اثر محافظتی عصاره هیدرواتانولی L. Tragopogon graminifolius در بهبود آسیب کبدی موش‏های صحرایی نر تحت مسمومیت حاد با تتراکلرید کربن

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه آزاد اسلامی واحد همدان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی، همدان، ایران

2 دانشگاه بوعلی سینا، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی، همدان، ایران

چکیده

هدف: در مطالعه حاضر،‌ اثرات محافظتی عصاره هیدرو اتانولیTragopogon graminifolius extract (THE) ، در یک مدل آزمایشگاهی مسمویت CCL4 مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش‏ها: سه گروه (هر گروه 6 سر) موش صحرایی نژاد ویستار با مخلوطی حاوی 2 میلی‏لیتر بر کیلوگرم وزن بدن از روغن زیتون استریلیزه و CCL4‌ با نسبت 1:1، به‏همراه به ترتیب 200،‌400  و 800  میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن از THE‌ مورد تیمار قرار گرفتند. گروه شاهد مخلوطی حاوی 2 میلی‏لیتر بر کیلوگرم روغن زیتون CCL4‌ با نسبت 1:1 دریافت کردند. گروه شم 2 میلی لیتر بر کیلو گرم روغن زیتون دریافت نمودند. گروه کنترل 5/0 میلی لیتر سرم سالین نرمال به‏صورت درون صفاقی دریافت نمودند. بعد از 96 ساعت، بررسی پاتولوژی بافت کبد و پارامترهای بیوشیمیایی سرمی (‏نظیر  ALT‌و AST  و ALP ) در بین گروه‏های مورد تیمار بامخلوط CCL4  و دوزهای مختلف THE در مقایسه با کنترل انجام شد.   
نتایج: نتایج نشان داد دریافت CCL4 موجب نکروز و التهاب حاد در کبد موش‏ها می‏شود. تیمار با THE  منجر به یک کاهش وابسته به دوز معنی‏دار (05/0p<) در تمامی پارامترهای بیوشیمیایی و هیستولوژیکی بافت کبد مورد بررسی قرار گرفت.
نتیجه گیری: مطالعه حاضر نشان می‏دهد که عصاره‌ Tragopogon graminifoliu L. حاوی ترکیبات شیمیایی محافظت کننده ای نظیر آنتی اکسیدان‏ها و فلاونوئیدها است که قادرند با مکانیسم‌هایی نظیر مقابله با استرس اکسیداتیو، کبد را در برابر آسیب‏های کبدی ناشی از مسمومیت با تتراکلرید کربن محافظت کنند.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

مسمومیت کبدی یکی از مشکلات رایج پزشکی  در سراسر دنیا است. نقش کبد به‏عنوان اندامی مرکزی در متابولیسم بسیاری از داروها و مواد شیمیایی، آن را مستعد بسیاری از مسمومیت‏ها می‏سازد(1). بر اساس  منابع موجود، سمیت کبدی با مکانیسم‏های متنوعی به‏وقوع می‏پیوند. یکی از مکانیسم‏های عمده مرتبط با سمیت کبدی شامل تشکیل رادیکال‏های آزاد و ایجاد استرس اکسیداتیودر کبد است (2). در حال حاضر مشخص شده است که رادیکال‏های آزاد و استرس اکسیداتیو دار نقش مهمی در سمیت کبدی و همچنین برخی دیگر از بیماری‏های کبدی است. گونه‏های رادیکال آزاد قادر به برهم کنش با ماکرومولکول های سلولی نظیر؛ لیپیدها، پروتئین ها و نوکلئیک اسیدها هستند که در نهایت می تواند منجر به اکسیداسیون لیپیدهای غشای سلولی شده و آسیب سلولی را ناشی شود. مدل‏های تجربی زیادی برای مطالعه مکانیسم‏های سمیتکبدی و بررسی اثرات درمانی احتمالی ترکیبات مختلف مورد استفاده قرار می‏گیرد. آسیب کبدی ناشی از تتراکلرید کربن (CCL4)، معمول‏ترین مدل درون تن ( in vivo) است که دهه‏های متمادی به‏طور گسترده  برای مکانیسم آسیب سلولی ناشی از رادیکال‏های آزاد در سلول‏های کبدی مورد استفاده محققان قرار گرفته است (3و4). سیروز القاشده در موش‏های صحرایی تشابه زیادی با نوع انسانی دارد (5). CCL4  یک مایع فرار است که به‏واسطه کلریناسیون متان، اتان، پروپان یا پروپن تشکیل می‏شود. اعتقاد بر این است که قسمتی از سمیت کبدی ناشی از CCL4  از برهم‏کنش‏های ناشی از متابولیسم CCL4  منشا می‏گیرد. در این فرآیند، CCL4  متحمل یک واکنش دهالوژناسیون احیایی به‏واسطه مونواکسیژنازهای شبکه آندوپلاسمی  سلول‏های کبدی می‏شود. این واکنش CCL4  به‏وسیله آنزیم‏های سیتوکروم P450  به رادیکال تری کلرومتیل ( CCl3) کاتالیزه می‏شود (6-8). این رادیکال ممکن است با اکسیژن واکنش داده  و تشکیل رادیکال تری کلرو متیل پروکسی دهد (CCl3·O2) (9). تشکیل این رادیکال‏ها و شاید دیگر حد واسط‏های رادیکالی که ممکن است در واکنش با اکسیژن در درون سلول‏ها صورت گیرد. در فرآیند پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی سلول  دخالت می‏کنند. این فرآیند سرانجام منجر به ایجاد استرس اکسیداتیو می‏شود که به‏نظر می‏رسد دارای نقش مهمی در آسیب‏زایی و پاتوژنز آسیب کبدی است (10). آسیب کبدی ناشی از CCL4  منجر به افزایش مارکرهای بیوشیمیایی آسیب کبدی در سرم نظیر؛ گلوتامات اگزالواستات ترانس آمینازسرمی (SGOT)، گلوتامات پیراوت ترانس آمیناز سرمی (SGPT)، آلکالین فسفاتاز (ALP)  و بیلی روبین تام سرمی (TB)  می‏شود (13-11).

