فسفریلاسیون کمتر از حد معمول آکسونم، پراکسیداسون لیپید، از دست دادن تحرک و بقا و نهایتا بروز آسیب به سیستم تولیدمثلی می‏شود (11).

سطوح پایین ROS برای برخی عملکردهای سلولی و فعال شدن برخی از مسیرهای سیگنالینگ سلولی ضروری است، اما سطوح بالای این رادیکال‏ها می‏تواند آسیب‏های جدی در عملکرد سلول ایجاد نموده و اثرات مخربی بر تکوین اولیه جنین القا کند. بنابراین به‏کارگیری ترکیبات ضد اکسیداتیو (آنتی اکسیدانت) که از فعالیت مخرب رادیکال‏های آزاد جلوگیری کنند، ضروری به‏نظر می‏رسد (12 و 13). از این‏رو مطالعات بر روی عوامل آنتی اکسیدانتی جدید به‏منظور جلوگیری از آسیب‏های سوخت و ساز سلول اسپرم ممکن است باعث افزایش تحرک و مورفولوژی طبیعی و افزایش ظرفیت لقاح یابی شود (9).

زعفران یک گیاه چند ساله از خانواده زنبقیان و دارای خاصیت ضد سرطانی، ضد التهابی و آنتی اکسیدانتی می‏باشد (13 و 14) که به‏طور گسترده در کشورهای هند، یونان، ایران، اسپانیا، فرانسه و غیره کشت شده و به‏عنوان ضد اسپاسم، سهل الهضم، ضد درد،  ضد نفخ و محرک معدی و داروی غرایز جنسی در طب سنتی و به‏عنوان یک ادویه غذایی استفاده می‏شود (15 و 16). تحقیقات نشان داده اند که زعفران در درمان ناباروری و ناتوانی جنسی نقش موثری دارد (17 و 18). با توجه به کاربرد زعفران به‏عنوان یک طعم دهنده غذایی، اهمیت سلول‏های بنیادی اسپرماتوژنیک در درمان ناباروری، آسیب پذیری بالای این سلول‏ها در برابر ترکیبات مختلف و لزوم شناسایی ترکیبات طبیعی دارای اثر حفاظتی و آنتی اکسیدانتی که کمترین سمیت را بر سلول‏های اسپرماتوژنیک وارد کنند (8). در این پژوهش تجربی آزمایشگاهی، سمیت کروسین به‏عنوان یکی از مواد فعال زیستی موجود در زعفران بر روی سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز موشی مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش‏ها

جداسازی  و کشت سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز: برای این منظور، دو مرحله هضم آنزیمی صورت گرفت. به این‏صورت که موش نر10 روزه بی‏هوش شده، بافت بیضه موش جدا شده و داخل محلول PBS حاوی آنتی بیوتیک شستشو داده شد. سپس به بافت تکه تکه شده، 100 تا 200 میکرو لیتر کلاژناز اضافه شده و 15 دقیقه داخل انکوباتور  CO2قرار داده شد. پس از گذشت 15 دقیقه بیوپسی بافت بیضه از داخل انکوباتور خارج شده، به آن تریپسین اضافه شده و به‏مدت 10 دقیقه داخل انکوباتور قرار گرفت. سوسپانسیون سلولی سانتریفوژ شد، 100 میکرو لیتر محیط 10 درصد  DMEM-F12 اضافه شد و درون پلیت کوت شده با ژلاتین 2/0 درصد کشت داده شد. پس از یک شبانه روز محیط رویی سلول‏ها خارج شده و به سلول‏ها محیط حاوی فاکتور رشد فیبروبلاستی به‏میزان 20 نانوگرم بر میلی لیتر و سرم ده درصد افزوده شد (4).

ارزیابی فعالیت آلکالین فسفاتاز: برای شناسایی سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز، 4 روز بعد از جداسازی و کشت، سلول‏ها به‏مدت 10 دقیقه در معرض فرمالین 10 درصد در دمای 4 درجه سانتی‏گراد قرار داده شدند، پس از آن توسط محلول تریس (9/8 (pH=دو بار شستشو شدند و به آن سوبسترای نفتل فسفات 01/0 و نمک ویوله 06/0 درصد اضافه شد و به‏مدت 30 دقیقه در انکوباتور قرار گرفت. سپس 2 بار با آب شستشو داده شد و در زیر میکروسکوپ معکوس توده‏های سلولی بنیادی اسپرم‏ساز مورد بررسی قرار گرفت (20).

