بررسی فعالیت‌ ضد تکثیری مشتق نیمه سنتزی آرتمیزینین- آرتسونات - بر روی رده سلول سرطان سینه انسانی MCF-7

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه گیلان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی، رشت، ایران

چکیده

هدف: هدف مطالعه حاضر بررسی این‏ است که آیا آرتسونات فعالیت‌ ضدتکثیری خود را با افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی ‌اکسیدانتی در رده سلولی سرطان سینه انسانیMCF-7  اعمال می‌کند. تعیین اثر اکسیدانتی آرتسونات می‌تواند مکانیسم احتمالی جایگزین برای سمیت سلولی آن را شرح دهد. مواد و روش‌ها: به‌منظور بررسی فعالیت سمیت سلولی آرتسونات، سلول‌های MCF-7 با غلظت‌های مختلف آرتسونات (0، 5، 10، 25، 50، 75، 100 و 200 میکروگرم بر میلی‌لیتر) تیمار شده و 24 ساعت بعد مورد سنجش MTT قرار گرفتند. همچنین فعالیت‌ آنزیم‌های سوپراکسید‌ دیسموتاز و پراکسیداز در سلول‌های تیمارشده با دوزهای انتخابی آرتسونات (10، 25، 50 و 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر) پس از 24 ساعت سنجیده شد. به‌علاوه از مایع رویی برای ارزیابی میزان تولید نیتریک اکساید با استفاده از متد گریس استفاده شد. نتایج: آرتسونات به‏‌صورت وابسته به دوز باعث مهار رشد سلول‌های MCF-7 شد و نیز فعالیت‌ آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانتی سوپر اکسید دیسموتاز و پراکسیداز را به‌طور ‌معنی‏داری افزایش داد. همچنین آرتسونات تولید نیتریک‌اکساید را به‏صورت وابسته به دوز مهار نمود. نتیجه گیری: نتایج نشان می‏دهد، آرتسونات اثر سمیت سلولی خود را از طریق افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی ‌اکسیدانتی و نیز با مهار تولید نیتریک ‌اکساید در سلول‌هایMCF-7  اعمال می‌نماید. افزایش فعالیت‌ آنزیم‌های آنتی اکسیدانتی در سلول‌های تیمار شده با آرتسونات، احتمالا سیستم دفاع آنتی ‌اکسیدانتی را تغییر داده و  موجب اثر ضدتکثیری شده است.  

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

یکی از عمده‏ترین علل مرگ و میر انسان در سراسر جهان، بیماری سرطان می­باشد و در این میان، سرطان سینه، شایع­ترین سرطان و نیز علت اصلی مرگ در میان زنان سراسر دنیا می‏باشد (1). بر اساس گزارشات آماری در سال­های اخیر، در حدود 41/24 درصد سرطان­ها در بانوان ایرانی، از نوع سرطان سینه بوده است (2). علی‏رغم پیشرفت­های فراوان در علم پزشکی مدرن در قرن گذشته، اغلب سرطان­ها هنوز قابل درمان نمی‏باشند. این امر تا حدودی ناشی از پیچیدگی پاتوژنز سرطان و مشکلات درمان­های موثر درحال پیشرفت می­باشد. از سوی دیگر شیمی درمانی، پرتودرمانی و جراحی، که از روش­های مرسوم در درمان اغلب سرطان­ها از جمله سرطان سینه می‏باشند، عوارض جانبی نامطلوبی دارند (3). همچنین اگرچه بسیاری از سرطان­ها در ابتدا به شیمی درمانی پاسخ می­دهند، اما اغلب پس از مدتی به آن مقاوم می­شوند (4). لذا تلاش برای کشف درمان­های جدید، همواره ادامه دارد. امروزه داروهای گیاهی به‏علت عدم عوارض جانبی نسبت به داروهای شیمیایی مورد توجه قرار گرفته اند و اثرات درمانی محصولات طبیعی فراوانی علیه انواع سرطان­­ها، به اثبات رسیده است (5). متابولیت‏های ثانویه گیاهی، همواره منبع مطلوبی از ترکیبات جدید برای درمان سرطان بوده (6) و  ترپن­ها، متنوع ترین و فراوان‏ترین خانواده از متابولیت های ثانویه هستند که طیف وسیعی نیز دارای فعالیت‏های دارویی علیه بیماری‏های انسانی می­باشند (7). سزکوئی ترپن‏ها (با سه واحد ترپنی) از ترکیباتی هستند که مقدار قابل توجهی از آن‏ها در گونه‏های گیاهی خانواده آرتمیزیا وجود دارد (8 و 9). از جمله این ترکیبات، آرتمیزینین، یک پراکسید سزکوئی­ ترپن لاکتون موجود درگیاه دارویی چینی به‏نام آرتمیزیا آنوا است (10) که در سال 1972 به‏صورت خالص از اندام هوایی این گیاه، استخراج و ساختار آن در سال 1975 تعیین شد (11). در حال حاضر، انواع مشتقات نیمه سنتزی آرتمیزینین برای افزایش جذب، پایداری و کاهش سمیت، توسعه یافته اند که در این میان، آرتسونات، به‏دلیل حلالیت و فعالیت بالا، از توانمندترین این مشتقات می­باشد (12). آرتمیزینین و مشتقات آن، داروی ضد مالاریای طبیعی و بالقوه هستند که نسبتا ارزان بوده (13) و نیز مشخص شده     علاوه بر فعالیت ضد مالاریایی، فعالیت­های آنتی اکسیدانتی، ضد میکروبی (ضد باکتریایی، ضد ویروسی، ضد قارچی) و ضد توموری (ضد التهابی، ضد رگ‏زایی و ضد تکثیری و القای آپوپتوزی) نیز نشان می­دهند (12، 14 و 15) در تازه ترین گزارش، Kim و همکارانش (16) نشان دادند که آرتمیزینین دارای خواص ضد التهابی (با مهار تولید نیتریک اکساید)، خواص آنتی اکسیدانتی (با مهار رادیکال­های آزاد DPPH) و نیز خواص ضد میکروبی می­باشد.

