تاثیر هم‏زمان اکسید نیتریک و میدان الکترومغناطیسی بر میزان تکثیر و تغییر مورفولوژی سلول‏های بنیادی استرومایی

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری گروه بیوفیزیک، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، صندوق پستی 14115/175، تهران

2 دانشیار گروه بیوفیزیک، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، صندوق پستی 14115/175، تهران

چکیده

هدف: میدان الکترومغناطیسی به‏عنوان یک عامل محرک فیزیکی خواه و ناخواه فرآیندهای سلولی را تحت تاثیر خود قرار می‏دهد. در مطالعه‏ی حاضر تغییر مورفولوژی و سرعت تکثیر سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی در حضور میدان الکترومغناطیسی (EMF) و مولکول پیامبر اکسید نیتریک (NO) بررسی شد. مواد و روش‌ها: بعد از جداسازی سلول‏های بنیادی استرومایی از مغز استخوان موش صحرایی و تکثیر و واکشت سلول‏ها، به محیط کشت آن‏ها Deta-NO اضافه شد و سلول‏ها با میدان الکترومغناطیسی با فرکانس 50 هرتز و شدت 20 میلی ‏تسلا تیمار شدند. برای تخمین میزان رشد سلول‏ها از روش سنجش MTT استفاده شد.  برای تخمین درصد سلول‏ها در فازهای مختلف چرخه‏ی سلولی و تاثیرپذیری توسط اکسید نیتریک و EMF، محتویات DNA سلولی توسط فلوسایتومتری محاسبه شد. نتایج: نتایج نشان داد که میدان الکترومغناطیسی در حضور مولکول سیگنالینگ NO میزان رشد سلول‏ها را کاهش می‏دهد که این کاهش رشد به غلظت بالا و پایین NO وابسته است و باعث توقف چرخه سلولی در فاز G2 می‏شود. همچنین EMF و NO تاثیر مهمی را روی تغییر شکل و تحرک سلول‏های بنیادی می‏گذارد. نتیجه‌گیری: کاهش رشد و تغییر شکل سلول‏ها می‏تواند مقدمه‏ای برای رفتن سلول‏ها به سمت تمایز باشد.  

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

سلول‏های استرومایی مغز استخوان که همچنین به‏عنوان سلول‏های بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان شناخته شده‏اند شامل جمعیتی از سلول‏های بنیادی بالغ (چندتوان) می‏باشند که قابلیت تمایز به چندین رده‏ی سلولی از جمله چربی، استخوان و غضروف را دارند (1). این سلول‏ها به‏دلیل داشتن قدرت تکثیر گسترده در محیط کشت و در عین حال دارا بودن پتانسیل تمایزی انتخاب‏های جذابی در تولید دوباره‏ی بافت‏ها می‏باشند و در‏ ترمیم بافت، رگ‏زایی و درمان بیماری‏هایی نظیر پارکینسون و هانتینگتون کاربرد دارند (2). فاکتورهای بیوشیمیایی ویژه‏ شامل عوامل رونویسی، مولکول‏های پیامبر (3)، فاکتورهای رشد، نوروتروفین‏ها، سیتوکین‏ها یا ترکیبات شیمیایی ویژه‏ مثل مرکاپتواتانول (4) قادر به تمایز سلول‏های بنیادی مزانشیمی به‏سمت سلول‏های عصبی هستند. میدان الکتریکی و مغناطیسی به‏عنوان یک ابزار فیزیکی مناسب برای تحریک تمایز سلول‏های بنیادی به‏سمت سلول‏های عصبی پیشنهاد شده است. تیمار سلول‏ها با میدان‏‏های الکتریکی و مغناطیسی با افزایش نرخ گونه‏های فعال اکسیژن و نیتروژن (Reactive oxygen/ nitrogen species) می‏تواند فرآیندهای سلولی را تغییر دهد (5).

