بررسی مقایسه ای تولید بذر مصنوعی گونه‏هایی از سرخ ولیک (زالزالک) از راه کشت مریستم و رویان‏های پیکری

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال، دانشکده علوم زیستی، گروه زیست شناسی، تهران، ایران

چکیده

هدف: هدف از این پژوهش تولید گیاهان سالم و مطلوب دو گونه زالزالک‏ از طریق کشت مریستم و رویان‌زایی پیکری و تهیه بذر مصنوعی که از نتایج زیست فناوری است، می‏باشد.
مواد و روش‏ها: بذرها، قطعات اندام‏های رویشی - زایشی و جوانه‏های دو گونه زالزالک به‏حالت سترون در محیط MS جامد همراه هورمون‏های اکسینی (2,4D ، NAA، IAA)، سیتو کینینی (KIN, Zeatin،BAP ) و  GA3 در شرایط استریل به مدت؟؟؟ و در چند تکرار؟؟؟کشت شدند. کپسولی کردن نمونه‏ها با آلژینات سدیم و کلرور کلسیم انجام شد.
نتایج: بهترین جدا کشت‏های کالوس زا، جدا کشت‏های برگی و مریستم جوانه‏ها در محیط MS جامد همراه با غلظت‏هایی از اکسین‏ها و سیتو کینین‏ها بودند. رویان نماها و به‏ویژه رویان‏ها اغلب از جدا کشت‏های برگی و با واکشت کالوس‏های رویان زا در محیط MS جامد همراه با هورمون‏های اکسین – سیتوکینین و حضور مختصر NaCl ایجاد شدند. جوانه‏های جانبی از اوایل پاییز و اواخر اسفند برای تولید بذرهای مصنوعی مناسب‏تر بودند. برای تولید بذرهای مصنوعی از پوشش 3 درصد آلژینات سدیم و 1 درصد کلرور کلسیم استفاده شد. برای ذخیره سازی دانه های مصنوعی دمای 4 درجه سانتی‏گراد و برای رویش این بذرها دمای 1± 24 درجه سانتی‏گراد مناسب بودند.
نتیجه‏گیری: مشکلاتی برای رویان‌زایی پیکری گونه‏های مورد مطالعه وجود دارد. نوع و مقدار هورمون‏ها بر کالزایی و تشکیل رویان نماها و رویان‏ها بسیار موثر است. زمان برداشت جوانه‏ها برای تولید بذرهای مصنوعی نیز اهمیت زیادی دارد. همراه کردن جوانه‏ها با محیط MS و کپسولی کردن آن‏ها با آلژینات سدیم مناسب است.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

سرخ ولیک ( زالزالک ) با نام علمی Crataegus از خانواده گل سرخیان (Rosaceae) در ایران دارای 27 گونه است. نام آن در تهران زالزالک، در فارس و در سردشت گوژ زرده است (1). سرخ ولیک‏ها (‏زالزالک‏ها) درختچه‏ها و درختانی تا ارتفاع 5/7 متر با شاخه‏های خاردار، برگ‏های لُب دار و گل‏های سفید مایل به گلی و بسیار معطرند، میوه‏های آن‏ها شفت و خوراکی هستند (2).

مهم‏ترین ترکیبات دارویی این گیاهان 1 تا 3 درصد آنتوسیانیدین‏ها و پرو آنتوسیانیدین‏ها هستند که جزء ترکیبات فلاونوئیدی می‏باشند. اثرات مهم این گیاهان مربوط به فلاونوئیدها و پروآنتوسیانیدین‏ها است که به مقدار زیاد در آن‏ها وجود دارند (3)‌. این مواد از آنتی اکسیدانت های قوی هستند. میوه ها و دانه های سرخ ولیک قادر به کاهش اسید اوریک و درمان نقرس می باشند. سرخ ولیک در کاهش فشارخون و حمله های قلبی،‌کاهش کلسترول سرم و تقویت حرکات قلب بسیار موثر است و به‏طور گسترده‏ای در اروپا برای کاهش فشار خون و به‏عنوان مقوی قلب مصرف می‏شود. از نظر کلینیکی داروی مناسبی برای فشار خون، ‌تصلب شرائین و احتقان قلب،‌ ضعف عضلات قلب و نارسایی کرونر است (4). تحقیقات نشان داده اند که ترکیبات و اثرات گونه‏های متفاوت سرخ ولیک تا حد زیادی مشابهند مهم‏ترین گونه‏هایی که در تهیه دارو از آن‏ها استفاده می‏شود Crataegus oxyacanth، Crataegus laevigata، Crataegus monogyna هستند (4)‌.