گروه بندی آزمایش‏ها: پس از جداسازی و تایید استخراج سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز، جهت بررسی اثر کروسین بر روی این سلول‏ها، سلول‏ها در گروه‏های کنترل (فاقد تیمار) و گروه‏های تیماری تحت تاثیر غلظت‏های مختلف کروسین (40، 20، 10 ،5، 5/2 میکروگرم بر میلی لیتر) تقسیم بندی می‏شوند.

بررسی سمیت کروسین توسط آزمون MTT : جهت بررسی سمیت کروسین بر روی سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز، این سلول‏ها در محیط کشت DMEM-F12 (شرکت ایده زیست، ایران) حاوی10 در صد FBS و 1 درصد پنی سیلین استرپتومایسین (شرکت Gibco، آمریکا) درون انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد کشت داده شدند و سمیت سلولی کروسین با استفاده از روش  MTT(شرکت Applichem، آلمان) مورد ارزیابی قرار گرفت. برای این‏ منظور سلول‏ها در پلیت 96 خانه کشت داده شدند و با غلظت‏های مختلف کروسین (40، 20، 10، 5، 5/2 میکروگرم بر میلی‏لیتر) به‏مدت 6 و 12 روز تیمار شدند. پس از این مدت سلول‏ها به‏مدت 4 ساعت در معرض رنگ MTT (5 میلی گرم بر میلی‏لیتر) قرار گرفته و DMSO جهت حل کردن کریستال‏های فورمازان به سلول‏ها اضافه شد و جذب در 560 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر (شرکت Epoch، آمریکا) خوانده شد (12).

آزمون اکریدین اورنج/ پروپودیوم ایداید و DAPI: رنگ‏آمیزی اکریدین اورنج/ پروپیدیوم ایداید برای تشخیص سلول‏های زنده و مرده به‏کار می­رود به‏طوری‏که سلول‏های زنده به رنگ سبز، سلول‏های آپوپتوزی و نکروزه به‏ترتیب به رنگ زرد، نارنجی و قرمز قابل تشخیص هستند (21). برای این منظور، 6 روز پس از تیمار سلول‏ها با غلظت‏های مختلف کروسین، به سلول‏های گروه کنترل و تیمار 10 میکرولیتر اکریدین اورنج و10 میکرولیتر پروپودیوم ایداید اضافه شده و زیستایی سلول‏ها در زیر میکروسکوپ فلورسانس مورد بررسی قرار گرفت.

رنگ‏آمیزی DAPI نیز که به‏منظور بررسی مورفولوژی هسته به‏کار می‏رود، 6 روز پس از تیمار، بر روی سلول‏های گروه کنترل و تیمار متانول جهت تثبیت افزوده شده و سپس در معرض رنگ با دوز 50 میکروگرم بر میلی‏لیتر قرارگرفته و در زیر میکروسکوپ فلورسنت مورد بررسی قرارگرفتند.

تعیین ظرفیت آنتی اکسیدانتی کروسین بر سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز: تعداد 500000 سلول در پلیت96خانه کشت وبعدازگذشت 24 ساعت توسط غلظت‏های مختلف کروسین تیمار شدند. بعداز6 روزمحیط رویی سلول‏ها برداشته شده وسلول‏ها درمعرض 50 میکرولیتر2O2H در 37 درجه سانتی‏گراد برای 30 دقیقه انکوبه شدند. سپس به سلول‏های کف پلیتDCFH-DA 5 میکرو مولار اضافه شد، دور پلیت فویل آلومینیومی پیچیده شده و شدت فلورسنس DCFتوسط فلوریمتر مورد بررسی قرار گرفت (22).

آنالیز آماری

آنالیز آماری توسط نرم افزار SPSS، آزمون یک‏طرفهANOVAتست دانکن به‏منظورمقایسه داده‏ها صورت گرفته و در مقایسه گروه‏های تیماری با گروه کنترل سطح 05/0 p<معنیدار در نظر گرفته شد.

