ﺑﺮرﺳﯽ ﺧﺼﻮﺻﯿﺎت ژﻧﻮﺗﯿﭙﯽ و فنوتیپی ﻫﯿﺒﺮﯾﺪﻫﺎی آﻣﯿﺰش ﻣﺘﻘﺎﺑﻞ ﻣﺎﺑﯿﻦ در ﺷﺮاﯾﻂ آزﻣﺎﯾﺸﮕﺎﻫﯽ urmiana A. و A. sinica

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه ارومیه، دانشکده منابع طبیعی، گروه شیلات، ارومیه، ایران

2 دانشگاه ارومیه، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، ارومیه، ایران

3 دانشجوی کارشناسی ارشد، دانشگاه ارومیه، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، ، ارومیه، ایران

4 کارشناس گروه بیوتکنولوژی، دانشگاه ارومیه، پژوهشکده مطالعات دریاچه ارومیه، ، ارومیه، ایران

چکیده

هدف: با توجه به اهمیت علمی و تجاری شناسایی گونه‌های آرتمیا خصوصا جمعیت‏های هیبرید، برخی ویژگی‌های فنوتیپی و ژنوتیپی هیبریدهای متقابل Artemia sinica و A. urmiana در شرایط آزمایشگاهی مطالعه شدند.
مواد روش‏ها: پرورش دو گونه آرتمیا از زمان تفریخ سیست تا بلوغ در شرایط آزمایشگاهی استاندارد صورت گرفت. سپس به تعداد 64 عدد نر و ماده از هر گونه جدا و در تیوب‏های 50 میلی‏لیتری هیبرید‌گیری متقابل انجام شد. لاروها روزانه جدا و مستقلا پرورش داده شدند. بررسی پروفایل اسیدهای چرب و الگوی برش آنزیمی ناحیه 12S-16S ژنوم mtDNA با آنزیم HpaII و مقایسه نتایج در والدین خالص و هیبریدهای نسل اول صورت گرفت.
نتایج: مقایسه پروفایل اسیدهای چرب تیمارهای هیبرید نسبت به والدین خالص نشان داد که میزان تعدادی از اسیدهای چرب به‏شدت وابسته به منشاء والدینی می‌باشد. در برخی نمونه‌ها نیز الگوی برش آنزیمی مشابهی بین والدین پدری و هیبریدهای نسل اول مشاهده شد که دور از انتظار بود.
نتیجه‌گیری: نتایج نشان داد پروفایل اسیدهای چرب به‏شدت تحت تاثیر منشاء مادری و یا پدری ژن‌های به ارث رسیده هستند. لذا با انتخاب جهت‌دار والدین تولید آرتمیاهایی با ویژگی‌های فنوتیپی خاص امکان پذیر است. مقایسه الگوهای برش آنزیمی شاخص گونه‌ها و مقایسه آن با الگوی برش آنزیمی نسل اول هیبرید نیز نشان داد که احتمالاً ژنوم میتوکندریایی (یا همان میتوکندری) از والد پدری نیز به ارث می‏رسد.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

تنوع زیستی یک شرایط دینامیک است که در هر زمانی در اثر برهم­کنش پدیده­های طبیعی، زیستی و غیرزیستی شکل می‏گیرد. در سال‏های اخیر دخالت و دستکاری انسان در طبیعت مهم‏ترین خطر در تغییر تنوع زیستی محسوب شده است. یکی از روش­های مهم دستکاری انسان در اکوسیستم­ها و به‏دنبال آن تاثیر روی گونه­ها و جوامع زیستی، معرفی گونه­های غیر بومی به زیستگاه­های جدید می‏باشد. این گونه­های مهاجم ممکن است سیر تکاملی گونه‏های بومی را تغییردهند و موجب بی­خانمانی، تولید جمعیت‏های جدید و هیبرید و حتی انقراض گونه‏های بومی شوند (1).

آرتمیا یکی از جنس‏های جانوری متعلق به خانواده آبشش پایان سخت پوست می­باشد که دارای 7 گونه دوجنسی با نام‏های,A. urmiana, A. persimilis, A. tibetiana, A. salina, A. monica ,A. sinica و A. franciscana و ده‏ها جمعیت بکرزا می­باشد. همه گونه­های آرتمیا، غیر از A. urmiana  وA. sinica، جدائی تولیدمثلی داشته و هر کدام از این گونه­های ویژگی‏های فیزیولوژیک، موفولوژیک و مولکولی منحصر به‏فردی دارند (2). همچنین غیر از جمعیت‏های بکرزا که اغلب دارای پلوئیدی می­باشند فقطA. persimilis دارای 44 کروموزوم بوده و بقیه گونه­ها دارای 42 کروموزوم می­باشند (2). بر اساس اختلافات مولکولی موجود تاکنون چندین مارکر اختصاصی مولکولی برای شناسایی هر کدام از این گونه­ها معرفی شده اند که به‏دلیل اهمیت تجاری گونه­های مختلف آرتمیا از ارزش زیادی نیز برخوردارند. بررسی­های اکولوژیک از بین این گونه­ها A. sinica و A. franciscana قدرت سازش پذیری و تهاجمی بیشتری داشته و در کل دنیا پراکنده شده­اند (3). بر اساس این یافته­ها اثبات شده است نه تنها تاثیر تغییر شرایط زیست بر روی صفات ژنتیکی و مورفولوژیکی موجودات انکار ناپذیر است بلکه در صورت ایجاد هیبرید امکان تغییرات ژنتیکی و فنوتیپی محقق می­باشد. در مطالعه­ای که توسط Weigt and Knowlton صورت گرفته است مشخص شد که با تـخمین توالی DNA میتوکندری و تعیین پروفایل پروتئین‏های موجود، مشخص شده است که جمعیت­های میگوهای گاز گیرنده (Alteus) از دو طرف کانال پاناما دارای فواصل ژنتیکی و درجه جدایی در همه گونه­های جفت مشابه است (4). در واقع با بلند شدن تدریجی کانال پاناما و انشقاق تدریجی اقیانوس­ها، جمعیت‏های متفاوت در اعماق مختلف ساکن شده و احتمال جدایی تولید مثلی مابین جمعیت ها برای تولید هیبریدهای جدید افزایش یافته است (4).

