بررسی رشد و تمایز سلول‏های بنیادی مزانشیمی ژله وارتون به استئوبلاست برروی نانو داربست‏های کامپوزیتی پلی کاپرو لاکتون (pcl)

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی، واحد اردبیل، دانشگاه آزاد اسلامی، اردبیل، ایران

2 دانشگاه محقق اردبیلی، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، اردبیل، ایران

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی زیست سازگاری و تمایز سلول بنیادی مزانشیمی بند ناف انسانی به استئوبلاست بر روی داربست‌های پلی‌کاپرولاکتون تهیه شده با روش الکتروریسندگی بوده که تحت اصلاح سطحی با پلاسمای اکسیژن قرار گرفته است.
مواد و روش‏ها: پس از جداسازی سلول‏های بنیادی مزانشیمی از بند ناف انسانی آنالیز فلوسایتومتری صورت گرفت. زیست سازگاری داربست به‏وسیله سنجش MTT مورد بررسی قرار گرفت. مورفولوژی و نحوة اتصال سلول ها بر سطح داربست به‏وسیلة تصاویر میکروسکوپ الکترونی نگاره مورد مطالعه قرار گرفت. همچنین زیست تخریب پذیری داربست با استفاده از روش کاهش وزن محاسبه شد. در نهایت برای بررسی تمایز سلول‏ها در سطح داربست، از محیط تمایز استئوژنی استفاده شد و تمایز با رنگ آمیزی آلیزارین قرمز و RT-PCR بررسی گردید..
نتایج: نتایج نشان داد که سلول‏ها نه تنها توانایی اتصال و تکثیر مناسب‌تری را روی نانوداربست داشتند، بلکه به لحاظ ریخت‌شناسی نیز از شرایط طبیعی برخوردار بودند. داربست پلی‌کاپرولاکتون از زیست سازگاری بالایی برخوردار است و زیست تخریب پذیری آن تا روز پانزدهم با سرعت بیشتری در مقایسه با 15 روز بعدی انجام گرفت. همچنین نتایج رنگ‌آمیزی آلیزارین قرمز و RT-PCR میزان بالای تمایز سلول بر روی داربست پلی‌کاپرولاکتون را نشان دادند.
نتیجه‏گیری: نتایج به‏دست آمده از این تحقیق پیشنهاد می‌کند که داربست‌های پلی‌کاپرولاکتون، پتانسیل استفاده به‏عنوان یک بیومتریال زیست سازگار را در کاربردهای مهندسی بافت و تمایز استخوان دارا می‌باشند.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

مهندسی بافت یکی از شاخه­های جدید علم بیومواد است که با ایجاد ارتباط بین علوم مهندسی و بیولوژی، باعث ترمیم یک بافت آسیب دیده و یا باز گرداندن عملکرد یک بافت به آن می‏شو‏د (1). در این رویکرد، نخست یک داربست متخلخل و زیست تخریب پذیر ساخته می­شود و سپس سلول‏های بافت مورد نظر روی آن کشت داده می­شود. با کنترل شرایط فیزیولوژیکی در خارج از بدن، بافت اولیه بر روی داربست تشکیل شده و پس از کاشت در داخل بدن، با تشکیل بافت جدید، داربست تخریب می­شود (2و3). از میان سلول‏های بنیادی، سلول‏های بنیادی مزانشیمی حاصل از بند ناف برای برنامه­های سلول درمانی در مقایسه با سایر سلول‏ها بیشتر مورد توجه محققین قرار گرفته­اند. دلیل توجه به این سلول‏ها داشتن فعالیت خود نوزایی و تمایز به انواع سلول‏های عملکردی می‏باشد (4). از جمله پلیمر­هایی که برای ساخت داربست مورد استفاده قرار می‌گیرند می‌توان به پلیمرهای طبیعی (کلاژن، کایتوزان، هیالورونان، نشاسته و غیره) یا مصنوعی  Poly (Lactic-co-Glycoltic) Acid  (PLGA)، poly capro lacton   (PCL)،

, poly lactic acid (PLA) پلی­اوتواسترها، پلی­کربونات­ها، هیدروژل­ها و غیره) اشاره کرد (5). تکنیک­های متعددی به‏منظور ساخت داربست­ها ایجاد شده است. از جمله این تکنیک­ها می­توان به  قالب‏گیری حلال و فروشویی ذره­ها، خشک کردن انجمادی، تکنیک جدایی فازی، اتصال رشته­ای، گاز کف­زا، قالب‏گیری ذوبی، اکتروریسی و تکنولوژی تولید بدون قالب Solid Freeform Fabrication (SFF) اشاره نمود. با توجه به روش‏های مختلفی که در تهیه داربست­ها در مطالعات پیشین انجام شده است، می­توان گفت تکنیک الکتروریسی به‏دلیل فراهم آوری محیط ی سه بعدی و مشابهECM) Extracellular matrix ) در تهیه داربست بیشتر مورد استفاده قرار می­گیرد. پلی­کاپرولاکتون (PCL) پلیمری زیست سازگار و متعلق به خانواده­ی پلی­استرهای آلیفاتیک می­باشد که  تاکنون در آزمایش‏های متعددی به‏عنوان داربست در مهندسی بافت بکار گرفته شده است (6و7).

