لاسمی, سینا, گردانه, موسی, اکبری, پروین. (1395). افزایش بقای سلولهای دوپامین ساز PC12 در برابر سمیت 6-OHDA با افزایش بیان فاکتور DJ-1. مجله سلول و بافت (Cell & Tissue Journal), 7(2), 141-148.
سینا لاسمی; موسی گردانه; پروین اکبری. "افزایش بقای سلولهای دوپامین ساز PC12 در برابر سمیت 6-OHDA با افزایش بیان فاکتور DJ-1". مجله سلول و بافت (Cell & Tissue Journal), 7, 2, 1395, 141-148.
لاسمی, سینا, گردانه, موسی, اکبری, پروین. (1395). 'افزایش بقای سلولهای دوپامین ساز PC12 در برابر سمیت 6-OHDA با افزایش بیان فاکتور DJ-1', مجله سلول و بافت (Cell & Tissue Journal), 7(2), pp. 141-148.
لاسمی, سینا, گردانه, موسی, اکبری, پروین. افزایش بقای سلولهای دوپامین ساز PC12 در برابر سمیت 6-OHDA با افزایش بیان فاکتور DJ-1. مجله سلول و بافت (Cell & Tissue Journal), 1395; 7(2): 141-148.
افزایش بقای سلولهای دوپامین ساز PC12 در برابر سمیت 6-OHDA با افزایش بیان فاکتور DJ-1
1دانشجوی کارشناسی ارشد زیست شناسی سلولی- مولکولی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران
2پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، پژوهشکده پزشکی، دپارتمان سلولهای بنیادی و پزشکی ترمیمی، تهران، ایران
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه بررسی تاثیر DJ-1 بر افزایش بقای سلولهای دوپامین ساز در برابر سمیت پارکینسونی میباشد. مواد و روشها: ابتدا لنتی ویروسهای نوترکیب ناقل توام ژن های DJ-1 و گزارشگر Jred تولید شده و برای آلوده سازی سلولها استفاده شدند. بدین منظور سه پلاسمید لنتی ویروسی بهنامهای ناقل، بسته بندی و غشا برای ترانسفکشن سلولهای HEK-293T بهعنوان رده سلولی مولد ویروس بهکار برده شدند. محیط سلولهای ترانسفکت شده 24 و 48 ساعت جمع آوری و تغلیظ شد تا ذخیرة لنتی ویروسی بهدست آید. بهدنبال ترانسدوکشن سلولهای دوپامین ساز PC12 با این ذخیرة غلیظ ویروسی، سلولهای مزبور افزایش بیان DJ-1 را آغاز کردند. پس از تیمار این سلولها با توکسین 6-OHDA، میزان بقای آنها در مقایسه با شاهد اندازهگیری شد. نتایج: مراحل ترانسفکشن سلولهای HEK-293T و آلودگی سلولهای PC12 با ذخیرة ویروسی بهطور موفقیت آمیز به انجام رسید، زیرا بیان ژن گزارشگر Jred با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس در هر دو مرحله مشاهده شد. سپس افزایش بیان DJ-1 با تکنیک RT- PCR اثبات شد. آزمایشهای بعدی نشان داد که افزایش بیان DJ-1 باعث افزایش چشمگیری در بقای سلولهای PC12 در برابر سمیت ناشی از 6-OHDA میشود. درصد بقای سلولهای PC12 که افزایش بیان DJ-1 داشتند، در حدود 30 درصد بیشتر از درصد بقای سلولهای کنترل برآورد شد و این افزایش از نظر آماری معنیدار بود. نتیجهگیری: افزایش بیان ژن DJ-1 در سلولهای دوپامین ساز PC12 مقاومت و بقای این سلولها را در برابر سمیت نورونی 6-OHDA بهطور معنیدار و چشمگیری افزایش میدهد.
