اثر انجماد شیشه ای روی میزان بلوغ و فراساختار اووسیت‏های بالغ شده انسانی در محیط آزمایشگاه

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی، دانشکده پزشکی، گروه آناتومی و بیولوژی سلولی، یزد، ایران

2 دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، مرکز تحقیقات بیولوژی سلولی، تهران، ایران

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه ارزیابی احتمالی اثرات انجماد شیشه‏ای روی میزان بلوغ و فراساختار اووسیتهای بالغ شده انسانی در محیط آزمایشگاه است. مواد و روش‏ها   : در این مطالعه از 292 تخمک نابالغ مرحله وزیکول زاینده  و متافاز I به‏دست آمده از بیماران نابارور استفاده شد. تخمک‏ها به دو گروه تقسیم شدند: 1- تخمک‏های نابالغ مرحله وزیکول زاینده  (تعداد=145) 2- تخمک‏های نابالغ مرحله متافازI (تعداد=147). تخمک‏ها ابتدا منجمد شده و سپس ذوب و بالغ شدند. به‏علاوه از 10 عدد تخمک بالغ شده به‏صورت In vivoبه‏عنوان کنترل استفاده شد. محیط بلوغ شامل Ham’s F10 به همراه FSH و LH و مایع فولیکولی بود. بعد از 36 ساعت تخمک‏ها از لحاظ بلوغ و فراساختار مورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج : میزان زنده ماندن و دژنراسیون تخمک‏ها در گروه متافاز I نسبت به گروه وزیکول زاینده  کاهش معنی‏داری داشت. اما میزان بلوغ تخمک‏ها بین دو گروه تفات معنی‏داری نداشت (06/0p<). به‏علاوه میزان توقف بلوغ تخمک‏ها بین دو گروه به‏طور معنی‏داری بالاتر بود. از نظر فراساختاری تعداد گرانول‏های قشری در هر دو گروه  به‏طور قابل ملاحظه ای کاهش یافت. همچنین واکوئل و تجمعات کوچکی از میتوکندری و شبکه اندوپلاسمیک صاف درون سیتوپلاسم اووسیت‏ها دیده شد. نتیجه گیری : فرآیندهای انجماد و ذوب منجر به تغییرات فراساختاری در نواحی خاصی از اووسیت می‏شوند و احتمالا کاهش توانایی بلوغ اووسیت‏های منجمد شده می‏تواند مربوط به این تغییرات باشد.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

انجماد اووسیت ممکن است یک جایگزین مهم برای نگه‏داری باروری در خانم‏هایی باشد که نیاز به تعویق انداختن استفاده از گامت‏های خود به‏دلایل مختلف از جمله داشتن  IVF های ناموفق, وقوع سندرم تحریک بیش از حد تخمدان (OHSS) یا ناتوانی در بدست آوردن اسپرم در روز انجام لقاح هستند و نهایتا یک انتخاب برای خانم‏های بارور جهت نگه‏داری گامت‏های آن‏ها حتی بعد از اثرات فیزیولوژیک افزایش سن باشد (1). به‏علاوه انجماد اووسیت‏های انسانی یک جایگزین منطقی برای حل مشکلات اخلاقی و مذهبی است که برای انجماد جنین وجود دارد و بدون شک کمک موثری برای تکنولوژی‏های تولید مثل است. هر چند که بر خلاف جنین، انجماد اووسیت بالغ سخت است و این به خاطر تفاوت نفوذپذیری غشای اووسیت و جنین، وجود دوکهای میوزی و نهایتا شرایط فیزیولوژیک مخصوص اووسیت است (2). اخیرا پیشرفت‏های قابل ملاحظه ای در بهبود تکنیک‏های انجماد اووسیت صورت گرفته و نتیجه آن حاملگی و تولد زنده بوده است (3). اووسیت بالغ یکی از بزرگترین سلول‏های بدن به اندازه تقریبی 130 میکرومتر است و نسبت پایین سطح به حجم اووسیت سبب کارآیی کمتر تبادل آب و ضدیخ محافظ انجماد می‏شود و نتیجه اجتناب ناپذیر این است که اووسیت بیشتر مستعد نگه‏داری آب و در نتیجه تخریب به‏دلیل ایجاد کریستال‏های یخ در زمان انجماد است (4). به‏علاوه نتایج نشان داده است که غشای اووسیت‏های بالغ دارای یک ترکیب لیپیدی متفاوت در مقایسه با اووسیت‏های نابالغ بوده و نسبت به کاهش درجه حرارت و آسیب‏های ناشی از سرما دارای مقاومت کمتری هستند (4). بنابراین با انجماد اووسیت‏های نابالغ می‏توان بر این مشکلات غلبه نمود. نتایج نشان داده که20 درصد تخمک‏های به‏دست آمده طی تحریک تخمدان، نابالغ بوده و در مراحل پایین‏تر بلوغ مثلا در نظیر مرحله Germinal Vesicle (GV)   یا Metaphase I (MI) قرار دارند، لذا می‏توان با انجماد و بلوغ آزمایشگاهی (IVM)In Vitro Maturation  در صورت ناموفق بودن درمان از آن‏ها استفاده کرد که این عمل دارای مزایای بی‏شماری از جمله کاهش هزینه‏های درمانی، جلوگیری از عوارض نامطلوب تحریک بیش از حد تخمدان در بیماران دارای سندرم پلی کیستیک تخمدانی (5) و یا حفظ باروری در بیماران سرطانی می‏باشد (6). از عدم مزایای انجماد اووسیت‏های نابالغ نیاز به بلوغ آن‏ها بعد از ذوب است و باید توجه داشت که  در این راستا حاملگی‏های اندکی در انسان گزارش شده است (7). Chian و همکاران (8) حاملگی و تولدهای زنده ای را با استفاده از اووسیت‏های IVM شده انسانی گزارش کردند.  بنابراین این تکنولوژی ممکن است برای بیماران و مطالعه انجماد اووسیت‏های نابالغ مفید باشد.  Cao و همکاران (9) نشان داده‏اند که تفاوتی بین میزان زنده ماندن اووسیت‏های انسانی بالغ و نابالغ منجمد شده وجودندارد، هرچند که توانایی بالغ شدن بلوغ اووسیت‏های نابالغ منجمد شده کاهش می‏یابد. مکانیسم انجماد مسئول میزان زنده ماندن یا بهبود بعد از ذوب و همچنین آسیب‏های فراساختاری است که توسط آن ایجاد می‏شود. ساختارهایی که عمدتا درگیر می‏شوند عبارتند از: 1- غشا 2- اسکلت سلولی 3- زوناپلوسیدا. دو روش انجماد در واحدهای IVF در دسترس می‏باشد که عبارتند از 1- انجماد آهسته (Slow Cooling) 2- انجماد سریع (Vitrification) (4).