رویان‏زایی پیکری و تولید بذر مصنوعی از دست آوردهای زیست فناوری است که برای تولید گیاهان مطلوب و مورد نظر،‌ عاری از پاتوژن‏ها، ‌دارای ژنوم مشخص با کاربردهای متفاوت به‏کار گرفته می‏شود (5). بذر مصنوعی شامل کپسولی است که با پوشش دادن ماده گیاهی قابل کشت و مواد غذایی توسط یک پوشش مصنوعی تهیه می‏شود. ماده گیاهی قابل کشت قطعه‏ای از بافت یا اندامی است که می‏تواند به پیکر اصلی گیاه کامل تبدیل شود. در سال‏های اخیر نمونه‏های متفاوتی شامل رویان‏های پیکری، ‌رویان‏های طبیعی، ‌مریستم‏ها، ‌جوانه‏های انتهایی و جانبی برای تولید بذر مصنوعی به‏کار گرفته می‏شوند (6).

با توجه به خواص دارویی و متنوع گیاهان سرخ ولیک (زالزالک‏ها)‌، وجود ‌آلاینده‏های قارچی فراوان آن‏ها در سال‏های اخیر که موجب کاهش بهره وری شدید آن‏ها شده است و نیز دست‏یابی به پروتوکلی مناسب برای بهینه سازی کشت در شیشه و تولید بذر مصنوعی این گیاهان، ‌پژوهش حاضر تدوین و انجام شده است.

مواد و روش‏ها

سر شاخه‏ها،‌میوه‏ها و بذرهای گیاهان سرخ ولیک از پارک قیطریه تهران، ‌پارک نیاوران و پارک جمشیدیه و نیز از ارتفاعات کوه سماموس، ‌جاده منتهی به جواهرده در ماه‏های متفاوت سال 92-91 جمع آوری شدند. جوانه‏ها،‌ میوه‏های نارس  و رسیده از سرشاخه‏ها جدا شدند. سپس برگ‏های فلسی روی آن‏ها که به‏رنگ قهوه‏ای بودند حذف شدند.

سترون کردن میوه‏ها، ‌بذرها و جوانه‏ها در زیر هود لامینار با استفاده از شستشو در وایتکس 5 تا 10 درصد‌،‌ اتانول 80 درصد و برای تعدادی از بذرها و جوانه‏ها به‏کارگیری کلرور جیوه 1 در 1000  انجام شد.

تعدادی از بذرها به‏طور کامل و تعدادی پس از شکستن و برداشتن پوست آن‏ها در شرایط سترون در محیط MS کشت شدند. از قطعات اندام‏های رویشی دانه رست‏ها ( پهنک و دمبرگ برگ‏ها) و نیز گیاهان نورسته حاصل از رشد جوانه‏ها (‏ساقه، پهنک و دمبرگ برگ‏ها)‏،‌ همچنین قطعاتی از دمگل، جوانه‏های زایشی در شروع گل‏دهی و میوه‏ها برای تهیه جدا کشت‏ها استفاده شد. جدا کشت‏ها در محیط پایه MS با تنوع زیادی از نظر مقدار و نوع هورمون‏های اکسینی(IAA,NAA,2,4,D)،‌ سیتوکینینی (Kinetin, Zeatin ,BAP)، جیبریک اسید (GA3) (به‏منظور سهولت دریافت نتایج‏،‌ ترکیب شیمیایی این محیط‏ها ضمن شرح نتایج آورده شده است)‌ و مقادیر صفر، 10، 20، 30 و 40 گرم بر لیتر ساکارز، 1 و 2 گرم در لیترNaCl  در ظرف‏های پتری در شرایط سترون کشت شدند. برخی محیط‏های کشت دارای میواینوزیتول (10 تا 100 میلی‏گرم بر لیتر) ‌بودند. غلظت آگار محیط‏های کشت 8 گرم بر لیتر بود. سترون کردن محیط‏های کشت با استفاده از اتوکلاو انجام شد. برای هر آزمایش حداقل سه ظرف پتری (‌سه تکرار) ‌و  در هر ظرف 3 تا 5 نمونه در نظر گرفته شد.