پلی کاپرولاکتون یک پلیمر نیمه بلوری آب‌گریز (هیدروفوب) با فرمول مولکولی (C6H10O2)n می­باشد. همچنین خصوصیات مکانیکی فوق‌العاده (انعطاف‌‌پذیری مکانیکی)، زیست‌سازگاری خوب، آنتی ژنیسیته پایین، فرآیندپذیری ساده و آسان، نقطه ذوب پایین(Tm=60 °C)  و غیرسمی بودن محصول حاصل از تخریب آن، را داراست. این پلیمر به‏علت داشتن ساختار انعطاف‌پذیر در بهبود الاستیسیته لاستیک‌ها و زیست‌سازگاری و نرخ زیست تخریب‌پذیری پایین در پزشکی، کاربرد دارد. سازمان غذا و داروی آمریکا (FDA) پلی‌کاپرولاکتون (PCL) را به‏عنوان پلی‌استر زیست‌تخریب‌پذیر تایید کرده است (8).

اصلاح سطح با استفاده از پلاسما یکی از روش‏های نوین در جهت بهبود ویژگی‏های سطحی داربست می‏باشد. پلاسمایک گاز بسیار داغ است یونیده است، گازی چنان داغ که برخوردهای شدید گرمایی همه یا بیشتر اتم‏های آن‏را به یون‏های مثبت و الکترون‏ها تفکیک می‏کند. دانشمندان پلاسما را حالت چهارم ماده می‏نامند. در واقع با افزایش انرژی جنبشی در حالت گازی ماده پلاسما شکل می‏گیرد (9). با وجود این که پیوند استخوان اتوژن هم‏چنان به‏عنوان استاندارد طلایی ترمیم برخی ضایعات استخوانی محسوب می­شود، معایب آن مانند محدود بودن، دردناک بودن جراحی، ریسک عفونت، خونریزی، آسیب به اعصاب و از دست دادن فانکشن، موجب شده تا محققان به‏دنبال روشی برای جایگزینی آن باشند (10).

باتوجه به بررسی­های صورت گرفته مشاهده شد که بیشتر تحقیقات، تنها بر روی اثر زیست­سازگاری و یا روش ساخت داربست انجام گرفته است و تاکنون مطالعات محدودی در رابطه با بررسی توان رشد و تمایز سلول‏های بنیادی مختلف بر روی نانوداربست زیست تخریب­پذیر پلی کاپرولاکتون انجام گرفته است که نمی‏توان نتایج آن‏ها را به‏طور قطعی به تمایز سلول‏های بنیادی بند ناف انسانی بر روی نانو داربست پلی کاپرو لاکتون نسبت داد و از طرف دیگر تکنیک تهیه داربست در تمام تحقیقات انجام گرفته یکسان نبوده است. لذا این تحقیق با هدف بررسی رشد وتمایز سلول‏های بنیادی ژله وارتون به استئوبلاست و به‏منظور ارتقای هرچند ناچیز در سطح دانش کشور در این زمینه و همچنین کمک به ارائه راه‏کار موثر و کاربردی در این زمینه بررسی شد.

 

 

مواد و روش‏ها

مطالعه در این تحقیق، از نوع بنیادی (basic research) می‏باشد و ابزارهایی که جهت گردآوری اطلاعات در این تحقیق استفاده شده است عبارتند از: دستگاه فلوسایتومتری، PCR، الکتروفورز، طیف سنجی مادون قرمز (FTIR)، میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM)، دستگاه اسپکتروفوتومتری، میکروسکوپ نوری معکوس می‏باشد‏. تجزیه و تحلیل آماری توسط نرم افزار  EXCELL و ایمیچ چی (ImageJ) انجام شده است و تمام آزمایش­های کشت سلولی به‏صورت حداقل سه تکرار انجام شده است.

کشت و جداسازی اولیه سلول‏های استرومای بند ناف انسان: بدین منظور بند ناف نوزاد سالمی که به‏روش سزارین متولد شده بود، با کسب رضایت از مادر در شرایط استریل به آزمایشگاه منتقل شد و پس از شستشو با الکل 70 درصد به‏مدت 30 ثانیه، تا پایان کشت در داخل بافر نرمال سالین نگه‏داری شد.

پاساژ دادن کشت اولیه و تولید رده سلولی:پس از رسیدن تراکم سلول به 80 درصد درون فلاسک، جهت جلوگیری از توقف رشد سلول‏ها (به‏دلیل کمبود مواد غذایی، فضا و افزایش متابولیت­های سمی) سلول‏ها توسط محلول  Trypsin- EDTAاز کف فلاسک جدا و رده سلولی ایجاد شده به دو یا چند فلاسک، انتقال و مجددا کشت داده شدند.

محاسبه تراکم سلولی با استفاده از رنگ آمیزی تریپان­بلو: بدین منظور مقدار 100 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی با حجم برابری از تریپان­بلو ترکیب و توسط لام هموسایتومتر مورد بررسی قرار داده شد.

تایید استخراج سلول‏های بنیادی: آنالیز فلوسایتومتری بر روی سلول‏های بنیادی مزانشیمی بند ناف، برای نشان دادن بیان مارکرهای CD 105، CD 90 و CD 45 انجام گرفت.

ساخت داربست: برای تهیه داربست مورد استفاده در این مطالعه PCL  در غلظت 13 درصد در حلال حاوی اسید فرمیک و اسید استیک به‏صورت محلول تهیه شد. محلول حاصله به‏وسیله­ی سرنگ 5 میلی­لیتری با سر سرنگی دارای قطر 4/0 میلی­متر با سرعت تزریق ml/h 1/0 با فاصله 150 میلی­متر از ورقه­­ی آلومینیوم تزریق شد.