عصاره‏های تهیه شده از گیاهان دارویی قرن‏ها برای درمان بیماری‏های مختلف مورد استفاده قرار گرفته است. بسیاری از گیاهان دارویی به‏منظور کشف ترکیبات گیاهی موثر برای مقابلهبا آسیب‏های کبدی ناشی از مسمومیت کبدی، مورد بررسی قرار گرفته است (14). در حقیقت، اعتقاد بر این است که بسیاری از ترکیبات گیاهی جدا شده ازاین گیاهان، قادر به تخفیف شرایط اکسیداتیو سلولی است و بنابراین، در درمان و جلوگیری از آسیب کبدی می تواند موثر باشد.

شنگ گیاهی با نام علمی Tragopogon graminifolius L.، یک گیاه دارویی است که استفاده از آن برای درمان بیماری‏های  معدی- روده‏ای  و همچنین بیماری‏های کبدی در غرب ایران مرسوم است. روغن‏های ضروری  و عصاره اتانولی تراگوپوگون گرامینی فولیوس متشکل از ترکیباتی با فعالیت آنتی اکسیدانتی و میکروب کشی است (15).  بنابراین در مطالعه حاضر، اثرات عصاره هیدرواتانولی T. graminifolius Extract(THE) در مدل سمیت کبدی القا شده ناشی از CCL4  در موش‏های صحرایی نر بالغ مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش‏ها

حیوانات: موش‏های صحرایی نر بالغ (8 هفته ای)، با وزن تقریبی 220 تا 250 گرم، از موسسه انستیتو پاستور ایران (تهران، ایران) تهیه شد و در شرایط بهداشتی معمولی، نور 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی، دما و رطوبت مناسب به‏منظور تطبیق با شرایط حیوان خانه به‏مدت دو هفته نگه‏داری شد. تمامی حیوانات دارای دسترسی آزاد به غذا و آب بودند. پروتکل این تحقیق بر اساس قوانین بین المللی در مورد حیوانات آزمایشگاهی و همچنین کمیته اخلاق کار با حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه بوعلی سینا همدان انجام گردید.

 

طراحی مطالعه: در مطالعه حاضر تعداد 42 سر موش صحرایی نژاد ویستار به‏صورت تصادفی به 6 گروه (هر گروه 7 سر) تقسیم شد و گروه‏ها در طول 96 ساعت (4 روز) تحت تیمارهای متفاوت قرار گرفتند.  گروه‏های مورد مطالعه به روش زیر تیمار شدند:

1-گروه کنترل: حیوانات این گروه میزان 2 میلی لیتر به ازا هر کیلوگرم وزن بدن (ml/kg B.W) از نرمال سالین را به‏صورت درون صفاقی (i.p)  در طی دروه آزمایش دریافت کردند.

2- گروه شم: حیوانات این گروه میزان ml/kg B.W 2 روغن زیتون استریلیزه را به‏صورت i.p در طی دروه آزمایش دریافت کردند.

3- گروه شاهد: حیوانات این گروه مخلوط ml/kg B.W 2 روغن زیتون استریلیزه به‏علاوه CCL4 را با نسبت 1:1 به‏صورت i.p در طی دوره آزمایش دریافت کردند.

4- گروه تیمار1: حیوانات این گروه به‏دنبال دریافت مخلوط ml/kg B.W 2 روغن زیتون استریلیزه به‏علاوه CCL4 را با نسبت 1:1 به‏صورت i.p ، میزان mg/ kg B.W 200 از THE را در طی دروه آزمایش دریافت کردند.

5- گروه تیمار2: حیوانات این گروه به‏دنبال دریافت مخلوط ml/kg B.W 2 روغن زیتون استریلیزه به‏علاوه CCL4 را با نسبت 1:1 به‏صورت i.p ، میزان mg/ kg B.W 400 از THE را در طی دروه آزمایش دریافت کردند.

6- گروه تیمار3: حیوانات این گروه به‏دنبال دریافت مخلوط ml/kg B.W 2 روغن زیتون استریلیزه به‏علاوه CCL4 را با نسبت 1:1 به‏صورت i.p ، میزان mg/ kg B.W 800 از THE را در طی دروه آزمایش دریافت کردند.

