بررسی ترمیم نقص جزئی استخوان ران با استفاده از غشاء ژلاتین- کیتوسان و سلول های بنیادی مغز استخوان در موش صحرایی نر بالغ نژاد Albino Wistar (ارزیابی هیستومورفومتریک وایمونوهیستوشیمی)

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی گروه زیست شناسی تکوینی جانوری، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شمال، دانشکده علوم زیستی، تهران، ایران

2 دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال، دانشکده علوم زیستی، گروه زیست شناسی، تهران، ایران

3 دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله (عج)، مرکز تحقیقات علوم اعصاب و گروه علوم تشریح، تهران، ایران

4 دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله (عج)، مرکز تحقیقات علوم اعصاب، تهران، ایران

چکیده

هدف: این تحقیق به بررسی هیستومورفومتریک و ایمونوهیستوشیمی ترمیم نقص جزئی استخوان ران توسط سلول‏های BMSCs و غشای ژلاتین- کیتوسان در موش صحرایی بالغ نژاد آلبینو - ویستار پرداخته است. مواد و روش‏ها: در این بررسی تجربی60 سر موش صحرایی نر بالغ نژاد آلبینو- ویستار به‏طور تصادفی در پنج گروه مساوی قرار گرفتند: گروه شاهد که بعد از ایجاد نقص هیچ درمانی دریافت نکردند، گروه شم که بعد از ایجاد نقص محیط کشت به‏صورت موضعی در محل تزریق شد، گروه ژلاتین – کیتوسان که از غشا در محل نقص استفاده شد، گروه سلول که پیوند غیر اتولوگ سلول‏های BMSC به‏صورت موضعی در محل نقص انجام شد، گروه سلول - غشاء که سلول به‏همراه غشاء ژلاتین – کیتوسان در محل نقص پیوند شد. نتایج: میانگین مساحت ترابکولای استخوانی در گروه‏های غشا و سلول  نسبت به گروه شاهد افزایش معنی‏داری را نشان داد. میانگین تعداد استئوسیت‏ها در ناحیه نقص در گروه سلول نسبت به گروه شاهد افزایش معنی‏داری نشان داد. میانگین تعداد استئوسیت‏ها در گروه‏های شم و غشا نسبت به گروه شاهد اختلاف معنی‏داری نداشت ولی این میانگین درگروه سلول- غشا  نسبت به گروه شاهد کاهش معنی‏داری داشت  (001/0p<). نتیجه گیری: پیوند سلول‏ها در ترمیم نقص موثر بوده و غشا هم می‏تواند به ترمیم نقص  کمک نماید ولی استفاده از سلول به‏همراه غشا کمک چندانی به ترمیم نقص جزئی  استخوان ران نمی‏کند.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

یکی از معضلات و مشکلات پیش روی علم پزشکی، وجود شکستگی‏های دیر جوش خورنده استخوان و نواقص استخوانی  است. اقدامات درمانی مختلفی در جهت ترمیم و بهبود نقص استخوان و شکستگی‏ها همچون استفاده از سیمان استخوانی، پیوند سلول‏های بنیادی، استفاده از پروتئین‏های شکل دهنده‏ی استخوان و کاربرد مواد زیست تخریب پذیر صورت می‏پذیرد (1، 2، 3 و 4).  سلول‏های بنیادی مزانشیمی ) (Mesenchymal Stem Cells) (MSCs) سلول‏های چند استعدادی و پرتوانی هستند که به راحتی تلخیص و تکثیر شده و  می‏توانند تبدیل به سلول‏های استخوانی، غضروفی، فیبروبلاست، عضلانی و غیره شوند و می‏توان از آن‏ها برای پیوند استفاده کرد (5 و 6). سلول‏های بنیادی را می‏توان از منابع مختلف از جمله مغز استخوان، (5) درم، (7) پالپ دندان، (8) سینوویوم، (9) و دندان شیری به‏دست آورد (10). سلول‏های ایده‌آل برای پیوند باید چندین خصوصیت از جمله دستیابی آسان، قدرت تکثیر سریع در محیط کشت، قدرت حیات طولانی و عدم رد پیوند در میزبان را داشته باشند. سلول‏های استرومایی مغز استخوان (Bone Marrow Stromal Cells)  (BMSCs) تمامی این صفات را دارا می‌باشند.) 4 و 11(

امروزه درمهندسی بافت، داربست‏های زیست تخریب پذیر به‏عنوان بستری برای سلول‏های بنیادین ساخته می‏شوند (12 و 13). در مهندسی بافت، داربست سلولی به تعیین شکل سه بعدی، افزایش بقای سلول و ایجاد چسبندگی مکانیکی اولیه کمک نموده و نیز به تجمع سلولی و ایجاد بافت و شکل‏گیری ساختار بافتی  کمک کرده و می‏تواند بافت طبیعی و کاملی را حاصل کند (14).

مهندسی بافت استخوان نیز به‏طور معمول به کمک داربست‏هایی که القاگر تشکیل استخوان بوده و قدرت هدایت و رشد سلول‏های استخوانی را دارند، انجام می‏شود. انواع متفاوتی از داربست‏ها در آزمایشگاه و در موجود زنده مورد بررسی قرار گرفته اند. ژلاتین، کیتوسان و کلاژن موادی زیست تخریب پذیر بوده و می‏توانند به‏عنوان ماده‏ی اولیه داربست سلولی در مهندسی بافت به‏کار گرفته شوند (‏14)

در مطالعه یوجی یین و همکاران (14) گزارش شده است که غشا ژلاتین - کیتوسان و بتا تری کلسیم فسفات با استفاده از تکنیکFreez – Drying  تولید و اثرات پوستی آن بر روی خرگوش مورد بررسی قرار گرفته است. نتایج حاصل از این تحقیق نشان می‏دهد که این غشا می‏تواند به‏عنوان غشای مناسب در مهندسی بافت استخوانی نیز مورد استفاده قرار گیرد.  در تحقیق Caplen  و همکاران (15)، نشان داده شده است که پیوند MSC کشت شده بر روی ژل کلاژن به خرگوش‏های مبتلا به ضایعات استخوانی و غضروفی سبب تشکیل مجدد استخوان و غضروف در ناحیه آسیب دیده شده است اما بافت تشکیل شده در این محل از نظر خصوصیات مکانیکی با بافت نرمال به‏طور قابل توجهی متفاوت بوده و طی 24 هفته بافت  از بین رفته است (15).