تعیین خصوصیات داربست: به‏منظور بررسی خصوصیات شیمی سطح داربست تهیه شده، از طیف سنجی مادون قرمز (FTIR) استفاده شد نمونه داربست در گستره­­ی عدد موج cm -1 4000-400 با وضوح cm -14 اندازه­گیری شد. همچنین ویژگی­های مورفولوژی سطح و تراکم نانوفیبرها توسط میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM) مورد بررسی قرار گرفت.

اصلاح سطحی پلاسمایی: برای بهبود ویژگی آبدوستی سطح داربست از اصلاح سطحی داربست با پلاسمای گاز اکسیژن به‏مدت 5 دقیقه با فشار 4/0 میلی­بار و قدرت 10 درصد، بر روی داربست PCL استفاده گردید.

کشت سلول‏های بنیادی مزانشیمی بندناف بر روی داربست­PCL: ابتدا داربست­ها به ابعاد 1×1 سانتی­متر مربع بریده شده و به‏مدت 24 ساعت در اتانول 70 درصد غوطه­ور شدند. پس از خشک شدن داربست­ها در دمای اتاق، دو طرف آن­ها هر کدام به‏مدت یک ساعت با قرار گرفتن تحت اشعه UV استریل شد. سپس داربست­ها درون چاهک­های پلیت 24 خانه قرار داده و به‏دنبال آن با PBS استریل شستشو داده شدند. سلول‏ها با تراکم 105×2 در هر میلی­لیتر با روش چکاندن و به‏مقدار 20 میکرولیتر بر روی هر دو نوع داربست قرار داده شدند.

بررسی زیست سازگاری داربست PCL: در ابتدا باید مشخص شود که داربست­ تهیه شده دارای مشخصه زیست سازگاری برای استفاده در مهندسی بافت باشد بدین‏منظور داربست PCL توسط UV و الکل 70 درصد استریل شد، پس از خشک کردن داربست در شرایط استریل، مقدار 105×2 از سوسپانسیون سلولی به‏روش چکاندن بر روی سطح داربست قرار گرفت. پس از اطمینان از نفوذ سلول‏ها به درون منافذ داربست، تست MTT در روزهای متفاوت کشت انجام شد.

ارزیابی رفتار زیست تخریب­پذیری: بدین منظور، داربست‏های پلی کاپرولاکتون در بافر Phosphate buffered saline ((PBS قرار داده شدند. هر نمونه به‏مدت 30 روز در محلول PBS قرار گرفت. هر 5 روز یک‏بار، نمونه­ها از محلول خارج شده و پس از این که در خلا، کاملا خشک شدند، کاهش وزن آن­ها اندازه­گیری شد.

تمایز سلول‏های بنیادی مزانشیمی بند ناف به استئوبلاست بر روی داربست PCL:جهت بررسی تمایز سلول‏های بنیادی مزانشیمی بندناف به استئوبلاست از سلول‏های پاساژ سوم استفاده شد. ابتدا سلول‏ها بر روی داربست­ها و در پلیت 24 خانه­ای کشت داده شدند، روز بعد محیط کشت چاهک­های حاوی داربست خارج شده و پس از شستشوی داربست-سلول با بافر PBS، محیط تمایزی استئوبلاستی اضافه شد. مدت تیمار 21 روز بود و تعویض محیط هر دو روز یک‏بار انجام شد.

بررسی تمایز  استئوبلاستی سلول‏های بنیادی مزانشیمی بندناف

1-رنگ­آمیزی آلیزارین قرمز

 برای این منظور 21 روز پس از کشت سلول‏ها در محیط تمایز، محیط کشت رویی سلول‏ها برداشته شد و سلول‏ها با PBS شستشو داده شدند، سپس سلول‏ها با فرمالدهید 4 درصد و به‏مدت 20 دقیقه تثبیت و مجددا با PBS شستشو داده شدند. در نهایت رنگ آلیزارین قرمز یک درصد اضافه شده و به‏مدت 8 دقیقه انکوبه شدند.

2- RT-PCR

استخراج RNA و سنتز cDNA: برای استخراج RNA از کیت Rima Zol، (طیف آریا فرایند) استفاده شد. با توجه به پروتکل کیت لیز سلول‏ها انجام شد برای تهیه cDNA بر اساس پروتکل شرکت سیناژن10 میکرولیتر از محلول RNA را در 65 درجه سانتی­گراد به‏مدت 5 تا 10 دقیقه انکوبه و سپس مخلوطی شامل 3 میکرولیتر بافر (3X  PCR)، 2/0 میکرولیتر پرایمراولیگودی تی، 25 میلی­مولار MgCl2، 10 میلی­مولار dNTP و 5/0 میکرولیتر از آنزیم ترانس کریپتاز معکوس به آن اضافه شد. محلول حاصله را 10 دقیقه در 25 درجه سانتی‏گراد قرار داده و سپس به‏مدت یک ساعت در 42 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد و سپس برای توقف واکنش، نمونه را در 70 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 10 دقیقه قرار گرفت.

:RT-PCR این تست برای بررسی بیان mRNAی آلکالین فسفاتاز و استئوکلسین در سلول‏های استئوبلاستی تمایز داده شده صورت گرفت. در این آزمایش cDNA تهیه شده از RNA استخراج شده از سلول‏های استئوبلاستی به‏عنوان نمونه تست و cDNA تهیه شده از RNA استخراج شده از سلول‏های بنیادی مزانشیمی به‏عنوان شاهد مورد آزمایش قرار گرفتند.

