افزایش بقای سلول‏های دوپامین ساز PC12 در برابر سمیت 6-OHDA با افزایش بیان فاکتور DJ-1

مقدمه

آسیب پذیر شدن سیستم‏های عصبی ویژگی بارز بیماری‏های دژنراتیو مغزی وابسته به سن می‏باشد. از جمله این بیماری‏ها Parkinson’s disease(PD)، Huntington’s disease(HD) و Amyotrophic lateral sclerosis(ALS) را می‏توان نام برد (1). بخش وسیعی از تحقیقات بر روی استرس اکسیداتیو متمرکز شده است که عامل تباهی و زوال نورون‏ها در این بیماری‏ها می‏باشند. گونه‏های واکنش‏گر اکسیژن مانند آنیون سوپراکسید، رادیکال هیدروکسیل و هیدروژن پروکسید در جریان متابولیزه شدن اکسیژن به‏عنوان محصولات فرعی در سلول‏ها تولید می‏شوند که از جمله مهم‏ترین عوامل آسیب رسان به نورون‏ها می‏باشند (1).

 بیماری پارکینسون (PD) یک بیماری وابسته به سن است که در آن با پیشرفت سن، زوال سلول‏های دوپامین ساز رخ داده و نشانه‏های بیماری بروز می‏کند. تقریبا 90 درصد کل نورون‏های دوپامین ساز مغز در بخش شکمی مزنسفالون قرار گرفته‏اند (2). در پستانداران نورون‏های دوپامین ساز مزونسفالیک (Mes-Daergic) در سه زیرناحیه ی متمایز مغز مستقر می‏شوند: Substantia nigra pars compacta(SNpc)، Ventral tegmental area(VTA) و Retrorubral field (RRF) (3). شاخص‏ترین تقسیم بندی مسیرهای دوپامین ساز، مسیر نیگرو-استریاتال (SN-ST) است که از SNpc منشا گرفته و به استریاتوم پشتی که شامل بخش های Putamen و Caudate است ادامه می‏یابد (4).

یکی از ژن‏های مهم دخیل در بروز PD، ژن DJ-1 می‏باشد. DJ-1 در آغاز به‏عنوان یک انکوژن شناسایی شد (5). سیزده جهش شامل جهش‏های نقطه‏ای و حذفی در ژن DJ-1 در PD شناسایی شده است (6-9). DJ-1 عملکردهای متفاوتی دارد از جمله تنظیم رونویسی ژن‏های پایین دست و فعالیت‏های ضد استرس اکسیداتیو. فرض بر این است که نقص در فعالیت‏های ضد استرس اکسیداتیو منجر به بروز PD می‏شود (10-12). بیان DJ-1  در سلول‏هایی که در معرض استرس اکسیداتیو قرار گرفته اند افزایش می‏یابد. در هنگام افزایش استرس اکسیداتیو آمینو اسید سیستئین در پروتئین DJ-1 در موقعیت 106 (C 106) اکسیده شده و به این ترتیب گونه‏های واکنش‏گر اکسیژن (ROS) را از محیط جمع آوری و خنثی می‏کند (13-15). کاهش فعالیت‏های آنتی اکسیدانتی در موارد جهش یافته‏ی DJ-1 در بیماران مبتلا به PD گزارش شده است  (17). بررسی‏های ساختاری و بیوشیمیایی نشان داده اند که DJ-1 به‏صورت همودایمر درمی‏آید و بیشترین کارآیی را در فرم همودایمر از خود نشان می‏دهد (14، 16و17). این آنالیزها نشان می‏دهند که DJ-1 به‏عنوان پروتئاز (16و18) و چاپرون (19و20) نیز فعالیت می‏کند. مطالعاتی که بر روی موش‏های فاقد ژن  DJ-1 انجام شد نشان داد که فقدان این ژن منجر به از بین رفتن فعالیت گیرنده دوپامین و حساس شدن سلول‏ها در برابر استرس اکسیداتیو می‏شود، این یافته‏ها پیشنهاد می‏کنند که نقص عملکرد DJ-1 با PD مرتبط است (21-23). در مطالعات In vivo که بر روی Rat های مدل پارکینسونی انجام شد نشان داد که پروتئین DJ-1 پس از تزریق 6-OHDA مرگ نورون‏های دوپامین ساز را در Substantia nigra مهار کرده، اختلالات رفتاری القا شده با 6-OHDA را بهبود بخشیده و سطح ROS را در سلول‏ها کاهش می‏دهد (24).

