افزایش بقای سلول‏های دوپامین ساز PC12 در برابر سمیت 6-OHDA با افزایش بیان فاکتور DJ-1

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد زیست شناسی سلولی- مولکولی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران

2 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، پژوهشکده پزشکی، دپارتمان سلول‏های بنیادی و پزشکی ترمیمی، تهران، ایران

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی تاثیر DJ-1 بر افزایش بقای سلول‏های دوپامین ساز در برابر سمیت پارکینسونی  می‏باشد.
مواد و روش‏ها:  ابتدا لنتی ویروس‏های نوترکیب ناقل توام ژن های DJ-1 و گزارش‏گر Jred تولید شده و برای آلوده سازی سلول‏ها استفاده شدند. بدین منظور سه پلاسمید لنتی ویروسی به‏نام‏های ناقل، بسته بندی و غشا برای ترانسفکشن سلول‏های HEK-293T به‏عنوان رده سلولی مولد ویروس به‏کار برده شدند. محیط سلول‏های ترانسفکت شده 24 و 48 ساعت جمع آوری و تغلیظ شد تا ذخیرة لنتی ویروسی به‏دست آید. به‏دنبال ترانسدوکشن سلول‏های دوپامین ساز PC12 با این ذخیرة غلیظ ویروسی، سلول‏های مزبور افزایش بیان DJ-1 را آغاز کردند. پس از تیمار این سلول‏ها با توکسین 6-OHDA، میزان بقای آن‏ها در مقایسه با شاهد اندازه‏گیری شد.
نتایج: مراحل ترانسفکشن سلول‏های HEK-293T و آلودگی سلول‏های PC12 با ذخیرة ویروسی به‏طور موفقیت آمیز به انجام رسید، زیرا بیان ژن گزارش‏گر Jred با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس در هر دو مرحله مشاهده شد. سپس افزایش بیان DJ-1 با تکنیک RT- PCR اثبات شد. آزمایش‏های بعدی نشان داد که افزایش بیان DJ-1 باعث افزایش چشم‏گیری در بقای سلول‏های PC12 در برابر سمیت ناشی از 6-OHDA می‏شود. درصد بقای سلول‏های PC12 که افزایش بیان DJ-1 داشتند، در حدود 30 درصد بیشتر از درصد بقای سلول‏های کنترل برآورد شد و این افزایش از نظر آماری معنی‏دار بود.
نتیجه‏گیری: افزایش بیان ژن DJ-1 در سلول‏های دوپامین ساز PC12 مقاومت و بقای این سلول‏ها را در برابر سمیت نورونی 6-OHDA به‏طور معنی‏دار و چشم‏گیری افزایش می‏دهد.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

آسیب پذیر شدن سیستم‏های عصبی ویژگی بارز بیماری‏های دژنراتیو مغزی وابسته به سن می‏باشد. از جمله این بیماری‏ها Parkinson’s disease(PD)، Huntington’s disease(HD) و Amyotrophic lateral sclerosis(ALS) را می‏توان نام برد (1). بخش وسیعی از تحقیقات بر روی استرس اکسیداتیو متمرکز شده است که عامل تباهی و زوال نورون‏ها در این بیماری‏ها می‏باشند. گونه‏های واکنش‏گر اکسیژن مانند آنیون سوپراکسید، رادیکال هیدروکسیل و هیدروژن پروکسید در جریان متابولیزه شدن اکسیژن به‏عنوان محصولات فرعی در سلول‏ها تولید می‏شوند که از جمله مهم‏ترین عوامل آسیب رسان به نورون‏ها می‏باشند (1).

 بیماری پارکینسون (PD) یک بیماری وابسته به سن است که در آن با پیشرفت سن، زوال سلول‏های دوپامین ساز رخ داده و نشانه‏های بیماری بروز می‏کند. تقریبا 90 درصد کل نورون‏های دوپامین ساز مغز در بخش شکمی مزنسفالون قرار گرفته‏اند (2). در پستانداران نورون‏های دوپامین ساز مزونسفالیک (Mes-Daergic) در سه زیرناحیه ی متمایز مغز مستقر می‏شوند: Substantia nigra pars compacta(SNpc)، Ventral tegmental area(VTA) و Retrorubral field (RRF) (3). شاخص‏ترین تقسیم بندی مسیرهای دوپامین ساز، مسیر نیگرو-استریاتال (SN-ST) است که از SNpc منشا گرفته و به استریاتوم پشتی که شامل بخش های Putamen و Caudate است ادامه می‏یابد (4).