آسیب پذیر شدن سیستمهای عصبی ویژگی بارز بیماریهای دژنراتیو مغزی وابسته به سن میباشد. از جمله این بیماریها Parkinson’s disease(PD)، Huntington’s disease(HD) و Amyotrophic lateral sclerosis(ALS) را میتوان نام برد (1). بخش وسیعی از تحقیقات بر روی استرس اکسیداتیو متمرکز شده است که عامل تباهی و زوال نورونها در این بیماریها میباشند. گونههای واکنشگر اکسیژن مانند آنیون سوپراکسید، رادیکال هیدروکسیل و هیدروژن پروکسید در جریان متابولیزه شدن اکسیژن بهعنوان محصولات فرعی در سلولها تولید میشوند که از جمله مهمترین عوامل آسیب رسان به نورونها میباشند (1).
بیماری پارکینسون (PD) یک بیماری وابسته به سن است که در آن با پیشرفت سن، زوال سلولهای دوپامین ساز رخ داده و نشانههای بیماری بروز میکند. تقریبا 90 درصد کل نورونهای دوپامین ساز مغز در بخش شکمی مزنسفالون قرار گرفتهاند (2). در پستانداران نورونهای دوپامین ساز مزونسفالیک (Mes-Daergic) در سه زیرناحیه ی متمایز مغز مستقر میشوند: Substantia nigra pars compacta(SNpc)، Ventral tegmental area(VTA) و Retrorubral field (RRF) (3). شاخصترین تقسیم بندی مسیرهای دوپامین ساز، مسیر نیگرو-استریاتال (SN-ST) است که از SNpc منشا گرفته و به استریاتوم پشتی که شامل بخش های Putamen و Caudate است ادامه مییابد (4).
یکی از ژنهای مهم دخیل در بروز PD، ژن DJ-1 میباشد. DJ-1 در آغاز بهعنوان یک انکوژن شناسایی شد (5). سیزده جهش شامل جهشهای نقطهای و حذفی در ژن DJ-1 در PD شناسایی شده است (6-9). DJ-1 عملکردهای متفاوتی دارد از جمله تنظیم رونویسی ژنهای پایین دست و فعالیتهای ضد استرس اکسیداتیو. فرض بر این است که نقص در فعالیتهای ضد استرس اکسیداتیو منجر به بروز PD میشود (10-12). بیان DJ-1 در سلولهایی که در معرض استرس اکسیداتیو قرار گرفته اند افزایش مییابد. در هنگام افزایش استرس اکسیداتیو آمینو اسید سیستئین در پروتئین DJ-1 در موقعیت 106 (C 106) اکسیده شده و به این ترتیب گونههای واکنشگر اکسیژن (ROS) را از محیط جمع آوری و خنثی میکند (13-15). کاهش فعالیتهای آنتی اکسیدانتی در موارد جهش یافتهی DJ-1 در بیماران مبتلا به PD گزارش شده است (17). بررسیهای ساختاری و بیوشیمیایی نشان داده اند که DJ-1 بهصورت همودایمر درمیآید و بیشترین کارآیی را در فرم همودایمر از خود نشان میدهد (14، 16و17). این آنالیزها نشان میدهند که DJ-1 بهعنوان پروتئاز (16و18) و چاپرون (19و20) نیز فعالیت میکند. مطالعاتی که بر روی موشهای فاقد ژن DJ-1 انجام شد نشان داد که فقدان این ژن منجر به از بین رفتن فعالیت گیرنده دوپامین و حساس شدن سلولها در برابر استرس اکسیداتیو میشود، این یافتهها پیشنهاد میکنند که نقص عملکرد DJ-1 با PD مرتبط است (21-23). در مطالعات In vivo که بر روی Rat های مدل پارکینسونی انجام شد نشان داد که پروتئین DJ-1 پس از تزریق 6-OHDA مرگ نورونهای دوپامین ساز را در Substantia nigra مهار کرده، اختلالات رفتاری القا شده با 6-OHDA را بهبود بخشیده و سطح ROS را در سلولها کاهش میدهد (24).
در مطالعه جاری، بر آن شدیم که اولا لنتی ویروسهای ناقل ژن DJ-1 را بهطور موفقیت آمیز تولید نمائیم، دوما با انتقال این ویروسها بهداخل سلولهای دوپامین ساز PC12 بیان آنرا در سلولهای مزبور افزایش دهیم و ثالثا تاثیر این افزایش بیان را بر بقای سلولها در برابر سمیت با 6-OHDA بسنجیم.