تخمک و جنین در طی انجماد دچار صدمات مورفولوژیکی و عملکردی می‏شوند، میزان صدمه به فاکتورهائی چون اندازه، شکل، نفوذپذیری،کیفیت و حساسیت تخمک و جنین بستگی دارد. همه این عوامل به میزان زیاد در هر گونه بسته به نوع گونه، مرحله تکاملی و روش بلوغ آزمایشگاهی یا درون تنیin) vitroیا in vivo ) متفاوت می‏باشد (10). ارزیابی مورفولوژی تخمک در بررسی تکامل جنین می‏تواند موثر باشد (11). در طی بلوغ تخمک هرنوع نقصی که در بلوغ سیتوپلاسمی وجود داشته باشد، می‏تواند تکوین جنینی را تحت تاثیر قرار داده حتی اگر تخمک بلوغ هسته ای طبیعی داشته باشد (12). امروزه متداول‏ترین روش ارزیابی مورفولوژیکی اووسیت میکروسکوپ نوری می‏باشد، ولی این روش جهت تشخیص صلاحیت لقاح و تکامل اووسیت روش کافی نمی‏باشد (13). لذا تکنیک‏های میکروسکوپ الکترونی از آن جهت که می‏توانند اطلاعات وسیعی را از فراساختار سلول و ارگانل‏های آن فراهم نمایند بسیار ارزشمند است (14). تغییرات فراساختاری گرانول‏های قشری، زوناپلوسیدا و سیتوپلاسم اووسیت‏های انسانی که در معرض آب‏گیری و آب‏دهی مجدد قرار گرفتند گزارش شده است و این نشان‏دهنده اینست که میکروسکوپ الکترونی  می‏تواند خط اول ابزار مورد بررسی باشد (15). هرچند که مطالعات جامع روی اووسیت‏های انسانی فریز شده اندک است و مدارک مربوط به تعیین کیفیت اووسیت‏های انسانی منجمد شده با استفاده از فرا ساختار اخیرا گزارش شده است (16، 17 و 18). با استفاده از میکروسکوپ الکترونی انتقالی (Transmission Electron Microscopy) نشان داده شده است که گرانول‏های قشری اووسیت‏های بالغ و نابالغ انسانی که با استفاده از PrOH و سوکروز فریز منجمد می‏شوند گرانول‏های قشری آن‏ها کاهش یافته و درون سیتوپلاسم آن‏ها واکوئل‏هایی ظاهر می‏شود که احتمالا به‏خاطر تخریب ارگانل‏های سیتوپلاسمی است (19). در مطالعه‏ای (20) نشان داده شدکه میزان بلوغ اووسیت‏های نابالغ مرحله MI بیشتر از اووسیت‏های نابالغ مرحله GV است. به‏علاوه در همین مطالعه با استفاده از TEM نشان داده شد مشخص شد که تعداد کمپلکس‏های میتوکندری و شبکه اندوپلاسمی اووسیت‏های نابالغ مرحله GV در مقایسه با اووسیت‏های نابالغ مرحله MI بعداز بلوغ در محیط کشت افزایش می‏یابد. با توجه به اینکه انجماد سریع دارای مزایای بیشتری نسبت به انجماد آهسته است (21)، هدف از این مطالعه اثر انجماد سریع روی بلوغ و فراساختار تخمک‏های نابالغ انسانی که در مرحله GV و MI قرار دارند را بعد از انجام IVM می‏باشد.

مواد و روش‏ها

در این مطالعه بنیادی- کاربردی از 292 عدد تخمک انسانی به‏دست آمده از بیماران  مراجعه کننده به مرکز تحقیقاتی درمانی ناباروری یزد استفاده شد. سن بیماران  بین 20 تا 40 سال بود. تخمک‏ها در گروه‏های زیر مورد مطالعه قرار گرفتند:

1)    گروه کنترل: در این گروه فراساختار تخمک‏های بالغ شده انسانی به‏صورت In-vivo در 10 مورد بررسی شد.

2)    گروه IVM شده بعد از عمل انجماد: گروه GV بلوغ یافته در آزمایشگاه: این گروه شامل 145 عدد تخمک نابالغ انسانی  در مرحله GV بود که بعد از انجام IVM   میزان بلوغ  و فراساختار آن‏ها مورد ارزیابی قرار گرفت.

3)    گروه IVM شده بعد از عمل انجماد: گروه MI بلوغ یافته در آزمایشگاه: این گروه شامل 147 عدد تخمک نابالغ انسانی در مرحله MI بود که بعد از انجام IVM   میزان بلوغ  و فراساختار آن‏ها مورد ارزیابی قرار گرفت.

 

روش تهیه نمونه

الف) پروتکل تحریک تخمدان: برای تحریک تخمدان از Long Protocol استفاده شد (20). بدین ترتیب که از روز 21 سیکل قبلی تحت درمان با 5/0 میلی‏لیتر بوسرلین به‏صورت زیر جلدی قرار گرفتند و با شروع سیکل بوسرلین به 25/0 میلی‏لیتر کاهش یافت. از روز دوم سیکل بیماران 150 تا 225 واحد FSH دریافت کردند و از روز هشتم سیکل تحت سونوگرافی واژینال قرار گرفتند. دوز FSH بر اساس سونوگرافی تنظیم شد. زمانی‏که حداقل دو فولیکول با قطر بالای 18 میلی‏متر وجود داشت، بیماران 10000 واحد HCG دریافت کردند و 36 ساعت بعد جمع آوری تخمک‏ها زیر بی‏هوشی عمومی و با استفاده از سونوگرافی واژینال انجام شد. تخمک‏های جمع آوری شده با استفاده از 80 واحد هیالورونیداز (Sigma Co, USA) و پیپتینگ از سلول‏های کومولوس جدا شدند. تخمک‏هایی که در مرحله GV و MI بودند جهت این مطالعه استفاده شدند و آن‏هایی که در مرحله MII بودند برای ICSI استفاده شدند. تنها تخمک‏های مرحله MII از سیکل‏های لغو شده جهت گروه کنترل استفاده شد. ارزیابی تخمک‏ها با استفاده از استریو میکروسکوپ (Olympus Co, Japan) انجام شد.