یکی از ژن‏های مهم دخیل در بروز PD، ژن DJ-1 می‏باشد. DJ-1 در آغاز به‏عنوان یک انکوژن شناسایی شد (5). سیزده جهش شامل جهش‏های نقطه‏ای و حذفی در ژن DJ-1 در PD شناسایی شده است (6-9). DJ-1 عملکردهای متفاوتی دارد از جمله تنظیم رونویسی ژن‏های پایین دست و فعالیت‏های ضد استرس اکسیداتیو. فرض بر این است که نقص در فعالیت‏های ضد استرس اکسیداتیو منجر به بروز PD می‏شود (10-12). بیان DJ-1  در سلول‏هایی که در معرض استرس اکسیداتیو قرار گرفته اند افزایش می‏یابد. در هنگام افزایش استرس اکسیداتیو آمینو اسید سیستئین در پروتئین DJ-1 در موقعیت 106 (C 106) اکسیده شده و به این ترتیب گونه‏های واکنش‏گر اکسیژن (ROS) را از محیط جمع آوری و خنثی می‏کند (13-15). کاهش فعالیت‏های آنتی اکسیدانتی در موارد جهش یافته‏ی DJ-1 در بیماران مبتلا به PD گزارش شده است  (17). بررسی‏های ساختاری و بیوشیمیایی نشان داده اند که DJ-1 به‏صورت همودایمر درمی‏آید و بیشترین کارآیی را در فرم همودایمر از خود نشان می‏دهد (14، 16و17). این آنالیزها نشان می‏دهند که DJ-1 به‏عنوان پروتئاز (16و18) و چاپرون (19و20) نیز فعالیت می‏کند. مطالعاتی که بر روی موش‏های فاقد ژن  DJ-1 انجام شد نشان داد که فقدان این ژن منجر به از بین رفتن فعالیت گیرنده دوپامین و حساس شدن سلول‏ها در برابر استرس اکسیداتیو می‏شود، این یافته‏ها پیشنهاد می‏کنند که نقص عملکرد DJ-1 با PD مرتبط است (21-23). در مطالعات In vivo که بر روی Rat های مدل پارکینسونی انجام شد نشان داد که پروتئین DJ-1 پس از تزریق 6-OHDA مرگ نورون‏های دوپامین ساز را در Substantia nigra مهار کرده، اختلالات رفتاری القا شده با 6-OHDA را بهبود بخشیده و سطح ROS را در سلول‏ها کاهش می‏دهد (24).

در مطالعه جاری، بر آن شدیم که اولا لنتی ویروس‏های ناقل ژن DJ-1 را به‏طور موفقیت آمیز تولید نمائیم، دوما با انتقال این ویروس‏ها به‏داخل سلول‏های دوپامین ساز PC12 بیان آن‏را در سلول‏های مزبور افزایش دهیم و ثالثا تاثیر این افزایش بیان را بر بقای سلول‏ها در برابر سمیت با 6-OHDA بسنجیم.

 

مواد و روش‏ها

ناقل‏های ویروسی شامل ناقل انتقال، ناقل غشا و ناقل بسته بندی با استفاده از کیت ماکسی پرپ کیاژن تهیه و تخلیص شدند.  سلول‏های HEK-293T از آزمایشگاه KL OMALLEY از دانشگاه واشنگتن در سنت لوئیس میسوری تهیه شده است.

کشت سلول: سلول‏های HECK-293T که نقش مولد ویروس را بازی می‏کنند در محیط DMEM حاوی FBS 10 درصد، در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و  CO2 5 درصد کشت و پاساژ داده شدند. حدود دو و نیم میلیون سلول در پتری دیش‏های 10 سانتی‏متری مخصوص کشت سلول، کشت داده شدند تا در روز بعد 60 درصد پتری دیش را پر کنند. همچنین سلول‏های نورونی PC12 به‏عنوان سلول‏های هدف ویروس، در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و CO2 5 درصد کشت و پاساژ داده شدند. برای آلوده سازی ویروسی تعداد 50 هزار سلول PC12 در پلیت 24 خانه، 24 ساعت قبل از آلوده سازی کشت داده شدند.