نتایج

استخراج سلول‏های بنیادی مزانشیمی

دو هفته پس از قرار دادن قطعات ژله وارتون در محیط کشت، سلول‏ها به‏تدریج از کناره­های این قطعات شروع به جوانه زنی و رشد نمودند. یک هفته بعد از جوانه زنی و رشد سلول‏ها کف پلیت­ها پوشیده از سلول شد. (شکل 1).

 

 

شکل1: سلول‏های بنیادی حاصل از بندناف انسانی A) رده سلولی سلول‏های بنیادی مزانشیمی بندناف انسانی، B) جوانه زنی سلول‏ها از بافت ژله وارتون سلول‏های بندناف انسانی با بزرگنمایی x 10

 

 

تایید استخراج سلول‏های بنیادی مزانشیمی از ماتریکس بند ناف

نتایج حاصل از فلوسایتومتری نشان دهنده بیان نشان‏گرهای مزانشیمی ماتریکس بندناف بود. نتایج نشان داد شاخص­های بنیادینگی CD 90 و CD 105 به‏ترتیب دارای بیان 95 درصد و 93 درصد بودند درحالی‏که شاخص غیربنیادینگی CD 45 دارای بیان کمتر از 3 درصد بود (شکل 2).

 

 

 

شکل 2: بیان نشان‏گرهای سلول بنیادی مزانشیمی ماتریکس بندناف A) بیان CD 45، B)بیان CD 90، C)بیان CD 105.

 

 

بررسی خصوصیات نانوالیاف الکتروریسی شده پلی­کاپرولاکتون (PCL)

تصاویر میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM) و توزیع قطری نانوالیاف پلی‌کاپرولاکتون در شکل‌ 3 نشان داده شده است. همچنین به‏طور واضح ملاحظه می‌شود که نانوالیاف بدون عیوب ساختاری (بید) با قطر متوسط 92، 99 و 102 نانومتر تولید شده است.

 

 

 

شکل3: تصاویر میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM) و توزیع قطری نانوالیاف پلی‌کاپرولاکتون (PCL).

 

 

نتایج  طیف سنجی مادون قرمز (FTIR) نانوالیاف پلی‌کاپرولاکتون (PCL) در شکل 4 نشان داده شده است.

پیک ظاهر شده شامل  cm-1 2937 (کشش متقارن CH2)،  cm-12865(کشش نامتقارن CH2)، cm-1 1729 (کشش کربونیل)، cm-1 1294 (کشش باند‌های C–O و C–C)، cm-1 1241 (کشش متقارن C-O-C) است.

 

 

 

 

شکل 4: طیف طیف سنجی مادون قرمز (FTIR) نانوالیاف پلی‌کاپرولاکتون (PCL).

 

 

توزیع اندازه منافذ داربست PCL

شکل‏های 5 و 6 به‏ترتیب تصاویر SEM، گرافیکی SEM و نمودار ستونی چگونگی توزیع منافذ در سطح داربست PCL را نشان می­دهد که نتایج خلاصه شده آن در جدول 1 آورده شده است.

 

 

 

شکل 5: تصویر گرافیکی چگونگی توزیع منافذ در سطح داربست PCL، A)تصویر میکروسکوپ الکترونی نگاره از داربست PCL، B) تصویر گرافیکی توزیع منافذ پس از تعیین تعداد و مساحت منافذ توسط نرم افزارImageJ

 

 

شکل 6: نمودار ستونی تعداد و توزیع مساحت منافذ در سطح داربست PCL

 

 

نتایج حاصل از تجریه و تحلیل نرم افزار ایمیچ چی نشان داد به‏طور متوسط 39 درصد سطح داربست  PCLحاصل از الکتروریسی را منافذ تشکیل می­دهد. همچنین این نتایج نشان داد که میانگین مساحت این منافذ 25559 نانومتر مربع می‏باشد (جدول 1).

 

 

جدول 1: تعداد، مساحت و درصد منافذ موجود در سطح داربست

تعداد منافذ

مساحت اندازه‏گیری شده

مجموع مساحت کل منافذ

میانگین مساحت منافذ

درصد منافذ

1116

nm2 72431064

 nm228524523

nm2 25559

39%

 

 

کشت سلول بر روی داربست

مورفولوژی و نحوه­­ی اتصال سلول‏ها بر روی سطح داربست­ها به‏وسیله­ی تصاویر حاصل از میکروسکوپ الکترونی مورد مطالعه قرار گرفت. تصاویر نشان دهنده­ی اتصال موفق سلول‏ها بر روی داربست است (شکل 7).

 

 

 

شکل 7: تصویر SEM اتصال سلول‏های بنیادی بر روی داربست PCL

 

 

زیست سازگاری داربست PCL

نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی زیست سازگاری داربست PCL نشان داد در تمامی تیمارها سلول‏های کشت شده بر روی داربست PCL  در مقایسه با گروه کنترل رشد بیشتری داشته‏اند. که با توجه به این نتایج می­توان چنین بیان داشت سلول‏ها رشد یافته بر روی داربست PCL  در مقایسه با گروه کنترل از شرایط رشدی بهتری برخوردار بوده­اند (شکل8)

 

 

 

شکل 8:  نمودار زیست سازگاری داربست PCL در تیمار 1، 3 و 7 روزه

 

 

ارزیابی رفتار زیست تخریب­پذیری: نتایج حاصل از تست کاهش وزن نشان داد روند کاهش وزن داربست تا روز 15 با شدت زیادی صورت گرفت اما پس از روز 15 این روند با سرعت بسیار پایینی صورت گرفت (شکل 9).