  آماده سازی مایع فولیکولی: آماده سازی مایع فولیکولی مطابق روشی که قبلا توسط Kim و همکاران (22) گزارش شد تهیه گردید. بعد از جدا سازی اووسیت‏ها از مایع فولیکولی، مایع با دور  RPM 3500 و به‏مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. پس از این مرحله سلول‏های گرانولوزا و خونی در لوله ته نشین شدند. سپس مایع فولیکولی خالص جهت غیرفعال کردن درون بن ماری به‏مدت 30 دقیقه در دمای 56 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد و در نهایت با فیلتر 22/0 میکرومتر فیلتر شد.

بلوغ آزمایشگاهی: تخمک‏های نابالغ بعد از انجماد و ذوب برای رسیدن به بلوغ، وارد محیط IVM (2 تا 3 عدد تخمک درون یک قطره 50 میکرو لیتر) نموده، به‏مدت 36 ساعت درون انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‏گراد، CO2 6 درصد و رطوبت بالا قرار گرفتند. محیط IVM شامل Ham’s F10 (Biochrom Co, Germany) غنی شده با FSH&LH (Ferring Co, Germany ) و 40 درصد مایع فولیکولی بود. بعد از گذشت زمان مذکور جهت بررسی بلوغ تخمک‏ها از استریومیکروسکوپ استفاده شد. ملاک ارزیابی بلوغ وجود اولین جسم قطبی بود.

روش انجام انجماد شیشه ای: ابتدا تخمک‏ها را به‏مدت 10 دقیقه درون محلول تعادل که شامل 5/7 درصد اتیلن گلیکول (Merck Co, Germany) و 5/7  درصد دی متیل سولفوکساید (Merck Co, Germany) درون محیط Ham’s F10 غنی شده با 20 درصد آلبومین سرم انسانی (Plasbumin Co, USA) است قرار گرفت. سپس آن‏ها را به‏مدت 45 تا60 ثانیه وارد محلول Vitrification که شامل 15 درصد اتیلن گلیکول (Merck Co, Germany) ، 15 درصد دی متیل سولفوکساید (Merck Co, Germany) و 5/0 مول ساکارز (Sigma Co, USA) درون محیط Ham’s F10 غنی شده با 20 درصد آلبومین سرم انسانی (Plasbumin Co, USA) است شد. بعد از گذشت زمان مذکور تخمک‏ها را به روی Cryotop منتقل کرده و جهت ذخیره درون نیتروژن مایع قرار دادیم.

برای ذوب کردن تخمک‏ها ابتدا آن‏ها درون محلولHam’s F10 حاوی 20 درصد آلبومین سرم انسانی و یک مول ساکارز به‏مدت یک دقیقه قرار داده شد و سپس جهت آب‏دهی تخمک‏های ذوب شده، آن‏ها را به‏مدت 3 تا 5 دقیقه به‏ترتیب درون محلول Ham’s F10 حاوی 20 درصد آلبومین سرم انسانی با 5/0 و 25/0 مول ساکارز قرار گرفت. در نهایت تخمک‏ها برای 3 تا 5 بار درون  محلول Ham’s F10 حاوی 20 درصد آلبومین سرم انسانی پی‏پت شدند. بعد از این مرحله تخمک‏ها وارد محیط IVM شده و درون انکوباتور قرار گرفتند (23). بعد از گذشت یک ساعت زنده بودن تخمک‏ها مورد ارزیابی قرار گرفت (24) و آن‏هایی‏که دارای سیتوپلاسم تیره و شدیدا گرانوله بودند از مطالعه خارج و بقیه مجددا درون انکوباتور قرار گرفتند.

مطالعه میکروسکوپ الکترونی ترانس میشن (TEM):جهت مطالعه با  TEM از هر گروه 10 عدد اووسیت انتخاب شد. مراحل کار طبق روشی که قبلا توسط Nottola و همکاران (25)  توضیح داده شد صورت گرفت. نخست اووسیت‏ها در گلوتار آلدئید ٥/1 درصد به‏مدت 3 تا 5 روز در دمای 4 درجه سانتی‏گراد فیکس اولیه شدند، سپس با بافر فسفات 1 /٠ مولار به‏مدت سی دقیقه (سه تعویض) شستشو شده و وارد آگارز 1 درصد کردیم. بعد با استفاده از تترااکسید اسمیوم ١ درصد فیکس ثانویه شده مجددا تحت شستشو به روش فوق قرارگرفتند. جهت آبگیری از غلظت‏های فزاینده استون (50 تا 100) در صد هر یک به‏مدت 30 دقیقه استفاده شد. سپس نمونه‏ها درون محلول ترکیبی Aceton-Resin به‏ترتیب نسبت‏های (١-٠، ٣-١، ١-١، ١-٣)  در روتاتور رزین دهی یا Infiltration  شدند. سپس نمونه‏ها را بااستفاده از رزین812 Epon قالب گیری شده و درون کوره با درجه حرارت ٦٠ درجه سانتی‏گراد به‏مدت ٢٤ ساعت قرار گرفتند تا رزین پلیمریزه شود. در ادامه برش‏های Semi-thin (ضخامت 1 میکرو متر) تهیه کرده و بعد از رنگ آمیزی با تولوئیدن (Toluidine blue) آن‏ها را زیر میکروسکوپ نوری مشاهده کردیم. سپس برش‏های (60 تا 80 نانومتر) را با استفاده از تیغه الماسی تهیه و بر روی گرید قرار داده و آن‏ها را با Uranyl acetate به‏مدت 7 دقیقه وLead citrate به‏مدت 13 دقیقه رنگ آمیزی شد و با استفاده از میکروسکوپ TEM مورد ارزیابی قرار گرفت (Germany Zeiss) .

رعایت اصول اخلاقی پژوهش

این مطالعه با کسب رضایت نامه از بیماران و تصویب در کمیته اخلاق مرکز تحقیقاتی درمانی ناباروری یزد انجام شد.

