تاثیر واریس ورید تخمدانی بر هیستومورفولوژی و هیستومورفومتری‏های تخمدان موش صحرایی بالغ

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

گروه علوم تشریحی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم پزشکی تهران

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه تعیین این‏که آیا واریس ورید تخمدانی می‏تواند موجب تغییر در تعداد و اندازه فولیکول‏های تخمدانی شود، می‏باشد                                                                            
مواد و روش‏ها: در این مطالعه سه گروه ده تایی موش صحرایی ماده شامل گروه کنترل، شم و واریکوسل در نظر گرفته شدند. گروه واریسی تحت عمل جراحی قرار گرفتند و ورید تخمدانی چپ به‏طور نسبی بسته شد. بعد از دو ماه حیوانات تشریح و تخمدان آن‏ها بلافاصله خارج  شده و مقاطع بافتی با قطر 7 میکرومتر از تخمدان تهیه شدند. آنها پس از رنگ آمیزی با  هماتوکسیلین-ائوزین با میکروسکوپ نوری مورد مطالعه قرار گرفتند. داده‏ها با استفاده از آزمون‏های آنالیز واریانس یک‏طرفه تجزیه و تحلیل شدند. سطح معنی‏داری، 05/0P< در نظر گرفته شد.
نتایج: آنالیز آماری نشان داد تعداد فولیکول‏های بدوی در گروه واریسی نسبت به گروه کنترل و شم افزایش معنی‏داری داشته است. تعداد فولیکول های اولیه، ثانویه و گراف در گروه واریسی نسبت به گروه کنترل کاهش معنی داری داشته است. اندازة فولیکول‏ها به جز فولیکول ثانویه در بین گروه کنترل و واریسی تغییر معنی‌داری نداشته است. اندازة فولیکول‏های ثانویه در گروه واریسی نسبت به گروه کنترل کاهش معنی‏داری داشته است P<0.05).).
نتیجه‏گیری: واریس ورید تخمدانی باعث کاهش رشد فولیکول‏های تخمدانی شده و در مواردی باعث کاهش اندازه آن‏ها و ناباروری می‏گردد.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

جراح انگلیسی به‏نام Giardino در سال ۱۹۹۸ به‏عنوان اولین کسی است که عبارت واریکوسل را اتساع پاتولوژیک وریدهای طناب‌ اسپرماتیک تعریف کرد واریکوسل وریدی عامل ناباروری متداول اغلب قابل اصلاح با جراحی در جنس مذکر است که مربوط به پیچ خوردگی غیرطبیعی و اتساع شبکه پمپینی فورم در طناب اسپرماتیک می‌باشد (1). ارتباط بین واریکوسل و ناباروری مردان در سال 1950 شناخته شد. با توجه به این موضوع که پاتوفیزیولوژی فرآیند این اختلال شناخته شده نبود. در سال 2011 مقاله‌ای با این فرض که هیپرترمی، فشار وریدی، جریان خون تستیکولار، عدم توازن هورمونال، مواد توکسیک و رادیکال آزاد ((ROS از عوامل مداخله‏کننده در ایجاد واریکوسل می‏باشند، بررسی‎های انجام شده بیان کردند که شناسایی عامل واحد یا غالب برای واریکوسل مشکل است. خیلی از این عوامل در این پدیده شرکت می‎کنند (2).Turner در سال 2001 بیان کرد که به‏دلیل محدودیت استفاده از نمونه‎های انسانی، بهتر است از مدل‎های حیوانی در کارهای تحقیقاتی استفاده شود. حیواناتی که از آن‎ها می‎توان برای القای واریکوسل استفاده کرد عبارتند از میمون، سگ، خرگوش و موش صحرایی. در این میان موش صحرایی به‏دلیل نگه‏داری آسان و هزینه کم بهترین گزینه می‎باشد (3). در جنس مونث واریکوسل لگنی به پیچ‌خوردگی و متسع شدن وریدهای ناحیه لگن در جنس مونث گفته
می‌شود و در صورتی‏که به این اختلال، درد‌های مزمن لگنی نیز اضافه شود، سندرم گرفتگی لگن
 (CPS: PelvicCongestionSyndrome) نام برده می‏شود که در 10 درصد جمعیت عمومی زنان این سندروم، وریدهای تخمدانی را نیز درگیر می‌کند. علائم این سندرم شامل درد مزمن، فشار و سنگینی در ناحیه لگن می‌باشد. این علائم به‏دلیل به عقب برگشتن جریان خون ناشی از ناکارآمدی دریچه‌های وریدهای تخمدانی ایجاد می‌شود واریکوسل لگنی در بیش‎تر موارد مربوط به ورید‌های سمت چپ است که با موقعیت آناتومیکی ورید‌ کلیوی چپ قابل توجیه است (4). در بیش از 15 درصد موارد، ورید‌ تخمدانی سمت چپ و در 6 درصد موارد، ورید تخمدانی سمت راست فاقد دریچه هستند که این وضعیت زمینه‌ساز واریسی شدن این ورید‌ها را فراهم می‌سازد. به‏علاوه در طی حاملگی نیز در پی افزایش جریان خون به ناحیه لگن، گشاد شدن وریدهای تخمدانی و بازگشت جریان خون در این ورید‌ها دیده می‌شود (5 و 6).