تولید ویروس: برای تولید لنتی ویروس‏های نوترکیب، سلول‏های مولد ویروس یعنی HEK-293T هم‏زمان با سه ناقل لنتی ویروسی به مقدار 20 میکروگرم از ناقل ترانسفر و 15 میکروگرم از هر یک از ناقلین بسته بندی و غشایی، با روش رسوب DNA- فسفات کلسیم ترانسفکت شد. این سه ناقل همراه با 50 میکرولیتر از کلرید کلسیم 5/2 میلی مولار، با آب استریل به حجم 500 میکرولیتر رسیدند و هم حجم آن HEPES اضافه شد. محلول حاصل 30 دقیقه در زیر هود و در دمای اتاق انکوبه شد تا رسوب مورد نظر به‏دست آید. سپس این رسوب قطره قطره به محیط سلول‏های HEK-293T اضافه شد. سلول‏ها به‏مدت 8 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه شدند و سپس محیط آن‏ها با محیط جدید تعویض شد. این سلول‏ها جهت تولید ویروس و رها سازی آن به محیط کشت، در انکوباتور دمای 37 درجه سانتی‏گراد و فشار CO2 5 درصد نگه‏داری شدند. 

تغلیظ ویروس و آلوده سازی سلول‏های هدف: محیط سلول‏های ترنسفکت شده، 24، 48 و 72 ساعت جمع آوری و از فیلتر 45/0 میکرون عبور داده شد. سپس محیط فیلتر شده به‏درون ستون‏های آمیکون 100 MW منتقل و مدت 10 الی 15 دقیقه در دور 4000 rpm سانتریفیوژ شد. محلول حاصل باقی مانده پشت فیلتر که سرشار از ذرات ویریونی بود جمع آوری شد. حجم‏های مختلف از این محلول برای آلوده سازی سلول‏های هدف یعنی PC12 استفاده شد. سپس سلول‏های مزبور در شرایط انکوباتوری ذکر شده قرار داده شدند تا بیان ژن J-RED  موجود در ناقل انتقالی، توسط میکروسکوپ فلورسنت مشاهده و بررسی شود.

استخراج RNA و آزمایش RT-PCR: نود و شش ساعت پس از ترانسدوکشن، کل RNA سلولی توسط کیت حاوی RNX (سیناژن) استخراج شده و پس از اطمینان از سلامت کامل آن روی ژل، 2 میکروگرم از آن برای سنتز cDNA به‏کار برده شد. ساخت cDNA به‏کمک آنزیم ترانسکریپتاز معکوس از (Fermentas, Lithuania) و در حضور هگزامرهای رندوم و مهار‏کننده RNase صورت گرفت. برای تکثیر یک قطعه 260 جفت بازی از cDNA ی مربوط به DJ-1 انسانی، جفت پرایمر زیر بر اساس توالی کد‏کننده آن طراحی و سنتز شد  (Genebank accession no.NG008271)

Forward: 5′-CGGGGTGCAGGCTTGTAAA-3′

Reverse: 5′-ACCACATCACGGCTACACTG-3′

مقادیر یکسان از نمونه‏های cDNA برای آزمایش PCR مورد استفاده قرار گرفت. پس از 2 دقیقه از دناتوراسیون نمونه‏ها در دمای 95 درجه سانتی‏گراد، واکنش PCR با سیکل دناتوراسیون در 95 درجه سانتی‏گراد به‏مدت یک دقیقه، Annealing در 57 درجه سانتی‏گراد برای یک دقیقه و مرحله‏ی Extension در 72 درجه ی سانتی‏گراد به‏مدت 45 ثانیه به انجام رسید. محصولات PCR با استفاده از ژل آگاروز 5/1 درصد آنالیز و عکس برداری شد.