فاکتورهای فیزیکی مثل میدان‏های الکتریکی و مغناطیسی ممکن است سطح تمایز سلول‏های بنیادی مزانشیمی را کنترل کنند. در موافقت با این ادعا مطالعات اخیر نشان داده‏ است که میدان‏های الکترومغناطیسی با فرکانس فوق العاده پایین 0 تا 100 هرتز روی تعداد زیادی از عملکردهای زیستی ازجمله تمایز سلول (6)، بیان ژن (7) و سرنوشت سلول تاثیر می‏گذارند و رها سازی فاکتورهای موردنیاز برای رشد را تنظیم و فرآیندهای تمایز را تحریک می‏کنند (8). در طی فرآیند رشد و نمو، میدان‏های الکتریکی در شکل‏گیری جریان‏های یونی بین سلولی و درون سلولی نقش دارند. با اینکه میدان‏های الکتریکی درونی در تمایز و شکل‏گیری همه بافت‏های حیوانی نقش دارند، وجود آن‏ها و اثر پتانسیلی آن‏ها روی شکل‏گیری و ترمیم بافت کاملا نادیده گرفته شده است. سیستم‏های زنده به صورت مداوم در حرکت هستند و تغییر در میدان الکتریکی باعث تولید میدان مغناطیسی درونی می‏شود. تیمار سلول‏ها با میدان الکترومغناطیسی همچنین می‏تواند باعث تغییر در نفوذپذیری غشای سلول شود. پروتئین‏های کانال‏های دریچه‏دار ولتاژی (voltage-gate) تحرکاتی دارند که می­توانند باز یا بسته شوند و عبور یون‏ها را از میان کانال تنظیم کنند. کنفورماسیون این پروتئین­ها در پاسخ به فاکتورهای خارجی نظیر میدان الکترومغناطیسی دستخوش تغییر می‏شود که این تغییر می‏تواند روی عملکرد کانال‏ها و عبور یون‏ها از کانال و درنتیجه تغییر اختلاف پتانسیل غشا تاثیرگذار باشد (9).

اکسید نیتریک یک رادیکال آزاد دو اتمی و یکی از مهم‏ترین مولکول‏های پیامبر در فیزیولوژی پستانداران است که بسیاری از فرآیندهای سلولی نظیر فشار خون، پاسخ ایمنی، انتقال نوروترانسمیترها و مکانیسم‏های حساس به اکسیداسیون را تنظیم می‏کند (10). این مولکول پیامبر همچنین در تنظیم رشد سلول، بقا، آپوپتوزیس، تکثیر و تمایز سلول نقش دارد (11). اکسید نیتریک (NO) توسط گروهی از آنزیم‏ها به‏نام نیتریک ‏اکسید سنتاز (NOS) ساخته می‏شود که آرژنین را به سیترولین تبدیل و NO را تولید می‏کند (12). همچنین  NO با مولکول‏هایی مثل اکسیژن، سوپراکسید، فلزات، نوکلئیک اسیدها و پروتئین‏ها واکنش می‏دهد. برهم‏کنش NO با گونه‏های فعال اکسیژن منجر به تغییرات پس از ترجمه روی پروتئین‏ها نظیر نیتروزیشن و نیتریشن و اثر روی فعالیت پروتئین می‏شود (13). اثر NO روی فرآیندهای سلولی به غلظت آن و حضور رادیکال‏های آزاد دیگر وابسته است. غلظت پایین NO روی فرآیندهایی مثل تکثیر سلولی و بقا تاثیر مستقیمی می‏گذارد، درحالی‏که غلظت‏های بالاتر NO از طریق استرس‏های اکسیداتیو و نیتروزاتیو اثرات غیرمستقیمی روی سلول اعمال می‏کند (14).

اکسید نیتریک نقش مهمی را در نورون‏زایی جنین بازی می‏کند. عملکرد NO در نورون‏زایی و تشکیل سیستم عصبی مرکزی ممکن است به نقش آن در مرگ برنامه‏ریزی شده‏ی سلول یا کنترل تکثیر سلولی وابسته باشد (15). در بعضی از مطالعات نشان داده شده که عملکرد ضد تکثیری NO پیش نیازی برای تمایز است (16).

در این مطالعه اثر میدان الکترومغناطیسی با فرکانس پایین 50 هرتز و شدت 20 میلی‏تسلا (17 و 18) روی مورفولوژی، میزان تکثیر و چرخه‏ی سلولی سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی در حضور و عدم حضور غلظت‏های مختلف اکسید نیتریک‏ بررسی شده است.