استفاده از داروی ضدمالاریای آرتمیزینین در تحقیقات سرطان از آن‏جا آغاز شد که برخی محققین پی بردند شاید آرتمیزینین و مشتقات آن بتوانند همان مسیر تخریبی رادیکال‏های آزاد در انگل مالاریا را در سلول­های سرطانی نیز ایجاد نمایند. در سال‏های اخیر، موارد بسیاری از فعالیت ضد سرطانی آرتمیزینین، برعلیه بسیاری از انواع سرطان­ها، هم در شرایطin vitro  و هم in vivo گزارش شده است (17). مشخص شده آرتمیزینین و مشتقات آن، پیشرفت سرطان را در مدل­های آزمایشگاهی بسیاری از جمله رده های سلولی سرطانی، مدل­های حیوانی و حتی کار­ آزمایی­های بالینی مهار می­کنند (18). اولین بار دو محقق  به‏نام­های Lai و Singh (19)، نشان دادند که آرتمیزینین می­تواند موجب القای آپوپتوزیس در سلول­های سرطانی شود. انستیتو ملی سرطان امریکا (NCI) نیز فعالیت ضد سرطانی مشتق آرتمیزینین، آرتسونات را با سنجش اثر مهارکنندگی آن­ها بر روی رشد 55 نوع رده سلولی، آزمایش نموده و نتایج، حاکی از بیشترین تاثیر آرتسونات بر روی لوسمی و سرطان روده و سپس بر روی سرطان­های پستان، تخمدان، پروستات و سرطان­های سیستم عصبی مرکزی مانند گلیوبلاستوما بوده است (20). همچنین نتایج مشابهی با استفاده از مدل­های حیوانی به‏دست آمد. به‏عنوان مثال، تجویز آرتمیزینین به موش­های مبتلا به سرطان فیبروسارکوما و نیز سرطان سینه موجب کاهش رشد و اندازه سلول­های توموری شد (21 و 22). در حال حاضر نیز ترکیبات آرتمیزینین در فاز I – II کار آزمایی­های بالینی بر روی سرطان‏های پستان، روده و شش می‏باشند. شایان ذکر است که تحقیق در مورد آرتمیزینین و سرطان، هنوز در مراحل بسیار اولیه است (23)، به‏طوری‏که هنوز مکانیسم پیام رسانی ضد سرطانی آرتمیزینین، به‏خوبی مشخص نشده است و نیز مکانیسم فعال شدن آرتمیزینین در سلول­های سرطانی تاکنون مبهم باقی مانده است (12 و 24). اگرچه به‏نظر می‏رسد مکانیسم عمل ضد سرطانی این ترکیبات، به‏واسطه پل اندو پراکسیدی موجود در ساختارشان صورت گیرد که در اثر واکنش با آهن فعال شده و تولید رادیکال­های آزاد می‏نمایند. رادیکال­های آزاد نیز موجب تخریب لیزوزوم و تولید گونه‏های فعال اکسیژن (ROS: Reactive Oxygen Species) می­شوند و بالاخره ROS، باعث آزادسازی سیتوکروم C، فعال شدن کاسپازهای 3 و 9 و نهایتا آپوپتوزیس می­شود (12 و 25). همچنین از آن‏جاکه اکثر سلول‏های سرطانی، غلظت‏های بالایی از رسپتورهای ترانسفرینی را در سطح خود بیان کرده و جریان یون آهن در آن­ها نسبت به سلول­های طبیعی بیشتر است (26)، لذا آرتمیزینین به‏طور اختصاصی بر روی این سلول­ها اثر نموده و بدین‏ترتیب، اثرات سمی آرتمیزینین و مشتقات آن خاص سلول‏های سرطانی می­باشد (17 و 27). داروهای ضد سرطانی کنونی، اکثرا با سمیت و مقاومت دارویی همراه هستند، لذا از چالش‏های عمده در درمان سرطان، توسعه داروهای موثرتری است که برای انواع سرطان­ها اختصاصی بوده، ولی حداقل اثرات جانبی را بر روی سلول­های طبیعی پستانداران داشته باشند. آرتمیزینین از داروهای بسیار نادری است که بدون هیچ‏گونه عوارض جانبی یا مقاومت بالینی در درمان مالاریا استفاده می‏شود و از همه مهم­تر اینکه اثر سمیت سلولی آن بر روی سلول سرطانی، اختصاصی است (12, 27). طبق تحقیقات پیشین به‏نظر می­رسد مکانیسمی که آرتسونات به‏واسطه آن اثر سمیت سلولی بر روی سلول­ها اعمال می­کند، از طریق تولید استرس اکسیداتیو باشد (28 و 29). در میان فاکتورهای بی‏شمار، استرس اکسیداتیو که در اثر برهم خوردن تعادل بین سیستم دفاع آنتی اکسیدانتی بدن و تشکیل رادیکا­ل­های آزاد روی می­دهد، نقش مهمی در شروع، ایجاد و پیشرفت سرطان دارد (30). از آن‏جایی‏که آنزیم­های آنتی اکسیدانتی، نقش کلیدی در حفاظت سلول­ها در برابر استرس اکسیداتیو ایفا می‏کنند، اختلال در تنظیم فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی، همچون سوپراکسید دیسموتاز و پراکسیداز باعث سرطان می‏شود (31). سوپراکسید دیسموتاز، دسته‏ای از آنزیم­هاست که دیسموتاسیون رادیکال سوپراکسید را به پراکسید هیدروژن و مولکول اکسیژن کاتالیز می­کند. سپس برخی دیگر از آنزیم­های آنتی اکسیدانتی ازجمله پراکسیداز، پراکسید هیدروژن را به آب تبدیل می­کنند (32). این واکنش­های پشت سر هم، کاهش استرس اکسیداتیو ناشی از ROS را تضمین می‏کنند (33). همچنین مشخص شده کاهش فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی یا تنظیم کاهشی بیان آن­ها، در انواع سرطان­ها از جمله سرطان پروستات، سرطان سینه، مثانه، کبد و غیره نقش دارد (34-36). البته عدم تغییر و یا حتی بیان بیشتر فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی در برخی سرطان­ها نیز گزارش شده است (37). بنابراین احتمالا حفظ سطوح کافی از فعالیت­ آنزیم­های آنتی اکسیدانتی، برای ممانعت از پیشرفت سرطان ضروری می­باشد. لذا هدف قرار دادن فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی، می­تواند راهکار مهمی برای توسعه عوامل درمانی در درمان سرطان باشد. به­علاوه، مطالعه اثرات داروهای ضدسرطانی بر روی فعالیت و بیان آنزیم­های آنتی اکسیدانتی، درک مکانیسم عملکرد دارو را افزایش می­دهد (33). از سوی دیگر، تحقیقات نشان داده که بین فعالیت آنتی اکسیدانتی گیاهان و اثرات ضدتکثیری آن­ها ارتباط مستقیمی وجود دارد. این امر حاکی از عملکرد بالقوه آنتی اکسیدانت‏ها در مهار رشد سلول­های سرطانی می­باشد (38). از آنجایی‏که مشخص شده آرتمیزینین و مشتقات آن دارای فعالیت آنتی اکسیدانتی می­باشند، بنابراین می­توانند به­طور بالقوه اثرات ضد تکثیری نشان دهند (12و 16). برخی مطالعات نیز حاکی از اثر سمیت سلولی این ترکیبات از طریق تولید گونه‏های فعال اکسیژن (ROS) و افزایش استرس اکسیداتیو می‏باشند. نیتریک اکساید (NO) یکی از انواع رادیکال آزاد می‏باشد (28) که تولید بیش از حد آن در اثر فعالیت آنزیم نیتریک اکساید سنتاز (iNOS : inducible Nitric Oxide Synthase)، در برخی شرایط پاتوفیزیولوژیکی از جمله سرطان، التهاب، دیابت و غیره نقش دارد (39 و 40). به‏علاوه، نقش نیتریک اکساید در تومورزایی بر اساس مطالعاتی که نشان می­دهند حضور نیتریک اکساید و نیتریک اکساید سنتاز، در سلول­های سرطانی نسبت به سلول­های طبیعی، بیشتر است ثابت شده و بدین‏ترتیب به­‏نظر می­رسد که ارزش تشخیصی در تحقیقات سرطان داشته باشند (41 و42). یافته‏های حاصل از بررسی­های بالینی بر روی برخی انواع توموری نشان می­دهند که نیتریک اکساید و نیتریک اکساید سنتاز، نه تنها در پیش‏گیری بلکه در گزینه های درمانی جدید نیز ارزشمند می ­باشند (43-45). گزارش‏های مختلفی نشان می­دهند که آرتمیزینین و مشتقات آن، نیتریک اکساید را کاهش می­دهند و مطالعات بسیاری نقش سمیت سلولی آرتسونات را از طریق مهار تولید نیتریک اکساید با جزئیات به اثبات رسانیده اند (46-49). این واقعیت که آرتسونات، تولید نیتریک اکساید ناشی از نیتریک اکساید سنتاز را مهار می­نماید، نشان می­دهد که نیتریک اکساید ممکن است در عملکرد سمیت سلولی آن نقش داشته باشد. ارتباط بین نیتریک اکساید و سمیت سلولی، ویژه آرتسونات نیست و   پیش­تر برای داروهای ضدسرطانی معتبر، گزارش شده است (46).