ایجاد سمیت پارکینسونی و سنجش بقا: سلول‏های آلوده شده و سلول‏های کنترل در معرض غلظت 100 میکرومولار از توکسین 6-OHDA به‏عنوان LD50  قرار گرفتند و پس از 48 ساعت میزان بقای آن‏ها با روش 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT)  اندازه‏گیری شد. استوک 5 میلی‏مولار 6-OHDA (سیگما) حاوی 9/0 درصد سالین (Phosphate buffered saline)،
1/0 درصد آسکوربات و 10 میلی diethylenetriaminepentaacetic acid (DETAPAC) در نیتروژن حل شده و قبل از ذخیره سازی در دمای 20- درجه سانتی‏گراد توسط فیلتراسیون، استریل شد. برای تعیین LD50 توکسین، سلول‏ها توسط رقت‏های سریالی از 6-OHDA برای مدت 24 ساعت تیمار شدند و غلظتی از توکسین که در آن نیمی از سلول‏ها از بین می‏رفتند به‏عنوان LD50 انتخاب شد. همچنین برای سنجش MTT، با حل کردن استوک این ماده در سالین، غلظت 5 میلی‏گرم در میلی‏لیتر از آن تهیه شد و پس از استریل کردن آن توسط فیلتراسیون، 20 میکرولیتر از آن به 180 میکرولیتر از محیط DMEM فاقد FBS در هر چاهک اضافه شد و به‏مدت 3 ساعت در شرایط انکوباتوری ذکر شده نگه‏داری شد. سپس این محیط با 200 میکرولیتر از Dimethyl Sulfoxide(DMSO) جایگزین شد و پس از 5 دقیقه انکوبه شدن، میزان جذب در طول موج 580 نانومتر اندازه‏گیری شد.

نتایج

تولید لنتی ویروس‏های نوترکیب pLV-DJ1

 

سلول‏های ترانسفکت شده در فواصل زمانی متوالی در زیر میکروسکوپ فلورسنت مشاهده گردید. این مشاهدات آغاز بیان ژن Jred را در سلول‏های HEK-293T، 9 ساعت پس از ترانسفکشن نشان داد. در ساعات بعدی بیان این ژن تشدید شد تا نهایتا 48 ساعت پس از ترانسفکشن این بیان به حدود 70 درصد رسید (شکل1).

 

 

شکل1: بیان ژن Jred در سلول‏های HEK-293T. این تصاویر 48 ساعت پس از ترانسفکشن سلول‏های HEK-293T، با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس تهیه شده است (A= سلول‏های طبیعی، B= سلول‏های پس از ترانسفکشن). بزرگ‏نمایی: 100x.

 

 

ترانسداکشن سلول‏های PC12 و بیان ژن گزارشگر

حدود 48 ساعت پس از افزودن استوک ویروسی به سلول‏های PC12 اولین نشانه‏های بیان Jred با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت مشاهده شد. بیان Jred در فاصله زمانی 96 ساعت به حداکثر خود رسید (شکل2).

 

 

B

A

شکل2: بیان ژن Jred در سلول‏های PC12. این تصاویر 96 ساعت پس از پس از آلوده سازی ویروسی (ترانسدوکشن) سلول‏های PC12 که با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس تهیه شده است (A= سلول‏های طبیعی B= سلول‏ها پس از ترانسدوکشن). بزرگ‏نمایی: 50x.

 

 

افزایش بیان ژن DJ-1

ده روز پس از آلوده سازی سلول‏های PC12 توسط ویروس‏های هدف و اطمینان از بیان ترانس‏ ژن، RNA این سلول‏ها استخراج شد و با استفاده از تکنیک RT-PCR میزان بیان ژن DJ-1 قبل و بعد از ترانسدوکشن مشاهده شد (شکل3). این آزمایش‏ها نشان داد که میزان بیان DJ-1 در سلول‏های آلوده شده به ویروس PLV-DJ1 نسبت به سلول‏های طبیعی و سلول‏های آلوده شده با ویروس کنترل (pLV-Jred) افزایش یافته است (شکل 3).