 

نتایج

جداسازی سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز:

نتایج آزمون فعالیت آلکالین فسفاتازی نشان داد که سلول‏های بنیادی اسپرماتوژنیک پس از گذشت 4 روز کلونی‏هایی را ایجاد  نمودند که یه رنگ آبی مایل به بنفش از سایر سلول‏ها قابل تشخیص بودند. ظهور رنگ آبی در کلونی‏های سلولی کف پلیت نشان دهنده فعالیتبالای آلکالین فسفاتازی توده‏های سلولی سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز است که از بارزترین مارکرهای سلول بنیادی به‏شمار می‏روند. این در حالی است که سلول‏های سرتولی به‏عنوان کنترل منفی جذب رنگ را نشان ندادند (شکل 1).

 

 

 

شکل1: A: مورفولوژی سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز موش نر 10 روزه 4 روز پس از کشت که بهصورت کلونیهایی قابل مشاهده است (بدون رنگ‏آمیزی). B: ظهور رنگ آبی 4 روز پس از کشت که بیانگر فعالیت آلکالین فسفاتازی سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز موشی است (پس از رنگ‏آمیزی) بزرگنمایی 100×. C: سلول‏های دوکی شکل سرتولی که بهعنوان کنترل منفی استفاده شده و رنگ آلکالین فسفاتاز را جذب نکردند. مشاهده زیر میکروسکوپ معکوس، بزرگنمایی ×400.

 

 

بررسی مورفولوژی سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز در طی دو هفته از کشت این سلول‏ها در محیط DMEM-F12 نشان داد که سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز 3 روز پس از کشت، به‏صورت توده‏هایی اتصال یافته به لایه سلولی زیری (احتمالا سلول‏های سرتولی دوکی شکل)، قابل مشاهده هستند. 4 روز پس از کشت این سلول‏ها قبل از انجام آزمون آلکالین فسفاتاز موروفولوژی این سلول‏ها در زیر میکروسکوپ معکوس مورد بررسی قرار گرفت و کلونی سلول‏های بنیادی اسپرماتوژنیک به‏وضوح مشاهده شد. پس از پاساژ سلولی و کندن سلول‏ها از کف پلیت، تک لایه فیبروبلاستی در کف ظرف مشاهده نشد و در این‏حالت سلول‏های به‏صورت مثلثی کشیده به کف پلیت چسبیده بودند، در حالی‏که سلول‏های بنیادی اسپرماتوژنیک با مورفولوژی دایره‏ای شکل مشاهده شدند. همچنین پس از پاساژ تمایل سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز به ایجاد کلونی به‏خوبی قابل مشاهده بود (شکل 2).

 

 

شکل2: A) سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز 3 روز پس از کشت، به‏صورت توده‏هایی اتصال یافته به لایه سلولی زیری (احتمالا سلول‏های سرتولی دوکی شکل)، قابل مشاهده است. بزرگنمایی ×200، B) کلونی سلول‏های بنیادی اسرماتوژنیک 4 روز پس از کشت که توده‏ها را به‏وضوح نشان می‏دهد بزرگنمایی ×100، C) سلول‏های سرتولی پس از اولین پاساژ به‏صورت مثلثی شکل به کف پلیت چسبیده در حالی‏که سلول‏های بنیادی اسپرماتوژنیک با مورفولوژی دایره ای شکل مشاهده می‏شوند. بزرگنمایی ×400، D) تمایل سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز به ایجاد کلونی پس از پاساژ اول به‏خوبی قابل مشاهده است. مشاهده زیر میکروسکوپمعکوس، بزرگنمایی ×400.

 

آزمون سمیت سلولی

یافته‏های آزمون MTTنشان داد که کروسین در غلظت های زیر 20 میکروگرم بر میلی‏لیتر در روزهای 6 و 12 پس از کشت سمیت چشم‏گیری بر روی سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز نسبت به گروه کنترل (فاقد تیمار) اعمال نکرد. این در حالی است که زیستایی سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز تحت تاثیر دوزهای20 و 40 میکروگرم بر میلی لیتر کروسین در روز 6 پس از کشت به‏میزان 21 و 24 درصد و در روز 12 به میزان 29 و 41 درصد در مقایسه با گروه کنترل کاهش یافت (نمودار1).