مواد و روشها
ناقلهای ویروسی شامل ناقل انتقال، ناقل غشا و ناقل بسته بندی با استفاده از کیت ماکسی پرپ کیاژن تهیه و تخلیص شدند. سلولهای HEK-293T از آزمایشگاه KL OMALLEY از دانشگاه واشنگتن در سنت لوئیس میسوری تهیه شده است.
کشت سلول: سلولهای HECK-293T که نقش مولد ویروس را بازی میکنند در محیط DMEM حاوی FBS 10 درصد، در دمای 37 درجه سانتیگراد و CO2 5 درصد کشت و پاساژ داده شدند. حدود دو و نیم میلیون سلول در پتری دیشهای 10 سانتیمتری مخصوص کشت سلول، کشت داده شدند تا در روز بعد 60 درصد پتری دیش را پر کنند. همچنین سلولهای نورونی PC12 بهعنوان سلولهای هدف ویروس، در دمای 37 درجه سانتیگراد و CO2 5 درصد کشت و پاساژ داده شدند. برای آلوده سازی ویروسی تعداد 50 هزار سلول PC12 در پلیت 24 خانه، 24 ساعت قبل از آلوده سازی کشت داده شدند.
تولید ویروس: برای تولید لنتی ویروسهای نوترکیب، سلولهای مولد ویروس یعنی HEK-293T همزمان با سه ناقل لنتی ویروسی به مقدار 20 میکروگرم از ناقل ترانسفر و 15 میکروگرم از هر یک از ناقلین بسته بندی و غشایی، با روش رسوب DNA- فسفات کلسیم ترانسفکت شد. این سه ناقل همراه با 50 میکرولیتر از کلرید کلسیم 5/2 میلی مولار، با آب استریل به حجم 500 میکرولیتر رسیدند و هم حجم آن HEPES اضافه شد. محلول حاصل 30 دقیقه در زیر هود و در دمای اتاق انکوبه شد تا رسوب مورد نظر بهدست آید. سپس این رسوب قطره قطره به محیط سلولهای HEK-293T اضافه شد. سلولها بهمدت 8 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند و سپس محیط آنها با محیط جدید تعویض شد. این سلولها جهت تولید ویروس و رها سازی آن به محیط کشت، در انکوباتور دمای 37 درجه سانتیگراد و فشار CO2 5 درصد نگهداری شدند.
تغلیظ ویروس و آلوده سازی سلولهای هدف: محیط سلولهای ترنسفکت شده، 24، 48 و 72 ساعت جمع آوری و از فیلتر 45/0 میکرون عبور داده شد. سپس محیط فیلتر شده بهدرون ستونهای آمیکون 100 MW منتقل و مدت 10 الی 15 دقیقه در دور 4000 rpm سانتریفیوژ شد. محلول حاصل باقی مانده پشت فیلتر که سرشار از ذرات ویریونی بود جمع آوری شد. حجمهای مختلف از این محلول برای آلوده سازی سلولهای هدف یعنی PC12 استفاده شد. سپس سلولهای مزبور در شرایط انکوباتوری ذکر شده قرار داده شدند تا بیان ژن J-RED موجود در ناقل انتقالی، توسط میکروسکوپ فلورسنت مشاهده و بررسی شود.
استخراج RNA و آزمایش RT-PCR: نود و شش ساعت پس از ترانسدوکشن، کل RNA سلولی توسط کیت حاوی RNX (سیناژن) استخراج شده و پس از اطمینان از سلامت کامل آن روی ژل، 2 میکروگرم از آن برای سنتز cDNA بهکار برده شد. ساخت cDNA بهکمک آنزیم ترانسکریپتاز معکوس از (Fermentas, Lithuania) و در حضور هگزامرهای رندوم و مهارکننده RNase صورت گرفت. برای تکثیر یک قطعه 260 جفت بازی از cDNA ی مربوط به DJ-1 انسانی، جفت پرایمر زیر بر اساس توالی کدکننده آن طراحی و سنتز شد (Genebank accession no.NG008271)
Forward: 5′-CGGGGTGCAGGCTTGTAAA-3′
Reverse: 5′-ACCACATCACGGCTACACTG-3′
مقادیر یکسان از نمونههای cDNA برای آزمایش PCR مورد استفاده قرار گرفت. پس از 2 دقیقه از دناتوراسیون نمونهها در دمای 95 درجه سانتیگراد، واکنش PCR با سیکل دناتوراسیون در 95 درجه سانتیگراد بهمدت یک دقیقه، Annealing در 57 درجه سانتیگراد برای یک دقیقه و مرحلهی Extension در 72 درجه ی سانتیگراد بهمدت 45 ثانیه به انجام رسید. محصولات PCR با استفاده از ژل آگاروز 5/1 درصد آنالیز و عکس برداری شد.