برای تولید بذرهای مصنوعی نیاز به پوشش آلژیناتی است. برای تهیه این پوشش ابتدا محیط کشت  بدون آگار تهیه شد و به‏جای آگار از سدیم آلژینات 3 درصد‌ استفاده شد. از این محلول پس از استریل شدن در اتوکلاو و سپس سرد شدن استفاده شد. مریستم  جوانه‏های استریل شده در پوشش آلژیناتی قرار گرفتند و با استفاده از یک پی پت استریل‏، ‌به‏همراه محلول آلژیناتی به‏درون محلول کلرید کلسیم 1 درصد چکانده شدند، کپسول‏های حاصل چند بار با آب مقطر استریل شستشو شدند‏. تعدادی از بذرها بر روی آگار 2 درصد‏،‌ تعدادی برروی MS بدون هورمون و تعدادی بر روی محیط MS همراه  هورمون‏ها  قرار گرفتند‏.

در هر سری از آزمایش‏ها‏، کپسول‏های تهیه شده به سه دسته تقسیم شدند: تعدادی در دمای اتاق کشت (24 تا 34 درجه سانتی‏گراد )‌تعدادی در یخچال (حدود 4- درجه سانتی‏گراد ) و تعدادی در قسمت سردتر یخچال(Extra Cold ) (حدود 18- درجه سانتی‏گراد) قرار داده شدند ضمن این که تاریکی مطلق و دوره‏های  روشنایی / تاریکی (8 تا 16 ساعت)‌ نیز در آزمایش‏های متفاوت مورد بررسی قرار گرفتند.

 

آنالیز آماری

در موارد ضروری بررسی‏های آماری با مقایسه میانگین نتایج داده‏ها انجام شد.

نتایج

از 14 نوع محیط کشت مورد آزمایش، محیط‏ها و جدا کشت‏های بهینه برای تولید کالوس‏ها انتخاب شدند که نتایج حاصل در جدول 1 و شکل 1 آورده شده‏اند.

 

 

B

D

A

C

شکل 1: A: بخشی از محیط های کشت و جدا کشت‏های کشت شده، B: جدا کشت‏های برگی در محیط کشت و شروع کالزایی،C: کالوس کم و بیش صاف، D: کالوس ناهموار با بخش‏های ارغوانی.    

 

جدول 1: شرایط بهینه تولید کالوس ها

محیط کشت پایه

هورمون ها

mg -1L

جداکشت

زمان پیدایش کالوس ها

نوع کالوس ها

MS همراه با

g -1L  8 آگار

BAP:4

NAA:1

 

2,4-D:1

 

قطعات پهنک برگ

7 تا 30 روز

آبدار و صاف موفقیت حدود 30 درصد

IAA:1

 

قطعات  پهنک برگ

7 تا 30 روز

کوچک، آبدار و  صاف موفقیت حدود 30 درصد

NAA:1

قطعات  پهنک برگ

7 تا 30 روز

حجیم و گره دار موفقیت حدود 30 درصد

BAP:5

NAA:2

 

IAA:1

مریستم انتهای شاخه جوان همراه با آخرین جفت برگ ها

7 تا 30 روز

آبدار و  صاف موفقیت حدود 40 درصد

NAA:1

مریستم  جوانه‏های جانبی همراه با آخرین جفت برگ ها

7 تا 30 روز

حجیم، گره دار با بخشهای انتهایی سفید، بخشی از کالوس ها ارغوانی رنگ

موفقیت حدود 40 درصد

 

تغییر هورمون IAA با NAA  در محیط‏های کشت تفاوت قابل ملاحظه‏ای در نتایج کالزایی نمونه‏ها ایجاد نکرد؛ جدا کشت‏های دمبرگی، ساقه ای، دمگلی، قطعات میوه و رویان‏های طبیعی خارج شده از بذرها موفقیت چندانی برای کالزایی نداشتند.

تعدادی از کالوس‏های ایجاد شده در هر یک از محیط‏های کشت مذکور پس از 10 تا 15 روز کالوس‏زایی برای اندامزایی به محیط‏های واکشت انتقال داده شدند. نتایج واکشت‏ها در جدول 2 و شکل 2 آورده شده‏اند.

 

 

 

 

C

D

B

A

شکل2: A تا D: واکشت بخش‏های کالوسی و مراحل متفاوتی از برگ­زایی آن‏ها.