در گروه های 3 تا 6، عصاره 4 بار تزریق شد که اولین تزریق 2 ساعت بعد از تزریق مخلوط روغن زیتون و CCL4 انجام شد.

بعد از یک فاصله زمانی 4 روزه از آغاز تیمارها، حیوانات با اتیل اتر بی‏هوش شده و خون‏گیری از قلب در حال تپش حیوانات با استفاده از یک سرنگ هپارینه و با سانتریفیوژ خون در شتاب g 800 به‏مدت 15 دقیقه انجام شد. سرم تهیه شده و برای سنجش مارکرهای بیوشیمیایی ALT، AST و ALP مورد استفاده قرار گرفت. بعد از خون‏گیری، بافت کبد حیوانات از بدن خارج شد و با استفاده از بافر سالین به دقت شستشو داده شد. به‏منظور تهیه لام پاتولوژی و بررسی‏های مورفولوژی بافت کبد، یک بخشی از بافت کبد بریده شده و به‏صورت جداگانه در فرمالین 10 درصد فیکس شده و برای رنگ آمیزی هماتوکسلین – ائوزین (H&E) مهیا گردید.

اندازه‏گیری پارامترهای بیوشیمیایی: فعالیت سرمی آنزیم‏های ALT  و AST با استفاده از کیت‏های سنجش تجاری  زیست شیمی ( ایران) و فعالیت سرمی آنزیم ALP با استفاده از کیت تجاری درمانکاو (ایران) سنجش شد.

تهیه عصاره گیاهی:گیاه شنگ از باغ گیاهان دارویی سازمان جهاد کشاورزی استان همدان تهیه و توسط کارشناس گیاه‏شناس آن مرکز شناسسایی شد. پس از جداسازی برگ گیاه شنگ، برگ‏ها در سایه خشک شدند و سپس توسط دستگاه میکسر پودر شد و 120 گرم از آن در 100 میلی لیتر اتانول 80 درصد به‏مدت یک هفته قرار گرفت. سپس محلول رویی عصاره توسط کاغذ صافی فیلتر شد. محلول جدا شده توسط دستگاه روتاری تبخیر و عصاره غلیظ شده جدا و در ظروف پتری قرار داده شد. عصاره مذکور جهت خشک شدن به‏مدت 48 ساعت در زیر هود قرار گرفت.

 

آنالیز آماری

در این مطالعه بسته نرم افزاری SPSS 20 برای آنالیز داده‏ها مورد استفاده قرار گرفت. جهت تعیین نرمال بودن داده‏ها از آزمون کولموگروف- اسمیرنوف استفاده شد. داده‏های مورد بررسی همه نرمال بودند. در صورت عدم نرمال بودن توزیع داده‏ها، تفاوت بین گروه‏ها با استفاده از تست آماری کوریسکال- والیس تعیین می‏شود. آزمون مورد استفادهANOVA یک‏طرفه بین آزمودنی بوده و تست توکی برای آنالیز تفاوت بین دو گروه  به‏کار گرفته شد. ارزش P  کمتر از 05/0 به‏عنوان سطح معنی‏داری تفاوت‏های آماری در این تحقیق مورد نظر گرفته شد.

نتایج

مطالعات هیستوپاتولوژی

مشاهدات میکروسکوپی برش‏های بافتی در شکل 1 نشان می‏دهد که معماری بافتی بافت کبد در نمونه‏های کنترل و شم نرمال بوده است و هیچ ناحیه نکروتیک در اطراف سیاهرگ‏های مرکزی دیده نمی‏شود. با این‏حال، تزریق دوز ml/kg B.W 2 از CCL4 منجر به القای نکروز گسترده بافتی  و فراخوانی سلول‏های ایمنی در نواحی اطراف سیاهرگ‏های مرکزی می‏شود. از طرف دیگر، بافت کبدی موش‏های صحرایی تحت مسمومیتCCL4 که  با غلظت‏های افزایشی THE( از mg/kg B.W 200 تا 800) تیمار شده بودند، کاهش قابل توجهی را از نظر مورفولوژی در آسیب‏های بافتی کبد نشان دادند.  این نمونه‏ها دارای کاهش نسبی قابل توجهی در تعداد سلول‏های نکروتیک و بافتی و همچنین تعداد سلول‏های فراخوان شده التهابی به نواحی اطراف سیاهرگ‏های مرکزی بودند (شکل 1).

 

 

 

 

 

شکل 1: کبد یک موش صحرایی کنترل که میزان ml/kg B.W 2 بافر نرمال سالین را به‏صورت درون صفاقی دریافت کرده است. b ) کبد یک موش از گروه شم که میزان ml/kg B.W 2 از روغن زیتون را به‏صورت درون صفاقی دریافت کرده است، c) موش صحرایی تیمار شده با مخلوطی حاوی ml/kg B.W 2 از روغن زیتون به همراه CCL4 با نسبت 1:1 که به‏صورت درون صفاقی تزریق شده است d، e و f) نمونه‏های بافتی تهیه شده از موش‏های صحرایی که مخلوطی از روغن زیتون استریل و CCL4 ( با نسبت 1:1) را همراه با به‏ترتیب mg/kg B.W 200، 400 و 800  از THE، به‏صورت درون صفاقی دریافت کرده‏اند. پیکان‏های تیره نمایانگر نواحی متحمل نکروز حاد سلولی است و پیکان‏های روشن نواحی از تجمعات سلولی می‏باشد. دایره‏های نشان دهنده نواحی از بافت است که تهاجم سلول‏های التهابی در آن دیده می‏شود. رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین (H&E) برش‏های بافت کبد (‏بزرگنمایی 100 ×)