ایجاد سمیت پارکینسونی و سنجش بقا: سلولهای آلوده شده و سلولهای کنترل در معرض غلظت 100 میکرومولار از توکسین 6-OHDA بهعنوان LD50 قرار گرفتند و پس از 48 ساعت میزان بقای آنها با روش 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT) اندازهگیری شد. استوک 5 میلیمولار 6-OHDA (سیگما) حاوی 9/0 درصد سالین (Phosphate buffered saline)، 1/0 درصد آسکوربات و 10 میلی diethylenetriaminepentaacetic acid (DETAPAC) در نیتروژن حل شده و قبل از ذخیره سازی در دمای 20- درجه سانتیگراد توسط فیلتراسیون، استریل شد. برای تعیین LD50 توکسین، سلولها توسط رقتهای سریالی از 6-OHDA برای مدت 24 ساعت تیمار شدند و غلظتی از توکسین که در آن نیمی از سلولها از بین میرفتند بهعنوان LD50 انتخاب شد. همچنین برای سنجش MTT، با حل کردن استوک این ماده در سالین، غلظت 5 میلیگرم در میلیلیتر از آن تهیه شد و پس از استریل کردن آن توسط فیلتراسیون، 20 میکرولیتر از آن به 180 میکرولیتر از محیط DMEM فاقد FBS در هر چاهک اضافه شد و بهمدت 3 ساعت در شرایط انکوباتوری ذکر شده نگهداری شد. سپس این محیط با 200 میکرولیتر از Dimethyl Sulfoxide(DMSO) جایگزین شد و پس از 5 دقیقه انکوبه شدن، میزان جذب در طول موج 580 نانومتر اندازهگیری شد.
نتایج
تولید لنتی ویروسهای نوترکیب pLV-DJ1
سلولهای ترانسفکت شده در فواصل زمانی متوالی در زیر میکروسکوپ فلورسنت مشاهده گردید. این مشاهدات آغاز بیان ژن Jred را در سلولهای HEK-293T، 9 ساعت پس از ترانسفکشن نشان داد. در ساعات بعدی بیان این ژن تشدید شد تا نهایتا 48 ساعت پس از ترانسفکشن این بیان به حدود 70 درصد رسید (شکل1).
شکل1: بیان ژن Jred در سلولهای HEK-293T. این تصاویر 48 ساعت پس از ترانسفکشن سلولهای HEK-293T، با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس تهیه شده است (A= سلولهای طبیعی، B= سلولهای پس از ترانسفکشن). بزرگنمایی: 100x.
ترانسداکشن سلولهای PC12 و بیان ژن گزارشگر
حدود 48 ساعت پس از افزودن استوک ویروسی به سلولهای PC12 اولین نشانههای بیان Jred با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت مشاهده شد. بیان Jred در فاصله زمانی 96 ساعت به حداکثر خود رسید (شکل2).
B
A
شکل2: بیان ژن Jred در سلولهای PC12. این تصاویر 96 ساعت پس از پس از آلوده سازی ویروسی (ترانسدوکشن) سلولهای PC12 که با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس تهیه شده است (A= سلولهای طبیعی B= سلولها پس از ترانسدوکشن). بزرگنمایی: 50x.
افزایش بیان ژن DJ-1
ده روز پس از آلوده سازی سلولهای PC12 توسط ویروسهای هدف و اطمینان از بیان ترانس ژن، RNA این سلولها استخراج شد و با استفاده از تکنیک RT-PCR میزان بیان ژن DJ-1 قبل و بعد از ترانسدوکشن مشاهده شد (شکل3). این آزمایشها نشان داد که میزان بیان DJ-1 در سلولهای آلوده شده به ویروس PLV-DJ1 نسبت به سلولهای طبیعی و سلولهای آلوده شده با ویروس کنترل (pLV-Jred) افزایش یافته است (شکل 3).