اگرچه مطالعات فراوانی حاکی از اثر سمیت سلولی آرتمیزینین و مشتقات آن از طریق تولید استرس اکسیداتیو می‏باشند، اما مطالعاتی که پروفایل آنتی اکسیدانتی آن را در رده سلولی سرطان سینه نشان دهند، بسیار محدودند. لذا در این مطالعه اثر سمیت سلولی و ضد تکثیری آرتسونات، موثرترین مشتق آرتمیزینین، بر روی رده سلولی سرطان سینه MCF-7 بررسی شد و نیز برای بررسی مکانیسم فعالیت ضدتکثیری آن، فعالیت­ آنزیم­های آنتی اکسیدانتی سوپراکسید دیسموتاز و پراکسیداز و نیز میزان مهار تولید نیتریک اکساید پس از تیمار با این ترکیب سنجیده شد.

 

مواد و روش‏ها

مواد شیمیایی و دستگاه‏ها: محیط کشتF12  DMEM/Ham’s و سرم جنین گاوی (FBS: Fetal Bovine Serum) از شرکت  Gibco(انگلستان) و محلول پنی­سیلین/ استرپتومایسین از شرکت Biobasic (کانادا)، خریداری شد. پودرهایMTT ((3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2 5-diphenyl tetrazolium bromide، تریپسین/EDTA، آرتسونات و معرفGriess  نیز از شرکت سیگما (آمریکا) تهیه شدند. سایر مواد شیمیایی و محلول­ها همگی از شرکتMerck  (آلمان) خریداری شدند. همچنین از دستگاه­ ثبت الایزا ساخت شرکت BioTek (آمریکا) و دستگاه اسپکتروفوتومتر ساخت شرکتUltrospec 3000  (کانادا) مدل Pharmacia biotechاستفاده شد.

 

روش­ها

کشت سلول: رده سلولی MCF-7 پس از خریداری از مرکز ذخایر ژنتیکی ایران(IBRC) ، در این مطالعه استفاده شد. سلول­ها در محیط کشت DMEM/Ham’s F12 حاوی10 درصد سرم جنین گاوی (FBS) و 1 درصد آنتی بیوتیک (پنی­سیلین/ استرپتومایسین) کشت داده شده و در فلاسک 25 سانتی‏متر مکعب در انکباتور با دمای 37 درجه سانتی‏گراد و 5 درصد CO2، نگه‏داری شدند. سلول­ها پس از رسیدن به تراکم 80 تا 90 درصد، به‏کمک محلول تریپسین/EDTA (25/0 درصد تریپسین و 05/0 درصد EDTA) از کف سلول­ها برداشت شده و پس از حداقل 5 مرتبه پاساژ و رسیدن سلول­ها به فاز رشدی، برای انجام تست­ها استفاده شدند.

سنجش سمیت سلولی: تست MTT: اثر مهار رشدی آرتسونات بر روی سلول­های MCF-7، با استفاده از تست MTT سنجش شد (50). این تست، یک روش رنگ سنجی کمی است که اساس آن بر پایه احیای آنزیمی محلول زرد رنگ MTT به‏وسیله آنزیم سوکسینات دهیدروژناز میتوکندریایی و تشکیل کریستال ارغوانی رنگ و نامحلول در آب فورمازان می­باشد که تنها در سلول‏های زنده روی می­دهد. میزان جذب نوری بلورهای فورمازان پس از حل شدن در حلال‏های آلی همچون دی متیل سولفوکساید (DMSO: Dimethyl sulfoxide)، به‏کمک دستگاه ثبت الایزا قابل سنجش است و بیانگر میزان سلول‏های زنده می­باشد. بدین منظور سلول‏هایMCF-7، درتراکم103×10 سلول در هر چاهک، در پلیت 96 خانه و در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و 5 درصدCO2  کشت داده شدند. پس از 24 ساعت انکوبه شدن و رسیدن به تراکم مطلوب، سوپرناتانت با غلظت­های مختلف آرتسونات (0، 1، 5، 10، 25، 50، 75، 100 و 200  میکروگرم بر میلی­لیتر) که در حلال استون حل شدند، تعویض و همراه با محیط کشت کامل به چاهک­ها اضافه گردید. غلظت نهایی حلال استون در چاهک­ها کمتر از 1/0 درصد محاسبه شد. پس از 24 ساعت تیمار، 10 میکرولیتر محلول MTT (5 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر) به هر چاهک اضافه شد و پلیت به‏مدت چهار ساعت در انکوباتور قرار داده شد. سپس محتویات کشت با احتیاط دور ریخته شد و 100 میکرولیتر دی متیل سولفوکساید (DMSO)، به منظور حل کردن کریستال­های نامحلول فورمازان به هر چاهک افزوده گردید. در نهایت پس از 10 دقیقه، جذب نوری محلول، در طول موج 570 نانومتر با دستگاه ثبت الایزا خوانده شده و درصد زیستایی سلولی با استفاده از فرمول زیر به‏دست آمد. لازم به ذکر است هر غلظت از ترکیب در سه چاهک تکرار شده و از سوی دیگر آزمایش، درسه تکرار مجزا صورت گرفت.

درصد زیستایی سلولی = (جذب نوری نمونه تقسیم بر جذب نوری کنترل) × 100: درصد زیستایی برای تعیین مقادیر) IC50 غلظت 50 درصد کشنده سلولی-  (Inhibitory Concentrationبه‏کار می­رود که عبارتست از غلظت یک ترکیب که باعث مهار 50 درصدی رشد سلول­های تیمارشده در مقایسه با کنترل می­شود.

 

 سنجش فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی: برای بررسی اثر ترکیب آرتسونات بر روی فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی سوپراکسید دیسموتاز و پراکسیداز در سلول­های MCF-7 ابتدا عصاره سلولی تهیه شد. بدین منظور سلول­های MCF-7 با غلظت­های مختلف آرتسونات (100 و 50، 25، 10، 0 میکروگرم بر میلی­لیتر) به‏مدت 24 ساعت تیمار و سپس با استفاده از اسکراپر جدا شدند. پس از سانتریفیوژ به‏مدت 7 دقیقه و دورRPM 1300، رسوب سلولی، دو بار باPBS  (Phosphate Buffered Saline) سرد شستشو داده شد. سپس100 میکرولیتر بافر لیزکننده به رسوب سلول­ها اضافه شد و پس از 15 دقیقه سانتریفیوژ در دمای 4 درجه سانتی‏گراد و دورRPM 10000، سوپرناتانت حاصل، جهت اندازه­گیری میزان پروتئین و نیز سنجش فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی، مورد استفاده قرار گرفت. اندازه­گیری پروتئین کل نمونه­ها با استفاده از روش برادفورد (51) انجام شد. بدین منظور، 5 میکرولیتر از نمونه با آب مقطر به حجم 50 میکرولیتر رسانده و 5/2 میلی لیتر از محلول برادفورد به آن اضافه و به‏مدت 10 دقیقه در دمای اتاق و در تاریکی انکوبه شد. سپس جذب نمونه­ها در طول موج 595 نانومتر خوانده شد و غلظت پروتئین نمونه­ها از روی منحنی استاندارد پروتئین، با در نظر گرفتن ضریب رقت نمونه و با استفاده از محلول یک میلی‏گرم در میلی لیتر آلبومین سرم گاوی  (BSA: Bovine Serum Albumin) محاسبه شد.