مواد و روش‏ها

موش صحرایی نژاد ویستار (Wistar rat) با وزن 240 تا 260 گرم از آزمایشگاه حیوانات دانشگاه تربیت مدرس خریداری شد. از مغز دو استخوان ساق و ران موش صحرایی، سلول‏های بنیادی مزانشیمی به‏همراه سلول‏های پیش‏ساز خونی استخراج شد. این سلول‏ها در محیط کشت alpha-Mem دارای 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS-Gibco)، 1 درصد آنتی بیوتیک پنی‏سیلین استرپتومایسین و 1 درصد فونجیزون (عامل ضد قارچ) در انکوباتور در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و گاز دی‏اکسیدکربن (CO2) 5 درصد و رطوبت نرمال به مدت 24 تا 48 ساعت کشت داده شدند. بعد از این مدت زمان محیط کشت سلول‏ها تعویض شد. با هر بار تعویض محیط کشت و شستشوی سلول‏ها با بافر سالین (PBS) سلول‏های خونی که غیر چسبان بودند و در محیط کشت شناور می‏ماندند از محیط کشت حذف می‏شدند و سلول‏های بنیادی مزانشیمی چسبان در محیط کشت باقی می‏ماندند. بعد از هر بار پر شدن سلول در کف فلاسک، سلول‏ها واکشت داده می‏شدند. بعد از 4 تا 5 بار واکشت و مطمئن شدن حذف سلول‏های پیش‏ساز خونی، بررسی‏های لازم روی سلول‏های بنیادی انجام گرفت. برای تعیین مارکرهای مزانشیمی بودن سلول‏های بنیادی تست فلوسایتومتری انجام شد (19). از میدان الکترومغناطیسی با فرکانس 50 هرتز استفاده شد و همچنین اثر اکسید نیتریک در غلظت پایین 10 میکرومولار و غلظت بالای 1 میلی‏مولار روی درصد زنده ماندن سلول‏های بنیادی بررسی گردید. Deta-NO به‏عنوان یک ترکیب شیمیایی آزادکننده‏ی اکسید نیتریک از شرکت Abcam آمریکا خریداری و‏ به محیط کشت اضافه شد. رتینوئیک‏اسید به‏عنوان ترکیب القاکننده تمایز سلول‏های بنیادی به‏سمت سلول‏های شبه‏ عصب از شرکت Sigma آمریکا خریداری شد و از غلظت 10 میکرو مولار این ماده در انجام آزمایشات استفاده شد (20).

از تست MTT برای سنجش درصد بقای سلول‏های بنیادی تحت تاثیر میدان الکترومغناطیسی و اکسید نیتریک در 5 بازه‏ی زمانی 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت استفاده شد. در هر خانه پلیت 96 خانه، 5000 سلول بنیادی برده شد. بعد از چسبیدن سلول‏ها به کف پلیت، سلول‏ها با غلظت بالا و پایین اکسید نیتریک و رتینوئیک اسید تیمار شدند و سلول‏ها در میدان الکترومغناطیسی با فرکانس 50 هرتز و شدت 20 میلی تسلا برده شدند. گروه‏های انتخابی عبارتند از: 1. گروهی که هیچ تیماری نمی‏دید (شاهد)، 2. گروهی که در حضور اکسید نیتریک با غلظت بالا بود (NO mac)، 3. گروهی که با نیتریک اکسید با غلظت پایین تیمار داده می‏شد (NO mic)، 4. گروهی که با رتینوئیک اسید تیمار داده می‏شد (Ret)، 5. گروهی که در معرض میدان الکترومغناطیسی قرار داده شد (EMF)، 6. گروهی که در معرض میدان الکترومغناطیسی قرار گرفت و با غلظت بالا و یا پایین NO تیمار داده شد. 7. گروهی که در معرض میدان قرار گرفت و با رتینوئیک اسید تیمار داده شد. و 8. گروهی که با رتینوئیک اسید و NO با غلظت بالا یا پایین تیمار داده شد و همزمان در معرض میدان الکترومغناطیسی قرار گرفت.

بعد از تیمار 12، 24، 48، 72 و 96 ساعته، محیط کشت سلول‏ها با محیط کشت حاوی نمک تترازولیوم تعویض گردید و سلول‏ها به مدت 3 ساعت در انکوباتور در حضور نمک تترازولیوم (خریداری شده از شرکت Sigma) انکوبه شدند. نمک تترازولیوم  به منظور سنجش میزان مرگ سلول‏ها استفاده شد. بعد از 3 ساعت محیط کشت حاوی نمک خالی و روی سلول‏ها دی متیل سولفاکساید (DMSO) ریخته و جذب سلول‏ها در دو  طول موج 540 و 570 نانومتر خوانده شد.

بعد از تیمار سلول‏ها به‏مدت 48 ساعت با اکسید نیتریک، رتینوئیک‏اسید و میدان الکترومغناطیسی درصد چرخه‏ی سلولی به کمک دستگاه فلوسایتومتری تعیین شد. به‏منظور انجام این آزمایش، سلول‏های تیمار شده تریپسینه و سانتریفیوژ شدند و سپس با بافر سالین شسته و با رنگ پروپیدیوم یدید (PI) انکوبه شدند و با استفاده از دستگاه فلوسایتومتری درصد هر یک از فازهای چرخه سلولی تعیین شد و با نرم‏افزار flowing software تحلیل شد.

آنالیز آماری

کلیه‏ی آزمایش‏ها با سه بار تکرار صورت گرفت. با کمک نرم‏افزار excel 2013 برای تمام داده‏ها میانگین و انحراف معیار محاسبه شد. معنی‏دار بودن یافته‏های حاصل با استفاده از t.Test در سطح 05/0 ≥p  مورد ارزیابی قرار گرفت.