علت به‏وجود آمدن ورید‌های واریسی کاملا مشخص نیست. اگرچه علل مختلفی گزارش شده است. یکی از این علل نقص در عملکرد اندوتلیوم وریدی است که می‌تواند منجر به تولید بیش از حد رادیکال‌های آزاد اکسیژن(ROS: Reactive oxygen species)، کاهش سطح آنتی‌اکسیدانت‎ها و افزایش استرس اکسیداتیو‌ شود (7). استرس اکسیداتیو، ناشی از عدم توازن بین مولکول‌های پراکسیدانت حاصل از متابولیسم هوازی و آنتی‌اکسیدانت‌های حفاظتی است. بر هم خوردن تعادل پراکسیدانت-آنتی‌اکسیدانت درتمامی فرآیند‌های تولیدمثلی در سیستم تناسلی یک فرد تاثیر‌ گذار است و می‌تواند زمینه‌ساز بروز ناباروری شود. رادیکال‌های آزاد اکسیژن در مایع فولیکولی نقش تنظیم‏کننده‌ای را در فرآیند‌های بلوغ تخمک، ترشح استرادیول در تخمدان، تکامل رشد فولیکول‌های تخمدانی و تسهیل پاره شدن فولیکول در زمان تخمک‌گذاری دارد. اما  سطوح غیرقابل کنترل آن زمینه آسیب به فرآیند‌های فیزیولوژیکی در دستگاه تولیدمثل جنس مونث را ‎فراهم می‎کند. زیرا ممکن است بر آنتی‌اکسیدانت‌های دفاعی در فولیکول چیره شود و بر اووسیت آسیب وارد کند (8). با توجه به این موضوع که احتمال واریسی شدن ورید تخمدانی در سندرم‌های مختلف مربوط به جنس مونث گزارش شده است، اما به واریکوسل ورید تخمدانی به‏عنوان عاملی برای اختلال در ساختار تخمدان در جنس مونث توجهی نشده است در این مطالعه بر آن شدیم که اثر واریسی شدن ورید تخمدانی سمت چپ را بر تعداد و اندازه فولیکول‏های تخمدانی مورد مطالعه قرار دهیم.