در مطالعه جاری، بر آن شدیم که اولا لنتی ویروس‏های ناقل ژن DJ-1 را به‏طور موفقیت آمیز تولید نمائیم، دوما با انتقال این ویروس‏ها به‏داخل سلول‏های دوپامین ساز PC12 بیان آن‏را در سلول‏های مزبور افزایش دهیم و ثالثا تاثیر این افزایش بیان را بر بقای سلول‏ها در برابر سمیت با 6-OHDA بسنجیم.

مواد و روش‏ها

ناقل‏های ویروسی شامل ناقل انتقال، ناقل غشا و ناقل بسته بندی با استفاده از کیت ماکسی پرپ کیاژن تهیه و تخلیص شدند.  سلول‏های HEK-293T از آزمایشگاه KL OMALLEY از دانشگاه واشنگتن در سنت لوئیس میسوری تهیه شده است.

کشت سلول: سلول‏های HECK-293T که نقش مولد ویروس را بازی می‏کنند در محیط DMEM حاوی FBS 10 درصد، در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و  CO₂ 5 درصد کشت و پاساژ داده شدند. حدود دو و نیم میلیون سلول در پتری دیش‏های 10 سانتی‏متری مخصوص کشت سلول، کشت داده شدند تا در روز بعد 60 درصد پتری دیش را پر کنند. همچنین سلول‏های نورونی PC12 به‏عنوان سلول‏های هدف ویروس، در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و CO₂ 5 درصد کشت و پاساژ داده شدند. برای آلوده سازی ویروسی تعداد 50 هزار سلول PC12 در پلیت 24 خانه، 24 ساعت قبل از آلوده سازی کشت داده شدند.

تولید ویروس: برای تولید لنتی ویروس‏های نوترکیب، سلول‏های مولد ویروس یعنی HEK-293T هم‏زمان با سه ناقل لنتی ویروسی به مقدار 20 میکروگرم از ناقل ترانسفر و 15 میکروگرم از هر یک از ناقلین بسته بندی و غشایی، با روش رسوب DNA- فسفات کلسیم ترانسفکت شد. این سه ناقل همراه با 50 میکرولیتر از کلرید کلسیم 5/2 میلی مولار، با آب استریل به حجم 500 میکرولیتر رسیدند و هم حجم آن HEPES اضافه شد. محلول حاصل 30 دقیقه در زیر هود و در دمای اتاق انکوبه شد تا رسوب مورد نظر به‏دست آید. سپس این رسوب قطره قطره به محیط سلول‏های HEK-293T اضافه شد. سلول‏ها به‏مدت 8 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه شدند و سپس محیط آن‏ها با محیط جدید تعویض شد. این سلول‏ها جهت تولید ویروس و رها سازی آن به محیط کشت، در انکوباتور دمای 37 درجه سانتی‏گراد و فشار CO₂ 5 درصد نگه‏داری شدند. 

تغلیظ ویروس و آلوده سازی سلول‏های هدف: محیط سلول‏های ترنسفکت شده، 24، 48 و 72 ساعت جمع آوری و از فیلتر 45/0 میکرون عبور داده شد. سپس محیط فیلتر شده به‏درون ستون‏های آمیکون 100 MW منتقل و مدت 10 الی 15 دقیقه در دور 4000 rpm سانتریفیوژ شد. محلول حاصل باقی مانده پشت فیلتر که سرشار از ذرات ویریونی بود جمع آوری شد. حجم‏های مختلف از این محلول برای آلوده سازی سلول‏های هدف یعنی PC12 استفاده شد. سپس سلول‏های مزبور در شرایط انکوباتوری ذکر شده قرار داده شدند تا بیان ژن J-RED  موجود در ناقل انتقالی، توسط میکروسکوپ فلورسنت مشاهده و بررسی شود.