a)                   تعیینفعالیت آنزیمسوپراکسیددیسموتاز(SOD: :superoxide dismutase)  سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (SOD) طبق روش Beauchamp و Fridovich (52) و با کمی تغییرات به‏کمک دستگاه ثبت الایزا انجام شد. به‏منظور سنجش فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز(SOD) ، یک میلی لیتر محلول واکنش شامل بافر فسفات 50 میلی مولار با 7=pH ، EDTA 1/0 میلی مولار، متیونین 13 میلی مولار، نیترو بلوتترازولیوم (NBT: Nitro Blue Tetrazolium) 75 میکرومولار، ریبوفلاوین 21/0 میلی‏مولار و نیز سوپرناتانت آنزیمی، تهیه و به هر چاهک از یک پلیت 24 خانه منتقل شد. همچنین به‏منظور مقایسه فعالیت آنزیمSOD  در نمونه‏ها با کنترل، علاوه بر چاهک‏های نمونه و بلانک از چاهک کنترل نیز استفاده شد که محتوای واکنشی چاهک بلانک و کنترل مشابه چاهک نمونه بوده، با این تفاوت که دو چاهک مذکور فاقد آنزیم می‏باشند. لازم به‏ذکر است که محتوای واکنشی چاهک کنترل به‏همراه نمونه‏ها در معرض نور قرار گرفت، درحالی‏که محتوای واکنشی بلانک در تاریکی قرار داده شد. سپس پلیت مذکور به‏مدت 5 دقیقه، بر روی یک شیکر و در معرض دو عدد لامپ فلوئورسنت (20 وات) قرار داده شد و پس از افزوده شدن محتوی ویال حاوی بلانک به یکی از چاهک‏های پلیت، جذب نمونه‏ها با دستگاه ثبت الایزا در طول موج 560 نانومتر خوانده شد. این روش براساس تبدیل نیترو بلو تترازولیوم به فورمازان درحضور نور و ظهور رنگ می­باشد. در صورتی‏که در محیط واکنش، آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز موجود باشد، از انجام این واکنش ممانعت نموده و میزان تشکیل ماده رنگی و در نتیجه ظهور رنگ را کاهش می­دهد. در واقع اختلاف جذب نمونه‏های دارای عصاره آنزیمی و کنترل (فاقد آنزیم)، نشان­دهنده ممانعت واکنش تشکیل ماده رنگین فورمازان توسط SOD می­باشد. با استفاده از این اختلاف جذب، واحد آنزیمی نمونه‏ها محاسبه و فعالیت آنزیمی برحسب واحد آنزیم در هر میلی‏گرم پروتئین عصاره (محاسبه شده از روش برادفورد) بیان شد. طبق تعریف، یک واحد فعالیتSOD ، مقدار فعالیت آنزیمی است که باعث 50 درصد ممانعت از احیای فتوشیمیایی نیترو بلو تترازولیوم به فورمازان تحت شرایط سنجش می‏شود.

b)                  سنجشفعالیت آنزیمپراکسیداز:(POD: peroxidase): برای اندازه گیری فعالیت آنزیم پراکسیداز از سوبسترای 4-آمینوآنتی پیرین در حضور پراکسید هیدروژن با روش اسپکتوفتومتری استفاده شد (53 و 54). اکسیداسیون 4-آمینوآنتی پیرین در دمای اتاق به‏مدت 2 دقیقه در یک میلی‏لیتر محلول واکنش متشکل از 470 میکرو لیتر 4- آمینوآنتی پیرین2 میلی مولار و 470 میکرولیتر پراکسید هیدروژن 1 میلی‏مولار و 60 میکرولیتر سوپرناتانت آنزیمی مورد سنجش قرار گرفت و بر علیه سل بلانک که حاوی تمام مواد به‏جز نمونه آنزیمی بود، خوانده شد. فعالیت آنزیم پراکسیداز (POD) با دنبال کردن تغییرات جذب در دقیقه (∆A/min) که در نتیجه اکسیداسیون 4- آمینو آنتی پیرین می­باشد، در طول موج 510 نانومتر ثبت شد. همچنین برای محاسبه فعالیت آنزیمی از ضریب خاموشی mM-1cm-1)6/26( استفاده شد. هر واحد از فعالیت آنزیم پراکسیداز عبارت است از مقداری از آنزیم که باعث افزایش جذب 001/0 در دقیقه در طول موج 510 نانومتر تحت شرایط سنجش می­شود.

 اندازهگیریمیزاننیتریک اکساید (NO): غلظت نیتریت به‏عنوان شاخصی از تولید نیتریک اکساید با روش گریس (Griess)  اندازه‏گیری می­شود. در این روش، معرف گریس
(1 درصد سولفانیل آمید، 1/0 درصد نفتیل اتیلن آمید دهیدروکلراید در 5/2 درصد فسفریک اسید) برای سنجش غلظت نیتریت به نمونه اضافه می‏شود (55)؛ بدین منظور      سلول­های  MCF-7پس از 24 ساعت تیمار با غلظت­های مختلف آرتسونات (0، 10، 25، 50 و 100میکروگرم بر میلی‏لیتر)، از انکوباتور خارج شده و سوپرناتانت محیط کشت از پلیت‏های کشت به ویال‏های 5/1میلی‏لیتری منتقل شد و پس از سانتریفیوژ به‏مدت 7 دقیقه و دور RPM 1300، حدود 100 میکرولیتر از هر نمونه به یک چاهک از پلیت 96 تایی انتقال یافت. سپس حدود 100 میکرولیتر معرفGriess   به ‏هر چاهک اضافه شد و برای 10 دقیقه در دمای اتاق در تاریکی قرار داده شد. رنگ ارغوانی تولید شده نسبت مستقیم با میزان تولیدNO  دارد. میزان جذب این رنگ توسط دستگاه ثبت الایزا و در طول موج 550 نانومتر قرائت شد. هرچه غلظت نیتریت در نمونه بیشتر باشد، میزان جذب در این طول موج بیشتر خواهد بود. به این ترتیب می‏توان با روش گریس کاهش یا افزایش نیتریک اکساید را در نمونه‏ها با کنترل مقایسه نمود. همچنین برای سنجش میزانNO  آزاد شده توسط نمونه‏های تیمار شده، از منحنی استانداردNO  استفاده شد. بدین‏منظور از نیتریت سدیم (NaNO2)  جهت تهیه غلظت­های نیتریت  استفاده شد.

 

آنالیز آماری

تجزیه و تحلیل آماری داده­ها و رسم نمودارها با استفاده از نرم افزارهای  SPSSو Excel انجام شد. پس از انجام تست نرمالیته(Kolmogorov  Smirnov= K.S) از روش آماری آنالیز واریانس یک طرفه (One-way ANOVA) و Post Hoc )تست( Dunnette برای مقایسه گروه­ها با کنترل استفاده شد. همچنین (05/0p<) معنی‏دار در نظر گرفته شد. تمامی آزمایش‏ها با حداقل سه تکرار انجام و نتایج به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شدند.

نتایج

آرتسونات بهصورت وابسته به دوز باعث مهار رشد سلول­های سرطان سینه شد.