مواد و روش‏ها

حیوانات: این مطالعه تجربی روی موش‏های صحرایی ماده بالغ نژاد ویستار در محدوده وزنی 200 تا 250 گرم انجام شد. حیوانات از مرکز پرورش و نگه‏داری حیوانات آزمایشگاهی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران تهیه شدند. همه حیوانات در قفس‏های مخصوص و در شرایط محیطی ثابت تحت شرایط استاندارد (12 ساعت روشنائی 12 ساعت تاریکی) نگه‏داری شدند. جهت مطالعه بر روی حیوانات تمامی موازین اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی مد نظر قرار گرفت و برای سازگاری با محیط دو هفته قبل از شروع ازمایش در حیوان‏خانه نگه‏داری شدند.با توجه به این که سیکل جنسی رت ماده کوتاه و 4 تا 5 روز است و شامل چهار دوره پرواستروس (12 تا 14 ساعت)، استروس (25 تا 27ساعت)، مت استروس (6 تا 8 ساعت) و دای استروس (55 تا 57 ساعت) می‎باشد (9). لذا به‏منظور یکسان سازی شرایط تخمدان‏ها مرحله پرو استروس برای ارزیابی انتخاب شد.

گروه‏ها:

تعداد 30 سر موش صحرایی ماده بالغ از نژاد wistar  به 3 گروه ده تائی تقسیم شدند:

گروه کنترل (گروه یک): شامل 10 سر رت که هیچ‏گونه عمل جراحی بر روی آن‏ها انجام نشد.

گروه شم( گروه2): شامل 10 سر موش صحرایی که تمام مراحل جراحی به‏جز تنگ کردن ورید کلیوی بر روی آن‏ها انجام گرفت.

گروه واریسی (گروه 3): شامل 10 سر موش صحرایی که تحت عمل جراحی جهت ایجاد واریکوسل در ورید کلیوی سمت چپ قرار گرفتند.

روش جراحی: رت‌ها در وضعیت خوابیده به پشت ‌(supine) قرار گرفتند و تحت شرایط استریل با محلول کتامین 10 درصد به‏میزان 44 میلی‏گرم بر کیلوگرم و محلول زایلزین 1 میلی‏گرم بر کیلوگرم به‏روش تزریق داخل صفاقی بی‏هوش شدند. محل جراحی با محلول بتادین شستشو داده شد. در ناحیه تخمدان‌ها برشی به اندازه 2 سانتی‏متر ایجاد گردید. پس از مشخص کردن ورید کلیوی سمت چپ مراحل زیر را انجام گرفت:

در گروه واریسی پس از پیدا شدن ورید کلیوی چپ و محل ورود ورید تخمدانی به آن، سوزن gage 20 را به‏موازات ورید کلیوی قرار داده و به‏وسیله نخ بخیه نایلون 4.0 سوزن روی ورید گره زده می‌شود، به‏طوری‏که محل گره بعد از محل ورود ورید تخمدانی به ورید کلیوی باشد. بعد از گره زدن سوزن را به‏آرامی خارج و سپس محل برش شکمی را در دو لایه (عضله و پوست) بخیه زده شد.

بعد از دو ماه با القای واریکوسل، حیوانات بی‏هوش شده و سریعا ناحیه شکم حیوانات بازشده و تخمدان‏ها به‏طورکامل برداشته شدند. پس از وزن‏گیری، نمونه‏ها‏ی تهیه شده بلافاصله در محلول ثابت‏کننده فرمالین 10 در صد به‏مدت یک هفته تثبیت شدند تمامی نمونه‏ها پس از اصلاح با روش‏های معمول بافت‏شناسی پاساژ داده شده و و از بلوک‏های پارافینی تهیه شده مقاطع سریالی به ضخامت 7 میکرون تهیه و با رنگ امیزی هماتوکسیلین-ائوزین رنگ امیزی و به‏وسیله میکروسکوپ مجهز به دوربین عکسبرداری شدند. در مطالعه هیستومتریک تخمدان‏ها تعداد فولیکول‏ها که از انواع مختلف بودند به‏صورت مارپیچی از قشر به مرکز و در جهت عقربه‏های ساعت برابر نتایج Bolon و همکاران (10) و Myers (11) شمارش شدند. تعداد فولیکول‌های بدوی، اولیه، ثانویه و گراف با استفاده از نرم افزار Image J شمارش شدند. جهت اندازه‏گیری قطر فولیکول‌ها میانگین سه قطر عرضی، عمودی و مایل آن‌ها بر حسب مبکرومتر محاسبه شد.