نتایج هیستومورفومتری حاصل از تحقیقات استوکمن (16) بر روی نقص جمجمه خوک که در آن پیوند سلول‏های استرومایی صورت گرفته بود، نشان داد که سی روز بعد از ایجاد نقص، گروه شاهد و تجربی از نظر حجم استخوان ترمیم شده به حجم کل نقص تفاوتی نشان ندادند.

با توجه به اهمیت سلول‏های بنیادی در ترمیم نواقص بافتی و از طرفی وجود گزارشاتی مبنی بر اثر مثبت داربست‏های زیست تخریب پذیر در تسریع ترمیم بافت‏ها، هدف از تحقیق حاضر بررسی ترمیم نقص جزئی استخوان ران توسط سلول‏های استرومایی مغز استخوان همراه با غشا ژلاتین – کیتوسان در موش صحرایی با استفاده از روش‏های هیستومورفومتریک و ایمونوهیستوشیمی می‏باشد.

مواد و روش‏ها

در این پژوهش تجربی از 60 سر موش صحرایی نر و بالغ نژاد آلبینو- ویستار با وزن حدود 200 تا 250 گرم استفاده شد. خوراک دام موش‏ها به‏صورت حبه به‏همراه آب و به‏صورت آزاد در دسترس موش‏ها قرار گرفت. حیوانات در دمای حیوان‏خانه که حدود 2 ± 22 درجه سانتی‏گراد و روشنایی آن به‏طور متناوب دوره روشنایی و تاریکی 12 ساعته بود در شرایط مطلوب و استاندارد حیوان‏خانه دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله نگه‏داری شدند. موازین اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی که مورد تایید کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌ا... بود، هنگام کار با حیوانات آزمایشگاهی رعایت شد. حیوانات به طور تصادفی به پنج  گروه تقسیم شدند. 1- گروه شاهد (Control) شامل حیواناتی که بر روی استخوان ران پای راستشان در ناحیه فوقانی اپیفیز دیستال سوراخی به‏صورت دو طرفه ایجاد نموده و هیچ درمانی دریافت نکردند.  2- گروه شم (Sham) گروهی که 72 ساعت بعد از ایجاد آسیب، 50 میکرولیتر از محیط کشت به‏صورت موضعی، درمحل نقص استخوان تزریق شد. 3- گروه (ژلاتین – کیتوسان) که پس از ایجاد نقص استخوان ران  و گذشت 3 روز پیوند غشای ژلاتین-کیتوسان در محل آسیب انجام شد 4- گروه سلول ((BMSCs که 72 ساعت بعد از ایجاد نقص استخوانی تعداد 000/150سلول BMSCs  به‏صورت غیراتولوگ و موضعی در محل آسیب تزریق شد.5 - گروه سلول - غشا (BMGC)  که نقص استخوانی در ران ایجاد شده و 3 روز بعد 000/150 سلول بنیادی  مغز استخوان به همراه غشای ژلاتین-کیتوسان در محل آسیب پیوند شد.

روش تهیه غشا: ابتدا کیتوسان (Ch) (Germany ,Merck  (Darmstadt) با نسبت 1 درصد وزنی به محلول آب مقطر 2 بار تقطیر که با درجه حرارت 40 درجه سانتی‏گراد اضافه شد محلول حاصل به‏وسیله‏ی دستگاه همزن(Germany, IKA-RH) مخلوط شد.  سپس میزان 5/0 میلی لیتر اسید استیک خالص به آن اضافه و ژلاتین ( Sigma-Aldrich هنــد، (Bangalore) با نسبت 1 درصد وزنی به آن اضافه و به دمای جوش رسانده شد. محلول حاصل به‏وسیله‏ی اتوکلاو استریل گردید.

استخراجسلول: ابتدا موش‏های صحرایی بالغ نر نژاد Albino wistar  با وزن حدود 200 تا 250 گرم به‏صورت تصادفی انتخاب شده و به‏وسیله مخلوط کتامین (50 میلی‏گرم بر کیلوگرم) و زایلازین (10 میلی‏گرم بر کیلوگرم) (هر دو Holland, Alfasan) بی‏هوش شدند. سپس استخوان ران پای چپ و راست اکسپوز شده و توسط قیچی استخوان‏ بر،  شکستگی کامل در استخوان ایجاد شده و با کمک سرنگ 5 میلی‏لیتری حاوی 1 میلی‏لیتر محیط αMEM (UK- GIBCO) و سرم جنین گاوی FBS Fetal bovine serum) ) (UK- GIBCO)  10 درصد  و یک سر سوزن G18 مغز استخوان را از هر دو انتهای پروگزیمال و دیستال استخوان آسپیره کرده و تمام محتویات سرنگ را به‏درون یک فلاسک 25 میلی‏لیتر تخلیه و در انکوباتور با 2/7 pH=، دمای 37 درجه سانتی‏گراد و میزان CO2، 5 درصد و در محیط مرطوب انکوباتور(MMM  کشور انگلیس) برای مدت 24 ساعت نگه‏داری نموده و سپس محیط کشت تعویض شد. هنگام تعویض محیط، سلول‏ها توسط (Phosphate Buffer  Saline) PBS استریل شسته شدند. پس از آن تعویض محیط هر 2 تا 3 روز تا تخلیه کامل سلول‏های خونی و خونساز و پر شدن بیش از 80  درصد کف فلاسک ادامه یافت. بعد از پاساژ دوم، سلول‏ها آماده پیوند شدند.