 

 

پارامترهای بیوشیمیایی

نمودارهای 1 تا 3 شامل داده‏های به‏دست آمده از ارزیابی مارکرهای بیوشیمیایی برای تعیین آسیب کبدی می‏باشد. این مارکرها شامل: ALT،  AST  و ALP سرم موش‏های صحرای مورد مطالعه است.

ALT

 براساس نمودار  1 سطوح سرمی ALT  در موش‏های صحرایی تیمار شده باml/kg B.W 2 مخلوط روغن زیتون استریلیزه و CCL4 با نسبت 1:1 به‏صورت معنی‏داری(P< 0.05)  به بالاتر از سطوح آن در مقایسه با گروه‏های کنترل و شم رسید. تیمار توام غلظت‏های مختلف THE (mg/kg B.W 200، 400 و 800 ) با CCL4 یک پاسخ حفاظتی وابسته به دوز را نشان داد به‏طوری‏که: هر چه غلظت THE مورد استفاده بالاتر بود، سطوح ALT سرم پایین‏تری مشاهده می‏شد. همان گونه که در شکل 2 نشان داده شده است، استفاده از غلظت‏های mg/kg B.W 400 و 800  از THE همراه با CCL4 ، باعث جلوگیری از افزایش معنی‏دار ALT در مقایسه با حالتی است که CCL4 به‏تنهایی استفاده می‏شود. در حالی‏که، اثر مشابهی در دوز mg/kg B.W 200 مشاهده نشد (نمودار 1).

 

 

نمودار1: اثرات وابسته به دوز THE بر میزان فعالیت سرمی ALT در موش‏های تیمار شده با CCL4 در مقایسه با گروه‏های کنترل، شم و گروه تیمار شده تنها با CCL4. گروه کنترل: میزان ml/kg B.W 2 بافر نرمال سالین گروه شم: میزان ml/kg B.W 2 از روغن زیتون گروه CCL4: مخلوطی حاوی ml/kg B.W 2 از روغن زیتون به‏همراه CCL4 با نسبت 1:1. گروه های THE+ CCL4: مخلوطی از روغن زیتون استریل و CCL4 ( با نسبت 1:1) را همراه با به‏ترتیب mg/kg B.W 200، 400 و 800  از THE. تمامی تزریق­ها به‏صورت درون صفاقی. ارزش P  کمتر از 05/0 به‏عنوان سطح معنی‏داری تفاوت‏های آماری در این تحقیق مورد نظر گرفته شد. هر یک از مقادیر نشان دهنده میزان میانگین± انحراف معیار است.  a نشان دهنده تفاوت معنی‏دار سطح سرمی آنزیمی در هر یک از گروه‏ها نسبت به گروه کنترل است.b نشان دهنده تفاوت معنی‏دار سطح سرمی آنزیمی در هر یک از گروه‏ها نسبت به گروه شم است.  cنشان دهنده تفاوت معنیدار سطح سرمی آنزیمی در هر یک از گروهها نسبت به گروه CCL4 است  dنشان دهنده تفاوت معنیدار میزان فعالیت آنزیمی در هر یک از گروه‏ها نسبت به گروه(mg/kg B.W200CCL4+THE ( است.

 

 

 

AST

سطوح سرمی AST در گروه موش‏های صحرایی تیمار شده با ml/kg B.W 2 مخلوط روغن زیتون استریلیزه و CCL4 با نسبت 1:1 منجر به افزایش معنی دار (05/0p< ) در سطوح سرمی آنزیم در مقایسه با میزان آن در گروه‏های کنترل و شم شد که به‏ترتیب، ml/kg B.W 2 نرمال سالین و روغن زیتون استریلیزه را دریافت کرده بودند. تیمار توام غلظت‏های متفاوت THE با CCL4 در موش‏ها نشان دهنده رفتار حفاظتی وابسته به دوزی از THE شد که در آن، با دو برابر شدن دوز THE، سطوح سرمی آنزیم نیز به‏میزان معنی‏داری همراه با کاهش شد. استفاده از غلظت mg/kg B.W 800 از THE همراه با CCL4 ، با جلوگیری از افزایش معنی‏دار (05/0p< )، AST  نسبت به گروه‏های کنترل و شم شد (نمودار 2).