با رشد دانش بشری و شناسایی ویژگی­­های منحصر به‏فرد ژنتیکی و فنوتیپی موجودات امکان بررسی سازگاری‏های ثانویه و تداخلات ژنتیکی فراهم شده است. محققین علم ژنتیک توانسته­اند انواع مارکرهای مولکولی برای شناسایی جمعیت­ها و گونه­­های موجوداتی از قبیل آرتمیا را فراهم سازند. در کنار این مارکرها برخی ویژگی‏های منحصر به‏فرد فنوتیپی نیز برای شناسایی جمعیت‏های مختلف موجودات همچون آرتمیا فراهم شده است (5 و 6). لذا این مارکرهای مولکولی و فنوتیپی برای جمعیت‏های هیبرید قابل استفاده نبوده و پیش بینی شده است با تغییر جهت کراس‏ها و والدین تنوع ژنتیکی وفنوتیپی آن‏ها نیز افزایش یابد. بر این اساس هدف از اجرای این تحقیق بنیادی –کاربردی بررسی آزمایشگاهی تغییرات پروفایل اسیدهای چرب و تنوع ژنتیکی ناحیه 12S-16S از ژنوم mtDNA در هیبریدهای مقابل A. urmiana و A. sinica در مقایسه با جمعیت والدین این گونه­ها می­باشد. نظر به اینکه این دوگونه آرتمیا تنها گونه‏هایی هستند که تولید مثل موفق داشته و هیبریدهای حاصل بارو می­باشد لذا این مطالعه به‏منظور بررسی برخی ویژگی‏های فنوتیپی و ژنوتیپی هیبرید­های حاصل می­باشد که راه را برای شناسایی یک جمعیت جدید آرتمیا محقق می‏سازد.

مواد و روش‏ها

سیست­های مورد استفاده در این بررسی از گونه‏های 100 درصد خالص گونه‏های A. urmiana و A. sinica از بانک سیست پژوهشکده مطالعات دریاچه ارومیه تهیه شد. در انتخاب سیست­ها سعی شد از جمعیت‏های شناسنامه دار و کاملا استریل جمعیتی استفاده شود (6). سیست­ها در شرایط آزمایشگاهی استاندارد آزمایشگاهی شامل 2 گرم سیست در یک لیتر از آب با شوری g/l 35، نور Lux3000 - 2000، دمای 1±27 درجه سانتی‏گراد، 1±8=pH و هوادهی کافی هچ شدند (7). ناپلیوس آرتمیا نورگرایی‌ مثبت‌ دارد لذا از این خصوصیت در جداسازی‌ آن‏ها از پوسته‌ سیست‌ها و مواد زاید دیگر استفاده‌ شد. بدین‌ ترتیب‌ که‌ بعد از تفریخ‌ سیست‌ها و خروج‌ لاروها عمل‌ هوادهی‌ از پائین‌ و نوردهی‌ از بالا قطع‌ و ظرف‌ تفریخ‌ در محل تاریک‌ قرار داده شد. به‏کمک‌ شعاع باریک نور قسمت‌ پایین‌ مخروط نوردهی‌ شد تا لاروها ته‌ مخـروط جمع‌ شـدند. سـپـس‌ به‏کـمک‌ پیپت‌ لاروهـــا از تـه‌ ظــرف‌ جمـع آوری‌ و در ظـــرف‌ دیـــــــگری‌ وارد شد (8).