آنالیز آماری

داده‏ها با استفاده ازنرم افزار SPSS نسخه 18 موردارزیابی آماری قرارگرفتند. نتایج به‏صورت میانگین همراه با انحراف معیار (Mean± SEM) بیان شد. جهت مقایسه بین گروه‏ها از ازمون انالیز واریانس یک‏طرفه استفاده شد. جهت مقایسه بین گروه‏ها از تست توکی استفاده شد و سطح معنی‏داری 05/0p< در نظر گرفته شد.

نتایج

بررسی واریسی شدن (دیلاتاسیون ورید تخمدانی)

دیلاتاسیون ورید تخمدانی تنها در دو مورد از حیوانات جراحی شده مشاهده نشد. درهیچ یک از موش های گروه شم دیلاتاسیون ورید تخمدانی دیده نشد. دیلاتاسیون ورید تخمدانی در یکی از گروه‏های واریکوسل قابل مشاهده است (شکل1).

 


 

 

K

O

V

V

V

A

B

C

شکل 1: موش صحرایی واریکوسلی. ورید تخمدانی دیلاته شده با فلش نشان داده شده است. ورید واریسی شده تخمدانی سمت چپ پس از دو ماه از انجام جراحی (شکل A,B) در مقایسه با ورید تخمدانی گروه کنترل (C)، (V= Ovarian Vein, O= Ovary, K: Kidney)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



نتایج مربوط به مطالعات بافت‌شناسی

پس از گذشت 2 ماه از القای واریس، از تخمدان گروه‌های مختلف مقاطع بافتی 7 میکرومتری تهیه و با هماتوکسیلین-ائوزین رنگ آمیزی شدند. بررسی مقاطع بافتی با میکروسکوپ نوری انجام شد. از لحاظ ساختار بافت شناسی (شکل فولیکول‏ها بدون در نظر گرفتن اندازه آن‏ها و بافت زمینه تخمدان) تفاوت  معنی‏داری بین گروه کنترل و شم با گروه  واریکوسل دیده  نشد. یعنی واریکوسل باعث تغییر ساختار بافت‌شناسی تخمدان نشد (شکل2 و 3 و 4).

 

شکل2:  مقاطعی از تخمدان: در تصویر سمت راست تعدادی از فولیکول‏های موجود درکورتکس  با بزرگنمایی 100 و در تصویر سمت چپ  کورتکس و مدولا بی تخمدان ا بزرگنمایی 40 قابل مشاهده است.

 

         

 

 

شکل 3- مقاطعی از تخمدان  به همراه. فولیکول‌های ثانویه

شکل 4: مقطع تخمدان به همراه  فولیکول‌های اولیه موجود در کورتکس

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


تعداد فولیکول‌های تخمدان

نتایج حاصل از مطالعه هیستومورفومتریک تخمدان نشان داد که در مقایسه بین تعداد فولیکول‎ها، در تخمدان گروه‌های مختلف، تعداد فولیکول‎های بدوی در تخمدان گروه واریسی  بیش‎تر از گروه کنترل و شم بود (05/0P≤). تعداد فولیکول‌های اولیه، ثانویه و گراف در گروه واریسی به‏طور معنی‌دار کمتر از گروه کنترل بود (05/0P≤)( نمودار ا، شکل 5).