 

 

نمودار 1: اثر کروسین بر زیستایی سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز پس از 6 روز (A) تیمار  و 12 روز تیمار  (B) توسط MTT. نتایج نشان داد که دوز های کمتر از  20 میکروگرم بر میلی لیتر  کروسین تاثیری بر زیستایی سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز ندارد. نتایج نشان دهنده این مطلب است که کروسین در غلظت‏های زیر 10 میکروگرم بر میلی‏لیتر ظرف 6 و 12 روز پس از تیمار موجب بقای 80 درصد به بالای سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز می‏شود. نتایج به‏صورت میانگین ± انحراف معیار نشان داده شده است). 05/0 p< *،01/0 p<  **)(نمودار Aشش روز پس از تیمار، نمودارB دوازده روز پس از تیمار) ). 05/0p< *،01/0p<**)

 

 

رنگ‏آمیزی اکریدین اورنج / پروپودیوم ایداید و DAPI: نتایج حاصل از رنگ‏آمیزی افتراقی اکریدین اورنج / پروپیدیوم ایداید نشان داد که در غلظت‏های 20، 10، 5  کروسین، اغلب سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز موشی به رنگ سبز در آمدند که نشان دهنده زنده بودن سلول‏ها و موید عدم سمیت غلظت‏های زیر 20 میکروگرم بر میلی لیتر کروسین بر روی سلول‏های بنیادی اسپرماتوژنیک موشی است، این در حالی است که کروسین در غلظت 40 میکروگرم بر میلی لیتر به سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز نفوذ کرده و موجب کاهش زیستایی این سلول‏ها نسبت به گروه کنترل شده است (شکل 3).

 

 

شکل3: رنگ‏آمیزی اکریدین اورنج/ پروپیدیوم ایداید نشان دهنده عدم نفوذ رنگ پروپودیوم ایداید به  سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز موشی 6 روز پس از تیمار با غلظت‏های مختلف کروسین (0 تا 20 میکروگرم بر میلی‏لیتر) و زیستایی سلول‏ها است درحالی‏که در غلظت 40 کروسین زیستایی سلول‏ها کاهش یافته است .A-E به‏ترتیب نشان دهنده کنترل، غلظت 5 میکروگرم بر میلی لیتر، غلظت 10 میکروگرم بر میلیلیتر، غلظت 20 میکروگرم بر میلی‏لیتر، غلظت 40 میکروگرم بر میلی‏لیتر کروسین. مشاهده زیر میکروسکوپ فلورسانس Olympus، بزرگنمایی ×400.

 

 

رنگ‏آمیزی DAPI نیز نشان داد که سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز تحت تاثیر غلظت‏های پایین کروسین (10، 5، 5/2 میکروگرم بر میلی لیتر) مورفولوژی هسته طبیعی داشتند که بیانگر اثر حفاظتی کروسین در غلظت‏های زیر حد کشنده بر روی سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز موشی است (شکل 4).

 

 

 

شکل4: رنگ‏آمیزی DAPI نشان دهنده عدم تغییر در هسته سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز موشی 6 روز پس از تیمار با غلظت‏های مختلف کروسین (0 تا 20 میکروگرم بر میلی لیتر) و زیستایی سلول‏ها است در حالی‏که در غلظت 40 کروسین مورفولوژی هسته تغییر یافته است. A-E به‏ترتیب کنترل، غلظت 5 میکروگرم بر میلی‏لیتر، غلظت 10 میکروگرم بر میلی‏لیتر، غلظت 20 میکروگرم بر میلی‏لیتر، غلظت 40 میکروگرم بر میلی‏لیتر کروسین. مشاهده زیر میکروسکوپفلورسانس Olympus، بزرگنمایی ×400.

 

پتانسیل آنتی اکسیدانتی کروسین بر سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز

کاهش شدت فلورسنت DCF نشان داد که غلظت‏های افزاینده کروسین از طریق کاهش ROS داخل سلولی در سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز به‏صورت وابسته به دوز دارای پتانسیل آنتی اکسیدانتی است، در این رابطه تمامی غلظت‏های مورد آزمایش کروسین دارای ظرفیت کاهش رادیکال‏های آزاد هستند، به این‏صورت که غلظت‏های 5/2 تا 10 میکروگرم بر میلی‏لیتر با   01/0 p<** و 20 تا 40 میکروگرم بر میلی‏لیتر نیز با 001/0 p<*** معنی‏دار است(نمودار 2).