 

 

جدول 2: شرایط واکشت مناسب برای اندام‏زایی ( برگ زایی) کالوس‏ها

محیط کشت پایه

هورمون ها

mg -1L

 

جدا کشت اولیه کالوس‏زا

زمان انتقال به محیط کشت از شروع کال‏زایی

 

نتیجه

MS همراه با

g -1L  8 آگار

-

مریستم جوانه‏های جانبی همراه با آخرین جفت برگ‏ها

 

10 تا 15 روز

تشکیل برگ‏ها پس از 20 روز

موفقیت حدود 30 درصد

NAA:1

مریستم جوانه‏های جانبی همراه با آخرین جفت برگ‏ها

 

10 تا 15 روز

تشکیل برگ‏ها پس از 21 روز

موفقیت حدود 30 درصد

Zeatin:4

GA3:1

BAP:1

مریستم انتهای شاخه جوان همراه با آخرین جفت برگ‏ها

10 تا 15 روز

تشکیل برگ‏ها پس از 28 روز

موفقیت حدود 20 درصد

 

 

همان‏گونه که نتایج نشان می‏دهند واکشت کالوس‏ها در محیط کشت پایه بدون هورمون یا دارای هورمون‏های رشد کمتر، از محیط کشت دارای تنوع هورمون‏ها برای اندام‏زایی مناسب‏تر بوده‏اند.

از آنجا که تولید رویان‏های پیکری برای تولید بذرهای مصنوعی از اهداف پژوهش حاضر بوده است‏، محیط‏های کشت و واکشت متنوعی برای تولید این رویان‏ها به‏کار گرفته شدند. به تعدادی از محیط‏های کشت ساکارز (غلظت 10،20،30و 40 گرم در لیتر) و به برخی  NaCl (1 و 2 گرم در لیتر) افزوده شد. مناسبترین محیط‏هایی که در آن‏ها کالوس‏های رویان­زا‏، رویان­نماها و رویان‏ها تشکیل شدند در جدول 3 و شکل 3 مشخص شده‏اند.

 

 

A

ce

ge

C

ce

D

B

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 3: A و B: کالوس‏های رویان­زا با توده‏های رویان­نما، C: تشکیل رویان‏های کروی(ge) و لپه دار (ce)، D: کالوس با رویان لپه‏ای (ce).

 

جدول 3: شرایط مناسب برای تشکیل کالوس‏های رویان زا، رویان نماها و رویان‏های پیکری

محیط کشت

هورمون‏ها

mg -1L

جدا کشت

زمان شروع واکشت

محیط واکشت

هورمون‏ها mg/l

نتیجه

 

 

 

 

 

 

 

MS همراه با

g -1L  8 آگار

BAP:5

NAA:2

 

مریستم جوانه‏های جانبی

 

 

پس از 30 روز

MS همراه با  g -1L  8 آگار

Zeatin:4

GA3:1

BAP:1

 

پس از 40 روز تولید رویان نماها. رویان نماها بالغ نشدند. (حدود 10 درصد)

BAP:3

NAA:1

 

مریستم  جوانه‏های جانبی

 

 

پس از 30 روز

MS همراه با  g -1L  8 آگار

NAA:2

BAP:5

 

پس از 40 روز تولید رویان نماهارویان نماها بالغ نشدند.

(حدود 25 درصد)

BAP:4

NAA:1

 

مریستم  جوانه‏های جانبی

پس از 20 تا 30 روز

MS همراه با  g -1L  8 آگار

2,4-D:2

BAP:2

NAA:2

 

پس از حدود 30 تا 35 روز تشکیل رویان‏های کروی.

(حدود 10 درصد)

BAP:3

NAA:1

 

قطعات برگ

پس از 20 تا 30 روز

MS همراه با  g -1L  8 آگار

2,4-D:0.5

NAA:0.5

BAP:1.5

*

پس از حدود 30 تا 35 روز تشکیل رویان‏های کروی.

(حدود 15 درصد)

NAA:3

 

قطعات برگ

پس از 20 تا 30 روز

MS همراه با  g -1L  8 آگار

2,4-D:2

BAP:2

NAA:2

*

پس از حدود 30 تا 35 روز تشکیل رویان ( به احتمال لپه‏ای ) حدود 15  درصد

* علامت ستاره نشان دهنده حضور 1 گرم بر لیتر  NaClدر محیط‏های واکشت می‏باشد.