بررسی سمیت سلولی آرتسونات بر روی رده سلولی MCF-7، با استفاده از تست MTT انجام شد. همان‏طور که در نمودار 1 نشان داده شده، تیمار سلول­هایMCF-7 با غلظت­های مختلف آرتسونات (0، 1، 5، 10، 25، 50، 75، 100، 200میکروگرم بر میلی­لیتر) به‏مدت 24 ساعت، باعث مهار معنی‏دار رشد سلول­ها به‏صورت وابسته به دوز در مقایسه با گروه کنترل شد (05/0p<)  بدین ترتیب با افزایش غلظت آرتسونات، درصد زیستایی به‏طور معناداری کاهش یافت. همچنین مقادیر IC50 آرتسونات پس از 24 ساعت 73/1 ± 78/43 میکروگرم بر میلی­لیتر محاسبه شد. بدین ترتیب نتایج ما نشان داد که آرتسونات رشد و تکثیر سلول‏هایMCF-7 را به‏صورت وابسته به دوز مهار نمود.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 1: فعالیت ضد تکثیری آرتسونات بر روی سلول­های MCF-7. پس از 24 تیمار سلول­ها با غلظت­های مختلف آرتسونات (0، 5، 10، 25، 50، 75، 100 و 200 میکروگرم بر میلی لیتر) درصد زیستایی سلول­ها با استفاده از تست MTT انجام شد. داده‏ها به‏صورت میانگین ± انحراف معیار سه آزمایش مستقل باحداقل سهتکراربیان شده اند.* 05/0p <، نشان دهنده تفاوت معنی­دار با گروه کنترل می­باشد.

 

 

میزان پروتئین کل در سلول­های سرطان سینه پس از تیمار با آرتسونات به‏صورت وابسته به دوز کاهش یافت. نتایج حاصل از تست سنجش پروتئین برادفورد نشان داد که غلظت پروتئین در عصاره سلولی استخراج شده، پس از تیمار با غلظت­های مختلف آرتسونات (0، 10، 25، 50 و 100) میکروگرم بر میلی­لیتر) به‏صورت وابسته به دوز کاهش یافت (نمودار 2). همچنین برای

تعیین غلظت پروتئین از منحنی استاندارد استفاده شد (نمودار 3).

 

فعالیت­ آنزیم­های آنتی اکسیدانتی سوپراکسید دیسموتاز

 

و پراکسیداز در سلول­های سرطان سینه پس از تیمار با آرتسونات افزایش یافت.

a) فعالیت­ آنزیم سوپراکسید دیسموتاز: سنجش فعالیت آنزیمی عصاره‏های سلولی استخراج شده از سلول­های MCF-7 تیمارشده با غلظت‏های مختلف آرتسونات نشان داد که فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز در غلظت­های 10، 25 و 50 میکروگرم بر میلی­لیتر در مقایسه با گروه کنترل، به‏طور معنی‏داری افزایش یافته است. نتایج نشان داد که آرتسونات در غلظت موثر 25 میکروگرم بر میلی­لیتر بیشترین افزایش را در فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز نسبت به گروه کنترل داشته است. به­طوری‏که میزان فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز از U/mg 05/0 ± 39/0 در کنترل به U/mg 19/0± 39/3 افزایش یافته است. این درحالی‏است که دوز کشنده (بالاتر ازIC50  ) 100 میکروگرم بر میلی­لیتر کمترین فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز را نشان داد ) (05/0p<) (U/mg04/0±  18/0) (نمودار a4).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار2: غلظت پروتئین کل در عصاره سلولی استخراج شده. پس از 24 تیمار سلول­های MCF-7 با غلظت­های مختلف آرتسونات (0، 10، 25، 50 و 100 میکروگرم بر میلی‏لیتر، تست سنجش غلظت پروتئین به‏روش برادفورد انجام شد. * 05/0p<، نشان دهنده تفاوت معنی­دار با گروه کنترل میباشد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار3: منحنیاستانداردپروتئین که بااستفادهاز رقت‏های مختلفمحلولیکمیلیگرمدرمیلیلیتر آلبومین سرمگاوی (BSA) رسم شد.

 

 

 

 

نمودار4: اثر آرتسونات بر روی فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی. پس از 24 تیمار سلول­های MCF-7 با غلظت­های مختلف انتخابی آرتسونات (0، 10، 25، 50 و 100 میکرو گرم بر میلی‏لیتر)، فعالیت آنزیم­های  a) سوپر اکسید دیسموتاز و b) پراکسیداز سنجش شد. هرتستباحداقل سهتکرارانجام و نتایج بهصورت میانگین واحد آنزیمی در هر میلی گرم پروتئین ± انحراف معیار بیان شده اند.* 05/0 p<، نشان دهنده تفاوت معنی­دار با گروه کنترل می­باشد.

 

 

b) فعالیت­ آنزیم پراکسیداز: نتایج نشان داد که آرتسونات فعالیت­ آنزیم پراکسیداز را در غلظت­های 10، 25 و 50 میکروگرم بر میلی­لیتر در مقایسه با گروه کنترل،                        به‏طور معنی‏داری افزایش داد. میزان فعالیت­ آنزیم پراکسیداز در غلظت موثر 25 میکروگرم بر میلی­لیتر، U/mg 53/2 ±61/31 محاسبه شد که در مقایسه با گروه کنترل (U/mg 21/1± 59/3) افزایش قابل توجهی نشان می­دهد. همچنین غلظت­های 50 و 10 میکروگرم بر میلی­لیتر به‏ترتیب با مقادیر U/mg43/2 ± 26/16 و  U/mg98/1 ± 31/8 بیشترین فعالیت آنزیم پراکسیداز را بعد از دوز 25 میکروگرم بر میلی­لیتر نشان دادند      (نمودار b4).

آرتسونات تولید نیتریک اکساید را در سلول­های سرطانی

 

مهار نمود. غلظت نیتریک اکساید (NO) با استفاده از متد گریس و با کمک منحنی استانداردNO ، محاسبه شد (نمودار 5). اثر غلظت­های مختلف آرتسونات (10، 25، 50 و 100 میکروگرم بر میلی­لیتر) بر روی سلول­های MCF-7 به‏مدت 24 ساعت، کاهش وابسته به دوز در تولید نیتریک اکساید (NO) را نشان داد (نمودار 6). به‏طوری‏که میزان نیتریک اکساید (NO) از 91/2± 65/39 نانو مولار در گروه کنترل به 76/1± 95/8 نانو مولار در غلظت 25 میکروگرم بر میلی­لیتر کاهش یافت (05/0p<). به‏عبارت دیگر با توجه به این نتایج می‏توان دریافت که آرتسونات موجب مهار معنی‏دار تولید نیتریک اکساید در سلول­های  MCF-7 شد.

 

 

 

 

 

 

نمودار5: منحنیاستانداردنیتریک اکساید (NO) که بااستفادهاز غلظت‌های مختلف نیتریت سدیم (0، 10، 20، 30، 50، 100 و 200 نانو مولار) رسم شد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار6: اثر آرتسونات بر مهار تولید نیتریک اکساید در سلول‏هایMCF-7. میزان مهار تولید نیتریک اکساید (NO) در سوپرناتانت حاصل از  سلول­های MCF-7 تیمارشده با غلظت‏های مختلف آرتسونات (0، 10، 20، 50 و 100 میکرو گرم بر میلی‏لیتر) به‏‏مدت 24 ساعت که با استفاده از متد گریس و به‏کمک منحنیاستانداردنیتریک اکساید (NO) محاسبه شد. هرتستباحداقل سهتکرارانجام و داده‏ها به‏صورت میانگینتولید نیتریت سدیم بر حسب نانومولار ± انحراف معیاربیان شده اند. *05/0p<، نشان دهنده تفاوت معنی­دار با گروه کنترل می­باشد.