کشت سلول‏های  BMSC بر روی غشاء ژلاتین کیتوسان: پس از تهیه غشا و قرار دادن قطعات1×1 سانتی‏متر آن به‏مدت یک هفته در محیط کشت  αMEM UK-) GIBCO) حاوی سرم، آن را به‏وسیله محلول PBS  و الکل 96 درصد شستشو داده و غشاها در پلیت‏های شش خانه ای استریل در زیر هود JAL TAJHIZ)کشور ایران) قرار گرفته و به کف پلیت‏ها‏ی آغشته به محلول ژلاتین استریل یک درصد، منتقل شدند. سپس قطعات غشا را به‏آرامی بر روی پلیت پهن نموده و کمی در داخل هود قرار داده تا خشک شوند. در این هنگام سلول‏های استرومایی را از کف پلیت به‏وسیله آنزیم تریپسین (Germany, Merck) جدا کرده و بر روی غشا  ریخته و کمی محیط کشت حاوی محلول سرم گاوی به آن اضافه شد. سپس پلیت‏ها در دستگاه انکوباتور(  MMMکشور انگلیس) قرار داده شدند. پس از دو روز غشاها را در زیر میکروسکوپ Leica) کشورآلمان( مشاهده کرده تا از وجود سلول استرومایی اطمینان حاصل شود.

ایجادنقصاستخوانی: حیوانات به‏وسیله مخلوط کتامین هیدروکلرید mg/kg) 60( و زایلازین هیدروکلرید (10 میلی‏گرم بر کیلوگرم) (هر دو (Holland, Alfasan بی‏هوش شده و پوست خلفی خارجی ران، توسط بتادین و الکل استریل شد. به‏منظور ایجاد نقص استخوان با استفاده از جراحی، پس از بی‏هوش کردن حیوانات، سطح خارجی ناحیه ران راست آن‏ها تراشیده شد و با بتادین استریل شد. سپس برشی به طول دو سانتی‏متر در ناحیه خارجی پای راست حیوانات ایجاد و پس از کنار زدن عضلات ، استخوان ران در معرض دید قرار گرفت، سپس سوراخی به قطر ١ میلی متر به‏صورت دو طرفه  (Transcortical) در ناحیه بالای اپی‏‏فیز دیستال استخوان ران ایجاد شد و در پایان عضلات و پوست به‏وسیله نخ ۴ صفر قابل جذب دوخته شد و مراقبت‏های پس از عمل جراحی از حیوانات به عمل آمد. پس از گذشت ٧٢ ساعت از جراحی ناحیه عمل مجددا باز شد و در گروه‏های پیوند سلول مقدار ٥٠ میکرو لیتر محیط کشت حاوی  000/150 سلول نشان دار شده با (UK- GIBCO) Brdu  (که ٧٢ ساعت قبل از پیوند در معرض  Brdu با  غلظت 5/1میلی‏مولار قرار گرفته بودند) و در گروه شم فقط ٥٠ میکرولیتر محیط کشت تزریق شد. در گروه غشا که غشا ژلاتین – کبتوسان در محل نقص استخوانی پیوند زده شد و گروه سلول - غشا که غشایی که سلول روی آن کشت داده شده بود در محل نقص پیوند زده شد و سپس عضلات و پوست مجددا با نخ ۴ صفر قابل جذب دوخته شد.

نمونهبرداریازحیوانات: موش‏ها 28 روز بعد از جراحی دوم با استفاده از دوز بالای کلروفورم کشته شده و پس از برداشتن استخوان‏ها، ارزیابی‏های هیستومورفومتریک و ایمونوهیستوشیمی بر روی آن‏ها صورت گرفت.

شمارشسلولیوبررسی میزان زندهبودنسلول‏ها ((Viability test: برای مشخص کردن زنده بودن سلول‏ها، به نسبت مساوی حجمی از سوسپانسیون سلولی و تریپان بلو (4/0 درصد) بر روی لام نئوبار ریخته و سلول‏های زنده و مرده توسط میکروسکوپ اینورت Leica) کشور آلمان) با بزرگ‏نمایی ٤٠٠ بررسی و شمارش شدند و از آنجایی که سلول‏های مرده توسط تریپان بلو به رنگ آبی درمی آیند و سلول‏های زنده شفاف می‏باشند، تعداد سلول‏های زنده و مرده شمارش شده و درصد آن‏ها محاسبه و ثبت شدند.

مطالعه هیستومورفومتری: جهت بررسی میزان ترابکولا موجود در محل کال استخوانی از مجموعه سخت افزاری (کامپیوترو میکروسکوپ متصل به دوربین(Tsview  INFINITY1) کشور کانادا ( وسیستم نرم افزاریMotic  استفاده شد. بدین ترتیب که از هر نمونه استخوان پس از کلسیم زدایی با اسید فرمیک ۱۰ درصد و فیکساسیون و پردازش بافتی، مقاطع طولی سریالی  5 میکرونی از نمونه‏ها تهیه و با نسبت ۱ به۴ تعداد ۷ مقطع از ناحیه کال تهیه و رنگ آمیزی هماتوکسیلین-  ائوزین انجام شد. جهت مطالعه هیستومورفومتری، از مقاطع بافتی، تصاویر با بزرگ‏نمایی100 برابر تهیه و میزان ترابکولاها و بافت همبندی عروقی در مساحتی برابر با 50000 میکرومترمربع اندازه‏گیری و ثبت شدند.

شمارشسلولی

تعداد استئوسیت‏های موجود درتیغه های استخوانی در سطحی معادل50000 میکرومتر مربع با بزرگ‏نمایی٤٠٠ برابر محاسبه و ثبت شدند.