 

 

از آنجا که با همه تغییرات هورمون‏ها و محیط های کشت تعداد اندکی رویان‏های پیکری و آن هم به‏طور ناهمزمان بر روی برخی کالوس‏ها پدیدار شدند و امکان تهیه بذر مصنوعی از آن‏ها فراهم نشد، بذرهای مصنوعی با استفاده از جوانه انتهایی شاخه‏های جوان و نیز  جوانه‏های جانبی مجاور برگ‏ها، پس از حذف برگ‏های پوشاننده آن‏ها (جز دو برگ بسیار جوان انتهایی) همراه با مقداری محیط کشت پایه MS به‏عنوان ذخیره غذایی در کپسول‏های آلژیناتی (روش تهیه آن‏ها در بخش مواد و روش‏ها شرح داده شد) کپسولی شدند (شکل 4).

 

 

 

A

C

B

D

شکل 4: A: تعدادی از بذرهای مصنوعی حاصل از کپسولی کردن  جوانه‏ها روی محیط کشت MS با 2درصد آگار، B تا D: مراحل متفاوتی از آغاز رویش بذرهای مصنوعی تا تشکیل برگ.

 

 

تعدادی از این بذرهای مصنوعی بلافاصله و تعدادی پس از قرار گرفتن به زمان‏های متفاوت یک هفته تا یک ماه در دماهای متفاوت حدود 4-، 18- و 24+ تا 34+ درجه سانتی‏گراد، روی محیط کشت MS با 2 درصد آگار کشت شدند. تعدادی از نمونه‏ها در تاریکی مطلق و تعدادی در دوره نوری / تاریکی (8  تا 16 ساعت) قرار گرفتند. نتایج این بخش از آزمایش‏ها نشان می‏دهند که دمای 2±24 درجه سانتی‏گراد موجب حفظ توان رویش بذرها و جوانه زنی آن‏ها ( حدود 6 درصد) پس از 17 تا 67 روز با موفقیت شد. (شکل 4 ) در دمای حدود 18- درجه سانتی‏گراد توان زیستی بذرهای مصنوعی حفظ نشد. بذرهای مصنوعی در دمای حدود 4- درجه سانتی‏گراد مدت طولانی‏تری از سرمای 18- درجه سانتی‏گراد (حدود 2 تا 3 هفته) زنده ماندند.

 

 

 

بحث

گیاه زالزالک Crataegus  که به‏نام‏های ولیک، سرخ ولیک و یا سیاه ولیک هم نامیده می‏شود. 27 گونه از آن در نواحی دارای شرایط اقلیمی متفاوت کشور می‏رویند. در پژوهش حاضر نتایج  آزمایش‏ها نشان دادند که فصل برداشت جوانه‏ها به‏منظور استفاده از آن‏ها  به‏عنوان جداکشت تاثیر قابل توجهی بر نتایج آزمایش‏ها دارد و  جوانه‏های اواخر مهرماه (شروع به خواب رفتن درختان) و اوایل اسفند ماه (آغاز بیداری گیاهان سرخ ولیک از خواب زمستانی) می‏تواند در القای کالوس‏زایی مفید و موثر باشد و این در حالی است که جوانه­های برداشت شده در آذرماه و دی ماه رشد و یا کالوس‏زایی را در هیچ یک از انواع محیط‏ها و شرایط به‏کار گرفته شده نشان ندادند. اهمیت فصل برداشت نمونه‏ها در نتایج آزمایش‏ها به‏وسیله محققان زیادی از جمله مجد (7)، ایران بخش و عبادی (8)، Smith (9)، Kozai و همکاران (10، 11 و 12)  نیز گزارش شده است.

از عوامل دیگری که بر نتایج آزمایش‏ها تاثیرگذار بوده اند  محل برداشت نمونه‏ها هستند به‏طوری‏که نمونه‏های برداشت شده از ارتفاعات کوه سماموس، جاده منتهی به جواهرده نمونه‏هایی بهینه برای کشت و تهیه بذرهای مصنوعی بودند در حالی‏که نمونه‏های برداشت شده از پارک قیطریه، نیاوران و جمشیدیه توان رویش یا کالوس‏زایی زیادی نشان ندادند. این تفاوت­ها می‏توانند به‏دلیل تفاوت شرایط اقلیمی در محل­های مذکور و به‏ویژه تفاوت دما و میزان آلاینده‏ها باشند. تاثیر عوامل  اقلیمی بر تغییرات سلولی- مولکولی و تکوینی موجودات زنده از سال‏ها قبل به‏خوبی مشخص شده و یکی از موضوعات مورد توجه در بوم‏شناسی و مسائل محیط زیست است که در سال‏های اخیر بیش از پیش مورد توجه پژوهشگران است. شریف نیا و همکاران (13)، معصومی و همکاران (14 و 15)،  Ray & Rossin  (16)، Prado و همکاران (17).