 

 

بحث

در این تحقیق فعالیت ضد تکثیری یکی از موثرترین مشتقات نیمه سنتزی ترکیب گیاهی آرتمیزینین، آرتسونات، بر روی رده

 

سلولی سرطان سینه انسانیMCF-7  بررسی شد. بر طبق یافته‏های حاصل، آرتسونات اثر مهار رشدی معناداری بر روی این سلول­ها نشان داد و نیز فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی عمده شامل سوپر اکسید دیسموتاز و پراکسیداز را که میزان فعالیت آن­ها در سرطان­های مختلف تغییر می­یابد، افزایش داد.              به‏نظر می­رسد کاهش بیان و یا کاهش فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی تا حدودی مسئول سرطان­زایی می­باشد (34-36). درنتیجه تنظیم بالای بیان آنزیم­های آنتی اکسیدانتی یا افزایش فعالیت آن­ها به‏عنوان یک راه‏کار موثر برای پیشگیری و یا درمان سرطان مطرح شده است. به‏عنوان مثال بیان بیش از حد آنزیم سوپراکسید دیسموتاز، باعث مهار رشد انواع سلول­های سرطان سینه شد (56). همچنین تحقیقات بسیاری حاکی از تاثیر محصولات گیاهی در مهار سلول­های سرطانی به‏واسطه افزایش بیان یا فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی می­باشند. به‏عنوان مثال نوعی ایزوفلاونوئید ضد سرطان، با افزایش بیان آنزیم­های آنتی اکسیدانی در رده سلولی سرطان پروستات باعث مهار موثر این سلول­ها شد (57) و در مطالعه ای دیگر، نوعی عصاره گیاهی با افزایش فعالیت­ آنزیم­های آنتی اکسیدانتی سوپراکسید دیسموتاز و پراکسیداز و درنتیجه تغییر سیستم دفاع آنتی اکسیدانتی باعث مهار رشد سلول­های سرطان سینهMCF-7  شد (58). آرتمیزینین، یک سزکوئی­ترپن­لاکتون موجود درگیاهی دارویی به‏نام آرتمیزیا آنوا می­باشد که امروزه انواع مشتقات نیمه سنتزی آن از جمله آرتسونات به‏عنوان داروی ضد مالاریا به‏کار می­روند. همچنین مشخص شده این ترکیبات علاوه بر فعالیت   ضد مالاریایی، فعالیت­های ضد تکثیری و ضد سرطانی نیز نشان می­دهند. در مطالعه ای که توسط Zhang و همکاران (28) در سال 2010 صورت گرفت مشخص شد که آرتمیزینین و مشتقات آن، سطوح پروتئینی آنزیم­های آنتی اکسیدانتی همچون سوپراکسید دیسموتاز و پراکسیداز را افزایش دادند که این یافته با ارتباط مقادیر غلظت­های مهاری (IC50) این ترکیبات با بیانmRNA  ژن­های دخیل در پاسخ استرس اکسیداتیو، موافق است. همچنین به­­نظر می­رسد عملکرد آرتمیزینین با بیان آنزیم‏های استرس اکسیداتیو از جمله سوپراکسید دیسموتاز تعدیل شد (59). با این وجود اگرچه فعالیت آنتی اکسیدانتی آرتمیزینین ثابت شده (16) و نیز اثر آن بر روی بیان آنزیم­های آنتی اکسیدانتی مختلف بررسی شده (28)، اما برای اثبات فعالیت آنتی اکسیدانتی آن تاکنون مطالعه ای صورت نگرفته تا میزان فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی عمده را پس از تیمار با آرتمیزینین یا مشتقات آن از جمله آرتسونات در سلول سرطان سینه مورد سنجش قرار دهد. لذا در این تحقیق به‏منظور بررسی مکانیسم مهار رشدی آرتسونات، فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی در سلول سرطانی سینه مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج تحقیق ما نشان داد که آرتسونات فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی سوپر اکسید دیسموتاز و پراکسیداز را در سلول سرطان سینهMCF-7  به‏طور معنی‏داری افزایش داد. اگرچه در این مطالعه دوز موثر آرتسونات (غلظت پایین‏تر از IC50) بیشترین اثر افزایشی را نشان داد. همچنین میزان پروتئین در عصاره سلولی استخراج شده، با افزایش غلظت آرتسونات کاهش یافت. از آنجاکه آنزیم سوپراکسید دیسموتاز، سوپراکسید را به آب و H202 تبدیل می­کند، درحالی‏که پراکسیداز، با تبدیل H202 به آب از صدمه ناشی از استرس اکسیداتیو ممانعت می‏کند. لذا تجمع H202 موجب صدمه پروتئین می­شود. H202 نه تنها نوعیROS  می­باشد، بلکه یک مولکول پیام رسان مهم نیز محسوب می­شود (60). از سوی دیگر به‏نظر می‏رسد مکانیسم عمل آرتمیزینین به‏دلیل عملکردهای متنوع آن مسیرهای پیام رسانی متعددی را شامل شود (46). به‏عنوان مثال طبق گزارش‏ها فراوان یکی از مکانیسم­های عمده عمل آرتمیزینین از طریق تولید ROS می­باشد (12). لذا کاهش میزان پروتئین که بعد از تیمار با آرتسونات روی داده، احتمالا ناشی از افزایشROS  می­باشد که باعث صدمه اکسیداتیو پروتئین و نهایتا کاهش میزان آن شده است. ترکیبات ضد سرطانی که فعالیت آنتی اکسیدانتی دارند، ممکن است اثرات سودمند خود را به‏واسطه متعادل ساختن سطوح ROS اعمال نمایند، به طوری‏که نه تنها از تکثیر سلول­های سرطانی ممانعت نمایند، بلکه امکان وقوع آپوپتوزیس را نیز فراهم ­­کنند (61). در مطالعه‏ای مشابه با تحقیق حاضر مشخص شد که مشتق نیمه سنتزی یک آلکالوئید ضد سرطانی از طریق تولید ROS و افزایش استرس اکسیداتیو، اثر سمیت سلولی بر روی رده سلولی سرطان سینه MCF-7 اعمال می­نماید. همچنین در این مطالعه فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی ازجمله سوپر اکسید دیسموتاز و پراکسیداز پس از تیمار با این ترکیب افزایش یافت. آن­ها فرض کردند این افزایش در فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی می­تواند به‏عنوان پاسخی برای افزایش استرس اکسیداتیو در سلول­های تیمارشده باشد (62). بدین ترتیب می‏توان این­طور نتیجه‏گیری کرد که آرتسونات احتمالا با افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی، موجب مهار رشد و نیز مرگ سلول­های سرطان سینه شده و بدین ترتیب اثر سمیت سلولی و ضد سرطانی خود را اعمال نموده است.