 

 

نمودار 2: فعالیت  ROSدرون سلولی القا شده توسط آب اکسیژنه پس از تیمار با غلظت‏های مختلف کروسین نشان دهنده پتانسیل آنتی اکسیدانتی این ترکیب است. نتایج به‏صورت میانگین ± انحراف معیار نشان داده شده است.

 (05/0p<*،01/0p< **،001/0p< ***)

 

 

بحث

تحقیقات قبلی نشان داده اند که زعفران و ترکیبات فعال آن دارای پتانسیل تمایزی روی سلول‏های بنیادی هستند. در یکی از پژوهش‏های قبلی یافته‏های ما نشان داد که عصاره آبی زعفران قادر به القای پتانسیل تمایزی اوستئوژنیک روی سلول‏های بنیادی مغز استخوان موش است (23). هم‏چنین گزارشات نشان داده است که کروسین به‏عنوان یکی از ترکیبات فعال زعفران قادر است سلول‏های بنیادی عصبی را به سمت اولیگودندروسیت‏ها تمایز دهد (24). در مورد سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز تا قبل از سال 2009 کشت این سلول‏ها، چه در محیط آزمایشگاه و چه در محیط‏های دیگر در ایران گزارش نشده بود، تا زمانی‏که صدری و همکارانش (25) توانستند سلول‏های بنیادی اسپرماتوگونی را در محیط آزمایشگاه در شرایط in vitro کشت و تکثیر دهند. تحقیقات اثبات کرده اند که عدم باروری مردان با آسیب به تکثیر سلول‏های زاینده مرتبط است، از طرفی نشان داده شده که ترکیبات فعال زیستی همانند عصاره گرده خرما می توانند دارای اثر حفاظتی بر سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز باشد (26).

در این مطالعه به‏دلیل اینکه سلول‏های بنیادی اسپرماتوژنیک در غشای پایه لوله‏های منی ساز قرار دارند و میزان این سلول‏ها در نوزادان موش بیشتر از موش بالغ است بر اساس پروتوکل گوهر بخش و همکاران (4) از موش‏های نر نوزاد 10 روزه استفاده می‏شود. جهت بررسی اثر کروسین بر سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز، اثر غلظت‏های مختلف کروسین به‏عنوان یکی از مواد بیولوژیک زعفران بر زیستایی سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز مورد بررسی قرارگرفت. روش MTT برای تعیین سمیت سلولی عوامل دارویی و شیمیایی مورد استفاده قرار می‏گیرد. نتایج حاصل از آزمون MTT نشان داد که غلظت‏های مختلف کروسین 5/2 تا 20 میکروگرم برمیلی لیتر در ظرف 6 روز و 12 روز سمیت چشم‏گیری بر روی سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز نداشت.

کشت طولانی مدت سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز به‏دلایل مختلف بسیار دشوار می‏باشد. یکی از دلایل این است که سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز در هفته اول دچار آپوپتوزیس می‏شوند و به‏شدت تعداد آن‏ها کاهش می‏یابد. به این‏صورت که پس از یک هفته کشت، سیگنال‏های متفاوتی در درون سلول‏ها فعال شده و اکسیژن به‏عنوان فعال کننده این سیگنال‏های درون سلولی موجب ایجاد استرس اکسیداتیو و از بین بردن سلول‏ها می‏شود. در رابطه با مکانیسم از بین رفتن سلول‏ها، مرگ سلولی آپوپتوزیس از طریق خنثی کردن عمل آنتی اکسیدانت‏ها سلول‏های آسیب دیده را حذف می‏کند، البته بعضی از سلول‏ها همانند سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز به‏دلایل دیگر مثل در معرض قرار گرفتن در برابر عوامل خارجی همانند نور و گرما حساسیت بیشتری به اکسیژن فعال دارند و بیشتر در معرض آپوپتوزیس هستند (29-27). از این‏رو در این پژوهش از دو بازه زمانی 6 روز و 12 روز به منظور بررسی زیستایی سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز تحت تاثیر غلظت‏های مختلف کروسین استفاده شد. از طرفی رنگ‏آمیزی اکریدین اورنج / پروپیدیوم ایداید و DAPI نشان داد که تحت تیمار با غلظت‏های 5/2 تا 10 کروسین سلول‏ها به رنگ سبز و دارای تمامیت هسته بودند که بیان‏گر این مطلب است که کروسین در این غلظت‏ها سمیت خاصی بر روی سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز نداشته و پس از 12 روز حداقل 80 درصد سلول‏ها تحت تاثیر غلظت‏های پایین کروسین زنده بودند. در مورد بقای سلول‏های بنیادی اسپرماتوژنیک، پژوهش‏گران همچنان در حال بررسی ترکیبات مکمل در محیط کشت جهت افزایش زیستایی این سلول‏ها هستند. به‏نحوی که مشخص شده است افزودن فاکتورهای رشد همانند bFGF, GDNF به محیط کشت این سلول‏ها می‏تواند در افزایش زیستایی این سلول‏ها نقش به‏سزایی داشته باشد. بنابراین با غنی کردن محیط کشت با فاکتورهای رشد ممکن است بتوان سمیت پایین کروسین را برطرف نمود (4).