ردیابی سلول‏های تزریق شده به­روش ایمونوهیستوشیمی: در پایان هفته چهارم، از ناحیه نقص استخوانی از گروه‏های مختلف مقاطع پارافینی به ضخامت 5 میکرومتر تهیه و وجود سلول‏های نشاندار شده موجود در محل ترمیم استخوان با استفاده از روش ایمنو هیستوشیمی و بهره‏گیری از آنتی Brdu ردیابی و تایید شدند.

آنالیز آماری

ارزیابی آماری داده‏ها با استفاده از آزمون آماری ANOVA و آزمون تکمیلی    Tukey Post Hock  انجام شد. در انجام آزمون‏های آماری از نرم افزار SPSS استفاده شد. کلیه اطلاعات ارائه شده برحسب Mean ± SEM  می‏باشد. میزان 05/0 p< به‏عنوان درجه معنی‏داری در نظر گرفته شد.

نتایج

تعیین میزان حیات سلول‏ها

بر اساسviability test  درصد سلول‏های BMSCs در انتهای مراحل کشت نشان دهنده این واقعیت بود که پس از پاساژ چهارم و پرشدن بیش از هشتاد درصد کف پلیت، میزان BMSCs زنده ، به بیش از 91 درصد رسید.

هیستومورفومتریبافتاستخوان

میانگین درصد وسعت تیغه‏های استخوانی(Trabeculae) شکل گرفته در محل نقص استخوانی در گروه های مختلف بر حسب میکرومتر مربع به‏ترتیب در گروه شاهد (130/2 ± 23/69)،  در گروه شم (07/2 ± 91/69)،  در گروه غشا (46/1 ± 18/86)،  در گروه سلول ( 71/1 ± 52/81 ) و در گروه سلول- غشا (16/1 ± 79/70) بوده است.  مقایسه میانگین درصد تیغه‏های استخوانی گروه‏ها با یکدیگر نشان داد که تفاوت معنی‏داری در گروه شم نسبت به گروه شاهد وجود نداشته است ولیکن این غیرمعنی‏داری افزایش را نشان می‏دهد. در گروه‏های  غشا و سلول (هر دو 001/0p<) نسبت به گروه شاهد افزایش چشمگیر معنی‏داری را نشان داده است،  حال آن‏که این میانگین در گروه سلول– غشا نسبت به گروه شاهد افزایش غیرمعنی‏داری داشته است. این میانگین در دو گروه غشا و سلول نسبت به گروه شم افزایش چشمگیر و معنی‏داری را نشان داده است  (001/0p<) . ولی گروه سلول- غشا نسبت به گروه شم دارای افزایش غیرمعنی‏داری بوده است و در گروه سلول در مقایسه با گروه غشا دارای کاهش غیرمعنی‏داربود. حال آن‏که میانگین درصد تیغه‏های استخوانی در گروه سلول – غشا نسبت به گروه غشا دارای کاهش معنی‏داری بود (001/0p<).در نهایت این میانگین در گروه سلول –  غشا در مقایسه با گروه سلول دارای کاهش معنی‏داری بود (001/0p<)

میانگین درصد بافت همبندی- عروقی (Connective Vascular Tissue) شکل گرفته در محل نقص استخوانی در گروه‏های مختلف بر حسب میکرومتر مربع به ترتیب در گروه شاهد (082/2 ± 06/30)، گروه شم (07/2 ± 96/29)،  گروه غشا (46/1 ± 82/13)، گروه سلول (69/1 ± 05/18) و گروه سلول- غشا (25/1 ± 10/29) بوده است. از مقایسه اعداد این نتیجه حاصل شد که میانگین درصد بافت همبندی- عروقی درگروه‏های غشا و سلول نسبت به گروه شاهد دارای کاهش معنی‏دار بوده (001/0p<)، حال آن‏که این میانگین دردو گروه شم و سلول- غشا نسبت به گروه شاهد رابطه معنی‏داری را نشان نداد. دو گروه غشا و سلول نسبت به گروه شم معنی‏دار بوده و کاهش چشمگیری را نشان دادند (001/0p<) ولیکن در گروه سلول –  غشا نسبت به گروه شم کاهش معنی‏داری را نشان داد. در ادامه بررسی‏ها این نتیجه حاصل آمد که میانگین درصد بافت همبندی - عروقی  درگروه غشا نسبت به گروه سلول کاهش معنی‏دارداشته است و گروه سلول- غشا نسبت به گروه غشا دارای افزایش معنی‏دارو چشمگیری بود (001/0p<).  در انتها گروه سلول نسبت به گروه سلول –  غشا دارای کاهش معناداری بود (001/0p<) (نمودار 1) (شکل 1).

 

*

*

*

*

 


 

نمودار 1:میانگین درصدوسعت ناحیه ترمیم شده استخوان و درصد بافت همبندی – عروقی در محل آسیب ران چهار هفته بعد از جراحی.

*

            اختلاف معنی‏دار با گروه شاهد (05/0p<)

 

A

B

E

D

C

TR

CO

TR

CO

A

TR

CO

CO

TR

TR

CO

 

شکل 1: تصاویر مقاطع بافت استخوانی ناحیه ترمیم شده مربوط به حیوانات گروه شاهد (A)، گروه شم (B)،  گروه غشاء (C)،  گروه سلول (D) و گروه سلول - غشا (E) در پایان هفته چهارم. . ترابکولاراستخوان (T)، فضاهایپیوندیعروقی..(C وسعت ترابکولایی درC و D نسبت به A و B افزایش یافته و برعکس وسعت عروقی کاهش یافته است. (رنگآمیزیهماتوکسیلین-ائوزین،بزرگ‏نمایی 100×(

 

 

 