 

 

 

 

M

WT

pLV-

Jred

pLV-DJ1

1000

800

600

500

400

300

200

100

260 bp

شکل 3: افزایش بیان DJ-1 در سلول‏های PC12. این تصویر ژل الکتروفورز، از نمونه‏ی واکنش مزبور بر روی قطعه ی 260 جفت بازی در ناحیه کد‏کننده ژن DJ-1 تهیه شده است. اندازه باندها بر اساس جفت باز مشخص شده است. M (مارکر 1000 جفت بازی RNAWT (Wild-type سلول‏های طبیعی PC12PLV-Jred (سلول PC12 آلوده شده با ویروس کنترل حاوی ژن JredPLV-DJ1 (سلول PC12 آلوده شده با ویروس حاوی ژن DJ-1 ).

 

 

افزایش بقای سلول‏های PC12 با افزایش بیان DJ-1

پس از اینکه سلول‏های PC12  افزایش بیان DJ-1 را به روشنی نشان دادند، توکسین 6-OHDA به گروه‏های مختلف سلولی اضافه شد تا میزان مقاومت آن‏ها در برابر سمیت پارکینسونی تعیین شود. شکل 4 تصویری از سلول‏ها را 24 ساعت پس از افزودن 6-OHDA نشان می‏دهد.

 

 

 

WT+

pLV-Jred

pLV-DJ1

WT-

 

شکل4: بقای سلول‏های PC12 در برابر سمیت پارکینسونی. این تصاویر میکروسکوپی 24 ساعت پس از تیمار سلول‏ها با توکسین 6-OHDA تهیه شده است. سلول‏های گروه WT- تنها گروه تیمار نشده است. بزرگ‏نمایی= 200x.

 


 

 

افزایش کمی بقا نورون‏ها در حضور DJ-1

داده‏های حاصل از سنجش MTT در شکل 5 نشان داده شده است. سلول‏های طبیعی و سلول‏های گروه PLV-Jred پس از تیمار به‏ترتیب به‏میزان 2±51 درصد و 4±52 درصد زنده ماندند که این میزان نسبت به درصد بقای سلول‏های هم گروه قبل از تیمار با 6-OHDA بسیار معنی‏دار بود (01/0p< ). در عین حال پس از تیمار با توکسین، بین سلول‏های طبیعی و سلول‏های گروه pLV-Jred اختلاف معنی‏داری مشاهده نشد. این در حالی است که سلول‏های pLV-DJ1 پس از تیمار با 6-OHDA به‏میزان 3 ±78 درصد زنده ماندند. این میزان بقا نسبت به‏میزان بقای سلول‏های کنترل (چه طبیعی و چه pLV-Jred) بسیار معنی‏دار بود (01/0p< ).

 

 

 

6-OHDA

-

-

+

+

+

 

شکل5: افزایش بقای سلول‏های PC12 پس از افزایش بیان DJ-1. این نمودار درصد بقای سلول‏های PC12 را پس از افزایش بیان ژن DJ-1 نشان می‏دهد که از سنجش MTT به‏دست آمده است. هر ستون نماینده 3 آزمایش مستقل است که به‏صورت تریپلیکیت انجام شده است. اختلاف آماری داده‏ها بین گرو‏ه‏های تیمار شده PLV-DJ1 و گروه طبیعی (WT)  با کنترل تیمار نشده آن‏ها با علامت ** نشان داده شده است. این اختلاف بین گروه تیمار شده pLV-DJ1  و دو گروه تیمار شده WT و pLV-Jred با علامت  ## نشان داده شده است.

 

 

 

بحث

در این مطالعه، تاثیرافزایش بیان پروتئین DJ-1 بر حفظ سلول‏های دوپامین ساز PC12 در برابر سمیت ناشی از 6-OHDA مورد بررسی قرار گرفت. در بدو امر لنتی ویروس‏های نوترکیب ساخته شد که ژن DJ-1 را با خود حمل می‏کردند (25). سلول‏های PC12 با این ویروس‏ها آلوده شده و شروع به بیان ژن گزارشگر Jred کردند که توام با DJ-1 در سازه لنتی ویروسی گنجانده شده بود. متعاقبا افزایش بیان DJ-1 نیز در سلول‏های مزبور با تکنیک RT-PCR به اثبات رسید. سلول‏های مهندسی شده فوق در معرض توکسین پارکینسونی 6-OHDA قرار گرفت. بررسی میزان بقای سلولی نشان داد که سلول‏های فوق در مقایسه با سلول‏های کنترل مقاومت معنی‏دار بیشتری نسبت به سمیت 6-OHDA نشان می‏دهند. متعاقبا آنالیز MTT نشان داد که سلول‏های PC12 با بیان فزاینده DJ-1 مقاومت بیشتر و معنی‏داری نسبت به سلول‏های کنترل در برابر توکسین پارکینسونی از خود بروز می‏دهند.