M
WT
pLV-
Jred
pLV-DJ1
1000
800
600
500
400
300
200
100
260 bp
شکل 3: افزایش بیان DJ-1 در سلولهای PC12. این تصویر ژل الکتروفورز، از نمونهی واکنش مزبور بر روی قطعه ی 260 جفت بازی در ناحیه کدکننده ژن DJ-1 تهیه شده است. اندازه باندها بر اساس جفت باز مشخص شده است. M (مارکر 1000 جفت بازی RNA)، WT (Wild-type سلولهای طبیعی PC12)، PLV-Jred (سلول PC12 آلوده شده با ویروس کنترل حاوی ژن Jred)، PLV-DJ1 (سلول PC12 آلوده شده با ویروس حاوی ژن DJ-1 ).
افزایش بقای سلولهای PC12 با افزایش بیان DJ-1
پس از اینکه سلولهای PC12 افزایش بیان DJ-1 را به روشنی نشان دادند، توکسین 6-OHDA به گروههای مختلف سلولی اضافه شد تا میزان مقاومت آنها در برابر سمیت پارکینسونی تعیین شود. شکل 4 تصویری از سلولها را 24 ساعت پس از افزودن 6-OHDA نشان میدهد.
WT+
pLV-Jred
pLV-DJ1
WT-
شکل4: بقای سلولهای PC12 در برابر سمیت پارکینسونی. این تصاویر میکروسکوپی 24 ساعت پس از تیمار سلولها با توکسین 6-OHDA تهیه شده است. سلولهای گروه WT- تنها گروه تیمار نشده است. بزرگنمایی= 200x.
افزایش کمی بقا نورونها در حضور DJ-1
دادههای حاصل از سنجش MTT در شکل 5 نشان داده شده است. سلولهای طبیعی و سلولهای گروه PLV-Jred پس از تیمار بهترتیب بهمیزان 2±51 درصد و 4±52 درصد زنده ماندند که این میزان نسبت به درصد بقای سلولهای هم گروه قبل از تیمار با 6-OHDA بسیار معنیدار بود (01/0p< ). در عین حال پس از تیمار با توکسین، بین سلولهای طبیعی و سلولهای گروه pLV-Jred اختلاف معنیداری مشاهده نشد. این در حالی است که سلولهای pLV-DJ1 پس از تیمار با 6-OHDA بهمیزان 3 ±78 درصد زنده ماندند. این میزان بقا نسبت بهمیزان بقای سلولهای کنترل (چه طبیعی و چه pLV-Jred) بسیار معنیدار بود (01/0p< ).
6-OHDA
-
-
+
+
+
شکل5: افزایش بقای سلولهای PC12 پس از افزایش بیان DJ-1. این نمودار درصد بقای سلولهای PC12 را پس از افزایش بیان ژن DJ-1 نشان میدهد که از سنجش MTT بهدست آمده است. هر ستون نماینده 3 آزمایش مستقل است که بهصورت تریپلیکیت انجام شده است. اختلاف آماری دادهها بین گروههای تیمار شده PLV-DJ1 و گروه طبیعی(WT) با کنترل تیمار نشده آنها با علامت ** نشان داده شده است. این اختلاف بین گروه تیمار شده pLV-DJ1 و دو گروه تیمار شده WT و pLV-Jred با علامت ## نشان داده شده است.