در اندازه‏گیری‏های حاصل از مساحت ترابکولای استخوان چنین به‏دست آمد که نسبت ترابکولای استخوانی به کل ناحیه اندازه‏گیری شده در گروه‏های شاهد (023/0 ± 70/0)،  شم      (020/0 ± 699/0)، غشا (014/0 ± 86/0)، سلول (017/0 ± 81/0) و سلول-غشا  (011/0 ± 70/0) بود.  این نسبت در گروه شم نسبت به شاهد کاهش غیرمعنی‏دار و در گروه سلول - غشا نسبت به شاهد دارای اختلاف معنی‏داری نبود. در صورتی‏که این نسبت درگروه‏های غشا و سلول نسبت به گروه شاهد افزایش چشمگیر و معنی‏داری را نشان داد) 001/0p<). نسبت مورد بررسی دردو گروه غشا و سلول نسبت به گروه شم دارای افزایش معنی‏دارو چشمگیری بود (001/0p<) حال آن‏که گروه
سلول- غشا نسبت به گروه شم دارای افزایش غیرمعنی‏دار بوده است. در ادامه بررسی‏ها مشخص شد که نسبت ترابکولای استخوانی به کل ناحیه اندازه‏گیری شده درگروه سلول نسبت به گروه غشا کاهش غیر معنی‏داری را نشان داده است حال آن‏که نسبت ترابکولای استخوانی به کل ناحیه اندازه‏گیری شده در گروه سلول- غشا نسبت به گروه غشا  دارای کاهش چشم‏گیر و معنی‏داری بوده است (001/0p<). در نهایت این نسبت درگروه سلول در مقایسه با گروه سلول– غشا  دارای افزایش چشمگیر و معنی‏دار بوده است (001/0 (p<   (نمودار2 ).

 

 

 

 

*

 

 

 

 

 

 

 

 

 


نمودار 2: میانگین نسبت مساحت ترابکولای استخوان به کل ناحیه ترمیم شده درمحل نقص بر حسب میکرومتر مربع در چهار هفته بعد از جراحی. مساحت ترابکولا در گروه شاهد و شم اختلافی نداشتند. *تفاوت معنی‏دار با گروه شاهد  (05/0p<)

 

 

در بررسی دیگر بر روی ناحیه ایجاد نقص،  مشخص شد میانگین نسبت بافت همبندی - عروقی  به کل ناحیه اندازه گیری شده در گروه‏های شاهد (021/0 ± 29/0)،  شم (020/0 ± 29/0)،  غشا (014/0 ± 13/0)،  سلول (016/0 ± 18/0) و سلول- غشا (012/0 ± 29/0) بود. این میانگین نسبت در گروه های شم  و سلول -  غشا نسبت به  شاهد دارای تفاوت غیرمعنی‏دار بود. در صورتی‏که این  میانگین در گروه‏های غشا و سلول نسبت به گروه شاهد دارای کاهش چشمگیر و معنی‏داری بود (001/0p<). میانگین نسبت بافت همبندی- عروقی  به کل ناحیه اندازه گیری شده درگروه‏های غشا و سلول نسبت به گروه شم دارای کاهش معنی‏دار و چشم‏گیری بود (001/0p<) حال آن‏که  در گروه سلول - غشا نسبت به گروه شم رابطه معنی‏داری وجود نداشت. در ادامه بررسی‏ها مشخص شد که گروه سلول نسبت به گروه غشا دارای افزایش معنی‏داری بوده است. از سویی دیگر،  این نسبت در گروه سلول- غشاء نسبت به گروه غشا دارای افزایش معنی‏دارو چشمگیری بوده است (001/0p<). در نهایت میانگین نسبت بافت همبندی - عروقی  به کل ناحیه اندازه گیری شده در گروه سلول- غشا نسبت به گروه سلول دارای افزایش چشمگیر ومعنی‏دار (001/0p<)  بوده است (نمودار3 ).

 

 

 

 

*

نمودار 3: میانگین نسبت مساحت بافت همبندی- عروقی استخوان به کل ناحیه ترمیم شده درمحل نقص بر حسب میکرومتر مربع در چهار هفته بعد از جراحی.  این نسبت در گروه شاهد و شم اختلاف چندانی نداشتند. * تفاوت معنی‏دار با گروه شاهد  (05/0p<)

 

 

تعداداستئوسیت‏ها

بررسی و شمارش تعداد استئوسیت‏ها درسطحی برابر 50000 میکرومتر مربع از ترابکولاهای ناحیه نقص استخوانی با بزرگنمایی 400 برابر در گرو‏های مختلف نشان داد که میانگین تعداد استئوسیت‏ها در گروه‏های شاهد (82/16 ± 47/72)،  شم (87/2 ± 24/55)، غشا (24/10 ± 62/51)، سلول (74/3± 53/88) و سلول- غشا (98/0 ±36/24) بود. میانگین تعداد استئوسیت‏ها در گروه‏های شم، غشا و سلول نسبت به گروه شاهد اختلاف معنی‏داری نداشت به این ترتیب که در گروه‏های شم و غشا کاهش غیر معنی‏دار و در گروه سلول افزایش غیر معنی‏دار مشاهده گردید در حالی‏که میانگین تعداد استئوسیت‏ها درگروه سلول- غشا نسبت به گروه  شاهد کاهش معنی‏داری داشته است (001/0p<). از سوی دیگر میانگین تعداد استئوسیت‏ها در گروه غشا نسبت به گروه شم دارای کاهش غیرمعنی‏دار بوده است حال آن‏که میانگین تعداد استئوسیت‏ها در گروه سلول نسبت به گروه شم افزایش معنی‏دار (01/0p<) و در گروه سلول- غشا نسبت به گروه شم کاهش معنی‏دار  (001/0p<) داشته است. علاوه بر این میانگین تعداد استئوسیت‏ها در گروه غشا در مقایسه با گروه سلول دارای کاهش غیر معنی‏دار و گروه غشا نسبت به گروه سلول- غشا افزایش غیر معنی‏دار داشته است. میانگین تعداد استئوسیت‏ها در گروه سلول در مقایسه با گروه سلول- غشا به شدت افزایش نشان داده است (001/0p<)  (نمودار 4).