به‏کارگیری محیط‏های کشت متفاوت در آزمایش‏های پژوهش حاضر موجب نتایج متفاوت جداکشت­ها، القای کالوس­ها و تولید رویان نماها و رویان‏ها شد. نقش محیط­های کشت متفاوت، عناصر پر مصرف و کم مصرف، قندهای موجود در محیط و شرایط فیزیکی و شیمیایی محیط­های کشت از نکات بنیادی در کشت بافت است. ضرورت وجود عناصر پر مصرف و کم مصرف به‏منظور تامین عناصر لازم برای بقا، رشد و تکوین گیاهان و بر پایه مقایسه با نیازهای گیاهان طبیعی بوده است. قندها نیز به‏منظور تامین انرژی،  تامین کربن و هم فشار اسمزی مناسب ضرورت دارند. نمک‏هایی مثل NaCl می‏توانند به‏عنوان عامل یون ساز و نیز اسمولاریته مناسب مطرح باشند.

اهمیت ترکیبات محیط کشت  به‏وسیله محققان زیادی از جمله مجد و چمن دوستی (18) که چندین محیط کشت را در آزمایش­های خود به‏کار گرفتند و Wang   و همکاران (19) که اهمیت وجود قند ساکارز را برای رویان‏زایی گیاهانی از غلات مفید گزارش کرده اند Farahani and Majd  (20)  مورد تاکید بوده است.

استفاده از واکشت­های متفاوت در پژوهش حاضر بر نتایج آزمایشها تاثیر چندانی نداشت، این وضعیت با گزارش­های Triqui و همکاران (21)، MIGUEL P. GUERRA (22) و CAO و همکاران (23) که واکشت‏های مکرر را برای حفاظت بهتر کالوس‏ها، القای اندام‏زایی و رویان‏زایی موثر دانسته اند هم‏سویی ندارد. این تفاوت‏ها می‏تواند مربوط به شرایط آزمایش‏ها و نوع ژنوتیپ گیاهان مورد آزمایش باشد. MIGUEL P. GUERRA  و همکاران (22)، قائمی و همکاران (24) اهمیت ژنوتیپ در پاسخ نمونه‏ها به شرایط کشت برای رویان‏زایی را مورد تاکید قرار داده‏اند. به‏طور کلی واکشت‏ها علاوه بر این که نقش نوعی تنش را دارند، می‏توانند در رفع کمبود مواد غذایی مورد نیاز و خروج مواد اضافی (دفعی) حاصل از فعالیت‏های زیستی نمونه‏های کشت شده موثر باشند. می‏توان تصور کرد که فعالیت زیستی کند نمونه‏های کشت شده در پژوهش حاضر کمبودی در مواد غذایی ضروری و یا افزایش چندانی در مواد اضافی (دفعی) را به‏همراه نداشته است و به‏همین دلیل واکشت‏ها ضرورت زیادی نداشته و اثر چندانی در تغییرات وضع نمونه‏ها نداشته‏اند.

به‏دلیل عدم تکوین تعداد کافی از رویان نماها به از رویان‏ها،  امکان تولید بذر مصنوعی از رویان‏ها فراهم نشد. این نتایج با گزارش‏های رجایی (25)، Mariani و همکاران (26)، غلامی و همکاران (27)  مشابه است.

بررسی اثر عوامل محیطی بر توان زیست بذرهای مصنوعی  و پی بردن به شرایط مناسب برای حفظ سلامت این بذرها از نکات حساس و قابل توجه در تولید بذرهای مصنوعی است. یکی از این شرایط که نقش بنیادی در بقای بذرهای مصنوعی دارد دمای محیط نگه‏داری آن‏ها است. محققان زیادی از جمله Tabassum و همکاران (28)، Priscila Cartes  و همکاران (29)، Ipekci و همکاران (30)، Rai  و همکاران (31)، Thobunluepop (32) و همچنین غلامی و همکاران (26) نقش دماهای متفاوت برای بقای بذرهای مصنوعی را مورد آزمایش قرار داده اند و نتایج متفاوتی را به‏حسب گونه‏های مورد آزمایش‏های خود گزارش کرده‏اند.