از سوی دیگر بر اساس یافته‏های این مطالعه، آرتسونات موجب مهار وابسته به دوز نیتریک اکساید در سلول­هایMCF-7 شد. این یافته با مطالعات مشابه بسیاری که اثر آرتمیزینین و مشتقات آن را بر روی مهار تولید نیتریک اکساید سنجیده اند، کاملا موافق می‏باشد. از جمله در مطالعه مشابهی، تولید نیتریک اکساید در سلول­های­ سرطان سینهMCF-7  در پاسخ به غلظت‏های مختلف نوعی عصاره گیاهی به‏صورت وابسته به دوز و زمان به‏طور معنی‏داری کاهش یافت و مهار تکثیر سلول­ها به‏واسطه این کاهش توجیه شد (63). همچنین مشخص شده آرتمیزینین تولید نیتریک اکساید را در رده سلولی ماکروفاژ موشی RAW.264.7 (46) و نیز فعال شدن فاکتور رونویسی NF-κB (Nuclear Factor kappaB) و درنتیجه نیتریک اکساید سنتاز را در رده سلولی آستروسیتوما (T67) مهار می‏کند (47). نهایتا تمامی این یافته‏ها با نتایج حاصل از مطالعه ای که حاکی از مکانیسم عمل ضد مالاریایی آرتمیزینین از طریق مهار تولید نیتریک اکساید می­باشد، موافق می­باشند (49). بدین ترتیب به‏نظر می­رسد در این تحقیق نیز سمیت سلولی آرتسونات بر روی سلول­های سرطان سینه MCF-7، ناشی از مهار نیتریک اکساید باشد. همچنین در این مورد نیز دوز موثر آرتسونات بیشترین اثر مهارکنندگی را نشان داد. در نتیجه پیام رسانی نیتریک اکساید نیز در بروز فعالیت سمیت سلولی آرتسونات نقش داشته است. اگرچه احتمالا سایر مسیرهای پیام رسانی نیز در اثر مهاری آرتسونات بر روی سلول­ها نقش دارند که موجب بروز عملکردهای متعدد آرتسونات شده‏اند.

 

نتیجه گیری

بر اساس نتایج مطالعه حاضر، به نظر می­رسد آرتسونات فعالیت­ ضدتکثیری خود را با افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانی در رده سلولی سرطان سینه انسانیMCF-7  اعمال نموده است. افزایش فعالیت­ آنزیم­های آنتی اکسیدانی سوپر اکسید دیسموتاز و پراکسیداز در سلول­های تیمارشده با آرتسونات، احتمالا سیستم دفاع آنتی اکسیدانتی را تغییر داده و بدین ترتیب موجب اثرات ضد تکثیری شده است. همچنین آرتسونات با مهار تولید نیتریک اکساید، اثرات سمیت سلولی بر روی سلول‏های سرطانی سینه داشته است. بدین ترتیب با تایید اثر آنتی اکسیدانتی آرتسونات مکانیسمی دیگر برای سمیت سلولی آن بیان شد. روی هم رفته می‏توان این‏طور نتیجه گیری کرد که آرتسونات می‏تواند تکثیر سلول­های سرطان سینه MCF-7 را به‏واسطه افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی و کاهش تولید نیتریک اکساید، مهار نموده و بدین ترتیب اثرات سمیت سلولی بروز دهد.

 

تشکر و قدردانی

حمایت مالی این پژوهش توسط دانشگاه گیلان انجام شده است که بدین‏وسیله مراتب قدردانی و سپاس از دانشگاه گیلان به‏عمل می‏آید.

1.  Siegel R, Ma J, Zou Z, Jemal A. Cancer statistics, 2014. CA: a cancer journal for clinicians. 2014; 64(1): 9-29.

2.  Taghavi A, Fazeli Z, Vahedi M, Baghestani AR, et al. Increased trend of breast cancer mortality in Iran. Asian Pac J Cancer Prev. 2012; 13(1): 367-70.

3. Edward Chu, Alan C Sartorelli. Cancer chemotherapy. Katzung BG, Masters SB, Trevor AJ. Basic & clinical pharmacology. 9th edn. New York:  MC Grow Hill; 2004; 898-9330.

4. Mika A. Sovak and David R. Spriggs. Cancer chemotherapy: Clinical evidence for drug resistance.  Teicher BA. Cancer drug resistance. New Jersey:  Humana Press. 2006; 543-558.

5. Mann J. Natural products in cancer chemotherapy: past, present and future. Nature Reviews Cancer. 2002; 2(2): 143-8.

6. Nobili S, Lippi D, Witort E, Donnini M, et al. Natural compounds for cancer treatment and prevention. Pharmacological Research. 2009; 59(6): 365-78.

7. Paduch R, Kandefer-Szerszeń M, Trytek M, Fiedurek J. Terpenes: substances useful in human healthcare. Archivum immunologiae et therapiae experimentalis. 2007; 55(5): 315-27.

8. Zhang S, Won Y-K, Ong C-N, Shen H-M. Anti-cancer potential of sesquiterpene lactones: bioactivity and molecular mechanisms. Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents. 2005; 5(3): 239-49.

9. Ghantous A, Gali-Muhtasib H, Vuorela H, Saliba NA, et al. What made sesquiterpene lactones reach cancer clinical trials? Drug discovery today. 2010; 15(15): 668-78.

10. Tan W, Lu J, Huang M, Li Y, et al. Anti-cancer natural products isolated from chinese medicinal herbs. Chin Med. 2011; 6(1): 27.

11. Liao F. Discovery of artemisinin (Qinghaosu). Molecules. 2009; 14(12): 5362-6.

12. Crespo-Ortiz MP, Wei MQ. Antitumor activity of artemisinin and its derivatives: from a well-known antimalarial agent to a potential anticancer drug. BioMed Research International. 2012; 2012(247597): 1-18.

13. Klayman DL. Qinghaosu (artemisinin): an antimalarial drug from China. Science. 1985; 228(4703): 1049-55

14. Efferth T. Willmar Schwabe Award 2006: antiplasmodial and antitumor activity of artemisinin--from bench to bedside. Planta medica. 2007; 73(4): 299-309.

15. Ferreira JF, Luthria DL, Sasaki T, Heyerick A. Flavonoids from Artemisia annua L. as antioxidants and their potential synergism with artemisinin against malaria and cancer. Molecules. 2010; 15(5): 3135-70.

 

 

 

16. Kim W-S, Choi WJ, Lee S, Kim WJ, et al. Anti-inflammatory, Antioxidant and Antimicrobial Effects of Artemisinin Extracts from Artemisia annua L. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 2015; 19(1): 21-7.

17. Nakase I, Lai H, Singh NP, Sasaki T. Anticancer properties of artemisinin derivatives and their targeted delivery by transferrin conjugation. International journal of pharmaceutics. 2008; 354(1): 28-33.

18. Krishna S, Bustamante L, Haynes RK, Staines HM. Artemisinins: their growing importance in medicine. Trends in pharmacological sciences. 2008; 29(10): 520-7.

19. Singh NP, Lai HC. Artemisinin induces apoptosis in human cancer cells. Anticancer Research. 2004; 24(4): 2277-80.

20. Efferth T, Dunstan H, Sauerbrey A, Miyachi H, et al.. The anti-malarial artesunate is also active against cancer. International journal of oncology. 2001; 18(4): 767-73.

21. Moore JC, Lai H, Li J-R, Ren R-L, et al. Oral administration of dihydroartemisinin and ferrous sulfate retarded implanted fibrosarcoma growth in the rat. Cancer letters. 1995; 98(1): 83-7.

22. Lai H, Singh NP. Oral artemisinin prevents and delays the development of 7, 12-dimethylbenz [a] anthracene (DMBA)-induced breast cancer in the rat. Cancer letters. 2006; 231(1): 43-8.

23. La Pensée L, Sabbani S, Sharma R, Bhamra I, et al. Artemisinin–Polypyrrole Conjugates: Synthesis, DNA Binding Studies and Preliminary Antiproliferative Evaluation. ChemMedChem. 2013; 8(5): 709-18.

24. Oneill PM, Barton VE, Ward SA. The molecular mechanism of action of artemisinin—the debate continues. Molecules. 2010; 15(3): 1705-21.

25. Mercer AE, Maggs JL, Sun X-M, Cohen GM, et al. Evidence for the involvement of carbon-centered radicals in the induction of apoptotic cell death by artemisinin compounds. Journal of Biological Chemistry. 2007; 282(13): 9372-82.

26. May Jr WS, Cuatrecasas P. Transferrin receptor: its biological significance. The Journal of membrane biology. 1985; 88(3): 205-15.