بحث
در این مطالعه، تاثیرافزایش بیان پروتئین DJ-1 بر حفظ سلولهای دوپامین ساز PC12 در برابر سمیت ناشی از 6-OHDA مورد بررسی قرار گرفت. در بدو امر لنتی ویروسهای نوترکیب ساخته شد که ژن DJ-1 را با خود حمل میکردند (25). سلولهای PC12 با این ویروسها آلوده شده و شروع به بیان ژن گزارشگر Jred کردند که توام با DJ-1 در سازه لنتی ویروسی گنجانده شده بود. متعاقبا افزایش بیان DJ-1 نیز در سلولهای مزبور با تکنیک RT-PCR به اثبات رسید. سلولهای مهندسی شده فوق در معرض توکسین پارکینسونی 6-OHDA قرار گرفت. بررسی میزان بقای سلولی نشان داد که سلولهای فوق در مقایسه با سلولهای کنترل مقاومت معنیدار بیشتری نسبت به سمیت 6-OHDA نشان میدهند. متعاقبا آنالیز MTT نشان داد که سلولهای PC12 با بیان فزاینده DJ-1 مقاومت بیشتر و معنیداری نسبت به سلولهای کنترل در برابر توکسین پارکینسونی از خود بروز میدهند.
حفاظت سلولهای دوپامین ساز در برابر سیگنالهای مرگ یکی از استراتژیهای مهم برای مقابله با PD و بیماریهای وابسته بهشمار میرود (26). سیگنالهای مرگ در اثر افزایش استرس اکسیداتیو و نیز از التهاب عصبی در مغز بیماران فوق منشا میگیرد. در این زمینه گزارشها حکایت از افزایش رادیکالهای آزاد در جسم سیاه مغز پارکینسونی دارد و این تغییرات با اختلالات نوروبیولوژیکی مشاهده شده در مبتلایان به PD همخوانی دارد (27). به این دلیل، تلاشها برای به حداقل رساندن میتواند ارزش درمانی زیادی داشته باشد.
چندین مکانیسم دفاعی در برابر استرس اکسیداتیو وجود دارد که شامل آنتی اکسیدانتهای غیر آنزیمی از جمله: آسکوربیک اسید، گلوتاتیون، ویتامین E و غیره میباشد (28-30). همچنین مکانیسمهای آنتی اکسیدانت آنزیمی از قبیل سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و پروکسی ردوکسین را میتوان نام برد که جزو دفاع ضد اکسیدانی سلول بهشمار میروند. علاوه بر این، مکانیسم سوم دفاع آنتی اکسیدانتی شامل تعمیر پروتئینهای آسیب دیده و یا تجزیه آنها وجود دارد که تیو رودوکسینها وسیستم پروتئازومی در آن دخیل میباشند (31).
اینک با مسجل شدن نقش استرس اکسیداتیو در آسیب رساندن به مولکولهای حیاتی استراتژیهای حفاظت نورونی در این راستا تدوین و تنظیم میشوند که از طریق مقابله با استرس اکسیداتیو از مرگ سلولها و شکلگیری یا پیشرفت بیماریهای نورودژنراتیو جلوگیری نماید. شکلگیری چنین شیوههایی حداقل در مورد PD در بدو امر مستلزم آن است که منابع باز تولید و یا افزایش استرس اکسیداتیو در مغز میانی شناسایی شوند تا سپس مکانیسم آسیبهای وارده از آن به سلولهای دوپامین ساز بررسی شود. با داشتن این اطلاعات میتوان بهدنبال یافتن راهها و ابزاری رفت که این مکانیسمها را مختل کرده و با آسیب اکسیداتیو به سلولهای مزبور مقابله نماید.
در این مطالعه مکانیسم ایجادکننده و تشدیدکننده رادیکالهای آزاد و سیگنالهای مرگ آفرین مغز میانی مد نظر قرار گرفت: استرس اکسیداتیو در اثر سمیت پارکینسونی که 6-OHDA آنرا شبیه سازی میکند. فرضیه کانونی این مطالعه بر این اساس استوار شد که پروتئین DJ-1 بهعلت دارا بودن ویژگیهای منحصر بهفرد خود از نظر ضدآپوپتوزیس و ضد التهاب عصبی میتواند سلولها را در برابر توکسین محافظت نماید.