آنالیز آماری

میزان زنده ماندن، بلوغ، دژنراسیون و توقف تخمک در بین گروه‏ها با استفاده ازChi-squared  و میزان پارتنوژنزیس تخمک با استفاده از Fisher-exact test محاسبه و مقایسه شدند. همچنین سطح معنی‏داری کمتر از 05/0 در نظر گرفته شد. (05/0P<). آنالیز آماری با استفاده از نرم افزار SPSS (version 16, USA) انجام شد.

نتایج

همان‏طور که در جدول 1 نشان داده شده است تفاوت معنی‏داری در علل ناباروری در دو گروه مشاهده نشد. در گروه GV 3/48 درصد و در گروه MI 69/51  درصد از ناباروری‏ها مربوط به فاکتور زنانه بود. فاکتور مردانه در گروه GV 19/49  درصد و در گروه MI 8/50 درصد بود. ناباروری مربوط به هر دو فاکتور در دو گروه GV و MI مورد بررسی قرار گرفت که و به‏ترتیب54 و 46 درصد در گروه  GV و MI بود. همان‏طور که در جدول 2 نشان داده شده است در گروه GV 127 تخمک از 145 تخمک بعد از ذوب زنده ماندند (58/87 درصد) و در گروه MI 108 تخمک از 147 تخمک بعد از ذوب زنده ماندند (46/73 درصد) که بین دو گروه تفاوت معنی‏داری داشت (003/0p<).  میزان دژنراسیون (004/0p<) و توقف تخمک‏ها (04/0p<) در بین دو گروه تفاوت معنی‏داری داشت. اما در میزان بلوغ و پارتنوژنزیس تخمک‏ها بین دو گروه تفاوت معنی‏داری مشاهده نشد.

 

 

جدول 1: مشخصات علل ناباروری در دو گروه GV و MIدر 292 تخمک.

 

علل ناباروری

GV )n= (145

MI )n=  (147

P-value

فاکتور زنانه

57 (3/48)

(69/51)61

0/72

فاکتور مردانه

(19/49)61

(8/50)63

0/89

هردو

(54)27

(46)23

0/5

 

اعداد داخل پرانتز درصد را نشان می دهند.

 

 

جدول 2:. میزان بلوغ, دژنراسیون, پارتنوژنزیس و Arrest را در دو گروه GV وMIنشان می دهد.

 

متغیرها

GV )n= (145

MI )n=  (147

P-value

میزان زنده ماندن

 (58/87) 127

 (46/73) 108

٭٭003/0

بلوغ

(45/46)59

(25/34)37

06/0

دژنراسیون

(79/37)48

(48/56)61

٭٭004/0

پارتنوژنزیس

(78/.)1

(77/2)3

34/0

Arrest

(96/14)19

(48/6)7

٭04 /0

 

اعداد داخل پرانتز درصد را نشان می دهند.

*تفاوت معنی داری بین گروههای GV و MI بعد از عمل انجماد و بلوغ  را نشان می دهد.( *05/0 P<  و  **01/0 P<).

 

 

 

بررسی فراساختار تخمک‏های بالغ شده به صورت In vivo

لایه شفاف از مواد فیبری الکترون متراکم تشکیل شده و به‏طور کامل اووسیت را احاطه کرده است (شکل‏های a2a,1).

فضای دور زرده ای (PVS) بین لایه شفاف و غشای اووسیت مشاهده می‏شود. (شکل a2). غشای پلاسمایی در تمام اووسیت‏ها  ممتد و میکروویلی‏های فراوانی دارد که به PVS کشیده شده اند (شکل a2). گرانول‏های قشری گرد و الکترون متراکم بوده و به‏صورت یک لایه در زیر غشای پلاسمایی مرتب شده اند (شکل a2) . ارگانول‏های سلولی در سرتاسر سیتوپلاسم

 

پراکنده شدند. از عمده‏ترین ارگانول‏های سلولی تجمعات شبکه اندوپلاسمی صاف  احاطه شده توسط میتوکندری‏ها است (شکل a3). همچنین وزیکول‏های کوچکی از شبکه اندوپلاسمیک صاف که توسط میتوکندری‏ها احاطه شده اند به‏طور پراکنده دیده می‏شوند (شکل a3). میتوکندری‏ها عمدتا کروی یا بیضی شکل هستند. تیغه‏های میتوکندری‏ها قوسی شکل یا عرضی بوده و در محیط میتوکندری و به موازات غشای خارجی میتوکندری می‏باشند (شکل a3).

بررسی فراساختار تخمک‏های نابالغ مرحله GV بعد از انجماد و بلوغ

همان‏طور که در شکل‏های b1 و b2 دیده می‏شود بخش درونی لایه شفاف نسبت به بخش برونی آن الکترون متراکم‏تر بوده و این مربوط به آزاد شدن زود رس گرانول‏های قشری می‏باشد. گرانول‏های قشری گرد و الکترون متراکم بوده و  تعداد آن‏ها کاهش یافته است (شکل‏های b1 و b2). تجمعات کوچکی از

شبکه اندوپلاسمیک صاف و میتوکندری‏ها دیده می‏شوند که به‏طور تصادفی در سرتاسر سیتوپلاسم پراکنده شده اند (شکل b3). کمپلکس‏های بزرگ و متعددی از وزیکول‏های شبکه اندوپلاسمیک صاف و میتوکندری‏ها درون سیتوپلاسم دیده می‏شوند (شکل‏های c3). همچنین واکوئل‏هایی درون سیتوپلاسم دیده می‏شوند که خالی بوده و اغلب توسط غشای گسسته ای احاطه شده اند (شکل b2). گاهی وقت‏ها لیزوزوم‏های ثانویه با این واکوئل‏ها همراه می‏شوند (شکل b2). فراساختار غشای پلاسمایی، میکروویلی‏ها و PVS مانند گروه کنترل می‏باشد (شکل b2).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1: گروه کنترل (a)، گروه GV بعد از IVM (b)، گروه MI بعد ازIVM  (c). فراساختار و Microtopography ارگانلها درون سیتوپلاسم اووسیت را نشان می دهد. بخش درونی زونا پلوسیدا در گروه GV و MI دارای تراکم الکترونی بالاتری نسبت به گروه کنترل است. . O=oocyte; ZP= zona pellucid; m= microvilli; CG= cortical granules .