نتایج

در این مطالعه تاثیر میدان الکترومغناطیسی با فرکانس 50 هرتز و شدت 20 میلی تسلا در حضور و عدم حضور ­اکسید نیتریک روی درصد زنده ماندن سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی و تعیین درصد چرخه‏ی سلولی بررسی شد.

در اکثر گروه­ها نسبت به گروه شاهد میدان الکترومغناطیسی در حضور اکسید نیتریک باعث افزایش درصد مرگ و میر سلول­های بنیادی مزانشیمی شد که این تاثیر در حضور NO با غلظت پایین کمتر و در حضور NO با غلظت بالا بیشتر است.

بعد از 12 ساعت تیمار با میدان الکترومغناطیسی و ‏اکسید نیتریک درصد زنده ماندن سلول‏ها در اکثر گروه‏ها روند کاهشی داشته است. در گروه‏های تیمار شده با اکسید نیتریک با غلظت بالا و پایین و گروه تیمار شده با رتینوئیک ‏اسید و نیتریک ‏اکسید به‏صورت هم‏زمان، رشد سلول‏ها بعد از 12 ساعت تیمار افزایش یافته است (نمودار 1).

بعد از 24 ساعت تیمار در گروه‎هایی که فقط ‎اکسید نیتریک یا رتینوئیک‎اسید دریافت کرده بودند یا در حضور هر دو قرار داشتند درصد زنده ماندن سلول‎ها نسبت به گروه کنترل کاهش معنی‎داری را از خود نشان داد (نمودار 1).

بعد از 24 ساعت تیمار، میدان الکترومغناطیسی به تنهایی باعث کاهش درصد زنده ماندن سلول‏ها به‏صورت معنی‏دار نسبت به گروه کنترل شد (نمودار 1).

 

 

 

 

 

نمودار1: نرخ تکثیر سلول‏های بنیادی مزانشیمی بعد از تیمار با میدان الکترومغناطیسی، ‏اکسید نیتریک و رتینوئیک‏اسید در بازه‏های زمانی 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت. حروف غیریکسان نشاندهنده‏ی تفاوت معنی‏دار بین تیمارهای مختلف می‏باشد.

 

 

در سایر گروه‏هایی که میدان الکترومغناطیسی را دریافت می‏کردند و با ‏اکسید نیتریک یا رتینوئیک اسید یا هر دو تیمار می‏شدند بعد از 24 ساعت تیمار درصد زنده ماندن سلول‏ها نسبت به گروه کنترل کاهش یافت که این کاهش در گروهی که رتینوئیک اسید را به‏همراه میدان الکترومغناطیسی دریافت می‏کرد و گروهی که با NO با غلظت بالا به همراه EMF تیمار می‏شد نسبت به سایر گروه‏ها شدیدتر بود (نمودار 1).

بعد از 48 ساعت تیمار با اکسید نیتریک و رتینوئیک اسید نتایج نشان داد که در گروهی که اکسید نیتریک با غلظت پایین را دریافت می‏کرد نسبت به گروه کنترل درصد زنده ماندن سلول‏ها افزایش یافته است در واقع غلظت پایین اکسید نیتریک بعد از 48 ساعت باعث افزایش رشد و تکثیر سلول‏ها شده است. اما در سایر گروه‏هایی که اکسید نیتریک‏ با غلظت بالا یا رتینوئیک اسید یا هر دو را دریافت می‏کردند درصد زنده ماندن سلول‏ها نسبت به گروه کنترل کاهش معنی‏داری داشت (نمودار 1).

بعد از 48 ساعت تیمار با میدان الکترومغناطیسی درصد زنده ماندن سلول‏ها در همه‏ی گروه‏هایی که EMF را دریافت

 

می‏کردند کاهش یافت که این کاهش در گروه‏های ترکیبی نمود بیشتری داشته است (نمودار 1).

بعد از 72 ساعت  تیمار در حضور نیتریک اکسید و رتینوئیک اسید یا هر دو درصد مرگ و میر سلول‏های بنیادی نسبت به گروه کنترل به‏صورت معنی‏داری افزایش یافت که این افزایش در گروهی که NO با غلظت پایین را دریافت کرده است کمتر و در گروهی که NO با غلظت بالا و رتینوئیک اسید را دریافت کرده است شدیدتر است (نمودار 1).

بعد از 72 ساعت تیمار با میدان الکترومغناطیسی با فرکانس 50 هرتز درصد زنده ماندن سلول‏ها در همه‏ی گروه‏ها نسبت به گروه کنترل کاهش یافت که در گروهی که NO با غلظت بالا یا رتینوئیک اسید یا هر دو را در حضور EMF دریافت کرده‏اند این کاهش معنی‏دار بود (نمودار 1).