 آرتمیاها به‏مدت 15 روز در شوری 80 گرم بر لیتر پرورش داده شدند. بدین منظور ابتدا آب‌ دریاچه‌ ارومیه‌ فیلتر شد و با افزودن‌ آب‌ شیر یا آب‌ مقطر، رقت‌ به‌ شوری 80 گرم بر لیتر رسانده‌ شد. pH آب‌ نیز اندازه­گیری شد و به‏میزان 1000 میلی‏لیتر داخل ظروف پرورشی مخروطی شکل ریخته شد و داخل آکواریوم‏های با دمای 1±27 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد (چهار تکرار برای هر تیمار). سپس‌ به‏کمک‌ پیپت‌ پاستور، پتری­دیش و شمارشگر، لاروهای‌ تازه‌ تفریخ‌ شده‌ شمارش‌ شد‌ و در هر ظرف‌ ته‌ مخروطی، 500 عدد لارو وارد شد. هر یک‌ از ظروف‌ کشت‌ توسط یک‌ پیپت‌ پلاستیکی‌ و لوله­‌های‌ هوادهی‌ متصل‌ به‌ پمپ‌ مرکزی‌ هوادهی‌ شدند. برای‌ ممانعت‌ از تبخیر آب‌، هر یک‌ از ظروف‌ فوق‌الذکر توسط پتری دیش‏های‌ پلاستیکی که‌ دارای دو سوراخ ‌(یکی‌ برای‌ هوادهی‌ و یکی‌ برای‌ غذادهی‌) بودند پوشانده شد (9). لاروها طی چند ساعت‌ اول‌ بعد از تفریخ‌ از ذخیره کیسه زرده‌ استفاده‌ کرده‌ و تقریبا هیچ ‌غذایی‌ از محیط نمی‌گیرند. لذا عمل‌ غذادهی‌ از 24‌ ساعت بعد از تفریخ‌ آغاز شده و میزان غذا طبق‌ جدول‌ غذادهی‌ Coutteau  و همکاران‌ (10) بر اساس تعداد آرتمیا در هر لیتر محاسبه و روزانه به ظرف افزوده می­شد. غذای‌ مورد استفاده‌ در پرورش‌، ترکیبی از جلبک ‌Dunaliella salina با غلظت‌ Cells/ml106×18 و مخمر غنی شده با اسید چرب بود.

در روز 15 پرورش، برداشت آرتمیاها انجام شد. در این مرحله می­بایستی قبل از مشاهده جفت­گیری و حتی بلوغ نهایی آرتمیاها این کار انجام می­شد. جمعیت­های جدا شده به‏صورت منفرد در داخل فالکون‏های 50 میلی­لیتری که با همان آب شور 80 گرم در لیتر آماده بودند انتقال داده شدند. فالکون تیوب‏ها در داخل انکوباتوری که دمای آن همانند مراحل اول آزمایش بود قرار گرفتند. غذادهی هر آرتمیا توسط اضافه نمودن یک قطره جلبک و یک قطره مخمر تهیه شده توسط پروتکل Coutteau و همکاران‌ (10) صورت گرفت. تعویض آب نمونه­ها به‏منظور ارتقاء آب محیط پرورش و بررسی احتمال تولید لارو (حذف نمونه­های بکرزا) هر 3 روز یکبار انجام شد. 10 روز پس از انتقال آرتمیاها به این فالکون تیوب‏ها و پس از حصول اطمینان از حذف جمعیت‏های بکرزا، در این مرحله والدهای کاملا استریل جهت نسل‏گیری مورد استفاده قرار گرفتند. به تعداد 32 عدد نر و 32ماده از هر گونه آرتمیا جدا شده و به‏صورت متقابل در داخل فالکون‏های 50 میلی‏لیتری جدید قرار گرفتند. به جفت­های آرتمیا اجازه داده شده تا مدت 1 ماه جفت­گیری نموده و روزانه ناپلیوس‏های حاصل از محیط فالکون فیلتر شد. غذا دهی والدین همانند تکنیک ایزوله سازی جمعیت‏های پیشین بکرزا صورت گرفت. لاروهای جدا شده در این مرحله در یک محیط کشت جدید به تفکیک گونه والد (پدر A. sinica و یا پدر A.urmiana) تا زمان بلوغ تحت شرایط استاندارد پرورشی کشت داده شدند. آنالیزهای بعدی بر روی گونه‏های والدین و نسل اول به‏ترتیب ذیل صورت گرفت.

 پروفایل اسیدهای چرب هر جمعیت (والدین A. urmiana، A. sinica و نسل اول با منشاء پدری A.urmiana و نسل اول با منشاء پدری A. sinica) با استفاده از روش گاز کروماتوگرافی و با پروتکل استخراج مستقیم چربی توسط اتر و تولید متیل استر از این اسیدچرب صورت گرفت. نتایج آنالیز اسیدهای چرب بصورت گراف­هایی توسط دستگاه حاصل شد که در نهایت درصد هر اسیدچرب نسبت به کل اسیدهای چرب هر نمونه با مقایسه سطح زیر منحنی استاندارد خارجی محاسبه شد (11).

 پس از پرورش آرتمیاهای تمامی تیمارها (والدین A. urmiana، A. sinica و نسل اول با منشا پدری A.urmiana و نسل اول با منشاء پدری A. sinica) و اطمینان از دو جنسی بودن آن­ها، هر کدام از نمونه­ها بطور منفرد و جداگانه در داخل میکروتیوب­های استریل که قبلا شماره­ گذاری شده بودند قرار داده شدند. از تکنیک کاهش تدریجی دما (که عموما برای فیکس نمودن سخت پوستان استفاده می شود) برای کشتن نمونه­های آرتمیا استفاده شد. میکروتیوب‏های حاوی این زئوپلانکتون در دمای 70- درجه سانتی‏گراد قرار داده شدند تا مرحله بعدی آنالیز که شامل مطالعات مولکولی می­باشد بر روی آنها انجام گیرد.