 

 

بررسی فراساختار تخمک‏های نابالغ مرحله MI بعد از انجماد و بلوغ

همان‏طور که در شکل‏های c1 و c2 دیده می‏شود بخش درونی لایه شفاف نسبت به بخش برونی آن الکترون متراکم تر بوده و این مربوط به آزاد شدن زود رس گرانول‏های قشری می‏باشد. گرانول‏های قشری گرد و الکترون متراکم بوده و  تعداد آن‏ها کاهش یافته است (شکل c2). میکروویلی‏ها اندک بوده و به‏طور پراکنده بر روی غشای پلاسمایی دیده می‏شوند (شکل c2). تجمعات کوچکی از شبکه اندوپلاسمیک صاف و میتوکندری‏ها دیده می‏شوند که به‏طور تصادفی در سرتاسر سیتوپلاسم پراکنده شده اند (شکل d3). همچنین واکوئل‏هایی درون سیتوپلاسم دیده می‏شوند که خالی بوده و اغلب توسط غشای گسسته ای احاطه شده اند (شکل c2). گاهی وقت‏ها لیزوزوم‏های ثانویه با

این واکوئل‏ها همراه می‏شوند (شکل d2).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل2: گروه کنترل (a)، گروه GV بعد از IVM (b)، گروه MI بعد ازIVM  (c, d). گرانولهای قشری به صورت یک لایه ممتد زیر غشای پلاسمایی اووسیت دیده می شوند (پیکانها) (a). اما در گروه GV و MI گرانولهای قشری اندک بوده و یک لایه منقطع را تشکیل می دهند (b, c). میکروویلیها متعدد و بلند بوده و به صورت یکنواخت دیده می شوند (a, b). اما در گروه c میکروویلیها اندک و کوتاه است. واکوئلها در گروه GV وMI دیده می شوند که بعضی وقتها با لیزوزوم همراه هستند (b, d).

ZP= zona pellucida; mv= microvilli; CG= cortical granules; PVS= perivitelline space; V=vacoule; LY=lysosome.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 3: گروه کنترل (a)، گروه GV بعد از IVM (b, c)، گروه MI بعد ازIVM  (d). میتوکندریها معمولا گرد بوده و حاوی کریستاهای محیطی یا عرضی هستند (a-d). گاهگاهی میتوکندریهای دمبل مانند که احتمالا میتوکندریهای در حال تقسیم هستند در سیتوپلاسم اووسیت دیده می شوند. (پیکان) (d). به کمپلکسهای بین میتوکندیها و وزیکولهای شبکه اندوپلاسمیک صاف توجه کنید. مخصوصا در گروه GV که بزرگ و متعدد هستند. (پیکانها) (a-c). تجمعاتی از شبکه اندوپلاسمیک صاف که توسط میتوکندریها احاطه شده اند دیده می شوند. (a, b, d). در شکل 3d  پیکان سیاه نشان دهنده گرانول قشری در حال مهاجرت است.  SER= smooth endoplasmic reticulum; M= mitochondria.

 

 

 

 

 

 

بحث

مطالعه حاظر به‏منظور ارزیابی اثرات انجماد شیشه ای روی زنده ماندن، بلوغ و فراساختار اووسیت‏های نابالغ انسانی مرحله GV و MI که از سیکل‏های IVF به‏دست آمده بودند انجام شد. منجمد کردن اووسیت یک روش حفظ باروری در خانم‏ها است. هر چند

که میزان حاملگی اندک و تعداد محدودی تولد زنده از اووسیت‏های منجمد شده گزارش شده است (26). یکی از مشکلاتی که در مورد انجماد اووسیت‏های بالغ انسانی وجود دارد مقاومت کمتر  غشای این اووسیت‏ها نسبت به کاهش درجه حرارت و آسیب‏های ناشی از سرما به‏دلیل داشتن ترکیب لیپیدی

متفاوت در مقایسه با اووسیت‏های نابالغ است (4). بنابراین با انجماد اووسیت‏های نابالغ می‏توان بر این مشکل غلبه کرد. به‏علاوه با انجماد اووسیت‏های نابالغ می‏توان باروری را در بیماران سرطانی بدون تاخیر در درمان آن‏ها و مشکلات ناشی از آن حفظ کرد (27). در این مطالعه نشان داده شد که 58/87  اووسیت‏های مرحله GV و 46/73 درصد اووسیت‏های مرحله MI  بعد از انجماد زنده ماندند که بین دو گروه تفاوت معنی‏داری را نشان داد. میزان بلوغ بین اووسیت‏های GV و MI تفاوت معنی‏داری را نشان نداد هرچند که در گروه GV میزان بلوغ بالاتر بود (25/34 درصد vs  45/46 درصد). اما میزان  دژنراسیون (48/56 vs 79/37) و توقف (48/6 vs 96/14) بین اووسیت‏های مرحله GV و MI تفاوت معنی‏داری داشتند. این نتایج نشان می‏دهد که مرحله بلوغ اووسیت نقش مهمی در آسیب ناشی از انجماد دارد و با توجه به اینکه  دوک‏های میوزی به کاهش درجه حرارت و ضدیخ‏ها مواد محافظ انجماد حساسیت بالایی دارند (28)، لذا انجماد اووسیت‏های نا بالغ مرحله GV نسبت به مرحله MI برتری دارد. مطالعات قبلی نشان دادند که 16 تا 43 درصد اووسیت‏های به‏دست آمده از تخمدان‏های تحریک نشده بعد از انجماد زنده ماندند و بین 20 تا 58 درصد از آن‏ها در محیط IVM بالغ شدند (29). Son و همکاران (30)  گزارش کردند که 1/55 درصد از اووسیت‏های نابالغ انسانی بعد از انجماد و ذوب زنده ماندند و میزان بلوغ، لقاح و کلیواژ  به‏ترتیب 3/59 درصد، 9/42 درصد و 7/16 درصد بود. میزان زنده ماندن و بلوغ در مطالعه ما مشابه با نتایج Son و همکاران نیست. این تفاوت می‏تواند به‏علت استفاده  از سرعت بالای انجماد به‏منظور غلبه بر حساسیت بالای اووسیت به کاهش درجه حرارت و محیط IVM باشد. Toth و همکاران (31) میزان زنده ماندن 3/83 درصد برای اووسیت‏های انسانی منجمد شده در مرحله GV نشان دادند که مشابه نتایج ما است. Cao و همکاران (9) انجماد اووسیت‏های نابالغ مرحله GV که از بیماران با تخمدان پلی کیستیک به‏دست آمده بود را گزارش کردند. آن‏ها میزان زنده ماندن و بلوغ اووسیت‏ها را بعد از ذوب به‏ترتیب 4/85 درصد و 4/50 درصد نشان دادند که یافته‏های ما آن‏را تایید می‏کند، اما میزان بلوغ اووسیت‏های نابالغ در مطالعه ما کمتر از آن‏ها بود. تفاوت میزان بلوغ در مطالعات مختلف به فاکتورهایی نظیر ترکیب محیط کشت، منبع تهیه اووسیت (سیکل‏های تحریک شده یا بدون تحریک) و حضور یا عدم حضور سلول‏های کومولوس بستگی دارد (30). از نظر فیزیولوژی حضور سلول‏های کومولوس در طول انجماد به‏خاطر بهبود در میزان بلوغ اووسیت بعد از ذوب مفید است (32). هرچند که Minasi و همکاران (33) اظهار کردند که وجود سلول‏های کومولوس در زمان انجماد اووسیت‏های بالغ اثر مفیدی روی صلاحیت تکاملی آن‏ها ندارد. مطالعاتی که توسط Ambrosini و همکارانش (34) صورت گرفت حاکی از آن بود که قرار گرفتن اووسیت در معرض ضدیخ‏ها مواد محافظ انجماد باعث فعال شدن پدیده بکرزایی در اووسیت‏های جانوری می‏شود. اما مطالعات اندکی در زمینه انسانی صورت گرفته است. در این مطالعه مشاهده شد که درصد بکرزایی در اووسیت‏های منجمد شده مرحله MI سه برابر اووسیت‏های مرحله GV  است که به‏نظر می آید مرحله بلوغ اووسیت  در فعال کردن بکرزایی نقش دارد.