 

 

 

شکل 9: نمودار ستونی کاهش وزن داربست

 

 

بررسی تمایز استئوبلاستی سلول‏های بنیادی مزانشیمی بندناف

رنگ آمیزی آلیزارین قرمز

مشاهده رسوب توده­های کلسیمی، تاییدی بر تمایز استئوبلاستی سلول‏های بنیادی حاصل از بندناف بود. در رنگ­­آمیزی سلول‏های بنیاد شاهد که فاقد محیط تمایزی بودند، سلول‏ها هیچ رنگی به‏خود نگرفتند (شکل 10).

 

 

 

شکل 10: تمایز سلول‏های بنیادی حاصل از بندناف به سلول‏های استئوبلاستی A)سلول‏های بنیادی شاهد (بدون محیط تمایز) پس از رنگ­آمیزی آلیزارین قرمز B) سلول‏های بنیادی حاصل از بندناف رنگ آمیزی شده با آلیزارین قرمز، 20 روز پس از قرار گرفتن در معرض محیط تمایز C) رنگ‏آمیزی سلول‏های شاهد و تمایز یافته کشت شده بر روی داربست PCL

         

 

نتایج RT-PCR

برای تایید تمایز سلول‏های استئوبلاستی علاوه بر رنگ آمیزی آلیزارین رد، از مارکرهای ترانس کریپتوم نیز استفاده شد. نتایج حاصل از RT-PCR هر دو مارکر در زیر آورده شده است. نتایج نشان می‏دهد این شاخص­ها در سلول‏های استوبلاستی بیان شده اما در سلول‏های بنیادی حاصل از بندناف بیان نگردید که تایید‏کننده تمایز سلول‏های استئوبلاستی می­باشد (شکل 11).

 

 

 

 

شکل11: A) نتیجه RT-PCR مارکر آلکالین فسفاتاز، چاهک اول لدر bp 100، چاهک دوم RT-PCR از RNA به‏دست آمده از سلول‏های بندناف انسانی بدون اعمال تیمار تمایز، چاهک سوم PCR-RT از RNA به‏دست آمده از سلول‏های تمایز یافته به سلول‏های استخوان؛ B) نتیجه RT-PCR مارکر استئوکلسین، چاهک اول لدر bp 100، چاهک دوم RT-PCR از RNA به‏دست آمده از سلول‏های بندناف انسانی بدون اعمال تیمار تمایز، چاهک سوم PCR-RT از RNA به‏دست آمده از سلول‏های تمایز یافته به سلول‏های استخوان

 

 

بحث

مهم‏ترین گام در مهندسی بافت، انتخاب بیومواد مناسب برای ساخت داربست است. داربست مطلوب الگویی برای بازسازی بافت است و نقش کلیدی در شکل‏گیری ساختار نهایی بافت مهندسی شده و عملکرد نهایی آن بر عهده دارد. بیومواد مورد استفاده در داربست باید از چسبندگی، رشد و تکثیر سلولی هم در شرایط in vivo و هم در in vitro حمایت به‏عمل آورند. آن‏ها باید چندین ویژگی ضروری نظیر زیست سازگاری، زیست تخریب­پذیری و فعالیت زیستی را داشته باشند (10).

استخوان یک بافت پیوندی می‏باشد که به‏همراه غضروف اسکلت بدن را تشکیل می‏دهد. این بافت از سلول‏های استئوبلاستی و ماتریکس استخوانی تشکیل شده است. بر خلاف سایر بافت­های پیوندی ماتریکس استخوانی دارای این توانایی منحصر به‏فرد است که می­تواند کلسیفیه شود. برای ترمیم ضایعات و نقایص استخوانی می­توان از امکانات مهندسی بافت بهره برد. در این ارتباط، می­توان از پیوند بافت استخوان اتولوگ استفاده کرد یا با طراحی داربست مناسب و گذاشتن سلول‏های دارای پتانسیل تولید استخوان بر روی آن­ها و پیوند در محل ضایعه، آن را ترمیم نمود. با توجه به محدودیت بافت استخوانی اتولوگ و لزوم عمل جراحی و ایجاد ضایعه در ناحیه دیگری برای تهیه این بافت، استفاده از داربست­های سلولی برای ترمیم ضایعات استخوانی مورد توجه ویژه­ای قرار گرفته است (11). مهندسی بافت بر توسعه جانشین­های زیستی برای ترمیم، نگه‏داری و بهبود بافت و عملکرد عضو تمرکز یافته است. رفتار سلولی در نتیجه­ی پاسخ ترکیبی از پیام رسانی متعددی بوده که در اثر برهم‏کنش سلول‏های مجاور با یکدیگر، با مولکول­های محلول و با ماتریکس خارج سلولی اتفاق می­افتد. داربست در مهندسی بافت در واقع باید تقلیدی از ماتریکس خارج سلولی طبیعی موجود در بدن باشد. یکی از ویژگی­های شاخص و مهم در ماتریکس خارج سلولی فراهم آوری شرایطی مناسب جهت تبادل و تعامل سلول‏ها با یکدیگر و با محیط اطرافشان می­باشد که ویژگی­های آبدوستی نانوتوپوگرافی مناسب می­تواند در تحقیق این راستا مفید واقع شود. وجود ویژگی نانوتوپوگرافی تاثیر به‏سزایی در القای مسیرهای دخیل در پیام رسانی در شکل‏گیری فنوتیپ و سرنوشت سلول دارد (12).