نتایج این مطالعه بر آن است که سازه لنتی ویروسی که به سلولهای PC12 منتقل شده است در بدو امر بهطور موفقیت آمیز منجر به افزایش بیان ژن DJ-1 شده است. در گام بعدی این تغییر در میزان بیان DJ-1 توانسته است مقاومت سلولها در برابر سمیت ناشی از 6-OHDA را بهطور معنیداری افزایش دهد. این نتایج نشانگر آن است که مقدار پروتئین DJ-1 که در سلولهای مهندسی شده PC12 بیان شده است برای مقابله با افزایش رادیکالهای آزاد و یا خنثی سازی اثر مخرب آنها تاثیرگذار بوده و این تاثیر DJ-1 از نظر آماری محسوس بوده است. بدین ترتیب، ما در طی مطالعه حاضر لنتی ویروس DJ-1 را تولید کرده و با موفقیت آزمودیم که میتواند ابزار مفیدی در مطالعات حفاظت نورونی در برابر استرس اکسیداتیو و التهاب عصبی بهشمار آید.
نتیجهگیری
بهطور خلاصه نتایج این مطالعه را میتوان در موارد زیر خلاصه کرد:
1- افزایش بیان DJ-1 در سلولهای PC12 با انتقال ژن آن توسط لنتی ویروسهای نوترکیب امکانپذیر است.
2- افزایش بیان DJ-1 در سلولهای PC12 میتواند با استرس اکسیداتیو ناشی از 6-OHDA مقابله کرده و سلولها را حفظ نماید.
تشکروقدردانی
از کمک آقای عمران اسماعیل زاده در تهیه کلونها و همکاری تکنیکی سپاسگزاری میشود.
مراجع
1. Coyle JT, Puttfarcken P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 1993; 262(5134): 689-95.
2. Chinta SJ, Andersen JK. Dopaminergic neurons. The international journal of biochemistry & cell biology. 2005; 37(5): 942-6.
3. Gardaneh M. Dopamine-synthesizing neurons: An overview of their development and application for cell therapy. Iran J Biotechnol. 2010; 8(4): 8.
4. Smith Y, Kieval JZ. Anatomy of the dopamine system in the basal ganglia. Trends in neurosciences. 2000; 23: S28-S33.
5. Nagakubo D, Taira T, Kitaura H, Ikeda M, , et al. DJ-1, a novel oncogene which transforms mouse NIH3T3 cells in cooperation withras. Biochemical and biophysical research communications. 1997; 231(2): 509-13.
6. Hedrich K, Djarmati A, Schäfer N, Hering R, et al. DJ-1 (PARK7) mutations are less frequent than Parkin (PARK2) mutations in early-onset Parkinson disease. neurology. 2004; 62(3): 389-94.
7. Annesi G, Savettieri G, Pugliese P, D'Amelio M, et al. DJ 1 mutations and parkinsonism dementia amyotrophic lateral sclerosis complex. Annals of neurology. 2005; 58(5): 803-7.
8. Hague S, Rogaeva E, Hernandez D, Gulick C, et al. Earlyonset Parkinson's disease caused by a compound heterozygous DJ‐1 mutation. Annals of neurology. 2003; 54(2): 271-4.
9. Abou Sleiman PM, Healy DG, Quinn N, Lees AJ, Wood NW. The role of pathogenic DJ‐1 mutations in Parkinson's disease. Annals of neurology. 2003; 54(3): 283-6.
10. Takahashi K, Taira T, Niki T, Seino C, et al. DJ-1 positively regulates the androgen receptor by impairing the binding of PIASxα to the receptor. Journal of Biological Chemistry. 2001; 276(40): 37556-63.
11. Niki T, Takahashi-Niki K, Taira T, Iguchi-Ariga SM, et al. DJBP: A Novel DJ-1-Binding Protein, Negatively Regulates the Androgen Receptor by Recruiting Histone Deacetylase Complex, and DJ-1 Antagonizes This Inhibition by Abrogation of This Complex1 1 Ministry of Education, Science, Sport, Culture and Technology of Japan. 2 2 The nucleotide sequence reported in this paper has been submitted to the DDBJ/GenBank/EBI Data Bank with accession number AB073862. Molecular Cancer Research. 2003;1(4): 247-61.
12. Sekito A, Taira T, Niki T, Iguchi-Ariga SM, et al. Stimulation of transforming activity of DJ-1 by Abstrakt, a DJ-1-binding protein. International journal of oncology. 2005; 26(3): 685-9.
13. Kinumi T, Kimata J, Taira T, Ariga H, et al. Cysteine-106 of DJ-1 is the most sensitive cysteine residue to hydrogen peroxide-mediated oxidation in vivo in human umbilical vein endothelial cells. Biochemical and biophysical research communications. 2004; 317(3): 722-8.