در زمینه ناباروری در تحقیقات اخیر از آنتی اکسیدانت‏های مختلف برای بهبود زیستایی اسپرم و عملکرد آن استفاده شده است. مطالعات نشان داده اند زمانی‏که در شرایط آزمایشگاهی محیط کشت اسپرم حاوی ترکیباتی همچون بتا مرکاپتو اتانول، سیستنین، سیستئامین و آنتوسیانین باشد، ناهنجاری کمتری در آن‏ها مشاهده می‏شود. این امر موجب شده است که گرایش زیادی به استفاده از آنتی اکسیدانت‏های طبیعی موجود در گیاهان دارویی و غذایی به‏وجود آید که می‏تواند در جلوگیری از آسیب‏های جانبی آنتی اکسیدانت‏های مصنوعی مفید واقع شود (17).

در رابطه با ارتباط زعفران و کاهش ناباروری مردان، حیدری و همکارانش (19) با بررسی 52 بیمار غیر سیگاری که کمبود اسپرم در مایع منی آن‏ها مشاهده شده بود پس از طی دوره درمان با زعفران در یک دوره سه ماهه نشان دادند که زعفران باعث افزایش اسپرم در مایع منی بیماران می‏شود. مطالعات نشان داده است که ترکیبات فیتوشیمیایی موجود در زعفران همچون ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی، کروسین، کروستین، پیکروکروسین و سافرانال در فعالیت آنتی اکسیدانتی عصاره زعفران نقش دارند و در شرایط in vivo و  in vitro خاصیت آنتی اکسیدانتی نشان می‏دهند (30).  در مقایسه اثر آنتی اکسیدانتی عصاره زعفران و ترکیبات فعال آن مطالعات نشان داده است که عصاره متانولی زعفران دارای فعالیت آنتی اکسیدانتی بالایی است و نسبت فعالیت آنتی اکسیدانتی کروسین در هضم رادیکال آزاد DPPH 50 درصد و سافرانال 34 درصد عصاره زعفران با غلظت 500 میلی گرم بر لیتر است (31). در این پژوهش نیز با توجه به پتانسیل آنتی اکسیدانتی زعفران و مواد فعال موجود در آن، با توجه به این که گزارش شده است کروسین از طریق سرکوب رادیکال‏های آزاد موجب افزایش کیفیت اسپرم در حیوانات تحت تیمار با سیکلوفسفامید می‏شود (32)، اثر کروسین بر زیستایی سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز مورد بررسی قرار گرفت. در رابطه با ظرفیت آنتی اکسیدانتی کروسین، نتایج این پژوهش نشان داد که کروسین در تمامی غلظت ها پتانسیل بالایی در مهار رادیکال‏های آزاد دارد، اما تنها در غلظت‏های زیر 10 میکروگرم بر میلی لیتر است که کاهش مرگ و میر سلول‏های بنیادی اسپرماتوژنیک مشاهده می‏شود. بنابراین کاهش میزان رادیکال آزاد تحت تاثیر غلظت های مختلف کروسین نشان می‏دهد که پتانسیل آنتی اکسیدانتی در غلظت‏های پایین همراه با کاهش مرگ و میر و افزایش زیستایی سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز ممکن بتواند به‏عنوان یک عامل حفاظتی در تحقیقات بعدی بر روی نقش این ترکیبات در پیشگیری از آسیب عوامل مخرب بر بافت بیضه مد نظر قرار گیرد.