 جهت استخراج DNA از آرتمیای بالغ از روش Chelex استفاده شد (12). جهت تکثیر ناحیه هدف از آغازگرهای 12S-SP و 16S-SP با ترکیب نوکلئوتیدی شامل پرایمر پیشرو 12S-SP (5’-cta-gga-tta-gat-acc-cta-3’) و آغازگر پیرو 16S-SP (5'-ccg-gtc-tga-act-cag-atc-3') استفاده شد (5). برنامه مورد استفاده در PCR شامل دناتوره شده در دمای 94 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 2 دقیقه، 34 سیکل شامل 94 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 15/1 دقیقه، اتصال در دمای52 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 45 ثانیه، گسترش در دمای 72 درجه سانتی­گراد به‏مدت 2 دقیقه با یک دمای 72 درجه سانتی­گراد نهایی به‏مدت 4 دقیقه.محصول PCR بر روی ژل 2/1 درصد مورد بررسی قرار گرفت. برش آنزیمی نمونه‏هایی که محصول PCR موفقی داشتند براساس پروتکل استاندارد کارخانه سازنده با استفاده از آنزیم HpaII صورت گرفت (6).

آنالیز آماری

بررسی اختلافات آماری مابین میانگین درصد اسیدهای­چرب در تیمارهای مختلف توسط تست DUNCAN از آنالیز آماریone way ANOVA در بسته نرم افزاری SPSS-19 انجام گرفت. اختلافات تاسطح 05/0 مورد بررسی قرار گرفت و اختلافات آماری با حروف لاتین نمایش داده شد. جهت رعایت اخلاق پژوهشی حداقل تعداد مورد قبول آنالیزهای علمی از زئوپلانکتون آرتمیا مورد استفاده قرار گرفت.

 

نتایج

بررسی انجام شده پیرامون پروفایل اسیدهای چرب نمونه­های آرتمیای خالص در مقایسه با نمونه­های هیبرید نشان داد، میزان انواع اسیدهای چرب در نمونه­های تحت مطالعه متغیر می­باشد. این بررسی همچنین نشان دهنده میزان متفاوت اسیدهای چرب در بین تیمارهای هیبرید متقابل می­باشد (05/0p<) (جدول 1). در این مطالعه میزان بسیاری از اسیدهای چرب در تیمارهای هیبرید در میانگین دو آرتمیا والد خاص قرار گرفت. این بررسی نشان داد که میزان دو اسیدچرب EPA و DHA در هر دو جمعیت هیبرید به‏صورت معنی‏داری از تیمارهای والد خالص وضعیت بهتری دارند (05/0p<).

 این بررسی همچنین نتایج جالب دیگری را در خصوص تاثیر والدین در به ارث رسیدن ویژگی برخی از اسیدهای چرب نشان داد. به‏طور مثال در اسیدهای چرب C14:1n5 دیده می­شود که در صورت هیبرید­گیری از آرتمیای مادهA.urmiana با نر A.sinica ویژگی بروز این اسید چرب تمایل بیشتری به A. sinica خواهد داشت در حالی‏که در حالت عکس میزان این اسید چرب بیشتر تابع ویژگی A. urmiana خواهد شد. در خصوص برخی از اسیدهای چرب همانند C20:5n3 نیز مشاهده شد که هیبرید­‏گیری موجب تشدید تولید یک اسید چرب در نسل اول هیبرید شده هست و میزان این اسید چرب از میانگین والدین خالص بالاتر هست.

 

 

جدول1: درصد اسیدهای چرب نسبت به کل اسیدهای چرب در تیمارهای مختلف آرتمیای خالص و هیبرید (Mean±SD).

Saturated

نام عمومی

A. urmiana

A. sicnica

A. u(F) × A. s(M)

A. u(M) × A. s(F)

C14:0

Myristic

1.50±0.24a

1.40±0.24a

1.20±0.24b

1.50±0.24a

C16:0

Palmitic

17.90±1.02a

16.90±1.02a

15.20±1.02a

16.30±1.02a

C18:0

Stearic

9.50±0.28a

9.32±0.28a

9.10±0.28a

8.10±0.28b

C20:0

Arachidic

0.20±0.01

0

0.20±0.01

0

C22:0

Behenic

0.50±0.01a

3.70±0.01b

1.60±0.01c

2.10±0.01d

C24:0

Lignoceric

0.10±0.001

0

0

0

Monounsat.

 

0

0

0

0

C14:1n5

Myristoleic

0

2.80±0.58a

0.90±0.58b

2.40±0.58a

C16:1n7

Palmitoleic

7.80±0.58a

7.30±0.58a

6.30±0.58b

8.00±0.58c

C18:1n9

Oleic

22.90±0.58

25.10±0.58

25.80±0.58

20.20±0.58a

C18:1n7

Vaccenic

8.10±0.58a

9.20±0.58b

9.80±0.58b

8.20±0.58a

C20:1n9

Eicosenoic

0.40±0.58a

0

0.30±0.58a

0.30±0.58a

C24:1n9

Nervonic

0.40±0.58a

1.20±0.58b

0.10±0.58c

0

C22:1n9

Erucic

0

0

0

0

Polyunsat.

 

0

0

0

0

C18:2n6

Linoleic

10.10±0.58a

10.10±0.58a

10.90±0.58a

9.50±0.58a

C18:3n3

α-Linolenic

5.50±0.58a

5.80±0.58a

5.90±0.58a

5.00±0.58a

C20:2n6

Eicosadienoic

0.30±0.17

0

0

0

C20:4n6

Arachidonic

0.80±0.58a

1.00±0.58b

1.50±0.58c

0.70±0.58d

C20:3n3

Eicosatrienoic

0

0

0

0

C20:5n3

Eicosapentaenoic

4.10±0.58a

4.00±0.58a

7.30±0.58b

4.20±0.58a

C22:6n3

Docosahexaenoic

0.80±0.58a

0

1.10±0.58b

1.20±0.58b

اعداد در هر ردیف با حروف لاتین یکسان فاقد اختلاف آماری می­باشند (p>0.05).