مطالعات فراساختاری نشان دادند که انجماد سبب کاهش تعداد گرانول‏های قشری در اووسیت‏های بالغ انسانی می‏شود (19 و 25). در این مطالعه ما نشان دادیم که تعداد گرانول‏های قشری اووسیت‏های نابالغ انسانی فریز شده بعد از بلوغ در محیط کشت کاهش می‏یابد. در یک مطالعه انسانی نشان داده شده است که فرآیند انجماد سبب کاهش تعداد گرانول‏های قشری در ناحیه قشری و ظهور واکوئل‏ها در سیتوپلاسم اووسیت‏های بالغ و نابالغ می‏شود که ممکن است نشان دهنده آسیب ساختاری به آن‏ها باشد و نتایج ما آن‏ها را تایید می‏کند (19). اگزوسیتوز زودرس گرانول‏های قشری در اووسیت‏های انسانی که در معرض  PrOH و یا DMSO قرار گرفتند نشان داده شده است (35). اگزوسیتوز زودرس محتویات گرانول‏های قشری به‏داخل PVS منجر به سخت شدن زوناپلوسیدا می‏شود که می‏تواند مانع نفوذ اسپرم در هنگام لقاح شود که با روش ICSI می‏توان بر این مشکل غلبه کرد (36). در این مطالعه نشان داده شد که بخش درونی زوناپلوسیدا الکترون متراکم‏تر است و این می‏تواند توجیه کننده کاهش تعداد گرانول‏های قشری به‏علت اگزوسیتوز زودرس در طول انجماد و ذوب باشد. تغییرات فراساختاری مشاهده شده در زوناپلوسیدا مشابه با مطالعات قبلی است (18 و 25). واکوئل‏های متعددی که در این مطالعه درون سیتوپلاسم اووسیت‏های فریز شده دیده شد ممکن است نشانه آسیب ساختاری به این اووسیت‏ها در اثر انجماد باشد. ظهور واکوئل‏ها در اووسیت‏های انسانی منجمد شده، یک واکنش غیر اختصاصی اوسیت به سرما و یا استرس ناشی از فشار اسمزی است (25). واکوئل‏های متعدد در سیتوپلاسم اووسیت‏های انسانی ممکن است در اثر تورم و ادغام وزیکول‏های جدا شده از شبکه اندوپلاسمیک صاف ایجاد و به‏عنوان یک فرآیند دژنراتیو در نظر گرفته شوند (37). این نظریه با همراهی واکوئل، لیزوزوم و اجسام چند حفره‏ای (Multivesicular Bodies) در سیتوپلاسم اووسیت‏های منجمد شده بیشتر تقویت شد (25). اجسام چند حفره ای به‏عنوان یک نوع  هضم ارگانل در نظر گرفته می‏شوند که به فرآیندهای تبادلی که در سطح اووسیت رخ می‏دهد مربوط می‏شوند، در حالی‏که لیزوزوم‏های ثانویه در هضم مواد اووسیتی نقش دارند. هر چند که هر دو ارگانل، به خصوص لیزوزوم‏ها، زمانی‏که همراه واکوئل‏ها هستند به‏عنوان علائم طبیعی دژنراسیون در نظر گرفته می‏شوند (38). بنابراین ظهور واکوئل‏ها در اووسیت‏های بالغ انسانی ممکن است نهایتا منجر به کاهش صلاحیت اووسیت جهت لقاح و یا اختلال تکاملی در مراحل اولیه جنین شوند (39). در این مطالعه نشان داده شد که در همه گروه‏ها اووسیت‏ها توسط یک غشای سالم و ممتد  که حاوی میکروویلی‏های بلند و یکنواخت است احاطه شده اند. هرچند که تعداد میکروویلی‏ها در اووسیت‏های نابالغ مرحله MI در مقایسه با گروه کنترل و GV کاهش یافته بود . میکروویلی‏ها دسته هایی از میکروفیلامانت‏ها هستند که درون اسکلت سلولی قشر اووسیت شاخه شاخه می‏شوند. یکپارچگی مجموعه غشا و اسکلت سلولی می‏تواند توانایی زایگوت را جهت تشکیل جنین تحت تاثیر قرار دهد (40). میتوکندری‏ها به‏عنوان ارگانلی که نقش اساسی در متابولیسم سلولی ایفا می‏کنند شناخته می شوند. شکل، تعداد و پراکندگی میتوکندری‏ها به نیازهای متابولیکی سلول بستگی داشته و به تکثیر و تمایز آن‏ها کمک می کنند. تکثیر و حرکت میتوکندری‏ها در طول دوره رشد اووسیت ضروری است، آن انرژی لازم برای ساخت و ترشح پروتئین و همچنین تبادل مواد بین اووسیت و سلول‏های کومولوس را فراهم می‏کند (41). نشان داده شدکه اندازه تجمعات میتوکندری و شبکه اندوپلاسمیک صاف در گروه فریز نسبت به گروه کنترل کوچکتر است ولی فراساختار میتوکندری‏ها در بین گروه‏ها تفاوتی ندارد. نتایج ما مشابه با یافته‏های قبلی است (18 و 25). پیشنهاد شده است که تغییرات فراساختاری تجمعات میتوکندری و شبکه اندوپلاسمیک صاف در اووسیت‏های فریز شده احتمالا مربوط به استفاده از اتیلن گلیکول در محلول‏های انجماد شیشه‏ای است تا آسیب‏های ناشی از سرما و ممکن است منجر به اختلال در هومئوستازی کلسیم و به‏دنبال آن کاهش میزان لقاح شوند (25). تجمعات میتوکندری و شبکه اندوپلاسمیک صاف به‏عنوان پیش ساز کمپلکس میتوکندری و وزیکول‏های شبکه اندوپلاسمیک در نظر گرفته می‏شوند (42). میتوکندری‏ها و غشاهای سیتوپلاسمیک مرتبط با آن‏ها ممکن است در تولید مواد لازم جهت لقاح و یا ایجاد سریع غشاهای جدید در مراحل اولیه رویان زایی نقش داشته باشند (42). همچنین تجمعات میتوکندری‏ها و شبکه اندوپلاسمیک صاف ممکن است در تنظیم غلظت کلسیم آزاد  و تولید ATP  نقش داشته باشند، بنابراین فعالیت‏های مختلف سلولی، از جمله مسیرهای انتقال سیگنال‏های وابسته به کلسیم را در زمان لقاح