 

 

 

 

 

نمودار2: اثرات وابسته به دوز THE بر میزان فعالیت سرمی AST در موش‏های تیمار شده با CCL4 در مقایسه با گروه‏های کنترل، شم و گروه تیمار شده تنها با CCL4. گروه کنترل: میزان ml/kg B.W 2 بافر نرمال سالین را به‏صورت درون صفاقی دریافت کرد، گروه شم: میزان ml/kg B.W 2 از روغن زیتون را به‏صورت درون صفاقی دریافت کرد، گروه CCL4: مخلوطی حاوی ml/kg B.W 2 از روغن زیتون به‏همراه CCL4 با نسبت 1:1 که به‏صورت درون صفاقی تزریق شد. گروه‏های THE+ CCL4: مخلوطی از روغن زیتون استریل و CCL4 ( با نسبت 1:1) را همراه با به‏ترتیب mg/kg B.W 200، 400 و 800  از THE، به‏صورت درون صفاقی دریافت کردند. ارزش P  کمتر از 05/0 به‏عنوان سطح معنی‏داری تفاوت‏های آماری در این تحقیق مورد نظر گرفته شد. هر یک از مقادیر نشان دهنده میزان میانگین± انحراف معیار است. . aنشان دهنده تفاوت معنیدار سطح سرمی آنزیمی در هر یک از گروهها نسبت به گروه کنترل است.bنشان دهنده تفاوت معنی‏دار سطح سرمی آنزیمی در هر یک از گروه ها نسبت به گروه شم است. C نشان دهنده تفاوت معنی‏دار سطح سرمی آنزیمی در هر یک از گروه‏ها نسبت به گروه CCL4 است.  dنشان دهنده تفاوت معنیدار میزان فعالیت آنزیمی در هر یک از گروه‏ها نسبت به گروه (mg/kg B.W200CCL4+THE ( است. e نشان دهنده تفاوت معنی‏دار سطح سرمی آنزیمی در هر یک از گروه‏ها نسبت به گروه (mg/kg B.W400CCL4+THE ( است.

 

 

ALP

تیمار موش‏ها با مخلوط حاوی روغن زیتون استریلیزه و CCL4، با نسبت 1:1، منجر به افزایش معنی­دار سطوح ALP سرمی نسبت به گروه‏های کنترل و شم می‏شود. تیمار توام سه غلظت صعودی THE (mg/kg B.W 200، 400 و 800 ) با CCL4 منجر به کاهش سطوح ALT سرم می‏شود. با این‏حال، از میان دوزهای استفاده شده، تنها دوز mg/kg B.W 800 از THE منجر به ایجاد تفاوت معنی‏دار نسبت به گروه CCL4 شد (نمودار 3).

 

 

 

 

 

نمودار 3: اثرات وابسته به دوز THE بر میزان فعالیت سرمی ALP در موش‏های تیمار شده با CCL4 در مقایسه با گروه‏های کنترل، شم و گروه تیمار شده تنها با CCL4، گروه کنترل: میزان ml/kg B.W 2 بافر نرمال سالین گروه شم: میزان ml/kg B.W 2 از روغن زیتون گروه CCL4: مخلوطی حاوی ml/kg B.W 2 از روغن زیتون به همراه CCL4 با نسبت 1:1. گروه‏های THE+ CCL4: مخلوطی از روغن زیتون استریل و CCL4 ( با نسبت 1:1) را همراه با به‏ترتیب mg/kg B.W 200، 400 و 800  از THE. تمامی تزریق­ها به‏صورت درون صفاقی. ارزش P  کمتر از 05/0 به‏عنوان سطح معنی‏داری تفاوت‏های آماری در این تحقیق مورد نظر گرفته شد. هر یک از مقادیر نشان دهنده میزان میانگین± انحراف معیار است.  a نشان دهنده تفاوت معنی‏دار سطح سرمی آنزیمی در هر یک از گروه‏ها نسبت به گروه کنترل است.b نشان دهنده تفاوت معنی‏دار سطح سرمی آنزیمی در هر یک از گروه‏ها نسبت به گروه شم است. c نشان دهنده تفاوت معنی‏دار سطح سرمی آنزیمی در هر یک از گروه‏ها نسبت به گروه CCL4 است.   dنشان دهنده تفاوت معنی‏دار سطح سرمی آنزیمی در هر یک از گروه‏ها نسبت به گروه (mg/kg B.W200CCL4+THE ( است.

 

 