14. Taira T, Saito Y, Niki T, Iguchi Ariga SM, et al. DJ 1 has a role in antioxidative stress to prevent cell death. EMBO reports. 2004; 5(2): 213-8.
15. Canet-Avilés RM, Wilson MA, Miller DW, Ahmad R, et al. The Parkinson's disease protein DJ-1 is neuroprotective due to cysteine-sulfinic acid-driven mitochondrial localization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2004; 101(24): 9103-8.
16. Honbou K, Suzuki NN, Horiuchi M, Niki T, et al. The crystal structure of DJ-1, a protein related to male fertility and Parkinson's disease. Journal of Biological Chemistry. 2003; 278(33): 31380-4.
17. Takahashi-Niki K, Niki T, Taira T, Iguchi-Ariga SM, et al. Reduced anti-oxidative stress activities of DJ-1 mutants found in Parkinson’s disease patients. Biochemical and biophysical research communications. 2004; 320(2): 389-97.
18. Olzmann JA, Brown K, Wilkinson KD, Rees HD, et al. Familial Parkinson's disease-associated L166P mutation disrupts DJ-1 protein folding and function. Journal of Biological Chemistry. 2004; 279(9): 8506-15.
19. Shendelman S, Jonason A, Martinat C, Leete T, et al. DJ-1 is a redox-dependent molecular chaperone that inhibits α-synuclein aggregate formation. PLoS biology. 2004; 2(11): e362.
20. Zhou W, Zhu M, Wilson MA, Petsko GA, at al. The oxidation state of DJ-1 regulates its chaperone activity toward α-synuclein. Journal of molecular biology. 2006; 356(4): 1036-48.
21. Chen L, Cagniard B, Mathews T, Jones S, et al. Age-dependent motor deficits and dopaminergic dysfunction in DJ-1 null mice. Journal of Biological Chemistry. 2005; 280(22): 21418-26.
22. Kim RH, Smith PD, Aleyasin H, Hayley S, et al. Hypersensitivity of DJ-1-deficient mice to 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyrindine (MPTP) and oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2005; 102(14): 5215-20.
23. Goldberg MS, Pisani A, Haburcak M, Vortherms TA, et al. Nigrostriatal dopaminergic deficits and hypokinesia caused by inactivation of the familial Parkinsonism-linked gene DJ-1. Neuron. 2005; 45(4): 489-96.
24. Inden M, Taira T, Kitamura Y, Yanagida T, et al. PARK7 DJ-1 protects against degeneration of nigral dopaminergic neurons in Parkinson’s disease rat model. Neurobiology of disease. 2006; 24(1): 144-58.
25. Naldini L, Dull T, Farson DA, Witt R. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors. US PATENT 6165782 A, 2000.
26. Kitamura Y, Kosaka T, Kakimura J-I, Matsuoka Y, et al. Protective effects of the antiparkinsonian drugs talipexole and pramipexole against 1-methyl-4-phenylpyridinium-induced apoptotic death in human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Molecular pharmacology. 1998; 54(6): 1046-54.
27. Dexter DT, Holley AE, Flitter WD, Slater TF, et al. Increased levels of lipid hydroperoxides in the parkinsonian substantia nigra: an HPLC and ESR study. Movement Disorders. 1994; 9(1): 92-7.
28. Frei B. Ascorbic acid protects lipids in human plasma and low-density lipoprotein against oxidative damage. The American journal of clinical nutrition. 1991; 54(6 Suppl): 1113S-8S.
29. Dhitavat S, Ortiz D, Rogers E, Rivera E, S, et al. Folate, vitamin E, and acetyl-L-carnitine provide synergistic protection against oxidative stress resulting from exposure of human neuroblastoma cells to amyloid-beta. Brain research. 2005; 1061(2): 114-7.
30. Grant CM, MacIver FH, Dawes IW. Glutathione is an essential metabolite required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current genetics. 1996; 29(6): 511-5.
31. Jung T, Catalgol B, Grune T. The proteasomal system. Molecular aspects of medicine. 2009; 30(4): 191-296.
ابتدای صفحه