 

محصول واکنش PCR با اندازه باند حدود 1500 جفت نوکلئوتید در شکل 1 ارائه شده است. این واکنش منجر به تولید باندهایی با اندازه یکسان در تمامی نمونه‏های خالص و هیبرید هر دو گونه شد.

 

 

 

شکل1: محصول PCR مربوط به قطعه 1500جفت بازی از ژنوم mtDNA در تعدای از نمونه‏های تحت بررسی در ژل 2/1 %. L معرف مارکر 50 جفت باز می­باشد. نمونه‏ها به‏ترتیب شامل: 1): والد خالص A.urmiana، 2): والد خالص A. sinica، 3): هیبرید نسل اول با والد پدری A.urmiana، 4): هیبرید نسل اول با والد مادری A.urmiana، 5): نمونه شاهد A. franciscana می­باشد.

 

 

 الگوی برش آنزیمی ناحیه 12S-16S از ژنوم میتوکندریایی با اندازه 1500 جفت باز توسط آنزیم HpaII در شکل2 آورده شده است. بر اساس الگوی مشاهده شده این برش توانست به‏راحتی گونه­های آرتمیا A. urmiana را از A. sinica با الگوهای معرف خود جداسازی و شناسایی دهد. الگوی برش آنزیمی A. urmiana با 3 قطعه کوچک و A. sinica با قطعه برش یافته بزرگتر در شکل قابل تشخیص می‏باشد. این آزمایش با بیش از 40 نمونه برای هر گونه انجام شده و در تمامی نمونه‏ها الگوی ثابتی برای هر گونه مشاهده شد.

 الگوی مشاهده شده در نمونه 7 احتمالا مربوط به تنوع ژنتیکی درون گونه­ای و یا آلودگی سیست با یک نمونه دیگر آرتمیا می‏باشد. همچنین در شکل 3 الگوی برش آنزیمی هیبرید A. urmiana (F) × A. sinica (M) ایجاد شده توسط آنزیم HpaII ارائه شده است.

 

 

 

شکل2: الگوی برش آنزیمی ناحیه 12S-16S ژنوم mtDNA با آنزیم برش HpaII. نمونه‏ها به‏ترتیب از 1 تا 5 نمونه­های خالص A. urmiana و از 6 الی 10 نمونه های خالص A. sinica میباشند. L معرف مارکر 100 جفت باز می­باشد.

 

 

شکل3: الگوی برش آنزیمی ناحیه 12S-16S ژنوم mtDNA با آنزیم برش HpaII. نمونه‏ها به‏ترتیب از 1 تا 10 نمونه‏های آرتمیای هیبریدA. urmiana(F) × A. sinica(M) می­باشند. L معرف مارکر 100 جفت باز می­باشد.

 

همان گونه که مشاهده می­شود با وجود تست دقیق نمونه­های آرتمیای والد در خصوص خلوص آرتمیاها، برش آنزیمی انجام شده پیرامون نمونه­های هیبرید، نشان دهنده تنوع ژنتیکی در این نمونه­ها بود. نمونه‏های 4 و 5 از این آنالیز با تنوع الگوی برش از دیگر نمونه‏ها متمایز شدند. برش آنزیمی نمونه­ها در دیگر جمعیت‏های هیبرید الگوی متفاوتی را ایجاد ننمود.

بحث

مشخص شده است که تفاوت در ساختار ژنتیکی بین گونه­های مختلف آرتمیا (13) و نیز میان جمعیت‏های درون یک گونه (14)، احتمال تفاوت­های فیزیولوژیکی میان نژادها را افزایش می­دهد (15). در حقیقت وجود برخی پارامترهای فیزیولوژیکی موثر از جمله تغییرات در سطوح پروتئین­های موثر و همچنین اسیدهای چرب می­تواند دلیل تفاوت‏های ایجاد شده در نحوه پاسخ به اثرات شوری باشد. مشخص شده است که تفاوت درساختار ژنتیکی مابین گونه­های مختلف آرتمیا (13) و نیز میان جمعیت­های درون یک گونه (14) احتمال تفاوت‏های فیزیولوژیکی میان نژادها را افزایش می­دهد (15).