 

شکل ۵:. مقطع تخمدان در گروه‌های مختلف. تعداد فولیکول‌ها در گروه‌های مختلف  قابل مشاهده است


 

 

نمودار 1: تعداد فولیکول‌ها در گروه های مختلف. نتایج بر اساس Means±SEMنوشته شده است.. P<0.05* گروه واریکوسل در مقایسه با گروه کنترل و شم. P<0.05** در مقایسه گروه واریکوسلی با کنترل و شم. P<0.05*** در مقایسه گروه واریکوسلی با کنترل و شم P<0.05**** در مقایسه گروه واریکوسلی با کنترل و شم

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


 

 

 

نمودار 2: اندازه  فولیکول‌ها در گروه‌های مختلف. نتایج بر اساس Means±SEMنوشته شده است. P<0.05* گروه واریکوسل در مقایسه با گروه کنترل و شم

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


اندازه فولیکول‌های تخمدان

نتایج نشان داد که  به جز فولیکول ثانویه، که اندازه آن در گروه واریسی به‏طور معنی‏دار کمتر از گروه کنترل بوده است ‌(05/0p< ) اندازه فولیکول‌های بدوی، اولیه و گراف در گروه‌های مختلف اختلاف معنی‏داری با یکدیگر نداشتند (نمودار2).

بحث

در این مطالعه مشخص شد که واریس ورید تخمدانی می‏تواند بر تعداد فولیکول‏ها تاثیر بگذارد. در این ارتباط مطالعه‏ای که توسط محققین مختلف انجام گرفت نشان داده که واریسی شدن طولانی مدت وریدهای تخمدان ممکن است سبب هایپوفانکشن تخمدان شود. محققین  فرضیه‌ای مطرح کردند که واریس ورید تخمدانی مشابه واریکوسل تستیکولار می‌تواند عاملی برای ایجاد ناباروری باشد. بر مبنای این فرضیه در سال 2011 دو مورد حاملگی گزارش شده است که زنان نابارور بعد از عمل جراحی و موفقیت در رفع انسداد وریدهای تخمدانی بارور شده‌اند (12). مطالعه اخیر بدنبال اثبات آسیب ناشی از واریکوسل در بافت تخمدان مشابه آنچه در بافت تستیکولار روی می‎دهد انجام گرفت، البته بر خلاف مطالعه Gokdeniz (15)، دراین  مطالعه برای رسیدن به نتایج درست، سیکل  پرواستروس درنظر گرفته شد تا تمام تخمدان‎های مورد بررسی در یک فاز قرار گیرند، چون همان‎طور که آشکار است فاز تخمک‎گذاری خود شرایط التهابی و استرسی برای تخمدان ایجاد می‎کند.  پس یکسان سازی فاز برای تخمدان‎ها الزامی است تا اثر واریس با اثر ناشی از استرس مربوط به تخمک‎گذاری از یکدیگر مجزا گردند. لذا به‏منظور بررسی  عوارض حاصل از واریکوسل با کمک میکروسکوپ نوری در بافت تخمدانی به بررسی اندازه و تعداد فولیکول‎های مختلف در سه گروه پرداخته شد.در مطالعات گذشته بیان شده است که احتمال واریکوسل یک طرفه با احتمال 90 درصد در سمت چپ، با احتمال کم دوطرفه و به ندرت مربوط به سمت راست می‎باشد (13). در مطالعه اخیر نیز واریسی شدن در سمت چپ صورت گرفت. در این ارتباط مطالعه‏ای که توسط Turner (3) انجام گرفت با بستن نسبی ورید کلیوی چپ می‎توان واریکوسل تجربی ایجاد کرد. در این مطالعه تعداد فولیکول‌های اولیه، ثانویه و گراف در گروه واریسی نسبت به گروه کنترل کاهش معنی‌داری داشته هست. این کاهش به‏خاطر عدم رشد فولیکول‌های بدوی در تخمدان است تعداد فولیکول‏های بدوی در گروه واریسی بیشتر از سایر گروه‏ها بود. همچنین در  این مطالعه بعد از ۲ ماه القای واریکوسل مطالعه مقاطع بافت شناسی تخمدان‏ها نشان داد که در گروه واریسی  ساختار و مورفولوژی تخمدان‏ها  تفاوت معنی‏داری را بین گروه کنترل و واریسی مشاهده نشد. پس می‏توان گفت القای وارکوسل باعث تغییرات مورفولوژیک در تخمدان نمی‏شود و وزن تخمدان‏ها در بین گروه‌ها اختلاف معنی‌داری را نشان نداد. در اندازه‏گیری قطر فولیکول‌ها اختلاف معنی‏داری در اندازه فولیکول‏های بدوی، اولیه و گراف بین گروه کنترل و واریسی وجود نداشت. فقط اندازه فولیکول‏های ثانویه در موش‌های واریسی نسبت به گروه کنترل کاهش معنی‏داری داشته است. این نشان می‏دهد که رشد فولیکول‏ها در مرحله‏ای از رشد در گروه واریسی کاهش پیدا می‏کند. در شمارش تعداد فولیکول‏ها بین تعداد فولیکول‌های بدوی در گروه واریسی نسبت به گروه کنترل افزایش معنی‏داری داشت. همان‏طور که می‏دانیم تعداد فولیکول‌های بدوی در تخمدان در بدو تولد عدد مشخصی هست و هر چقدر فولیکول‌ها رشد پیدا کنند و به فولیکول‌های اولیه تبدیل شوند، تعداد فولیکول‌های بدوی کاهش پیدا می‏کند. نتایج نشان داد رشد فولیکول‌ها در گروه واریسی کاهش پیدا کرده و بنابراین تعداد زیادی از فولیکول‌ها در گروه واریسی به‏صورت بدوی باقی می‌ماند.