27. Lai H, Singh NP. Selective cancer cell cytotoxicity from exposure to dihydroartemisinin and holotransferrin. Cancer letters. 1995; 91(1): 41-46.

28. Zhang S, Chen H, Gerhard GS. Heme synthesis increases artemisinin-induced radical formation and cytotoxicity that can be suppressed by superoxide scavengers. Chemico-biological interactions. 2010; 186(1): 30-5.

29. Efferth T, Briehl MM, Tome ME. Role of antioxidant genes for the activity of artesunate against tumor cells. International journal of oncology. 2003; 23(4): 1231-5.

30. Klaunig JE, Kamendulis LM. The role of oxidative stress in carcinogenesis. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2004; 44: 239-67.

31. Khan MA, Tania M, Zhang D-z, Chen H-c. Antioxidant enzymes and cancer. Chinese Journal of Cancer Research. 2010; 22(2): 87-92.

32. Weydert CJ, Cullen JJ. Measurement of superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase in cultured cells and tissue. Nature protocols. 2010; 5(1): 51-66.

33. Khan MA, Chen H-c, Wan X-x, Tania M, et al. Regulatory effects of resveratrol on antioxidant enzymes: a mechanism of growth inhibition and apoptosis induction in cancer cells. Molecules and cells. 2013; 35(3): 219-25.

34. Arsova-Sarafinovska Z, Eken A, Matevska N, Erdem O, et al. Increased oxidative/nitrosative stress and decreased antioxidant enzyme activities in prostate cancer. Clinical biochemistry. 2009; 42(12): 1228-35.

35. Jeon SH, Park J-H, Chang S-G. Expression of antioxidant enzymes (catalase, superoxide dismutase, and glutathione peroxidase) in human bladder cancer. Korean Journal of Urology. 2007; 48(9): 921-6.

36. Kasapović J, Pejić S, Todorović A, Stojiljković V, et al. Antioxidant status and lipid peroxidation in the blood of breast cancer patients of different ages. Cell biochemistry and function. 2008; 26(6): 723-30.

37. Ho JC-m, Zheng S, Comhair SA, Farver C, et al. Differential expression of manganese superoxide dismutase and catalase in lung cancer. Cancer Research. 2001; 61(23): 8578-85.

38. Li W-Y, Chan S-W, Guo D-J, Yu PH-F. Correlation between antioxidative power and anticancer activity in herbs from traditional Chinese medicine formulae with anticancer therapeutic effect. Pharmaceutical Biology. 2007; 45(7): 541-6.

39. Anggard E. Nitric oxide: mediator, murderer, and medicine. The Lancet. 1994; 343(8907): 1199-206.

40. Lechner M, Lirk P, Rieder J, editors. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) in tumor biology: the two sides of the same coin. Seminars in cancer biology. 2005; 15(4): 277-289.

41. Tanaka H, Kijima H, Tokunaga T, Tajima T, et al. Frequent expression of inducible nitric oxide synthase in esophageal squamous cell carcinomas. International journal of oncology. 1999; 14(6): 1069-142.

42. Franco L, Doria D, Bertazzoni E, Benini A, et al. Increased expression of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 in pancreatic cancer. Prostaglandins & other lipid mediators. 2004; 73(1): 51-8.

43. Wang L, Shi GG, Yao JC, Gong W, et al. Expression of endothelial nitric oxide synthase correlates with the angiogenic phenotype of and predicts poor prognosis in human gastric cancer. Gastric Cancer. 2005; 8(1): 18-28.

44. Hirst DG, Robson T. Nitrosative stress in cancer therapy. Front Biosci. 2007; 12: 3406-18.

45. Coulter J, McCarthy H, Xiang J, Roedl W, et al. Nitric oxide—a novel therapeutic for cancer. Nitric Oxide. 2008; 19(2): 192-8.

46. Konkimalla VB, Blunder M, Korn B, Soomro SA, et al. Effect of artemisinins and other endoperoxides on nitric oxide-related signaling pathway in RAW 264.7 mouse macrophage cells. Nitric Oxide. 2008; 19(2): 184-91.

47. Aldieri E, Atragene D, Bergandi L, Riganti C, et al. Artemisinin inhibits inducible nitric oxide synthase and nuclear factor NF-kB activation. FEBS letters. 2003; 552(2): 141-4.

48. Wang J-x, Hou L-f, Yang Y, Tang W, et al. SM905, an artemisinin derivative, inhibited NO and pro-inflammatory cytokine production by suppressing MAPK and NF-κB pathways in RAW 264.7 macrophages. Acta Pharmacologica Sinica. 2009; 30(10): 1428-35.

49. Severina IS, Pyatakova NV, Bussygina OG, Mikhailitsyn FS, et al. Inhibition of nitric oxide-dependent activation of soluble guanylyl cyclase by the antimalarial drug, artemisinin. European journal of pharmacology. 2002; 438(1): 69-73.

50. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of immunological methods. 1983; 65(1): 55-63.

51. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 1976; 72(1): 248-54.

52. Beauchamp C, Fridovich I. Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable to acrylamide gels. Analytical biochemistry. 1971; 44(1): 276-87.

53. Sariri R, Jafarian V, Sajedi RH, Khajeh K. Inhibition of horseradish peroxidase by thiol type inhibitors: mercaptoethanol and mercaptoacetic acid. Journal of molecular liquids. 2006; 128(1): 175-7.

54. Damirchi A, Kiani M, Jafarian V, Sariri R. Response of salivary peroxidase to exercise intensity. European journal of applied physiology. 2010; 108(6): 1233-7.

55. Miranda KM, Espey MG, Wink DA. A rapid, simple spectrophotometric method for simultaneous detection of nitrate and nitrite. Nitric oxide. 2001; 5(1): 62-71.

56. Weydert CJ, Waugh TA, Ritchie JM, Iyer KS, et al. Overexpression of manganese or copper–zinc superoxide dismutase inhibits breast cancer growth. Free Radical Biology and Medicine. 2006; 41(2): 226-37.

57. Park CE, Yun H, Lee E-B, Min B-I, et al. The antioxidant effects of genistein are associated with AMP-activated protein kinase activation and PTEN induction in prostate cancer cells. Journal of medicinal food. 2010; 13(4): 815-20.

58. Abrahim NN, Kanthimathi M, Abdul-Aziz A. Piper betle shows antioxidant activities, inhibits MCF-7 cell proliferation and increases activities of catalase and superoxide dismutase. BMC complementary and alternative medicine. 2012; 12(1): 220.

59. Efferth T, Sauerbrey A, Olbrich A, Gebhart E, et al. Molecular modes of action of artesunate in tumor cell lines. Molecular Pharmacology. 2003; 64(2): 382-94.

60. Giorgio M, Trinei M, Migliaccio E, Pelicci PG. Hydrogen peroxide: a metabolic by-product or a common mediator of ageing signals? Nature reviews Molecular cell biology. 2007; 8(9): 722-8.

61. MM A, AE M, AE R. Inhibition of human MCF-7 breast cancer growth by free radicals enhancement of polycondensed thienopyrimidine derivatives. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research. 2011; 4(1): 118-22.

62. Timur M, Akbas SH, Ozben T. The effect of Topotecan on oxidative stress in MCF-7 human breast cancer cell line. Acta biochimica polonica-english edition-. 2005; 52(4): 897.

63. Rezakhani L, Rashidi Z, Mirzapur P, Khazaei M. Antiproliferatory Effects of Crab Shell Extract on Breast Cancer Cell Line (MCF7). Journal of breast cancer. 2014; 17(3): 219-25.