 نقش اسیدهای چرب خصوصا DHA (docosahexaenoic acid) و EPA (eicosapentaenoic acid) در رشد و تکامل لارو تمام آبزیان خصوصا ماهیان دریازی پیش از این مورد توجه قرار گرفته بود (16). پیش از این اثبات شده است که مهم‏ترین اسیدهای چرب ضروری برای سخت­پوستان، ماهی‏ها و نرمتنان دریازی و آب شور، اسیدهای چرب غیراشباع بلند زنجیر HUFA (n-3) به‏ویژه ایکوزاپنتانوئیک ­اسید 20:5 (n-3) (EPA) و دکوزاهگزانوئیک­اسید 22:6 (n-3) (DHA) هستند. این ترکیبات ضروری برای تشکیل غشا، تنظیم اسمزی و تنظیم پروستاگلندین‏ها (prostaglandins) مورد نیاز هستند. همچنین به‏نظر می­رسد که آن­ها دارای نقش فعالی در سیتم ایمنی می­باشند (17). درباره منشا دقیق تغییرپذیری در پروفایل اسید چرب آرتمیا شناخت کمی وجود دارد ولی آنچه که اثبات شده است این است که گونه­های مختلف آرتمیا به‏صورت ذاتی پروفایل متفاوتی از اسیدهای چرب را دارا می‏باشند. در گذشته مطالعاتی روی فاکتورهای موثر بر پروفایل اسید چرب سیست‏ها و ناپلی­ها صورت گرفته است (18). به‏ویژه تفاوت‏های ترکیب اسید چرب سیست و ناپلئوس آرتمیا از طریق تفاوت در ترکیب اسید چرب غذای بلعیده شده توسط جمعیت والدی (19)، ژنوتیپ (10) یا انتخاب ماده غذایی تعیین می­شود (18).

 در مقابل فاکتورهای موثر بر ترکیب اسید چرب نمونه­های بالغ به تازگی مورد مطالعه قرار گرفته است. Gozalbo  (20) دریافت که توده زنده آرتمیای بالغ گونه­های مختلف تغذیه شده در آزمایشگاه با جلبک یکسان تفاوت­هایی را در پروفایل اسید چرب نشان می­دهند. نتایج تحقیق حاضر نیز نشان داد که با وجود تغذیه یکسان تفاوت‏های معنی­داری مابین اسیدهای چرب تیمارهای مختلف مشاهده می­شود.

 تفاوت در پروفایل اسید چرب در بین جمعیت‏های دیگری از آبزیان به‏طور مثال گونه­های Anostracan نیز گزارش شده است (21). این قبیل مطالعات تفاوت‏هایی را در مقدار 20:5(n-3) و 22:6(n-3) بین تاکسای زوپلانکتون‏ها همانندDaphnia Spp. و گونه­هایCopepod مختلف در آب‏های شیرین نشان دادند (22). به‏علاوه تفاوت­های ویژه گونه­ای در Copepods گزارش شده است (23). Gozalbo (20) تفاوت­هایی را در ترکیب اسید چرب بین جمعیت‏های پارتنوژنیک و دوجنسی آرتمیا یافت ولی از علت این چنین تغییرپذیری صرف ­نظر کرد.

 نقش برخی از اسیدهای چرب در گونه­هایی از آبزیان مورد تحقیق قرار گرفته و ارتباط منطقی مابین این اسیدهای چرب و سطوح تحمل فیزیولوژیک یافت شد. به‏طور مثال مطالعات نشان داده است که ممکن است سطح (ARA) آراشیدونیک ­اسید در ماهی‏های دریازی برای تحمل استرس، پیگمانتاسیون، رشد و بقا مهم باشد (24). ایکوزانوئیدها گروهی از مولکول­های فعال بیولوژیکی هستند که به‏عنوان هورمون‏های موضعی که شامل پروستاگلندین‏ها، ترومبوکسان‏ها و لوکوترین‏ها می­باشند، شناخته شده­اند (25). مطالعات متعددی ثابت کرده است که پروستاگلندین­ها در کنترل فرآیندهای تنظیم اسمزی و استرس شرکت می­کنند (25).

 به‏عنوان یک نتیجه جالب در این تحقیق مشخص شد که تنوعات ژنتیکی می­تواند در اصل پایه ژنتیکی داشته و از یک نسل به نسل دیگر انتقال یابد. البته بایستی به این مورد اشاره نمود که ویژگی‏های درون گونه­ای و ژنتیکی یکی از مهم‏ترین دلایل تغییر پروفایل اسیدهای چرب در آرتمیا تشخیص داده شده است و نقش تغذیه در بعد دوم قرار دارد. بدین ترتیب می‏توان انتظار داشت مقاومت نسبت به شرایط استرس­زای محیط می­تواند به‏طور کامل در یک نسل مورد ارزیابی قرار گیرد و یا اینکه می­توان انتظار داشت که در اثر ایجاد شرایط استرس­زای محیطی امکان تغییرات ژنتیکی را در این جمعیت انتظار داشت. در این ارتباط به‏طور مثال مطالعات ثابت کرده است که تفاوت اسیدهای چرب بین A. persimilis و A. fanciscana با تغییرپذیری بین گونه­ای ارتباط واضح‏تری دارد در صورتی‏که تغییرپذیری درون گونه­ای کمتر است (26).

پیش از این، محققان موفق به شناسایی گونه­ها و یا تیپ‏های مختلف آرتمیا با استفاده از مارکرهای مولکولی شده بودند. از جمله این مارکرها می­توان به مارکر Na/K ATPase اشاره نمود که به‏وسیله تکنیک RFLP بر روی ناحیه exon-7 از ژنوم مربوطه، قابلیت شناسایی دو تیپ مختلف از آرتمیای دو جنسی را از بکرزا دارد (6). همچنین از مارکرهای بسیار موفق می­توان به ناحیه 12S-16S از ژنوم mtDNA اشاره نمود که به‏وسیله تکنیک RFLP قابلیت شناسایی جمعیت‏های آرتمیا را دارد (5) (شکل 4). البته از تکنیک‏های دیگر مولکولی نیز با موفقیت در شناسایی جمعیت‏ها و گونه‏های مختلف آرتمیا استفاده شده است که در این مطالعات A. urmiana وA. sinica قرابت نیزدیکتری را به هم نشان داده اند (27). بخش اغلب این دسته از تحقیقات در راستای شناسایی جمعیت‏ها و گونه­های جدید آرتمیا و یا تصحیح رده­بندی این موجود صورت گرفته است (28).