حفاظت سلول‏های دوپامین ساز در برابر سیگنال‏های مرگ یکی از استراتژی‏های مهم برای مقابله با PD و بیماری‏های وابسته به‏شمار می‏رود (26). سیگنال‏های مرگ در اثر افزایش استرس اکسیداتیو و نیز از التهاب عصبی در مغز بیماران فوق منشا می‏گیرد. در این زمینه گزارش‏ها حکایت از افزایش رادیکال‏های آزاد در جسم سیاه مغز پارکینسونی دارد و این تغییرات با اختلالات نوروبیولوژیکی مشاهده شده در مبتلایان به PD هم‏خوانی دارد (27). به این دلیل، تلاش‏ها برای به حداقل رساندن می‏تواند ارزش درمانی زیادی داشته باشد.

چندین مکانیسم دفاعی در برابر استرس اکسیداتیو وجود دارد که شامل آنتی اکسیدانت‏های غیر آنزیمی از جمله: آسکوربیک  اسید، گلوتاتیون، ویتامین E و غیره می‏باشد (28-30). همچنین مکانیسم‏های آنتی اکسیدانت آنزیمی از قبیل سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و پروکسی ردوکسین را می‏توان نام برد که جزو دفاع ضد اکسیدانی سلول به‏شمار می‏روند. علاوه بر این، مکانیسم سوم دفاع آنتی اکسیدانتی شامل تعمیر پروتئین‏های آسیب دیده و یا تجزیه آن‏ها وجود دارد که تیو رودوکسین‏ها وسیستم پروتئازومی در آن دخیل می‏باشند (31).

اینک با مسجل شدن نقش استرس اکسیداتیو در آسیب رساندن به مولکول‏های حیاتی استراتژی‏های حفاظت نورونی در این راستا تدوین و تنظیم می‏شوند که از طریق مقابله با استرس اکسیداتیو از مرگ سلول‏ها و شکل‏گیری یا پیشرفت بیماری‏های نورودژنراتیو جلوگیری نماید. شکل‏گیری چنین شیوه‏هایی حداقل در مورد PD در بدو امر مستلزم آن است که منابع باز تولید و یا افزایش استرس اکسیداتیو در مغز میانی شناسایی شوند تا سپس مکانیسم آسیب‏های وارده از آن به سلول‏های دوپامین ساز بررسی شود. با داشتن این اطلاعات می‏توان به‏دنبال یافتن راه‏ها و ابزاری رفت که این مکانیسم‏ها را مختل کرده  و با آسیب اکسیداتیو به سلول‏های مزبور مقابله نماید.

در این مطالعه مکانیسم ایجاد‏کننده و تشدید‏کننده رادیکال‏های آزاد و سیگنال‏های مرگ آفرین مغز میانی مد نظر قرار گرفت: استرس اکسیداتیو در اثر سمیت پارکینسونی که 6-OHDA آن‏را شبیه سازی می‏کند. فرضیه کانونی این مطالعه بر این اساس استوار شد که پروتئین DJ-1 به‏علت دارا بودن ویژگی‏های منحصر به‏فرد خود از نظر ضدآپوپتوزیس و ضد التهاب عصبی می‏تواند سلول‏ها را در برابر توکسین محافظت نماید.