بحث

در مطالعه حاضر اثرات حفاظتی THE بر علیه مدل سمیت CCL4 در بافت کبد مورد پژوهش قرار گرفت. اعتقاد بر این است که مکانیسم سمیت این ماده شیمیایی در بافت کبد از نوع مکانیسم آسیب‏زایی وابسته به تولید رادیکال‏های اکسیژن است. به‏همین دلیل، پارامترهای بیوشیمیایی آسیب کبدی نظیر؛ ALT، AST و ALP  در سرم حیوانات تحت تیمار مورد بررسی قرار گرفت. به‏علاوه، نمونه‏های بیوپسی از بافت کبد حیوانات تحت سمیت تهیه شده و با نمونه‏های بافت نرمال مورد مقایسه قرار گرفت. یافته‏های این تحقیق نشان داد که از یک طرف، CCL4 همان‏گونه که انتظار می رفت منجر به صعود معنی‏دار سطوح سرمی آنزیم‏های فوق شده است و از طرفی دیگر، تیمار توام موش‏های صحرایی تحت مسمومیت CCL4 با THE منجر به کاهش در سطوح چنین پارامترهایی می‏شود. مشابه نتایج به‏دست آمده در این تحقیق، نتایج تحقیقات گذشته نیز نشان دهنده سمیت CCL4 منجر به افزایش گونه‏های فعال اکسیژنی (ROS) و آسیب سلولی به ماکرومولکول های حیاتی نظیر پروتئین‏ها و لیپیدها در غشا سلولی می‏شود که سمیت سلولی  و به‏دنبال آن مرگ سلولی نکروزیس یا آپوپتوزیس را برای سلول رقم می‏زند. به‏علت خواص آنتی اکسیدانتی ترکیباتی نظیر فلاوونوئیدها، کارتنوئیدها و دیگر ترکیبات طبیعی در گیاهان، مطالعات زیادی برای مطالعه اثرات محافظتی چنین ترکیباتی طراحی شده است (۱۵).  نتایج یک مطالعه نشان داد، عصاره گل گیاه وحشی Nymphea pubescens منجر به مهار سمیت ناشی از CCL4 در کبد موش‏های صحرایی می‏شود. این مطالعه نشان داد که نقش محافظتی عصاره گل مورد استفاده به‏علت حضور مقادیر نسبتا بالای فلاوونوئیدها، فنول‏ها و ساپونین‏ها در عصاره گیاهی می باشد (16).

در مطالعه‏ای دیگر، اثرات حفاظتی ترکیبات پلی فنول به‏دست آمده است برگ‏های گیاهGinkgo biloba L علیه سمیت کبدی ناشی از CCL4 در موش‏های صحرایی نژاد اسپراگ- دالی مورد بررسی قرار گرفت و یافته‏هایی مشابه نتایج تحقیق حاضر به‏دست آمد که نشان می داد، استفاده از این عصاره گیاهی با کاهش معنی‏دار سطوح بیومارکرهای آسیب بافتی کبد همراه است (17).

در مطالعات گذشته، تغییرات قابل توجه در میزان چربی‏ها، نکروز، تخریب و تورم، تهاجم و نفوذ گسترده لنفوسیت‏ها  و از دست رفتن و تخریب حاشیه‏های سلول، به‏عنوان شواهدی مشترک در تایید سمیت ناشی ازCCL4 مورد توافق است(18). پاسخ‎های التهابی و ارتشاح سلول‎های التهابی به بافت کبد، خود مرحله بسیار آسیب زننده در پروسه بیماری­زایی کبد است و می­تواند به اختلال شدید در عملکرد کبد منجر شود. در این مطالعه نشان داده شد که در گروه‎های تیمار شده با THE  تعداد سلول‎های التهابی در بافت کبد به‏طور قابل توجهی کاهش یافته بود. از این‏رو می‎توان گفت مکانسیم فعالیت محافظت کبدی THE علاوه بر خواص آنتی اکسیدانتی ­اش در خاصیت ضد التهابی آن نیز هست (۱۹). با توجه به یافته­های یِوم و یامادادر (20)،THE  احتمالا با کاهش ترشح سایتوکین ­التهابی موجب مهار التهاب بافتی می‎شود. آن‎ها همچنین نشان دادند که تیمار باTHE   باعث افزایش سطح پروتینیIL-10   در کبد می­شود. تحقیقات نشان داده‎اند واکنش­های ضد ­التهابی در کبد در سلول­­های کوپفر باIL-10  که یک سایتوکین ضد التهابی است در ارتباط می‎باشد. از این‏رو THE احتمالا با سرکوب ترشح سایتوکین­های التهابی و تحریک ترشح سایتوکین‎های ضد التهابی روند التهاب در کبد را مهار می‎کند. مهار پراکسیداسیون لیپیدی و نکروز هپاتوسیتی و همچنین سرکوب التهاب، منجر به بازگشت عملکرد از دست رفته کبد و بازسازی سلول‎های آسیب دیده می­شود. این نتایج در مطالعات بسیاری دیده شده است. بازگشت نسبی عملکرد کبد و کاهش مارکر­های سرمی آسیب کبدی از آنسفالوپاتی کبدی و مرگ در اثر آن جلوگیری می‎کند از این روست که درصد بیشتری از حیوانات بیمار تیمار شده با     THE زنده ماندند. برگ گیاه شنگ غنی از ترکیبات آنتی اکسیدانت‏ها نظیر ترکیبات فنلی است (۲۱). مهم­ترین فلاونوئیدهای موجود در برگ گیاه شنگ آپی ژنین، لوتئولین، کوئرستین، ویتکسین، ایزوویتکسین، ایزواوریئنتین می­باشد.  کوئرستین یکی از فلاونوئیدهای مهم موجود در عصاره برگ گیاه شنگ می­باشد. این ماده در برگ گیاه گردو نیز به‏وفور یافت می‏شود (۲۲). در تحقیقی با موضوع اثر محافظت کبدی برگ درخت گردو مشخص شد که اثر محافظتی عصاره مورد نظر به‏دلیل وجود میزان بالای فلاونوئید کوئرستین موجود در آن می­باشد. ثابت شده است کوئرستین به‏دلیل داشتن دو گروه هیدروکسیل (OH) مجاور هم باعث افزایش قدرت احیاکنندگی و در نتیجه افزایش قدرت آنتی اکسیدانتی این ماده شده است. همچنین کوئرستین لنفوسیت‏ها را از آسیب ناشی از مواد شیمیایی و سمی محافظت می­کند. این ماده توان آنتی اکسیدانتی پلاسما را افزایش می­دهد و سبب پایداری ژنومی در موش­هایی با سیروز کبدی می­شود. همچنین با جمع­آوری رادیکال­های آزاد مانع آسیب به ژنوم و ایجاد جهش در آن می‏شود (۲۳).گالیک اسید، کاتچین و کافئیک اسید از مهم­ترین اسیدهای فنلی موجود درعصاره برگ گیاه شنگ می­باشد. کاتچین یکی از عناصر مهم موجود در چای و به‏خصوص چای سبز می­باشد که نسبت به آنتی‌اکسیدانت‌های معروفی چون ویتامین‏هایC و E بسیار قوی‌تر عمل می‌کند. خاصیت ضد سرطانی و ضد اکسیدانتی این ماده به اثبات رسیده است.