در یکی از موفق‏ترین مطالعات تقریبا تمامی گونه­های آرتمیای دو جنسی توسط برش آنزیمی یک قطعه 1500جفت بازی از ناحیه 12S-16S توسط دو آنزیم HpaII و HaeIII با الگوهای بسیار متفاوت حاصله قابل شناسایی می­شود (شکل 4). البته با توجه به قرابت مولکولی نزدیک A. sinica و A. urmiana (5 و6) جداسازی این دو گونه آرتمیا فقط توسط مارکر RFLP و آنزیم HpaII محقق شده و آنزیم برش دیگر نتوانست این دو گونه نزدیک به هم را از هم تشخیص دهد (5 و 6). این تحقیق نه تنها در تائید یافته­های پیشین اهمیت و قابلیت ناحیه  میتوکندریال را در شناسایی جمعیت‏های مختلف آرتمیا نشان داد (29و30) بلکه برای اولین بار نشان داد که آرتمیای هیبرید هر دو الگوی برش آنزیمی مربوط به A. sinica و A. urmiana را نشان می­دهد. با توجه به نتایج مشاهده شده در این تحقیق پیش بینی ­­شد که تنها هیبریدها ویژگی‏های والد مادری خود را در بررسی مولکولی توسط مارکرهای mtDNA نشان می­دهند، در حالی‏که در تعدادی هیبریدهای دیگر متقابل نیز الگوهای برش آنزیمی شبیه والد پدری نیز مشاهده شد.

 

 

 

شکل 4: برش آنزیمی ناحیه 12S-16S توسط دو آنزیم برش HpaII و HaeIII..

 

با این‏حال اصولا ژنوم مربوط به ناحیه 12S-16S از مادر به ارث می­رسد، زیرا میتوکندری در درون سیتوپلاسم به‏راحتی همراه با سلول تخم انتقال یافته ولی تاکنون گزارشی مبنی بر به ارث رسیدن میتوکندری توسط اسپرم وجود نداشته است.

 بر اساس آنچه که در بررسی موفولوژیک اسپرم موجودات مختلف مشاهده می­شود، بخشی از اسپرم در ناحیه ابتدای دم (یقه اسپرم) حاوی تعدادی میتوکندری با اشکال مختلف جهت تولید انرژی حرکتی اسپرم می­باشد که نهایتا این بخش پیش از ورود اسپرم به‏درون تخمک از هسته n کروموزومی جدا می­شود. بر اساس گزارش­های موجود و تحقیقات به‏عمل آمده اشکال مختلفی از اسپرم در سخت پوستان گزارش شده است اما اطلاعات دقیقی در این خصوص در آرتمیا وجود ندارد. بر اساس اشکال مختلف موجود اسپرم در سخت پوستان احتمال به ارث رسیدن میتوکندری از والد پدری غیر محتمل به‏نظر نمی­رسد.

نتیجه‏گیری

با توجه به امکان جفت­گیری و تولید مثل موفق دوگونه A. Sinica و A. urmiana به‏نظر می‏رسد در سال‏های آینده جمعیت‏های هیبرید این دو گونه در نقاط مختلف دنیا گزارش شوند که با استفاده از مارکرهای مولکولی و فنوتیپی مورد استفاده در این تحقیق امکان شناسایی آن‏ها وجود دارد. همچنین به‏نظر می‏رسد بتوان با انتخاب والد پدری یا مادری این هیبریدها، جمعیت‏های ویژه­ای را با مشخصات فنوتیپی خاص تولید نمود.

تشکر و قدر دانی

از مسئولین محترم پژوهشکده مطالعات دریاچه ارومیه برای تامین هزینه­های اجرای این پروژه تحقیقاتی کمال تشکر و قدردانی به‏عمل می­آید.