همچنین تعداد فولیکول‏های اولیه و ثانویه و گراف در گروه واریسی نسبت به کنترل و شم  کاهش معنی‏دار داشت و این کاهش به‏دلیل عدم رشد فولیکول‏های بدوی در تخمدان است زیرا تعداد فولیکول‏های بدوی در گروه واریسی بیشتر از سایر گروه‏ها بود.

جهت شفاف‌سازی اثرات واریکوسل بر پارامترهای مورفولوژی و ماهیت DNA اسپرم  تحقیقی انجام گرفت که اثرات متنوع واریکوسل را بر میزان توانایی لقاح آزمایشگاهی در رت تخمین می‏زد. نتایج بافتی با میکروسکوپ نوری نشان داد که اثرات منفی واریکوسل باعث شده است که پارامترهای ریختی اسپرم‏های مورد مطالعه نسبت به گروه کنترل در سطوح پایین‏تری قرار گیرد و طبق ارزیابی انجام گرفته با Fluorescnt Microscope در همه گروه‌ها به مرور زمان آسیب به DNA اسپرم مشاهده شد. نتیجه این‏که، واریکوسل به‏طور قابل توجهی توانایی اسپرم را جهت لقاح آزمایشگاهی کاهش می‌دهد (14). در تحقیق دیگری القای واریکوسل به بافت بیضه‎ی سمت راست رت در مقایسه با بافت بیضه‎ی سمت چپ به‏طور قابل توجهی در همه پارامترهای مورد بررسی آسیب کمتری وارد کرد (15).

محققین دیگر گزارشی مبنی بر اثر منفی واریس ورید تخمدانی سمت چپ بعد از گذشت 30 روز از القای واریس را بدون تغییر بافتی خاصی  در گروه واریسی ارائه داشتند، ولی گرفتگی در عروق در بافت گروه واریسی را بر خلاف گروه کنترل مشاهده نمودند (16). بررسی‏ها نشان داد که واریکوسل طولانی مدت ورید‌های تخمدانی ممکن است موجب افت عملکرد تخمدان و ناباروری شود (17). در تحقیق دیگر افزایش Malondialdehyde، تغییر در سطح هورمون‌های LH، FSH، PRL، تغییر در ساختار میتوکندری‌ها و افزایش سطح ROS را در تخمدان موش صحرایی‌ ماده واریکوسلی گزارش کردند (18).