گالیک اسید دارای ویژگی‏های ضد قارچی و ضد باکتریایی است.گالیک اسید به‏عنوان یک آنتی­ اکسیدانت عمل کرده و به سلول­های بدن در محافظت از صدمات اکسیداتیو کمک می‏کند. تحقیقات نشان می­دهد که گالیک اسید دارای ویژگی ضد سرطانی است بدون این‏که به سلول­های بدن آسیب برساند. همچنین در خونریزی­های داخلی هم مورد استفاده قرار می‏گیرد و در درمان بیماری دیابت هم به‏عنوان دارو مورد استفاده قرار می­گیرد (۲۴).

کافئیک اسید یکی از اسیدهای فنلی موثر موجود در برگ گیاه شنگ است که قادر به مهار سنتز اسید آراشیدونیک و متابولیت‏های آن می­باشد. یکی از متابولیت­های مهم اسید آراشیدونیک، پروستاگلاندین می­باشد. آنزیم فسفولیپازفسفولیپیدهای غشای سلول را به اسید آراشیدونیک تبدیل می­کند. سپس اسید آراشیدونیک به‏وسیله آنزیم سیکلواکسیژناز نوع 2 تبدیل به پروستاگلاندین می‌شود. پروستاگلاندین‌ها یکی از مهم‏ترین واسطه‌های التهاب می­باشند. یکی از اثرات تتراکلریدکربن در کبد ایجاد التهاب در هپاتوسیت‏ها می­باشد. رادیکال­های آزاد با اثر بر غشای سلول موجبات تبدیل آن‏ها به اسید آراشیدونیک و سپس پروستاگلاندین را فراهم می­کند. پروستاگلاندین هم باعث التهاب هپاتوسیت­ها می­شود (۲۵). عصاره برگ گیاه شنگ به واسطه دارا بودن کافئیک اسید قادر است سنتز پروستاگلاندین را مهار کرده و اثرات ضد التهابی از خود بروز دهد. همین امر موجب التیام هپاتوسیت­ها و در نهایت التیام کبد آسیب دیده می­شود.

نتیجه‏گیری

نتایج تحقیق حاضرنشان داد که تیمار با عصارهTragopogon  graminifolius L. به‏واسطه خاصیت آنتی­ اکسیدانتی موجود در آن موجب تخفیف آسیب کبدی القا شده توسط تتراکلریدکربن شده و به‏صورت معنی­داری شاخص‏های آسیب بافتی را بهبود می­بخشد. عصاره هیدروالکلی برگ گیاه شنگ احتمالا با مهار برهم‏کنش‏های شیمیایی رادیکال­های آزاد ناشی از تتراکلریدکربن که آغاز‏کننده استرس اکسیداتیو، پراکسیداسیون لیپیدها و تغییرات مولکولی هستند و همچنین سرکوب التهاب بافتی اثرحفاظت کنندگی کبد را اعمال می‏کند.

تشکر و قدردانی

نویسندگان این مقاله لازم میدانند از جناب آقای دکتر رمضان کلوندی کارشناس بیوسیستماتیک گیاهی مرکز تحقیقاتی سازمان کشاورزی استان همدان در شناسایی علمی گیاه شنگ و همچنین مسئول و پرسنل محترم آزمایشگاه تشخیص طبی بزرگمهر در انجام آزمایشات خون که ما را صمیمانه کمک و یاری نمودند کمال تشکر و سپاسگزاری را به‏عمل آورند.

1. Jaeschke HGores GJCederbaum AIHinson JA, et al. Mechanisms of hepatotoxicity. Toxicol Sci. 2002; 65(2): 166-76.

2. Nitti MA, Pronzato UM, Marinari C. Domenicotti PKC signaling in oxidative hepatic damage.  Molecular Aspects of Medicine. 2008; 29(1); 36–42.

3. Chen P, Li C, Pang, W, Zhao Y, et al. The Protective Role of Per2 against Carbon Tetrachloride-Induced Hepatotoxicity. Am J Pathol. 2009; 174(1); 63-70.

4. Roy S. Sannigrahi S, Majumdar S, Ghosh B, Resveratrol B. Regulates Antioxidant Status,Inhibits Cytokine Expression and Restricts Apoptosis in Carbon Tetrachloride Induced Rat Hepatic Injury. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2011; 1(1); 1-12.