نتیجه گیری

نتایج این پژوهش نشان داد که کروسین می‏تواند در غلظت‏هایی پایین اثر حفاظتی بر روی سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز موشی داشته باشد. اما در غلظت‏های بالاتر (20 و 40 میکروگرم بر میلی لیتر) از طریق کاهش زیستایی سلول‏ها و افزایش مرگ و میر  سلول‏ها موجب القای آسیب به سلول‏های زایای دودمان اسپرماتوژنیک می‏شود. این نتایج  نشان می‏دهد که غلظت‏های غیر سمی کروسین (زیر 10 میکروگرم بر میلی لیتر) ممکن است بتواند مکمل مناسبی برای حفظ بقای سلول‏های بنیادی اسپرم‏ساز موشی در مقابله با عوامل آسیب رسان باشد که می‏تواند در تحقیقات باروری حائز اهمیت باشد. البته برای اثبات این فرضیه، نیاز به پزوهش‏های بیشتر و درک جزئیات مکانیسم این اثر بر سلول‏های بنیادی اسپرماتوژنیک در حضور عوامل آسیب رسان است.

تشکر و قدردانی

از همکاران محترم مرکز تحقیقاتی بیولوژی کاربردی پژوهشکده خوارزمی که در اجرای این پژوهش همکاری داشتند صمیمانه سپاسگزاریم.