نتایج این مطالعه بر آن است که سازه لنتی ویروسی که به سلول‏های PC12 منتقل شده است در بدو امر به‏طور موفقیت آمیز منجر به افزایش بیان ژن DJ-1 شده است. در گام بعدی این تغییر در میزان بیان DJ-1 توانسته است مقاومت سلول‏ها در برابر سمیت ناشی از 6-OHDA را به‏طور معنی‏داری افزایش دهد. این نتایج نشانگر آن است که مقدار پروتئین DJ-1 که در سلول‏های مهندسی شده PC12 بیان شده است برای مقابله با افزایش رادیکال‏های آزاد و یا خنثی سازی اثر مخرب آن‏ها تاثیرگذار  بوده و این تاثیر DJ-1 از نظر آماری محسوس بوده است. بدین ترتیب، ما در طی مطالعه حاضر لنتی ویروس DJ-1 را تولید کرده و با موفقیت آزمودیم که می‏تواند ابزار مفیدی در مطالعات حفاظت نورونی در برابر استرس اکسیداتیو و التهاب عصبی به‏شمار آید. 

نتیجه‏گیری

به‏طور خلاصه نتایج این مطالعه را می‏توان در موارد زیر خلاصه کرد:

1- افزایش بیان DJ-1 در سلول‏های PC12 با انتقال ژن آن توسط لنتی ویروس‏های نوترکیب امکانپذیر است.

2- افزایش بیان DJ-1 در سلول‏های PC12 می‏تواند با استرس اکسیداتیو ناشی از 6-OHDA مقابله کرده و سلول‏ها را حفظ نماید.

تشکروقدردانی

از کمک آقای عمران اسماعیل زاده در تهیه کلون‏ها و همکاری تکنیکی سپاسگزاری می‏شود.

1. Coyle JT, Puttfarcken P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 1993; 262(5134): 689-95.

2. Chinta SJ, Andersen JK. Dopaminergic neurons. The international journal of biochemistry & cell biology. 2005; 37(5): 942-6.

3. Gardaneh M. Dopamine-synthesizing neurons: An overview of their development and application for cell therapy. Iran J Biotechnol. 2010; 8(4): 8.

4. Smith Y, Kieval JZ. Anatomy of the dopamine system in the basal ganglia. Trends in neurosciences. 2000; 23: S28-S33.

5. Nagakubo D, Taira T, Kitaura H, Ikeda M, , et al. DJ-1, a novel oncogene which transforms mouse NIH3T3 cells in cooperation withras. Biochemical and biophysical research communications. 1997; 231(2): 509-13.

6. Hedrich K, Djarmati A, Schäfer N, Hering R, et al. DJ-1 (PARK7) mutations are less frequent than Parkin (PARK2) mutations in early-onset Parkinson disease. neurology. 2004; 62(3): 389-94.

7. Annesi G, Savettieri G, Pugliese P, D'Amelio M, et al. DJ 1 mutations and parkinsonism dementia amyotrophic lateral sclerosis complex. Annals of neurology. 2005; 58(5): 803-7.

8. Hague S, Rogaeva E, Hernandez D, Gulick C, et al. Earlyonset Parkinson's disease caused by a compound heterozygous DJ‐1 mutation. Annals of neurology. 2003; 54(2): 271-4.

9. Abou Sleiman PM, Healy DG, Quinn N, Lees AJ, Wood NW. The role of pathogenic DJ‐1 mutations in Parkinson's disease. Annals of neurology. 2003; 54(3): 283-6.

10. Takahashi K, Taira T, Niki T, Seino C, et al. DJ-1 positively regulates the androgen receptor by impairing the binding of PIASxα to the receptor. Journal of Biological Chemistry. 2001; 276(40): 37556-63.

11. Niki T, Takahashi-Niki K, Taira T, Iguchi-Ariga SM, et al. DJBP: A Novel DJ-1-Binding Protein, Negatively Regulates the Androgen Receptor by Recruiting Histone Deacetylase Complex, and DJ-1 Antagonizes This Inhibition by Abrogation of This Complex1 1 Ministry of Education, Science, Sport, Culture and Technology of Japan. 2 2 The nucleotide sequence reported in this paper has been submitted to the DDBJ/GenBank/EBI Data Bank with accession number AB073862. Molecular Cancer Research. 2003;1(4): 247-61.

12. Sekito A, Taira T, Niki T, Iguchi-Ariga SM, et al. Stimulation of transforming activity of DJ-1 by Abstrakt, a DJ-1-binding protein. International journal of oncology. 2005; 26(3): 685-9.

13. Kinumi T, Kimata J, Taira T, Ariga H, et al. Cysteine-106 of DJ-1 is the most sensitive cysteine residue to hydrogen peroxide-mediated oxidation in vivo in human umbilical vein endothelial cells. Biochemical and biophysical research communications. 2004; 317(3): 722-8.