 

 

 

 

*

نمودار 4: تعداد استئوسیت‏ها در 50000 میکرومتر مربع ازترابکولای استخواندر محل آسیب چهار هفته بعد از پیوند. *اختلاف معنی‏دار با گروه شاهد  (05/0p<)

 

نتایج ایمونوهیستوشیمی

 

در پایان آزمایش وجود سلول‏های نشاندار شده در محل ترمیم استخوان در هر دو گروه سلول – غشا و سلول با استفاده از روش ایمنوهیستوشیمی تایید شد (شکل2).

 

 

 

 

 

A

شکل 2: سلول‏های ردیابی شده BMSC چهار هفته بعد از پیوند سلول و سلول-غشا. کنترل منفی (A) ، سلول – غشا (B) و سلول  (C). پیکان به هسته سلول‏های نشاندار اشاره دارد که در B و C به رنگ قهوه ای دیده می‏شوند ولی در A رنگ نگرفته و به رنگ بنفش دیده می شوند (بزرگنمایی100×)

 

 

 

بحث

در مواردی مثل شکستگی‏هایی که در آن جوش خوردگی و ترمیم ضایعه با دشواری همراه است و یا در بیماری‏هایی مانند سرطان، عفونت، استئوپروز، استئوآرتریت و غیره  فرآیندها و مکانیزم‏هایی که برای بازسازی محل آسیب باید طی شده و وارد عمل شوند اغلب با دشواری رو به رو می‏شوند (17). امروزه ﺳﻠﻮلﻫﺎی ﺑﻨﻴﺎدی ﻣﺰاﻧﺸﻴﻤﻲ مغز استخوان و نیز دارﺑﺴﺖ‏های زیست تخریب پذیر جهت ترمیم نقائص استخوانی استفاده ای گسترده دارد (18). یافته‏‏های هیستومورفومتری این تحقیق چهار هفته بعد از پیوند بیانگر افزایش مساحت ترابکولاهای استخوانی و کاهش بافت همبندی-  عروقی در گروه‏های پیوند سلول و پیوند غشا نسبت به گروه شاهد بوده است. تعداد استئوسیت‏ها درناحیه ترمیم در گروه  پیوند سلول- غشا نسبت به گروه شاهد کاهش معنی‏داری نشان داد.

مشابه نتایج گروه سلول و گروه غشا تحقیق ما، یافته‏های  Kon و همکاران (19) بر روی استخوان حیوانات مدل بزرگ است. ایشان  استخوان‏های آسیب دیده که بر روی آن‏ها پیوند سلول و یا سلول به‏همراه داربست انجام شده بود را با استخوان‏های شاهد که سالم بودند، مورد ارزیابی و مقایسه قرار دادند. در بز سی و دو هفته بعد از پیوند سلول، استخوان‏های تجربی همانند استخوان‏های شاهد بودند و تقریبا به‏طور کامل ترمیم شده بودند. در گوسفند نیز هشت هفته بعد از پیوند چنین نتیجه‏ای به‏دست آمد (20).

در بررسی نتایج ما ، میانگین درصد وسعت تیغه‏های استخوانی شکل گرفته در محل نقص استخوانی در گروه‏های سلول و غشا، دارای افزایش معنی‏داری نسبت به گروه شاهد بوده است. در تحقیق Cao (21)، بررسی هیستولوژی و مورفومتری حاصل از پیوند سلول اتولوگ در ناحیه آسیب استخوانی در بز 16 هفته بعد از پیوند، نشان داد که نسبت حجم استخوان ترابکولای موجود در محل آسیب به حجم کل بافت استخوان در گروه پیوند سلول نسبت به گروه‏های داربست و شاهد افزایش معنی‏داری پیدا کرده بود. بررسی هیستولوژی آنان هم نشان داد که در گروه سلول بازسازی به‏خوبی صورت گرفته اما در گروه شاهد ترمیم نقص استخوان با کندی انجام شده و ناحیه ترمیم از بافت فیبروزه پر شده بود و در گروه داربست در مرکز نقص استخوان بافت فیبروزی به‏همراه مقداری استخوان پراکنده مشاهده شد که نشان دهنده تشکیل استخوان به‏میزان حداقل بود. همچنین مطالعه هیستومورفومتری این گروه نشان داد که میانگین درصد تیغه‏های استخوانی، ضخامت تیغه‏ها و نیز تعداد ترابکولا‏ها در ناحیه آسیب استخوان نسبت به گروه کنترل، افزایش معنی‏داری داشته است و لذا نتایج تحقیقات Cao  همسو با نتایج تحقیقات ما می‏باشد. اگرچه در تحقیقات ما نتیجه عملکرد داربست در بازسازی استخوان، مغایر با نتیجه گزارش شده از سوی ایشان می‏باشد.