تیمار 96 ساعت با میدان الکترومغناطیسی و ‏اکسید نیتریک نیز باعث کاهش درصد زنده ماندن سلول‏ها در اکثر گروه‏ها شده است (نمودار 1).

میدان الکترومغناطیسی و ­اکسید نیتریک با غلظت بالا بعد از 48 ساعت تیمار باعث افزایش تحرک و مهاجرت سلول­های بنیادی شده است و همچنین باعث شد که شکل سلول‏ها نسبت به گروه کنترل تغییر کند و سلول دارای زائده‏های شبه دندریتی شود (شکل 1).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1: مورفولوژی سلول‏های بنیادی مزانشیمی بعد از قرارگیری در میدان الکترومغناطیسی و تیمار با اکسید نیتریک‏ و رتینوئیک اسید. a) گروه شاهد، b) گروه تیمار شده با EMF+ Ret، c) گروه تیمار شده با غلظت بالای NO، d) گروه تیمار شده با EMF، e) گروه تیمار شده با EMF و غلظت پایین اکسید نیتریک‏ ، f) گروه تیمار شده با EMF و غلظت بالای اکسید نیتریک‏

 

 

بعد از 48 ساعت تیمار با میدان الکترومغناطیسی و اکسید نیتریک، 6 گروه کلیدی برای تعیین درصد چرخه‏ی سلولی انتخاب شد. نتایج فلوسایتومتری نشان داد که در همه‏ی گروه‏ها درصد سلول‏های موجود در فاز G0/G1 نسبت به گروه کنترل کاهش یافت. درصد سلول‏های موجود در فاز S در همه‏ی گروه‏ها به جز گروه تیمار داده شده با غلظت بالای NO و گروه تیمار

 

داده شده با غلظت بالای NO و EMF نسبت به گروه کنترل کاهش یافت. درصد سلول‏های موجود در فاز G2 نیز در همه‏ی گروه‏ها نسبت به گروه کنترل افزایش یافت. همچنین درصد سلول‏های موجود در فاز sub G1 در همه‏ی گروه‏ها به‏جز گروه تیمار داده شده با رتینوئیک اسید و EMF نسبت به گروه کنترل افزایش یافت (نمودار2، 3، 4).

 

 

 

نمودار 2: درصد سلول‏های موجود در هرکدام از فازهای چرخه‏ی سلولی بعد از اعمال تیمارهای مختلف

 

 

 

نمودار 3: درصد سلول‏های موجود در فاز sub G1 بعد از اعمال تیمارهای مختلف

 

 

نمودار 4: درصد چرخه‏ی سلولی گروه‏های مورد مطالعه با استفاده از نرم‏افزار flowing software

 

بحث

پاسخ‏های سلولی در غلظت‏های مختلف اکسید نیتریک به‏صورت متفاوتی تنظیم می‏شوند، NO در غلظت پیکو تا نانومولار در محیط درون تنی (in vivo) معمولا تکثیر و بقای سلولی را تحریک می‏کند. در حالی‏که در سطح میلی‏مولار به توقف چرخه‏ی سلولی، آپوپتوزیس و پیری منجر می‏شود (21). در یک مطالعه نشان داده شد که SNAP (S-Nitroso-N-Acetyl-D, L-Penicillamine) به‏عنوان یک مولکول‏دهنده‏ی NO در دامنه‏ی غلظتی 10 تا 50 میکرومولار، سلول‏های بنیادی

 

مزانشیمی را علیه آپوپتوزیس خودبخودی از طریق تحریک فعالیت پروتئین کیناز G وابسته به cGMP حفاظت می‏کند (22). با رهاسازی NO در غلظت‏های پایین، پروتئین کیناز G فعال می‏شود و درصد زنده ماندن سلول‏های بنیادی مزانشیمی را افزایش می‏دهد. کمبود فعالیت پروتئین کیناز G میزان تکثیر سلولی را کاهش می دهد (22).

در این مطالعه نشان داده شد که غلظت بالای NO تکثیر سلول‏ها را به‏صورت معنی‏داری کاهش اما غلظت پایین NO  تکثیر سلولی را به‏ویژه در زمان 48 ساعت افزایش می‏دهد .

اکسید نیتریک با نقش آپوپتوزیس خود، رشد سلول را مهار می‏کند. گزارش‏های پیشین نشان داده‏اند که NO روی بسیاری از پروتئین‏های چرخه سلولی شامل سیکلین‏ها، کیناز 2 وابسته به سیکلین (CDK2)، مهارکننده 1 کینازی وابسته به سیکلین (p21) و پروتئین رتینوبلاستوما  اثر می‏گذارد که NO می‏تواند از هر دو مسیر وابسته به cGMP و مستقل از آن این تاثیر را اعمال کند (23). میانجی‏گرهای توقف تکثیر سلولی در مسیر وابسته به cGMP، نیتروزیشن، تیروزین نیتریشن و بعضی از واکنش‏های اکسیداتیو/نیتروزاتیو هستند (23).