14. Taira T, Saito Y, Niki T, Iguchi Ariga SM, et al. DJ 1 has a role in antioxidative stress to prevent cell death. EMBO reports. 2004; 5(2): 213-8.

15. Canet-Avilés RM, Wilson MA, Miller DW, Ahmad R, et al. The Parkinson's disease protein DJ-1 is neuroprotective due to cysteine-sulfinic acid-driven mitochondrial localization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2004; 101(24): 9103-8.

16. Honbou K, Suzuki NN, Horiuchi M, Niki T, et al. The crystal structure of DJ-1, a protein related to male fertility and Parkinson's disease. Journal of Biological Chemistry. 2003; 278(33): 31380-4.

17. Takahashi-Niki K, Niki T, Taira T, Iguchi-Ariga SM, et al. Reduced anti-oxidative stress activities of DJ-1 mutants found in Parkinson’s disease patients. Biochemical and biophysical research communications. 2004; 320(2): 389-97.

18. Olzmann JA, Brown K, Wilkinson KD, Rees HD, et al. Familial Parkinson's disease-associated L166P mutation disrupts DJ-1 protein folding and function. Journal of Biological Chemistry. 2004; 279(9): 8506-15.

19. Shendelman S, Jonason A, Martinat C, Leete T, et al. DJ-1 is a redox-dependent molecular chaperone that inhibits α-synuclein aggregate formation. PLoS biology. 2004; 2(11): e362.

20. Zhou W, Zhu M, Wilson MA, Petsko GA, at al. The oxidation state of DJ-1 regulates its chaperone activity toward α-synuclein. Journal of molecular biology. 2006; 356(4): 1036-48.

21. Chen L, Cagniard B, Mathews T, Jones S, et al. Age-dependent motor deficits and dopaminergic dysfunction in DJ-1 null mice. Journal of Biological Chemistry. 2005; 280(22): 21418-26.

22. Kim RH, Smith PD, Aleyasin H, Hayley S, et al. Hypersensitivity of DJ-1-deficient mice to 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyrindine (MPTP) and oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2005; 102(14): 5215-20.

23. Goldberg MS, Pisani A, Haburcak M, Vortherms TA, et al. Nigrostriatal dopaminergic deficits and hypokinesia caused by inactivation of the familial Parkinsonism-linked gene DJ-1. Neuron. 2005; 45(4): 489-96.

24. Inden M, Taira T, Kitamura Y, Yanagida T, et al. PARK7 DJ-1 protects against degeneration of nigral dopaminergic neurons in Parkinson’s disease rat model. Neurobiology of disease. 2006; 24(1): 144-58.

25. Naldini L, Dull T, Farson DA, Witt R. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors. US PATENT 6165782 A, 2000.

26. Kitamura Y, Kosaka T, Kakimura J-I, Matsuoka Y, et al. Protective effects of the antiparkinsonian drugs talipexole and pramipexole against 1-methyl-4-phenylpyridinium-induced apoptotic death in human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Molecular pharmacology. 1998; 54(6): 1046-54.

27. Dexter DT, Holley AE, Flitter WD, Slater TF, et al. Increased levels of lipid hydroperoxides in the parkinsonian substantia nigra: an HPLC and ESR study. Movement Disorders. 1994; 9(1): 92-7.

28. Frei B. Ascorbic acid protects lipids in human plasma and low-density lipoprotein against oxidative damage. The American journal of clinical nutrition. 1991; 54(6 Suppl): 1113S-8S.

29. Dhitavat S, Ortiz D, Rogers E, Rivera E, S, et al. Folate, vitamin E, and acetyl-L-carnitine provide synergistic protection against oxidative stress resulting from exposure of human neuroblastoma cells to amyloid-beta. Brain research. 2005; 1061(2): 114-7.

30. Grant CM, MacIver FH, Dawes IW. Glutathione is an essential metabolite required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current genetics. 1996; 29(6): 511-5.

31. Jung T, Catalgol B, Grune T. The proteasomal system. Molecular aspects of medicine. 2009; 30(4): 191-296.