جهت تامین نانوتوپوگرافی برای تسهیل و تعدیل تبادلات سلول با محیط اطراف مناسب است که داربست­ها در مقیاس نانو تهیه شوند که تولید این داربست­ها در سال­های اخیر مورد توجه محققین قرار گرفته است. از روش­های متفاوتی جهت تهیه نانوالیاف استفاده می­شود که پرکاربردترین این روش‏ها شامل روش الکتروریسندگی، خود سامانی و جدایی فازی است (13). در مهندسی بافت از مواد طبیعی و مصنوعی متفاوتی برای تولید داربست استفاده می­شود. پلیمرهای مصنوعی ویژگی‏های برتری از لحاظ مکانیکی نسبت به پلیمرهای طبیعی دارند و به آسانی دارای قابلیت پردازش می­باشند (14). در این مطالعه پلیمر پلی‏کاپرولاکتون به عنوان ماده سازنده داربست برای تولید نانوالیاف به‏روش الکتروریسندگی انتخاب شد.

پلی کاپرولاکتون یک پلیمر نیمه بلوری آب‌گریز (هیدروفوب) با فرمول مولکولی (C6H10O2)n می­باشد. همچنین خصوصیات مکانیکی فوق‌العاده (انعطاف‌‌پذیری مکانیکی)، زیست‌سازگاری خوب، آنتی ژنیسیته پایین، فرآیندپذیری ساده و آسان، نقطه ذوب پایین(Tm=60 °C)  و غیرسمی بودن محصول حاصل از تخریب آن، را داراست. این پلیمر به‏علت داشتن ساختار انعطاف‌پذیر در بهبود الاستیسیته لاستیک‌ها و زیست‌سازگاری و نرخ زیست تخریب‌پذیری پایین در پزشکی، کاربرد دارد. سازمان غذا و داروی آمریکا (FDA) پلی‌کاپرولاکتون (PCL) را به‏عنوان پلی‌استر زیست‌تخریب‌پذیر تایید کرده است (8).

از میان نانوالیاف الکتروریسی شده زیست‌سازگار، نانوالیاف پلی‌کاپرو‌لاکتون می‌تواند خصوصیاتی را که مورد علاقه برای کاربردهای پزشکی است، فراهم کند. همچنین در تحقیقات گذشته نشان داده شده است که نانوالیاف پلی‌کاپرولاکتون قادر است گستره وسیعی از انواع سلول‏ها را حمایت کند که از این جمله می­توان به نتایج پارک و همکاران  (15) اشاره کرد. آن‏ها از داربست­های PEG/PCL با درصد متفاوت PEG (پلی اتیلن گلیکون) به PCL جهت تمایز سلول‏های غضروفی استفاده کردند. نتایج حاصل از تحقیق آن‏ها نشان داد داربست‏های دارای نسبت بالای PEG دارای تعاملات مناسب­تری با سلول‏های غضروف می­باشند. در حالی‏که داربست­های با نسبت کم PEG تمایز غضروفی پایین­تری را نشان دادند. همچنین نتایج RT-PCR برای سلول‏های غضروفی حاصل نشان داد که نسبت 14 PEG به 6 PCL دارای بیان ژن بالایی در ژن COMP
( cartilage oligomeric matrix protein ) می­باشد.

یکی از معایب استفاده از پلیمر PCL در مهندسی بافت آبگریز بودن و در نتیجه اتصال نامناسب سلول به سطح داربست­های حاصل از این پلیمر می­باشد. به‏منظور تعدیل ویژگی نامطلوب آبگریزی این پلیمر گروه های اکسیژنی بر روی سطح داربست اصلاح شده با پلاسما اضافه گردید. اصلاح داربست توسط پلاسما  سبب بهبود ویژگی آبدوستی، اتصال سلولی و درنتیجه رشد و تکثیر سلول‏ها بر روی داربست پلی­کاپرولاکتون می­‏شود که در مطالعات متعددی نیز این مورد به اثبات رسیده است (16). به‏عنوان مثال یلدیریم و همکاران (16)، به منظور بررسی و مقایسه رفتار سلولی و تعیین بهترین مورد برای اصلاح سطحی داربست پلی­کاپرولاکتون از پلاسمای اکسیژن و پروتئین فیبرونکتین به‏طور جداگانه بر روی داربست­های پلی­کاپرولاکتون و داربستی که تلفیقی از پلاسما-پروتیئن بود استفاده نمودند. نتایج به‏دست آمده نشان ­داد که با اعمال پلاسما ویژگی آبدوستی به‏طور معنی­داری بهبود یافته است. اتصال سلولی بر روی داربست اصلاح شده با پلاسما تقریبا دو برابر داربست اصلاح نشده بود. اما نکته قابل ذکر این است که داربست اصلاح شده با پلاسما بعد از داربست تلفیقی پلاسما-پروتئین دارای بیشترین نرخ رشد و تکثیر سلولی بودند.

بسترهایی که تحت عنوان داربست در مهندسی بافت استفاده می­شوند باید توانایی واکنش با سلول‏ها در ابعاد سه بعدی و یا تسهیل‏گر ارتباط سه بعدی سلول‏ها با یکدیگر و محیط اطراف‏شان را داشته باشند. پس می­توان گفت که فراهم آوری این مشخصه توسط نانوالیاف برای سلول‏ها فاکتور تعیین‏کننده برای موفقیت یا شکست داربست می­باشد. نتایج به‏دست آمده از تست MTT و زیست سازگاری در این مطالعه به خوبی تایید‏کننده­ی این مهم می­باشد. بعد از انتقال سلول‏ها برروی داربست چسبندگی اولین واقعه­ای است که رخ می­دهد البته در کنار آن تعیین زیست سازگاری داربست تهیه شده نیز از اهمیت ویژه­ای برخوردار است (17). بدین منظور پس از گذشت 24 ساعت از انتقال سلول‏های بنیادی حاصل از بندناف انسانی بر روی داربست استریل شده با استفاده از اشعه­­ی UV زیست سازگاری و عدم سمیت داربست برای سلول‏های مورد بررسی قرار گرفت.