 

تحت تاثیر قرار می‏دهند. در این مطالعه‏، تغییرات فراساختاری در کمپلکس‏های میتوکندری و وزیکول‏های شبکه اندوپلاسمیک صاف در گروه GV مشاهده شد که احتمالا مربوط به طولانی بودن مدت زمان کشت است و می‏تواند به‏طور بالقوه کاهش صلاحیت اووسیت برای لقاح را به خاطر اختلال در هومئوستازی کلسیم توجیه کند.

نتیجه گیری

این مطالعه نشان داد که توانایی بلوغ اووسیت‏های نابالغ انسانی مرحله MI نسبت به مرحله GV به دنبال انجماد کاهش می‏یابد، به‏علاوه اووسیت‏های منجمد شده مرحله MI آسیب‏های فراساختاری شدیدتری را نسبت به گروه GV نشان دادند که این احتمالا مسئول کاهش توانایی بلوغ اووسیت و نشان دهنده آن است که مرحله بلوغ اووسیت نقش مهمی در تعیین آسیب‏های ناشی از فریز دارد. به‏هرحال  با توجه به این‏که انجماد شیشه‏ای تغییرات فراساختاری را در نواحی خاصی از اووسیت ایجاد می‏کند لذا تحقیقات بیشتری باید برروی تکنیک‏های انجماد صورت گیرد.

تشکر و قدردانی

این مقاله نتیجه طرح تحقیقاتی مصوب مرکز تحقیقات بیولوژی سلولی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی به شماره 354م است و نویسنده‏ها مقاله مراتب تقدیر و تشکر خود را از آن مرکز ابراز می‏دارند.

1. Gook DA, Edgar DH. Human oocyte cryopreservation. Hum Reprod Update. 2007; 13(6): 591–605.

2. Gardner DK, Sheehan CB, Rienzi L, Katz-Jafee M , et al. Analysis of oocyte physiology to improve cryopreservation procedures. Theriogenology.  2007; 67: 64–72.

3. Stachecki J. An overview of oocyte cryopreservation. Reprod Biomed Online. 2004; 9(2): 152–63.

4. Rao GD, Tan  SL. In  vitro maturation of oocytes. Semin Reprod Med. 2005; 23(3): 242-247.

5. Reichman DE, Politch J, Ginsburg ES, Racowsky C. Extended in vitro maturation of immature oocytes from stimulated cycles: an analysis of fertilization potential, embryo development, and reproductive outcomes. J of Assist Reprod & Gene. 2010; 27(7): 347-356.

6. Fadini R, Comi R, Renzini MM, Coticchio G, et al. Anti-mullerian hormone as a predictive marker for the selection of women for oocyte in vitro maturation treatment. J of Assist Reprod & Gene. 2011; 28(6): 501-508.

7. Wu J, Zhang L, Wang X. In vitro maturation, fertilization and embryo development after ultrarapid freezing of immature human oocytes. Reprod. 2001; 121(3): 389–93.

8. Chian RC, Buckett WM, Abdul Jalil AK, Son WY, et al. Natural-cycle in vitro fertilization combined with in vitro maturation of immature oocytes is a potential approach in infertility treatment. Fertility & Sterility. 2004; 82: 1675–8.

9. Cao Y, Xing Q, Zhang ZG, Wei Z L, et al.  Cryopreservation of immature and in-vitro matured human oocytes by vitrification. Reprod  BioMed  Online. 2009; 19(3): 369-373.

10. Vajta G, Kuwayama M. Improving cryopreservation systems. Theriogenology. 2006; 65(1): 236-244.

11. Balaban B, Urman B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation. Reprod Biomed Online. 2006; 12(5): 608-615.

12. Eimani H, Hasani F, Haeri Rohani SA, NasrEsfahani MH, et al. Effect of gluthation on Resumption of Meiosis, In Vitro Maturation and Embryo Development of Immature Mouse Oocytes. J Mazandaran Uni Med Sci. 2003; 15(48): 1- 10.

13. Lassalle B, Testart J, Renard JP. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1, 2 propanediol. Fertil Steril. 1985; 44(5): 645-651.