5. HHardin BJ. Carbon tetrachloride poisoning; a review.Ind Med Surg. 1954; 23(3): 93-105.

6. Albano E, Lott AK, Slater TF, Stier A, et al. Spin-trapping studies on the free-radical product formed by metabolic activation of carbon tetrachloride in rat liver microsomal fractions of isolated hepatocytes and in vivo in the rat. Biochem. J. 1982; 204(1); 593–603.

7. McCay PB, Lai Ek, Poyer JL, DuBose CM, et al. Oxygen and carbon-centered free radical formation during carbon tetrachloride metabolism. J. Biol. Chem. 1984; 259(1);  2135–2143.

8. Noguchi T, Fong KL, Lai EK, Alexander SS, et al. Specificity of phenobarbitol-induced cytochrome P-450 for metabolism of carbon tetrachloride to the trichloromethyl radical. Biochem.Pharmacol. 1982; 31(1); 615–624.

9. Packer JE, Slater TF, Willson RL. Reactions of carbon tetrachloride-related peroxy free radical (CCl3·O2) with amino acids. Pulse radiolysis evidence.Life Sci. 1978; 23 (1); 356–362.

10. Basu S. Carbon tetrachloride-induced lipid peroxidation: eicosanoid formation

 and their regulation by antioxidant nutrients. Toxicology. 2003;15; 189(1-2): 113-27.

11. Parveen R, Baboota S, Ali J, Ahuja A, et al. Effects of silymarin nanoemulsion against carbon tetrachloride induced hepatic damage. Arch Pharm Res. 2011; 34(5): 767-774.

12. Frank PR, Suresh V, Arunachalam G, Kanthalal SK, et al. Evaluation of Hepatoprotective effect of Adiantunincisumforsk leaf extract against CCl4 Hepatotoxicity in rats. International Research Journal of Pharmacy. 2012; 3(3): 230-234.

13. Li R, Guo W, Fu Z, Ding G, et al. Hepatoprotective Action of Radix PaeoniaeRubra Aqueous Extract against CCl4-Induced Hepatic Damage. Molecules. 2011;16(1); 8684-8693.

14. Adewusi E, Afolayan AJ. A review of natural products with hepatoprotectiveactivity.J Med Plant Res. 2010; 4(13): 1318-1334.

15. Farzaei MHRahimi RAttar FSiavoshi F, et al. Chemical composition, antioxidant and antimicrobial activity of essential oil and extracts of Tragopogongraminifolius, a medicinal herb from Iran. Nat Prod Commun. 2014; 9(1): 121-4.

16. Debnath SGhosh SHazra. Inhibitory effect of Nymphaea pubescens Willd. flower extract on carrageenan-induced inflammation and CCl-induced hepatotoxicity in rats. Food ChemToxicol. 2013; 59(1): 485-91.

17. Yang  L, Wang CZYe JZLi HT. pepatoprotective effects of polyprenols from Ginkgo biloba L.  leaves on CCl4-induced hepatotoxicity in rats. Fitoterapia. 2011; 82(6): 834-40.

18. Pareek A, Godavarthi A, Issarani R, Nagori BP. Antioxidant and hepato protective activity of Fagoniaschweinfurthii (Hadidi) Hadidi extract in carbon tetra chloride induced hepatotoxicity in HepG2cell line and rats. J Ethnopharmacol. 2013; 150(1): 973–981.

19. Domitrović R, Jakovac H, Milin C, Radosević-Stasić B. Dose- and time-dependent effects of luteolin on carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in mice.ExpToxicolPathol. 2009; 61(6): 581-9. 

20. Yeom MJ, Yamada I. Antiarthritic effects of ephedra sinicaStapf herb-acupuncture: inhibition of lipopolysaccharide-induced inflammation and adjuvant-induced polyarthritis. J Pharmacol Sci. 2006; 100(1): 41-50.

21. Hsu YWTsai CFChuang WCChen WK, et al. Protective effects of silica hydride against carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in mice. Food ChemToxicol. 2010; 48(6): 1644-53.

22. Saba AB, Onakoya OM, Oyaghbemi, AA. Hepatoprotective and in vivo antioxidantactivities of ethanolic extract of whole fruit of Lagenaria breviflora, J Basic Clin Physiol Pharmacol. 2012; 27-32.

23. Farshchi A, Ghiasi G, Abdollahi A. Antinociceptive and antiinflammatory effects ofTeucriumhyrcanicum aqueous extract in male mice and rats ,Physiology and Pharmacology. 2010; 14(1): 78 – 84.     

24. Heebaa GH, Abd-Elghany MI. Effect of combined administration of ginger (Zingiberofficinale Roscoe) and atorvastatin on the liver of rats. Phytomedicine. 2010; 65(7): 240-8. 

25. Jadhav VB, Thakare VN, Suralkar AA, Deshpande AD, Naik SR. Hepatoprotectiveactivity of Luffaacutangula against CCL4 and rifampicin induced liver toxicity in rats: abiochemical and histopathological evaluation, Indian J Exp Biol. 2010; 8(1): 822.