کاکریرمن و همکارن (18) نشان داده اند که فیبروبلاست­های کشت داده شده به‏صورت سه بعدی در مقایسه با کشت­های دوبعدی سریع تر تکثیر می­شوند. به‏نظر می‏رسد این تفاوت­ها به‏علت نزدیکی فضای سلول در کشت سه بعدی (کشت بر روی داربست) نسبت به محیط موجود زنده باشد. نتایج تست زنده‏مانی در این تحقیق نشان داد سلول‏هایی که بر روی داربست رشد کرده­اند در مقایسه با سلول‏های شاهد جذب بیشتری را نشان داده­اند شاید دلیل این امر را بتوان به این نسبت داد که رشد و تکثیر سلول‏های بنیادی بر روی داربست از سرعت بیشتری برخوردار بوده است که در این صورت با نتایج کاکریرمن مطابقت دارد (شکل 8). همچنین در مطالعه انجام شده توسط لی و همکاران (19) فیلم PCL با استفاده از پلاسمای اتمسفری به چهار صورت Ar+O2، Ar+N2، Ar+H2 و Ar مورد اصلاح سطحی قرار گرفت. نتایج تست­های انجام شده بیانگر کاهش زاویه تماسی در سه مورد Ar+O2، Ar+N2 و Ar البته بیشترین کاهش در پلاسمای Ar+O2 مشاهده شد. از سوی دیگر بیشترین زبری سطحی و به‏دنبال آن بالاترین نرخ اتصال سلولی و در نهایت رشد و تکثیر سلولی بر روی فیلم PCL اصلاح شده با پلاسما Ar+O2 دیده شد. که با توجه به نتایج به‏دست آمده در پروژه­های تحقیقی انجام شده، از اصلاح پلاسما با اکسیژن برای انجام این تحقیق استفاده گردید.

در این مطالعه روند تمایز سلول‏های بنیادی مزانشیمی بندناف به سلول‏های استخوان­ساز روی داربست­ مورد مطالعه قرار گرفت. یکی از تغییرات قابل بررسی در سلول‏های تمایز یافته به استئوبلاست، بررسی میزان رسوب کلسیم در سلول‏هاست. در این بررسی رنگ­آمیزی آلیزارین قرمز که رسوبات کلسیمی را به رنگ قرمز در می­آورد، تمایز استئوبلاستی سلول‏ها را در روز 21 تمایز تحت محیط تمایز استئوبلاستی تایید کرد. همچنین نتایج حاصل از RT-PCR برای دو مارکر آلکالین فسفاتاز و استئوکلسین نشان دهنده بیان این ژن­های استئوبلاستی پس از تمایز سلول‏های بنیادی بندناف انسانی به سلول‏های استئوبلاست بودند.

همان‏طور که در این تحقیق مشخص شد با استفاده از فاکتورهای تمایز می­توان با کارایی بالا سلول‏های بنیادی مزانشیمی را به سلول‏های استئوبلاست تمایز داد. در تحقیقات گذشته مشخص شده است که پروسه تمایز سلول‏های بنیادی به سلول‏های تمایز یافته از تقسیم سلولی خاصی پیروی می‏کند.

یکی از راه‏کارهای تشخیص تخریب داربست­ها کاهش وزن آن­ها می­باشد بدین‏صورت که پلیمر پس از تجزیه به واحدهای سازنده خود از سطح داربست جدا شده و با توجه به مشخصات هیدروفوبیک خود یا درون PBS حل شده و یا در سطح آن قرار می­گیرد از جمله فاکتورهای موثر در زیست تخریب پذیری می‏توان به نوع ماده تشکیل دهنده داربست، وزن ملکولی، روش ساخت داربست و غیره اشاره نمود. نتایج حاصل از درصد کاهش وزن در این تحقیق نشان­ داد (شکل 9) کاهش وزن داربست تا روز 15 با سرعت زیادی صورت گرفت اما پس از روز 15 تا روز 30 سرعت تخریب به‏شدت کاهش یافت. شاید دلیل این نوع تخریب پذیری را بتوان به اصلاح سطح داربست با پلاسمای اکسیژن نسبت داد به این‏صورت که احتمالا پلاسمایی اکسیژن با افزایش گروه­های قطبی در سطح داربست سبب افزایش سطح تماس بافر PBS با داربست شده که این امر سبب افزایش سرعت زیست تخریب پذیری داربست شده باشد و پس از حذف بخش­های قطبی داربست، سرعت تخریب داربست کاهش یافته باشد.

نتیجه‏گیری

به‏دلیل اصلاح سطحی داربست با پلاسمای اکسیژن، افزایش گروه­های اکسیژنی ناشی از اصلاح بر روی سطح داربست الکتروریسی شده که دارای نانوتوپوگرافی، با بهبود ویژگی آبدوستی سطحی داربست این مشخصه ذاتی تعدیل و شرایط برای اتصال اولیه سلول بر سطح داربست بهبود یافته که در پی آن مهاجرت، رشد و تکثیر مناسب و بهتر سلولی بر روی داربست فراهم گردید.