  1.  Oyeyipo IP, Raji Y, Bolarinwa AF. Antioxidant profile changes in reproductive tissues of rats treated with nicotine. J Hum Reprod Sci. 2014; 7(1): 41–46.
  2.  Kanatsu-Shinohara M, Miki H, Inoue K, Ogonuki N, et al. Long-term culture of mouse male germline stem cells under serum-or feeder-free conditions. Biol Reprod. 2005; 72(4): 985–991.
  3. Hermann BP, Sukhwani M, Winkler F, Pascarella JN, et al. Spermatogonial stem cell transplantation into rhesus testes regenerates spermatogenesis producing functional sperm. Cell Stem Cell. 2012;11(5): 715-726.
  4. Goharbakhsh L, Mohazzab A, Salehkhou S, Heidari M, et al. Isolation and Culture of Human Spermatogonial Stem Cells Derived from Testis Biopsy. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 2013; 5(1): 54-61.
  5.  Walker WH. Testosterone signaling and the regulation of spermatogenesis. Spermatogenesis. 2011; 1(2): 116–120.
  6. Dym M, Kokkinaki M, He Z. Spermatogonial stem cells: mouse and human comparisons. Birth Defects Res C Embryo Today 2009; 87(1):27-43
  7. Seandel M, James D, Shmelkov SV, Falciatori I, et al. Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors. Nature. 2007;449(7160): 346-350
  8. Golestaneh N, Kokkinaki M, Pant D, Jiang J, et al. Pluripotent stem cells derived from adult human testes. Stem Cells Dev. 2009;18(8): 1115-1126.
  9. Safarnavadeh T, Rastegarpanah M. Antioxidants and infertility treatment, the role of Satureja Khuzestanica: A mini-systematic review. Iran J Reprod Med. 2011; 9(2): 61–70.
  10. Agarwal A, Said TM. Oxidative stress, DNA damage and apoptosis in male infertility: a clinical approach. BJU Int. 2005; 95: 503-507.
  11. Eid Hammadeh M, Filippos A, Faiz Hamad M. Reactive Oxygen Species and Antioxidant in Seminal Plasma and Their Impact on Male Fertility. IJFS  2009; 3(3): 87-110.
  12. Amini E, Nabiuni M, Baharara J, Parivar K, et al. Metastatic Inhibitory and Radical Scavenging Efficacies of Saponins Extracted from the Brittle Star (Ophiocoma erinaceus). Asian Pac J Cancer Prev. 2015; 16(11): 4751-8.
  13. Naskar S. In vitro and in vivo antioxidant potential of hydromethanolic extract of Phoenix dactylifera fruits. J Sci Res. 2010; 2: 144–157.
  14. Gohari AR, Saeidnia S, Kourepaz Mahmoodabadi M. An overview on saffron, phytochemicals, and medicinal properties. Pharmacogn Rev. 2013; 7(13): 61–66.
  15. Rajaei Z, Hadjzadeh MA, Nemati H, Hosseini M, et al. Antihyperglycemic and antioxidant activity of crocin in streptozotocin-induced diabetic rats. J Med Food. 2013; 16(3): 206-210.
  16.  Kanakis CD, Tarantilis PA, Tajmir-Riahi HA, Polissiou MG. Crocetin, dimethylcrocetin, and safranal bind human serum albumin: stability and antioxidative properties. J Agric Food Chem. 2007; 55(3): 970-977.
  17. Srivastava R, Ahmed H, Dharamveer RK, Saraf SA. Crocus sativus L.: A comprehensive review. Pharmacogn Rev. 2010; 4(8): 200–208.
  18.  Samarghandian S, Borji A. Anticarcinogenic effect of saffron (Crocus sativus L.) and its ingredients. Pharmacognosy Res. 2014; 6(2): 99–107.
  19. Heidary M, Reza Nejadi R ,Delfan B, Birjandi M, et al. Effect of Saffron on Semen Parameters of Infertile Men. Urol J. 2008; 5(4): 255-259.
  20.  Huang YH, Chin CC, Ho HN, Chou CK, et al. Pluripotency of mouse spermatogonial stem cells maintained by IGF-1- dependent pathway. FASEB J. 2009; 23(7): 2076-2087.
  21. Namvar F, Sulaiman HS, Mohamad R, Baharara J, et al. Cytotoxic effect of magnetic iron oxide nanoparticles synthesized via seaweed aqueous extract. International Journal of Nanomedicine. 2014; 9(1): 2479-2488.
  22. Mousavi SH, Tayarani-Najaran Z, Asghari M, Sadeghnia HR. Protective effect of Nigella sativa extract and thymoquinone on serum/glucose deprivation-induced PC12 cells death. Cell Mol Neurobiol. 2010; 30(4): 591-598.
  23.  Ramezani T, Baharara J, Saghiri N. The effect of saffron aqueous extract(Crocus sativus L) on osteogenic differentiation of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Journal of Birjand University of Medical Sciences. 2014; 21 (2): 169-178.
  24. Sachamitr P, Hackett S, Fairchild PJ. Induced pluripotent stem cells: challenges and opportunities for cancer immunotherapy. Front Immunol, . 2014, 5:176,1-9.
  25. Sadri-Ardekani H, Mizrak SC, van Daalen SK, Korver CM, et al. Propagation of human spermatogonial stem cells in vitro. JAMA. 2009; 302(19): 2127-2134.
  26. Mahaldashtian M, Makoolati Z, Ghorbanian MT, Naghdi M, et al. In vitro cytotoxicity effects of date palm (Phoenix dactylifera L.) pollen on neonate mouse spermatogonial stem cells. Nat Prod Res. 2015; 29(6): 578-81
  27. Naskar S. In vitro and in vivo antioxidant potential of hydromethanolic extract of Phoenix dactylifera fruits. J Sci Res. 2010; 2(1): 144–157.
  28. Gholami M, Saki G, Hemadi M, Khodadadi A, et al. Melatonin improves spermatogonial stem cells transplantation efficiency in azoospermic mice. Iran J Basic Med Sci. 2014; 17(2): 93–99.
  29. Izadyar F, Wong J, Maki C, Pacchiarotti J, et al. Identification and characterization of repopulating spermatogonial stem cells from the adult human testis. Hum Reprod. 2011; 26(6): 1296-1306.
  30. Rahaiee S, Moini S, Hashemi M, Shojaosadati SA. Evaluation of antioxidant activities of bioactive compounds and various extracts obtained from saffron (Crocus sativus L.): a review. J Food Sci Technol 2015; 52(4): 1881–1888.
  31. Assimopoulou AN, Sinakos Z, Papageorgiou VP. Radical scavenging activity of Crocus sativus L. extract and its bioactive constituents. Phytotherapy Research 2005; 19(11): 997-1000.
  32. Premkumar K, Abraham SK, Santhiya ST, Ramesh A. Protective effects of saffron (Crocus sativus Linn.) on genotoxins-induced oxidative stress in Swiss albino mice. Phytother Res. 2003; 17(6): 614-7.