نتیجه‏گیری

از مطالعه حاضر  چنین استنباط می‏شود که واریس ورید تخمدانی موجب  تاثیر بر روند تکاملی فولیکول‏های تخمدانی شده و موجب کاهش قطر برخی از انواع فولیکول‏ها می‏شود.

1. Giardino I, Fard AK, Hatchell DL, Brownlee M. Aminoguanidine inhibits reactive oxygen species formation, lipid peroxidation, and oxidant-inducedapoptosis. Diabetes. 1998; 47(7): 1114-20.

2. Eisenberg ML, Lipshultz LI. Varicocele-induced infertility: newer insights into its pathophysiology. Indian journal of urology: IJU: journal of the Urological Society of India. 2011; 27(1): 58.

3. Turner T. The study of varicocele through the use of animal models. Human reproduction update. 2001; 7(1): 78-84.

4. Tinelli A, Prudenzano R, Torsello M, Malvasi A, et al. Suprapubic percutaneous sclero-embolization of symptomatic female pelvic varicocele under local anesthesia. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2012; 16(1): 111-7.

5. Bittles M.A, Hoffer E.K, eds. Gonadal vein embolization: treatment of varicocele and pelvic congestion syndrome. Seminars in interventional radiology; 2008; Thieme Medical Publishers.

6. Cura M, Cura A. What is the significance of ovarian vein reflux detected by computed tomography in patients with pelvic pain? Clinical imaging. 2009; 33(4): 306-10.

7. Krzyściak W, Kózka M. Generation of reactive oxygen species by a sufficient, insufficient and varicose vein wall. Acta Biochim Pol. 2011; 58(1): 89-94.

8. H Sekhon L, Gupta S, Kim Y, Agarwal A. Female infertility and antioxidants. Current Women's Health Reviews. 2010; 6(2): 84-95.

9. Hubscher C, Brooks D, Johnson J. A quantitative method for assessing stages of the rat estrous cycle. Biotechnic & Histochemistry. 2005; 80(2): 79-87.

10. Bolon B, Bucc TJ, Warbritton AR, Chen JJ, et al. Differentialfollicle counts as a screen for chemicallyinduced ovarian toxicity in mice: results fromcontinuous breeding bioassays. Fundam ApplToxicol. 1997; 39: 1-10.

11. Myers M, Britt KL, Ebling FJP, Kerr JB. Methods for quantifying follicularnumbers within the mouse ovary. Reproduction.2004; 127: 569-580.

12. Tarazov P, Prozorovskij K, Rumiantseva S. Pregnancy after embolization of an ovarian varicocele associated with infertility: report of two cases. Diagn Interv Radiol. 2011; 17(2): 174-6.

13. Cocuzza M, Cocuzza MA, Bragais FMP, Agarwal A. The role of varicocele repair in the new era of assisted reproductive technology. Clinics. 2008; 63(3): 395-404.

14. García-Peiró A, Martínez-Heredia J, Oliver-Bonet M, Abad C, et al. Protamine 1 to protamine 2 ratio correlates with dynamic aspects of DNA fragmentation in human sperm. Fertility and sterility. 2011; 95(1): 105-9.

15. Gokdeniz R, Ozbek E, Mizrak B, Ozen S. Female Varicocele:  ; A Rat Model..Turgut  Ozal Tip Merkezi Dergisi. Gupta S.Banerjee.J.1999 ;6(3):183-6.

16. Galkin E, Grakova L, Naumova E. [Roentgeno-endovascular surgery of hypofunctional ovaries in varicositiesof the ovarian veins]. Vestnik rentgenologii i radiologii. 1990(5): 51-9.

17. Heydari L, Mugahi SMHN, Fazelipour S, Koruji M, et al. Efectos de las Venas Ováricas Varicosas sobre la Estructura Mitocondrial, Niveles de Malondialdehídoy Balance Prooxidantes: antioxidantes en Ovarios de Ratas. International Journal of Morphology. 2015; 33(3): 930-5.