تصاویر حاصل از  سلول‏های کشت شده بر روی داربست­ها نشان دهنده این است که داربست PCL تیمار شده با پلاسمای اکسیژن محیطی مناسب برای رشد درونی سلول‏ها فراهم کرده­ است. در واقع خواص مواد به وسیله ساختار آن­ها تعیین می­شود، بنابر این دلیل اینکه داربست­ها ویژگی­های بهتری را نشان می‏دهد، به ایجاد تغییر در ساختار آن بر می­گردد. با توجه به تصاویر میکروسکوپ الکترونی می­توان به این نکته پی برد، سلول‏ها دارای زوائد سیتوپلاسمی و ریخت­شناسی طبیعی بوده که به شکل کلنی­های سلولی درآمده­اند. همچنین نتایج حاصل از رنگ آمیزی آلیزارین قرمز و RT-PCR نشان داد این نوع داربست از توانایی بالایی در تمایز سلول‏های بنیادی حاصل از بندناف انسانی به سلول‏های استئوبلاستی برخوردار هستند.

تشکر و قدردانی

از مسئولین محترم دانشگاه آزاد اسلامی واحد اردبیل به‏خاطر فراهم کردن امکانات انجام این تحقیق و نیز از کلیه افرادی که در این تحقیق کمک شایانی کردند از کارشناسان آزمایشگاه سلول‏های بنیادی و  دکتر حسین اکبری کمال تشکر و قدردادنی را داریم.

1. Barre`re F, Mahmood TA, de Groot K. Blitterswijk, CA. Advanced biomaterials for skeletal tissue regeneration: Instructive and smart functions.Materials Science and Engineering. 2008; 59(5): 38–71

2. Hench JW. Biomaterials. Artificial organs and tissue engineering.Wodhed pub. 2005; 18(1): 193-200.

3. Liu C, Xia Z, Czernuszka JT. Design and development of three-dimensional scaffolds for tissue engineering.Chemical Engineering Research and Design. 2007; 85(8): 1051–1064.

4. Grompe M. Embryonic stems cells without embryos? Nature Biotechnology. 2005; 23(19):1496 1497.

5. Manuela M, Gomes E. A bone tissue engineering strategy based on starch scaffolds and bone marrow cells cultured in a flow perfusion bioreactor. University of Minho. 2004; 69(4): 25-34.

6. Hayman MW, Smith KH, Cameron NR, Przyborski SA. Growth of human stem cell-derived neurons on solid three-dimensional polymers. Biochemical Biophysic Methods. 2005; 62(24): 231-240

7. Hashemi S, Soleimani M, Zargarian S, Haddadi-Asl V, et al. In vitro differentiation of human cord blood-derived unrestricted somatic stem cells into hepatocyte-like cells on poly(epsilon-caprolactone) nanofiber scaffolds.. Cells Tissues Organs. 2009; 190(2): 135- 49.

8. Jiang CP, Huang JR, Hsieh MF. Fabrication of synthesized PCL-PEG-PCL tissue engineering scaffolds using an air pressure-aided deposition system.Rapid Prototyping Journal. 2011; 17(1): 288-297.

9. Sharifi Ferdoey F, Irani S, Zandi M, Soleimani M. Synthesis and Surface Modification of PolycaprolactoneNanofibers for Tissue Engineering. J Ardabil Univ Med Sci. 2014; 14(3):217-228.   

10. Marolt D, Campos IM, Bhumiratana S, Koren A, et al. Engineering bone tissue from human embryonic stem cells.Proceedings of the National Academy of Sciences. 2012; 109(2):8705-8709.

11. Cunha C, Panseri S, Antonini S. Emerging nanotechonolgy approaches in tissue engineering for peripheral nerve regeneration. Nanomedicine. 2011; 7(3): 50-9.

12. Barnes CP, Sell SA, Boland ED, Simpson DG. Nanofiber technology: Designing the next generation of tissue engineering scaffolds. Advanced Drug Delivery. 2007; 59(4):1413-1433.

13. Pramanik S, Pingguan-Murphy B, Azuan A. Progress of key strategies in development of electrospun scaffolds: bone tissue. Science and Technology of Advanced Materials. 2012; 110(3): 1045-1055.

14.  Vance RJ, Miller DC, Thapa A, Haberstroh KM. Decreased fibroblast cell density on chemically degraded poly-lactic-co-glicolic acid, polyurethane, and poly caprolactone.Biomaterials. 2004; 78(5): 2095-2103.

15. Park JS, Woo DG, Sun BK, Chung HM, et al. In vitro and in vivo test of PEG/PCL-based hydrogel scaffold for cell delivery application. Journal of Controlled Release. 2007; 124(7): 51–59.

16. Yildirim ED, Besunder R, Papas D, Allen F, et al. Accelerated differentiation of osteoblast cells on polycaprolactone scaffolds driven by a combined effect of protein coating and plasma modification. Biofabrication.Oct. 2010; 88(2):12-24.

17. Caetano GF, Bártolo PJ, Domingosb M, Caliari C. Osteogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells into Polycaprolactone (PCL) scaffold.ProcediaEngineering. 2015; 110(14):59 – 66.

18. Cukierman E, Pankov R, Stevens, DR, Yamada KM. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.Science Signalling. 2010; 294(11): 1708.

19. Lee Hyun UK, Sul Jeong Y, Young jong S, Young Park S, et al. Role of reactive gas in atmospheric plasma for cell attachment and proliferation on biocompatible poly caprolactone film. Applied Surface Science. 2008; 254: 5700-05.