14. Vajta GC, Nagy ZP. Are programmable freezers still needed in the embryo laboratory? Review on vitrification. Reprod Biomed Online. 2006; 12(6): 779-796.

15. Gualtieri R, Iaccarino M, Mollo V, Prisco M, et al. Slow cooling of human oocytes: ultrastructural injuries and apoptotic status. Fertil Steril. 2009; 91(4): 1023-34.

16. Coticchio G, Borini A, Distratis V, Maione M, et al. Qualitative and morphometric analysis of the ultrastructure of human oocytes cryopreserved by two alternative slow cooling protocols. J Assist Reprod Genet. 2010; 27:131-40.

17. Van Blerkom J, Davis PW. Cytogenetic, cellular, and developmental consequences of cryopreservation of immature and mature mouse and human oocytes. Microsc Res Tech. 1994; 27: 165-93.

18. Shahedi A, Hosseini A, Khalili MA, Norouzian M, et al. The effect

 

of vitrification on ultrastructure of human in vitro matured germinal vesicle oocytes. Europe J of Obstet & Gynecol and Reprod Biol. 2013; 167: 69-75.

 

19. Ghetler Y, Skutelsky E, Ben Nun I, Ben Dor L, et al. Huma oocyte cryopreservation and the fate of cortical granoles.Fertil and Steril. 2006; 86: 210-216.

20. Shahedi A, Khalili MA, Soleimani M, Morshedizad S.  Ultrastructure of in vitro Matured Human Oocytes.  Shiraz E Med J. 2013; 15(12): e7379.

21. Paynter SJ. Current status of the cryopreservation of human unfertilized oocytes. Hum Reprod Update. 2000; 6:449–56.

22. Kim BK, Lee SC, Kim KJ, Han CH, et al. In vitro maturation, fertilization, and development of human germinal vesicle oocytes collected from stimulated cycles. Fertil Steril. 2000; 74(6): 1153–8.

23. Al-Hasani S, Ozmen B, Koutlaki N, Schoepper B, et al. Three years of routine vitrification of human zygotes: is it still fair to advocate slow-rate freezing? Reprod Biomed Online. 2007; 14(3): 288-293.

24. Fasano G, Vanin AS, Biramane J, Delbaere A, et al. Cryopreservation of human failed maturation oocytes shows that vitrification gives superior outcomes to slow cooling. Cryobiology. 2010; 61: 243-247.

25. Nottola SA, Coticchio G, Sciajno R, Gambardella A, et al. Ultrastructural markers of quality in human mature oocytes vitrified using cryoleaf and cryoloop. Reprod BioMed Online.

2009; 19:17-27.

26. Yoon TK, Kim TJ, Park SE, Hong SW, et al. Live births after vitrification of oocytes in a stimulated in vitro fertilization-embryo transfer program. Fertil Steril. 2003; 79(6): 1323-6.

27. Huang JY, Tulandi T, Holzer H, Tan SL, et al. Combining ovarian tissue cryobanking with retrieval

of immature oocytes followed by in vitro maturation and vitrification: an additional strategy of fertility preservation. Fertil Steril. 2008; 89: 567–72.

28. Paynter SJ. Current status of the

cryopreservation of human unfertilized oocytes. Hum Reprod Update. 2000; 6(5): 449–456.

29. Mandelbaum J, Junca AM, Plachot M, Alnot M O, et al. Cryopreservation of human embryos and oocytes. Hum Reprod. 1988; 3(1): 117-9.

30. Son WY, Park SE, Lee KA, Lee WS, et al. Effects of 1,2-propanediol and freezing-thawing on the in vitro developmental capacity of human immature oocytes. Fertil Steril. 1996; 66: 995-999.

31. Toth TL, Baka SG, Veeck LL, Jones HW Jr, et al. Fertilization and in vitro development of cryopreserved human prophase I oocytes. Fertil Steril. 1994; 61: 891–894.

32. Hassan HA. Cumulus cell contribution to cytoplasmic maturation and oocyte developmental competence in vitro. J of Assist Reprod and Gene. 2001; 18: 539–43.

33. Minasi MG, Fabozzi G, Casciani V, Ferrero S, et al. Efficiency of slush nitrogen vitrification of human oocytes vitrified with or without cumulus cells in relation to survival rate and meiotic spindle competence. Fertil Steril. 2012; 97(5): 1220–5.

34. Ambrosini G, Andrisani A, Porcu E, Rebellato E, et al. Oocytes cryopreservation: state of ART. Reprod Toxicol. 2006; 22(2): 250-262.

35. Schalkoff ME, Oskowitz SP, Powers RD. Ultrastructural observations of human and mouse oocytes treated with cryopreservatives. Biol Reprod. 1989; 40(2): 379-93.

36. Tao   T, Del  Valle   A. Human    oocyte   and    ovarian   tissue cryopreservation and  its application. J Assist Reprod Gene. 2008; 25(7): 287-296.

37. Gualtieri   R,   Iaccarino M, Mollo V, Prisco M, et al. Slow  cooling of human  oocytes: ultrastructural injuries and apoptotic status. Fertil  Steril. 2009; 91(4): 1023-34.

38. Familiari G, Heyn R, Relucenti M, Nottola SA, et al. Ultrastructural dynamics of human reproduction, from ovulation to fertilization and early embryo development. Int Rev Cytol. 2006; 249: 53-141.

39. Ebner T,  Moser M, Sommergruber M,  Gaiswinkler U, et al. Occurrence and     developmental consequences       of       vacuoles      throughout   preimplantation    development. Fertil  Steril.   2005; 83(6): 1635-40.

40. Palermo  GD, Alikani  M, Bertoli  M, Colombero  LT,  et al. Oolemma    characteristics   in     relation to   survival  and fertilization patterns of oocytes treated  by  intracytoplasmic  sperm  injection.  Hum Reprod. 1996; 11(10): 172-176.

41. Carrell   DT, Moskovtsev   S, Chohan   KR, Peterson  CM. Ovarian   folliculogenesis:   emerging role   of  in   vitro   maturation  of oocytes  and  follicles in clinical practice. Clin Obstet Gynecol.  2003; 46(2): 239-253.

42. Motta PM, Nottola SA, Makabe S, Heyn R. Mitochondrial morphology in human fetal and adult female germ cells. Hum Reprod. 2000; 15 Suppl 2: 129-47.