در مطالعه‏ای دیگر نشان داده شد که بعد از تیمار با SNAP، تغییرات میتوکندریایی در سلول‏های بنیادی مزانشیمی موش با القای آپوپتوزیس از طریق فعالیت کاسپاز ایجاد می‏شود (24).

همچنینNO مهاجرت سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان را از طریق افزایش بیان فاکتور 1 آلفا تحریک‏کننده تسهیل می‏کند (25). در یک بررسی مهاجرت سلول‏های بنیادی در حضور SNAP دیده شد. رهاسازی NO باعث افزایش پروتئین دسمین اسکلت سلولی می‏شود درحالی‏که سطح اکتین شبکه اسکلتی را کاهش می‏دهد. NO با اثر روی پروتئین‏کیناز G (PKG) فسفوپروتئین تحریک‏کننده‏ی گشادکننده عروق (VASP5) را فسفوریله می‏کند. این پروتئین یک تنظیم کننده کلیدی در چندین فرآیند وابسته به اکتین شبکه اسکلتی مثل اندازه سلول، چسبندگی و پهن شدن سلول است. زمانی‏که سرین 239 VASP توسط PKG فسفوریله می‏شود اتصال آن به فیبرهای اکتین کاهش می‏یابد و اتصال سلولی و گسترش آن مهار می‏شود (26 و 27). تحت موقعیت‏های استرس‏اکسیداتیو NO و پراکسی نیتریت با تغییر شکل ساختار پروتئین‏های شبکه اسکلتی از طریق S-نیتروزیلیشن گروه‏های تیول آن‏ها می‏توانند روی تحرک سلولی اثر بگذارند (28). کاهش در اندازه سلول و توزیع مجدد پروتئین‏های شبکه اسکلتی ممکن است همچنین یک تغییر اولیه برای تمایز سلول‏های بنیادی باشد (29).

در این مطالعه نشان داده شد که غلظت بالای NO هم باعث تغییر شکل سلول‏ها و هم باعث جدا شدن  سلول ها از کف فلاسک و از این طریق افزایش تحرک و مهاجرت سلول‏ها می‏شود.

اثرات میدان الکترومغناطیسی به پارامترها و پروتکل‏های مختلف تیمار مانند زمان تیمار، شدت و فرکانس میدان وابسته است. در یک مطالعه نشان داده شد که تیمار با میدان الکترومغناطیسی با فرکانس فوق‏العاده پایین با اثر روی بیان ژن‏ها و پروتئین‏ها سرعت تکثیر سلول‏ها را افزایش داد (30). در بررسی دیگر دینیز و همکاران (31) نشان دادند که EMF با فرکانس 15 هرتز و شدت 6/0 میلی تسلا رشد سلول‏ها را به واسطه‏ی افزایش سنتز اکسید نیتریک‏ افزایش می‏دهد. بسیاری از مطالعات نشان داده‏اند که EMF می‏تواند پتانسیل تمایزی سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان را افزایش و رشد سلو‏ل‏ها را کاهش دهد (32). در مطالعه‏ای دیگر نشان داده شد که تیمار با میدان الکترومغناطیسی با شدت 2 میلی‏تسلا و فرکانس 50 هرتز cAMP درون سلولی را افزایش می‏دهد و تکثیر سلولی را مهار می‏کند (33).

در مطالعه‏ی حاضر نشان داده شد که حضور میدان الکترومغناطیسی تاثیر به‏سزایی روی افزایش درصد مرگ و میر سلول‏ها‏ی تیمار شده با رتینوئیک‏اسید و NO با غلظت بالا گذاشت.

بسیاری از مطالعات نشان داده‏اند که میدان الکترومغناطیسی روی سیالیت و اختلاف پتانسیل غشای سلول تاثیر می‏گذارد و باز و بسته شدن کانال‏های کلسیمی دریچه دار ولتاژی را تحت تاثیر قرار می‏دهد و منجر به افزایش یون کلسیم درون سلولی می‏شود، افزایش غلظت یون کلسیم درون سلولی می‏تواند فعالیت نیتریک ‏اکسید سنتاز وابسته به کلسیم /کالمودولین را تشدید و میزان اکسید نیتریک درون سلولی را افزایش دهد (34).