نتیجه‏گیری

در پژوهش حاضر دمای محیط (اتاق کشت 24 تا 34 درجه سانتی‏گراد) و نیز دمای 4 تا 8 درجه سانتی‏گراد برای بقای بذرهای مصنوعی مورد آزمایش قرار گرفت. مجموع بررسی‏ها و پژوهش‏ها نشان می‏دهند که دمای حدود 4- درجه سانتی‏گراد برای نگه‏داری و سلامت بذرهای مصنوعی مناسب‏تر از سرمای شدید 18- درجه سانتی‏گراد است، دلیل این امر می‏تواند ادامه آرام فعالیت‏های متابولیکی و آسیب‏های آنزیمی کمتر ساختارهای سلولی و بافتی باشد.

تشکر و قدردانی

از حوزه معاونت محترم پژوهشی واحد تهران شمال دانشگاه آزاد اسلامی که هزینه لازم برای اجرای این طرح را تامین کرده اند و همکاری‏های پرسنل محترم آزمایشگاه محمودیه به‏ویژه سرکار خانم فلور مظهر سپاس‏گزاری می‏شود

1. Sabeti, H, Forest, Tree & Shrub of IRAN. 3th  Ed, Iran, Yazd university Publisher; 2008.

2. Ghahreman A, Flor of Iran, Research Institute of Forests & Rangelands. 2006; 14-17.

 3. Radpooya AA. The plants food etonments, Naghshe mehr Publisher. 1996; 34-38.

 4. Salehi Sormaghi MH. Medical plants and phytotherapy, Food world Publisher. 2008; 43(2): 178-183.

5. Majd A, ChamanDoosti F, Mehrabian S, et al. Somatic embryogenesis and plant regeneration in Canola ( Brassica napus L.), Iranian Journal Of Biology. 2007; 4: 344-352.

6. Ara H, Jaiswel U, Jaiswel VS. Synthetic seed: prospects and limitations. Current Science. 2000; 78: 1438-1444.

7. Majd A. The cours of plant tissue culture, 2012; 4(2): 42-47.

8. Iranbakhsh A. Ebadi M. Plant cell and tissue culture, Islamic Azad University Aliabad Katoul Branch Publisher. 2009; 27-31.

9. Smith HR. Translators: Bagheri, H. Azadi , P. Plant tissue culture techniques and experiments, ACECR Mashhad Publisher. 2009.

10. Kozai T. Fujiwara K, Watanabe I. Fundamental studies of environments in plant tissue culture vessels. (1) Relation between the culture medium composition and water potential of liquid culture media. J. Agr. Meteorol. 1986; 42(1):1-6. (JE)

11. Kozai T, Fujiwara K, WatanabeI. Fundamental studies of environments in plant tissue culture vessels. (2) Effects of stoppers and vessels on gas exchange rates between inside and outside of vessels closed with stoppers. J. Agr. Meteorol. 1986; 42(2): 119-127. (JE)

12. Kozai T, Hayashi M. Hirosawa Y, Kodama T, et al. Environmental control for acclimatization of in vitro cultured plantlets. (1) Development of the acclimatization unit. J.Agr.Meteorol. 1987; 42(4): 349-358.

13. Sharifnia F, Seyedipour N, Salimpour F. Biosystematic study of four species of Crataegus L. In central of Iran, Biology Journal, Islamic Azad University Garmsar Branch. 2009; 45-52.

14. Maassoumi AA, Mahmoodi M, hamzehie B. Geographic distribution of Astragalus in Iran, Botanical Journal of Iran. 2009; 10(1): 112-132.

15. Maassomi AA,  Farhangisabet  M, Majd A, Nejadsattari T, ET AL. MEGAGAMETOPHYTE AND EMBRYO DEVELOPMENT IN FIVE SPECIES OF ASTRAGALUS (FABACEAE), The Iranian Journal of Botany. 2012; 17(2): 167-174.

16. Rossin CB, Rey MEC. Effect of explant source and auxin on somatic embryogenesis of selected cassava (Manihot esculenta Crantz ) cultivars.  South African Journal of Botany. SAJB-00550. 2010; 7(1): 75-80.