یافته‏های هیستولوژیک تحقیق ما نشان داد که در گروه‏های سلول و غشا به‏دلیل افزایش میزان وسعت ترابکولاهای استخوانی و کاهش مساحت بافت همبندی عروقی،  بافت ترمیمی محل آسیب تقریبا با بافت اطراف که آسیب ندیده بودند یکنواخت و یک‏پارچه شده و فضای خالی چندانی بین آن‏ها نبود که حاکی از روند استئوژنز سریعتر و افزایش روند بازسازی (Remodeling) استخوان در محل ترمیم می باشد چنین تصور می‏شود که تمایز سلول‏های بنیادی مزانشیمی به سلول‏های استئوبلاست به‏وسیله یک سری فرآیندهای سیگنال دهی مانند اینتگرین و پروتئین‏های شکل دهنده استخوان (BMP) در یک واکنش متقابل انجام می‏شود. بعضی مطالعات نشان می‏دهند که سلول‏هایBMSC  می‏توانند طیف وسیعی از سیتوکین‏ها را ترشح کنند (11).  فاکتورهای رونویسی Runx-2 ,osterix تمایز استئوبلاستیک و شکل‏گیری استخوان را کنترل می نمایند. در همین راستا و هم‏سو با نتایج تحقیقات ما، تحقیقات Niedhviedzki و همکاران (22) است که مطالعات هیستولوژیک  آن‏ها ، ده،  بیست و چهل روز بعد از پیوند غیر اتولوگ سلول‏های استرومایی به محل نقص استخوان رادیال خرگوش بود و نشان داد که ده روز بعد از پیوند سلول‏های استرومایی، استئوبلاست‏ها همراه با الیاف کلاژن افزایش یافته، پریوست و آندوست فعال و ضخیم بوده و ناحیه ترمیم از یک شبکه رگی غنی برخوردار بوده است. در اندام کنترل و در ناحیه نقص استخوانی مقدار زیادی بافت همبند سست و میزان کمی الیاف کلاژن و شبکه مویرگی مشاهده شد. میزان ترابکولاهای شکل گرفته در ناحیه کال در اندام تجربی بیشتر از گروه کنترل  بود.  بیست روز بعد از پیوند در اندام تجربی، ترابکولاهای استخوانی جدید در محل نقص به‏وسیله بافت همبند فیبروزه احاطه شده و در اطراف ترابکولاها بافت همبند متراکم نیز مشاهده شد. در اندام کنترل میزان ترابکولاهای استخوانی در محل نقص کمتر بوده و میزان استخوان متراکم، تعداد استئوبلاست‏ها و شبکه مویرگی وسعت کمتری داشتند. پس از 40 روز در اطراف کال، جهت گیری ترابکولا به‏صورت موازی در آمده و بافت آن ناحیه به استخوان کورتیکال تغییر شکل داده است (22). 

تحقیق ما نشان داد که تعداد استئوسیت‏ها در ترابکولای استخوان در گروه‏های پیوند سلول به‏طور برجسته افزایش یافته در حالی‏که در گروه شاهد تعداد استئوسیت‏ها به‏میزان کم‏تری دیده می‏شد.  همچنین در گروه سلول- غشا کاهش تعداد استئوسیت‏ها نسبت به گروه‏های سلول و غشا مشاهده شد. نتایج همچنین نشان داد که در گروه‏‏های پیوند سلول و پیوند غشا،  ترابکولاهای استخوانی متراکم بوده و به‏وسیله بافت همبند فیبروزه احاطه شده اند. علت این امر می تواند وجود فاکتورهای دیگری که در تمایز سلول‏های استرومایی مغز استخوان به سلول‏های استئوبلاست و استئوسیت نقش داشته و به‏عنوان پروتئین‏های موجود در مسیر سیگنال دهی Wnt است، باشد. پروتئین ROR2 یک گیرنده (Reseptor ) تیروزین کینازی Orphan است که به‏عنوان رسپتور همراه (Co-receptor) عمل می‏کند و در هر دو مسیر سیگنال دهی اصلی و فرعی وجود دارد و بیان آن در سلول‏های MSC در حال تمایز، افزایش و در سلول‏های تمایز یافته به استئوسیت کاهش می‏یابد. ROR2 در تمایز سلول‏های MSC  به استئوبلاست‏ها و در طول روند استئوژنز دخالت می‏کند (23).  علاوه بر آن Liu و همکاران (24) نیز نشان دادند که ROR2 دودمان استئوبلاستیک را از سلول‏های بنیادی مزانشیمی انسان  (human Mesenchymal Stem Cell) (hMSC) به‏راه می اندازند. در همین راستا، در تحقیق دیگری که توسط Nather  و همکاران (25) او صورت گرفت از پیوند اتولوگ سلول‏های بنیادی مزانشیمی برای ترمیم آلوگرافت نقص استخوان ران در خرگوش استفاده شد و نتایج آن بهبود وضعیت ترمیم استخوان و افزایش سلول‏های استخوانی در ناحیه دیافیز ران متعاقب پیوند آلوگرافت بوده است. که نتایج این محققین در راستای یافته های تحقیق ما می‏باشد.

در تعدادی از تحقیقات، نتایج متفاوت با یافته‏های ما نیز دیده می‏شوند. به‏طور مثال  Meinel و همکاران (26) بعد از پیوند سلول‏ها (5 هفته) به‏همراه داربست شبه ترابکولایی در نقص جمجمه موش کوچک آزمایشگاهی نشان دادند که پس از پیوند سلول همراه با داربست، میزان ترابکولاهای استخوانی در این گروه در مقایسه با گروه‏های داربست و شاهد بیشتر بوده است. در مثالی دیگر ، نتایج Stockman و همکاران (16) را می‏توان ذکر نمود زیرا ایشان پس از پیوند اتولوگ سلول‏های استرومایی مغز استخوان همراه با داربست کلاژن در محل نقص استخوان جمجمه خوک، و بررسی‏های  هیستولوژیک نشان دادند که میزان کال استخوانی سی روز بعد از پیوند در گروه تجربی که  پیوند سلول همراه با کلاژن دریافت کرده اند در مقایسه با گروه شاهد که در آن‏ها تنها از کلاژن استفاده شده بود، افزایش معنی‏داری نداشت که این یافته‏ها تا حدی متفاوت با نتایج هیستومورفومتری ما است.

تزریق سلول‏های استرومایی به محل آسیب استخوانی،  ظرفیت استئوژنیک آن‏ها را بالا می‏برد که حاصل آن افزایش سرعت

تشکیل کال استخوانی می‏باشد. تصور بر آن است که پیوند سلول‏های استئوبلاست،  تولید غضروف و کال استخوانی را از طریق استخوان سازی داخل غضروفی تحریک می‏کند (27). 