با توجه به نتایج فلوسایتومتری می‏توان نتیجه گرفت که افزایش درصد سلول‏ها در فاز S یا  G2/M با افزایش درصد سلول‏ها در فاز sub G1 همراه است. اکسید نیتریک به‏همراه میدان الکترومغناطیسی و رتینوئیک ‏اسید باعث توقف چرخه‏ی سلولی در فاز S و G2/M شده است. (35). اما در گروه تیمار داده شده با Ret +EMF افزایش درصد سلول‏ها در فاز S و G2/M با کاهش فاز sub G1 همراه است که نشانگر این است که سلول‏‏ به‏سمت فرآیند ترمیم رفته است.

کاهش رشد سلول‏ها همراه با تغییر مورفولوژی سلول‏ها در حضور اکسید نیتریک با غلظت بالا و میدان الکترومغناطیسی و توقف چرخه‏ی سلولی می‏تواند مقدمه‏ای برای رفتن سلول به‏سمت فرآیند تمایز باشد.

نتیجه گیری

در این مطالعه نشان داده شد که میدان الکترومغناطیسی درصد مرگ و میر سلول‏ها را به‏صورت معنی‏دار افزایش می‏دهد که این اثر در حضور NO تشدید می‏شود. حضور میدان الکترومغناطیسی با افزایش بیشتر سیالیت و نفوذپذیری غشا باعث ورود و اثرگذاری بیشتر NO در محیط درون سلولی، اثر روی رشد سلول، شکل سلول و آپوپتوزیس و درنهایت هدایت سلول به سمت فرآیند تمایز شده است.

 

تشکر و قدردانی

مطالعه ی حاضر توسط صندوق حمایت از پژوهشگران و فناوران
کشور به شماره طرح95815665از نظر مالی پشتیبانی شد.

1. Sacchetti B, Funari A, Michienzi S, Di Cesare S, etal. Self-renewing osteoprogenitors in bone marrow sinusoids can organize a hematopoietic microenvironment. Cell. 2007; 131(2): 324–336.

2. Lindvall O, Barker RA, Brustle O, Isacson O, et al. Clinical translation of stem cells in neurodegenerative disorders. Cell Stem Cell. 2012; 10: 151– 155.

3. Ceccarelli G, Bloise N, Mantelli M, Gastalki G, et al. A comparative analysis of the in vitro effects of pulsed electromagnetic field treatment on osteogenic differentiation of two different mesenchymal cell lineages. Biores. 2013; 2(4): 283–294.

4. Park J, Seo Y, Yoon H, Kim C, et al. Electromagnetic fields induce neural differentiation of human bone marrow derived mesenchymal stem cells via ROS mediated EGFR activation. Neurochemistry International. 2013; 62: 418–424.

5. Burdon TJ, Paul A, Noiseux N, Prakash S, et al. Bone marrow stem cell derived paracrine factors for regenerative medicine: current perspectives and therapeutic potential. Bone Marrow Res. 2011; 10: 207-326. 

6. Funk RH, Monsees TK, Ozkucur N. Electromagnetic effects — from cell biology to medicine. Prog Histochem Cytochem. 2009; 43(4): 177–246.

7. Mousavi M, Baharar J, Shahrokhabadi K. The synergic effects of Crocus sativus L. and low frequency electromagnetic field on VEGFR2 gene expression in human breast cancer cells. Avicenna J Med Biotechnol. 2014; 6(2): 123–127.

8. Funk RH, Monsees TK. Effects of electromagnetic fields on cells: physiological and therapeutical approaches and molecular mechanisms of interaction. Cells Tissues Organs. 2006; 182(2): 59–78.

9. Sherwood L, Klandorf H, Yancey P. Animal Physiology: From Genes to Organisms. Thomson Brooks/Cole Ch. 2005; 2: 95–100.

10. Bian K, Murad F. Nitric oxide (NO)-biogeneration, regulation, and relevance to human diseases. Front Biosci. 2003; 8: 264–78.

11. Wimalawansa SJ, Bilezikian JP, Raisz LG, Martin TJ. Skeletal effects of nitric oxide: novel agent of osteoporosis. Principles of Bone Biology. 2008; 3: 1275–1310.

12. Alderton WK, Cooper CE, Knowles RG. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition. Biochem J. 2001; 357(3): 593–615.

13. Thomas DD, Ridnour LA, Isenberg JS. The chemical biology of nitric oxide: implications in cellular signaling. Free Radic Biol Med. 2008; 45(1):18–31.

14. Lundberg JO, Weitzberg E. NO generation from inorganic nitrate and nitrite: Role in physiology, nutrition and therapeutics. Arch Pharm Res. 2009; 32: 1119–1126.

15. Bicker G. Stop and GO with NO: nitric oxide as a regulator of cell motility in simple brains. Bioessays. 2005; 27(5): 495–505.

16. Cheng A, Wang S, Cai J, Rao MS, et al. Nitric oxide acts in a positive feedback loop with BDNF to regulate neural progenitor cell proliferation and differentiation in the mammalian brain. Dev Biol. 2003; 258(2): 319–333.