17. Prado MJ, Grueiro MP, Gonzalez MV.Testillano, P.S. Dominguez, C. Lopez, M. Rey, M. Efficient plant regeneration through somatic embryogenesis from anthers and ovaries of six autochthonous grapevine cultivars from Galicia (Spain). Scientia Horticulturae. 2010; 125: 342-352.

18.  Majd A, ChamanDoosti F, Mehrabian S, Shaidai M. The Regeneration of Brassica napusl. and indirecte Caulogenesis used Hypostyle explant of invitro culture, QUARTERLY JOURNAL OF SCIENCE (KHARAZMI UNIVERSITY). 2005; 344-352.

19. Wang N, Fisher DB. Sucrose Concentration Gradients along the Post-Phloem Transport Pathway in the Maternal Tissues of Developing Wheat Grains, Plant Physiol. 1995 Oct. 109(2); 587–592

20. Farahani F, Majd A. Comparison of liquid culture methods and effect of temporary immersion bioreactor on growth and multiplication of banana (Musa, cv. Dwarf Cavendish). African Journal of Biotechnology. 2011; 11(33): pp. 8302-8308.

21. Triqui ZEA, Guedira A, Chlyah A, Chlyah H, et al. Effect of genotype, gelling agent , and auxin on the induction of somatic embryogenesis in sweet potato (Ipomoea batatas Lam.). C.R.biological. 2008; 331: 198-205.

22. Miguel P, Guerra Lirio L. Dal Vesco, JEAN Perre H.J.Ducroquet,. Somatic embryogenesis in Goiabeira serrana. genotype rssponse , auxinic shock and synthetic seed.. R. Bras. Fisiol. Veg. 2001; 13(2): 117-128

23. CAO JL. ZHANG XL. JIN, Shuang-X. YANG, XY. et al. An Efficient Culture System for Synchronization Control of Somatic Embryogenesis in Cotton (Gossypium hirsutum L.). ACTA AGRONOMICA SINICA. 2008; 34(2): 224-231.

24. Ghaemi M, Majd A. Fallahian F. Ghasemi Bezdi, K. Comparison of callus induction and somatic embryogenesis of some Iranian cottons (Gossypium Spp.) with Coker 312 and histology of somatic embryogenesis. African Journal of biotechnology. 2011; 10(15): 2915-2922.

25. Rajaee S, Majd A. Somatic embryogenesis and artificial seed production of Canola (Brassica napus L.) , Science and Research Branch Islamic Azad University. 2013; 73-77.

26. Mariani, TS,  Latif S, Ginting G, Miyake H. Somatic embryogenesis of oil palm (Elaeis guineensis Jacp.) for synthetic seed production. ASIAN JOURNAL OF APPLIED SCIENCES. 2014; 2(3): 626-629.

27. Gholami AA, Alavi SV, Majd A, Fallahian F. Plant regeneration and cold preservation of Eureka lemon (Citrus limon [L.]  Burm. f. [‘Eureka’]) by using sodium alginate-encapsulated shoot tips. Annals of Biological Research. 2013; 4 (5): 279-285.

28. Tabassum B,  Nasir  IA, Farooq AM, Rehman  Z,  et al. Viability assessment of in vitro produced synthetic seeds of cucumber. African Journal of Biotechnology. 2010; l.9(42): 7026-7032.

29. Priscila Cartes R, Hermes Castellanos B, Darcy Ríos L, Katia Sáez C, et al. ENCAPSULATED SOMATIC EMBRYOS AND ZYGOTIC EMBRYOS FOR OBTAINING ARTIFICIAL SEEDS OF RAULI-BEECH (Nothofagus alpine (Poepp. & Endl.) Oerst.). Chilean Journal of Agricultural Research. 2009; 69(1): 112-118.

30. Ipekci ZGozukirmizi N. Direct somatic embryogenesis and synthetic seed production from Paulownia elongata. Plant Cell Rep. 2003; 22: 16-24.

31. Rai MK, Akhtar N, Jaiswal VS. Somatic embryogenesis and plant regeneration in Psidium guajava L. cv. Banarasi local. Scientia Horticulturae. 2007; 113(2): 129-133.

32. Thobunluepop P. The somatic embryogenesis and plant regeneration from immature embryo of sweet corn inbred line.  Journal of Plant Breeding and Crop Science. 2009; 1(10): 330-335.