  1. Mooney HA, Cleland EE. The evolutionary impact of invasive species. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2001; 98(10): 5446–5451.
  2. Gajardo G, Abatzopoulos T.J, Kappas I. Beardmore J.A. Chapter V. Evolution and speciation. In: Abatzopoulos, T.J., Beardmore, J.A., Clegg, J.S., Sorgeloos, P. (eds). Artemia: basic and applied biology. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, the Netherlands; 2002; 225-250.
  3. Kappas I, Abatzopoulos TJ, Van Hoa N, Sorgeloos P, et al. Genetic and reproductive differentiation of Artemia franciscana in a new environment. Marine biology. 2004; 146(1): 103-117.
  4. Weigt LA, Knowlton N. Divergence in proteins, mitochondrial DNA, and reproductive compatibility across the Isthmus. Science. 1993; 260(5114): 1629-1632.
  5. Bossier P, Xiaomei W, Catania F, Dooms F, et al. An RFLP database for authentication of commercial cyst samples of the brine shrimp Artemia spp. (International Study on Artemia LXX). Aquaculture. 2004; 231(1-4): 93-112.
  6. Manaffar R, Zare S, Agh N, Abdolahzadeh N, et al. SNP detection in Na/K ATP-ase gene α1 subunit of bisexual and parthenogenetic Artemia strains by RFLP screening. Molecular Ecology Resources. 2010; 11(1): 211–214.
  7. Amat F.G, Sorgeloos P, Roels O. Jaspers E. (eds), Differentiation in Artemia, strains from Spain. Inpersoone The Brine Shrimp Artemia. Volum Universa Press, Wetteren, Belgium; 1980; 19-39.
  8. Van Stappen G. Artemia: Use of cysts; p. 132- 154 In P. Lavens and P. Sorgeloos (ed.). Manual on the production and use of life food for the aquaculture. FAO Fishery Technical Paper; 1996; No. 361. Rome, FAO.
  9. Boone E, Bass-Beckins LGM. Salt effects on eggs and nauplii of Artemia sauna L. Journal of General Physiology. 1931; 14(6):753-763.
  10. Coutteau P, Sorgeloos P. The use of algal substitutes and the requirement for live algae in the hatchery and nursery rearing of bivalve molluscs: an international survey. J. Shellfish Res. 1992; 11(2): 467-476.
  11. Lepage G, Roy CC. Improved recovery of fatty acid through direct transesterification without prior extraction or purification.J. Lipid Res. 1984; 25(12): 1391-1396.
  12. Estoup A, Tailliez C, Cornuet JM, Solignac M. Size homoplasy and mutational processes of interrupted microsatellites in two bee species, Apis mellifera and Bombus terrestris (Apidae). Molecular Biology and Evolution 1995; 12(6):1074-1084.
  13. Pilla EJS, Beardmore JA. Genetic and morphometric differentiation in Old World bisexual species of Artemia (the brine shrimp). Heredity. 1994; 73(1): 47-56.
  14. Brown RA, Hoops CW. Genotype diversity and selection in asexual brine shrimp (Artemia). Evolution. 1990; 44: 44: 103-1051.
  15. Vanhaecke P, Siddall SE, Sorgeloos P. International study on Artemia XXXII. Combined effects of temperature and salinity on the survival of Artemia of various geographical origin. Journal of experimental marine biology and ecology. 1984; 80: 259-275.
  16. Kraul S, Ako H. Brittain K, Cantrell R, et al. Nutritional factors affecting stress resistance in the larval Coryphaena hippurus. Journal of World Aquaculture Society. 1993; 24: 186-193.
  17. Citarasu T, Venket Ramalingam K, Raja Jeya Sekar R, Micheal Babu M, et al. Influence of the antibacterial herbs, Solanum trilobatum, Andrographis paniculata and Psoralea corylifolia on the survival, growth and bacterial load of Penaeus monodon post larvae. Aqua international. 2003; 11: 583-595.
  18. Ruiz O, Medina GR, Cohen RG, Amat F, et al. Diversity of the fatty acid composition of Artemia spp. cysts from Argentinean populations. Marine Ecology Progress Series. 2007; 335: 155-165.
  19. Lavens P, Léger P, Sorgeloos P. Manipulation of the fatty acid profile in Artemia offspring produced in intensive culture systems. Aquaculture—a biotechnology in progress. 1989; 731-739.
  20. Gozalbo D, Hohmann S. Nonsense suppressors partially revert the decrease of the mRNA level of a nonsense mutant allele in yeast. Current genetics. 1990; 17(1), 77-79.
  21. Mura G. The life history of Chirocephalus kerkyrensis Pesta (Crustacea: Anostraca) in temporary waters of Circeo National Park (Latium, Italy). Hydrobiologia. 1997; 346(1), 11-23.
  22. Farkas T, Nevenzel JC, Benson AA. Lipid labeling with P-32 orthophosphate and C-14 acetate in marine copepod.Lipids. 1970; 8(12): 728–731.
  23. Graeve M, Kattner G, Hagen W. Diet-induced changes in the fatty acid composition of Arctic herbivorous copepods: experimental evidence of trophic markers. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 1994; 182(1): 97-110.
  24. Bell JG, Sargent JR. Arachidonic acid in aquaculture feeds: current status and future opportunities. Aquaculture. 2003; 218(1): 491-499.
  25. Sargent J, McEvoy L, Estevez A. Bell G. et al. Lipid nutrition of marine fish during early development: current status and future directions. Aquaculture. 1999; 179: 217–229.
  26. Ruiz O, Amat F, Saavedra C, Papeschi A, et al. Genetic characterization of Argentinean Artemia species with different fatty acid profiles. Hydrobiologia. 2008; 610(1): 223-234.
  27. Sun Y, Zhong Y, Song W, Zhang R, et al. Detection of genetic relationships among four Artemia species using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD). International Journal of Salt Lake Research. 1999; 8: 139-147.
  28. Ruebhart DRCock IEShaw GR. Brine Shrimp Bioassay: Importance of Correct Taxonomic Identification of Artemia (Anostraca) Species. Environmental Toxicology. 2008; 23(4):555-60.
  29. Maniatsi S, Kappas I, Baxevanis A,  Farmaki Th, et al. Sharp Phylogeographic Breaks and Patterns of Genealogical Concordance in the Brine Shrimp Artemia franciscana. International journal of molecular science; 2009, 10: 5455-5470.
Gajardo G, Crespo J, Triantafyllidis A, Tzika A, et al. Species identification of Chilean Artemia populations based on mitochondrial DNA RFLP analysis. Journal of Biogeography. 2004, 31(4): 547-555.