استخراج RNA و آزمایش RT-PCR: نود و شش ساعت پس از ترانسدوکشن، کل RNA سلولی توسط کیت حاوی RNX (سیناژن) استخراج شده و پس از اطمینان از سلامت کامل آن روی ژل، 2 میکروگرم از آن برای سنتز cDNA به‏کار برده شد. ساخت cDNA به‏کمک آنزیم ترانسکریپتاز معکوس از (Fermentas, Lithuania) و در حضور هگزامرهای رندوم و مهار‏کننده RNase صورت گرفت. برای تکثیر یک قطعه 260 جفت بازی از cDNA ی مربوط به DJ-1 انسانی، جفت پرایمر زیر بر اساس توالی کد‏کننده آن طراحی و سنتز شد  (Genebank accession no.NG008271)

Forward: 5′-CGGGGTGCAGGCTTGTAAA-3′

Reverse: 5′-ACCACATCACGGCTACACTG-3′

مقادیر یکسان از نمونه‏های cDNA برای آزمایش PCR مورد استفاده قرار گرفت. پس از 2 دقیقه از دناتوراسیون نمونه‏ها در دمای 95 درجه سانتی‏گراد، واکنش PCR با سیکل دناتوراسیون در 95 درجه سانتی‏گراد به‏مدت یک دقیقه، Annealing در 57 درجه سانتی‏گراد برای یک دقیقه و مرحله‏ی Extension در 72 درجه ی سانتی‏گراد به‏مدت 45 ثانیه به انجام رسید. محصولات PCR با استفاده از ژل آگاروز 5/1 درصد آنالیز و عکس برداری شد.

ایجاد سمیت پارکینسونی و سنجش بقا: سلول‏های آلوده شده و سلول‏های کنترل در معرض غلظت 100 میکرومولار از توکسین 6-OHDA به‏عنوان LD50  قرار گرفتند و پس از 48 ساعت میزان بقای آن‏ها با روش 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT)  اندازه‏گیری شد. استوک 5 میلی‏مولار 6-OHDA (سیگما) حاوی 9/0 درصد سالین (Phosphate buffered saline)،
1/0 درصد آسکوربات و 10 میلی diethylenetriaminepentaacetic acid (DETAPAC) در نیتروژن حل شده و قبل از ذخیره سازی در دمای 20- درجه سانتی‏گراد توسط فیلتراسیون، استریل شد. برای تعیین LD50 توکسین، سلول‏ها توسط رقت‏های سریالی از 6-OHDA برای مدت 24 ساعت تیمار شدند و غلظتی از توکسین که در آن نیمی از سلول‏ها از بین می‏رفتند به‏عنوان LD50 انتخاب شد. همچنین برای سنجش MTT، با حل کردن استوک این ماده در سالین، غلظت 5 میلی‏گرم در میلی‏لیتر از آن تهیه شد و پس از استریل کردن آن توسط فیلتراسیون، 20 میکرولیتر از آن به 180 میکرولیتر از محیط DMEM فاقد FBS در هر چاهک اضافه شد و به‏مدت 3 ساعت در شرایط انکوباتوری ذکر شده نگه‏داری شد. سپس این محیط با 200 میکرولیتر از Dimethyl Sulfoxide(DMSO) جایگزین شد و پس از 5 دقیقه انکوبه شدن، میزان جذب در طول موج 580 نانومتر اندازه‏گیری شد.

نتایج

تولید لنتی ویروس‏های نوترکیب pLV-DJ1

سلول‏های ترانسفکت شده در فواصل زمانی متوالی در زیر میکروسکوپ فلورسنت مشاهده گردید. این مشاهدات آغاز بیان ژن Jred را در سلول‏های HEK-293T، 9 ساعت پس از ترانسفکشن نشان داد. در ساعات بعدی بیان این ژن تشدید شد تا نهایتا 48 ساعت پس از ترانسفکشن این بیان به حدود 70 درصد رسید (شکل1).

شکل1: بیان ژن Jred در سلول‏های HEK-293T. این تصاویر 48 ساعت پس از ترانسفکشن سلول‏های HEK-293T، با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس تهیه شده است (A= سلول‏های طبیعی، B= سلول‏های پس از ترانسفکشن). بزرگ‏نمایی: 100x.

ترانسداکشن سلول‏های PC12 و بیان ژن گزارشگر

حدود 48 ساعت پس از افزودن استوک ویروسی به سلول‏های PC12 اولین نشانه‏های بیان Jred با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت مشاهده شد. بیان Jred در فاصله زمانی 96 ساعت به حداکثر خود رسید (شکل2).