 

نتیجه گیری

نتایج هیستومورفومتری و ایمونوهیستوشیمی تحقیق حاضر نشان داد که روند ترمیم استخوان در محل نقص جزئی استخوان ران در موش صحرایی، با استفاده از پیوند غشا ژلاتین - کیتوسان و سلول‏های بنیادی مغز استخوان سبب افزایش سرعت ترمیم و بازسازی استخوان  ران می‏شود.

 

تشکروقدردانی

این مطالعه با پشتیبانی مرکز تحقیقات ترومای دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله )عج ( انجام شد، که بدین وسیله تشکر و قدردانی می‏شود.

1. Rojhan MS .[Basic histology]. Tehran University of Medical Sciences: Chehrpublications. 2003;  119-129.

2. Kvyyra J. Translated by  Montazeri M. Basic histology. Tehran University of Medical Sciences:  Arjomand publications. 2008 ; 175-180.

3. Shirzadi M. [Orthopedics and related fractures]. Tehran University of Medical Sciences: Aseman publications.1999; 5-9.

4. Ankeny D, McTigue D, Jakeman LB. Bone marrow transplants provide tissue protection and directional guidance for axons after contusive spinal cord injury in rats. Exp Neurol. 2004; 190(1): 17–31.

5. Nichol JW, Khademhosseini A. Modular tissue engineering: Engineering biological tissues from the bottom up.soft matter . 2009 ; 5(7): 131-29.

6.  Ding D-C, Shyu W-C, Lin S-Z. Mesenchymal stem cells. Cell Transplant. 2011; 20(1): 5-14.

7. Elahi M, Kabirsoleimani M, Shiravi A. [Investigate the possibility of using enzymes to extract mesenchymal stem cells from human adipose tissue]. J Med Res. 2011; 4(35): 200-80.

8. Goldberg VM, Caplan AI. Chap1 .Marcel Dekker. Orthopedic tissue engineering. New York: 2004; 600-602.

9. Fan J, Varshney RR, Ren L, Cai D, et al. Part B: Synovium-derived mesenchymal stem cells; A new cell source for musculoskeletal regeneration. Tissue Eng. 2009; 15(1): 75–86. 

10. Olszta MJ, Cheng X, Jee S,  Kumar R, et al. Bone structure and formation: A new perspective. Materials Science and Engineering. 2007; 58(3): 77-116.

11. Liu Y, Rubin B, Bodine PV, Billiard J. Wnt5a induces homodimerization. and activation of ROR2 receptor tyrosinekinase. J Cell Biochem. 2008; 105(2): 497-502.

12. Hollister S. Porous scaffold design for tissue engineering. Nature materials. 2005; 4(7): 518-524.

13. Habraken WJC. Wolke JA. Jansen. Ceramic composites as matrices and scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Advanced drug delivery reviews. 2007; 59(4): 234-248.

14. Yuji Yin F,  Junfeng C,  Fujiang Z. Preparation and characterization of macroporous chitosan–gelatin/tricalcium phosphate composite scaffolds for bone tissue engineering:  Research Institute of Polymeric Materials, Tianjin University, Tianjin, People’s Republic of China. 2003; 79: 46-53.

15. Caplan AI, Dennis JE. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 2006; 198(5): 176–184.

16. Stockmann P, Park J, Wilmowsky V, Nkenke C, et al. Guided bone regeneration in pig calvarial bone defects using autologous mesenchymal stem/progenitor cells: A comparison of different tissue sources. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery.2012; 40: 310-320.

17. Bergfeld M, Scott A, DeClerck, Yves A. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells and the tumor microenvironment. Cancer Metastasis. 2010; 29(2): 249–261.

18. Choi JH, Gimble JM, Lee K, Marra KG, et al. Adipose tissue engineering for soft tissue regeneration. Tissue Eng Part B. 2010; 16(4): 413-26.

19. Kon E, Muraglia A, Corsi A, Bianco P, et al.

 

 

Autologous bone marrow stromal cells loaded onto porous hydroxyapatite ceramic accelerate bone repair in critical-size defects of sheep long bones. J Biomed Mater Res. 2000; 49(3): 328–337.

20. Arthur A, Zannettino A, Gronthos S. The therapeutic applications of multipotential mesenchymalStromal stem cells in skeletal tissue repair. J. Cell. Physiol. 2009; 218(2): 237–245.

21. Cao L,  Liu G, Gan Y,  Zhang  X, et al. The use of autologous enriched bone marrow MSCs to enhance osteoporoticbone defect repair in long-term estrogen deficient goats. Biomaterials. 2012; 33(20): 60-68. 

22. Niedhviedzki T, Dabrowski Z, Miszta H, Pawlikowskiti M. Bone healing after bone marrow stromal cell transplantation to the bone defect. Biomaterials. 1993; 51(14): 115-121.

23. Schofer M, Veltum A, Theisen Ch, Chen F, et al. Autologous mesenchymal stem cells loaded in Gelfoam for structural bone allograft healing in rabbits. J Biomed Mater. 2011; 62: 24-34.

24. Liu G, Zhao L, Zhang W. Cui L, et al. Repair of goat tibial defects with bone marrow stromal cells and beta-tricalcium phosphate. J Mater Sci Mater Med. 2008; 24(19): 2367–2376.

25.  Nather A, David V, Teng JW, Lee CW, et al. Effect of autologous mesenchymal stem cells on biological healing of allografts in critical-sized tibial defects simulated in adult rabbits. Ann Acad Med Singapore. 2010; 39(8): 599-606.

26. Meinel L, Fajardod R, Hofmanna S, Langerc R. et al. Silk implants for the healing of critical size bone defects Bone. 2005; 37(5): 688–698.

27. Young RG, Butler DL, Weber W. Use of mesenchymal stem cells in a collagen matrix for Achilles tendon repair. J Orthop Res. 1998; 16(4): 406–413.