17. Di Loreto S, Falone S, Caracciolo V, Sebastiani P, et al. Fifty hertz extremely low-frequency magnetic field exposure elicits redox and trophic response in rat-cortical neurons. Cell Physiol. 2009; 219(2): 334-343.

18. Falone S, Mirabilio A, Carbone MC, Zimmitti V, et al. Exposure to 50 Hz magnetic fields causes a significant weakening of antioxidant defence systems in aged rat brain. Biochem Cell Biol. 2008; 40: 2762-2770.

19. Javani Jouni F, Abdolmaleki P, Movahedin M. Investigation on the effect of static magnetic field up to 15 mT on the viability and proliferation rate of rat bone marrow stem cells. In Vitro Cell. 2013; 49: 212–219.

20. Jin W, Xing YQ, Yang AH, Yang YN, et al. Differentiation and apoptosis effects of all-trans retinoic acid on inducing umbilical cord mesenchymal stem cells into neuron-like cells. Zhonghua Yan Ke Za Zhi. 2010; 46: 542-549.

21. Burke AJ, Sullivan FJ, Giles FJ, Glynn SA. The yin and yang of nitric oxide in cancer progression. Carcinogenesis. 2013; 34(3): 503–512.

22. Wong JC, Fiscus RR. Essential roles of the nitric oxide (NO)/cGMP/protein kinase G type-I (PKG-I) signaling pathway and the atrial natriuretic peptide (ANP)/cGMP/ PKG-I autocrine loop in promoting proliferation and cell survival of OP9 bone marrow stromal cells. J Cell Biochem. 2011; 112(3): 829–839.

23. Martinez Ruiz A, Cadenas S, Lamas S. Nitric oxide signaling: classical, less classical, and non-

classical mechanisms. Free Radic Biol Med. 2011; 51(1): 17–29.

24. Taylor EL, Li JT, Tupper JC, Rossi AG, et al.

 

 

GEA 3162, a peroxy nitrite donor, induces Bcl-2-

 

sensitive, p53-independent apoptosis in murine bone

marrow cells. Biochem Pharmacol. 2007; 74: 1039–1049.

 25. Li N, Lu X, Zhao X, Xiang FL, et al. Endothelial nitric oxide synthase promotes bone marrow stromal cell migration to the ischemic myocardium via up regulation of stromal cell-derived factor-1alpha.Stem Cells. 2009; 27: 961–970.

26. Krause M, Dent EW, Bear JE, Loureiro JJ, et al. Ena/VASP proteins: regulators of the actin cytoskeleton and cell migration. Annu Rev Cell Dev Biol. 2003; 19: 541–564.

27. Defawe OD, Kim S, Chen L, Huang D, et al. VASP phosphorylation at serine239 regulates the effects of NO on smooth muscle cell invasion and contraction of collagen. J Cell Physiol. 2010; 222(1): 230–237.

28. Ascenzi P, Masi A, Sciorati C, Clementi E. Peroxynitrite—an ugly biofactor? Biofactors. 2010; 36: 264-273.

29. Hofner M, Höllrigl A, Puz S, Stary M, et al. Desmin stimulates differentiation of cardiomyocytes and upregulation of brachyury and nkx2.5. Differentiation. 2007; 75: 605–615.

30. Sun LY, Hsieh DK, Lin PC, Chiu HT, et al. Pulsed electromagnetic fields accelerate proliferation and osteogenic gene expression in human bone marrow mesenchymal stem cells during osteogenic differentiation. Bio electromagnetics. 2010; 31: 209-219.

31. Diniz P, Soejima K, Ito G. Nitric oxide mediates the effects of pulsed electromagnetic field stimulation on the osteoblast proliferation and differentiation. Nitric Oxide. 2002; 7:18–23.

32. Esposito M, Lucariello A, Riccio I, Riccio V, et al. Differentiation of human osteoprogenitors cells increases after treatment with pulsed electromagnetic fields. In Vivo. 2012; 26(2): 299-304.

33. Schimmelpfeng J, Stein CJ, Dertinger H. The action of 50Hz magnetic and electric fields on cyclic AMP and intercellular communication in monolayers and spheroids of mammalian cells. Bio electromagnetics. 1995; 16: 381-386.

34. Pall ML. Electromagnetic fields act via activation of voltage-gated calcium channels to produce beneficial or adverse effects. J. Cell. Mol. Med. 2013; 17(8): 958-965.

35. Liu L, Wang D, Wanga J, Ji H, et al. NOAD, a novel nitric oxide donor, induces G2/M phase arrest and apoptosis in human hepatocellular carcinoma Bel-7402 cells. Toxicology in Vitro. 2015; 29: 1289-1297.