شکل2: بیان ژن Jred در سلول‏های PC12. این تصاویر 96 ساعت پس از پس از آلوده سازی ویروسی (ترانسدوکشن) سلول‏های PC12 که با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس تهیه شده است (A= سلول‏های طبیعی B= سلول‏ها پس از ترانسدوکشن). بزرگ‏نمایی: 50x.

افزایش بیان ژن DJ-1

ده روز پس از آلوده سازی سلول‏های PC12 توسط ویروس‏های هدف و اطمینان از بیان ترانس‏ ژن، RNA این سلول‏ها استخراج شد و با استفاده از تکنیک RT-PCR میزان بیان ژن DJ-1 قبل و بعد از ترانسدوکشن مشاهده شد (شکل3). این آزمایش‏ها نشان داد که میزان بیان DJ-1 در سلول‏های آلوده شده به ویروس PLV-DJ1 نسبت به سلول‏های طبیعی و سلول‏های آلوده شده با ویروس کنترل (pLV-Jred) افزایش یافته است (شکل 3).

شکل 3: افزایش بیان DJ-1 در سلول‏های PC12. این تصویر ژل الکتروفورز، از نمونه‏ی واکنش مزبور بر روی قطعه ی 260 جفت بازی در ناحیه کد‏کننده ژن DJ-1 تهیه شده است. اندازه باندها بر اساس جفت باز مشخص شده است. M (مارکر 1000 جفت بازی RNA)، WT (Wild-type سلول‏های طبیعی PC12)، PLV-Jred (سلول PC12 آلوده شده با ویروس کنترل حاوی ژن Jred)، PLV-DJ1 (سلول PC12 آلوده شده با ویروس حاوی ژن DJ-1 ).

افزایش بقای سلول‏های PC12 با افزایش بیان DJ-1

پس از اینکه سلول‏های PC12  افزایش بیان DJ-1 را به روشنی نشان دادند، توکسین 6-OHDA به گروه‏های مختلف سلولی اضافه شد تا میزان مقاومت آن‏ها در برابر سمیت پارکینسونی تعیین شود. شکل 4 تصویری از سلول‏ها را 24 ساعت پس از افزودن 6-OHDA نشان می‏دهد.

شکل4: بقای سلول‏های PC12 در برابر سمیت پارکینسونی. این تصاویر میکروسکوپی 24 ساعت پس از تیمار سلول‏ها با توکسین 6-OHDA تهیه شده است. سلول‏های گروه WT- تنها گروه تیمار نشده است. بزرگ‏نمایی= 200x.

افزایش کمی بقا نورون‏ها در حضور DJ-1

داده‏های حاصل از سنجش MTT در شکل 5 نشان داده شده است. سلول‏های طبیعی و سلول‏های گروه PLV-Jred پس از تیمار به‏ترتیب به‏میزان 2±51 درصد و 4±52 درصد زنده ماندند که این میزان نسبت به درصد بقای سلول‏های هم گروه قبل از تیمار با 6-OHDA بسیار معنی‏دار بود (01/0p< ). در عین حال پس از تیمار با توکسین، بین سلول‏های طبیعی و سلول‏های گروه pLV-Jred اختلاف معنی‏داری مشاهده نشد. این در حالی است که سلول‏های pLV-DJ1 پس از تیمار با 6-OHDA به‏میزان 3 ±78 درصد زنده ماندند. این میزان بقا نسبت به‏میزان بقای سلول‏های کنترل (چه طبیعی و چه pLV-Jred) بسیار معنی‏دار بود (01/0p< ).

شکل5: افزایش بقای سلول‏های PC12 پس از افزایش بیان DJ-1. این نمودار درصد بقای سلول‏های PC12 را پس از افزایش بیان ژن DJ-1 نشان می‏دهد که از سنجش MTT به‏دست آمده است. هر ستون نماینده 3 آزمایش مستقل است که به‏صورت تریپلیکیت انجام شده است. اختلاف آماری داده‏ها بین گرو‏ه‏های تیمار شده PLV-DJ1 و گروه طبیعی (WT)  با کنترل تیمار نشده آن‏ها با علامت ** نشان داده شده است. این اختلاف بین گروه تیمار شده pLV-DJ1  و دو گروه تیمار شده WT و pLV-Jred با علامت  ## نشان داده شده است.