پاسخ‌های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی گیاه لوبیا (Phaseolus vulgaris L.) به تیمار با نانو ذرات‌ اکسید آلومینیوم

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

دانشکده علوم، دانشگاه بوعلی سینا، گروه زیست شناسی، همدان، ایران

چکیده

هدف: هدف از این پژوهش اثرات نانو ذرات اکسید آلومینیوم بر روی جوانه‌زنی، رشد ریشه، مقدار رنگیزه‌های فتوسنتزی، محتوای پروتئین کل، فعالیت برخی آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانتی و محتوای کربوهیدرات‌ گیاه لوبیا (Phaseolus vulgaris) می‏باشد. مواد و روش‌ها: آزمایش در شرایط کشت گلخانه، به‌صورت کاملا تصادفی با 4 تکرار طراحی شد. گیاهان در معرض غلظت‌های مختلف    (01/0، 5/0 و 1 ) گرم بر لیتر نانو ‌اکسید آلومنیوم‌  قرارگرفتند و ویژگی‏های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاهان تحت تیمار با گیاهان شاهد مقایسه شد . نتایج: بر اساس نتایج به‌دست آمده تیمار با نانو ‌اکسید‌ آلومینیوم اثر مثبتی بر درصد جوانه‌زنی، طول ریشه، محتوای کلروفیل b و کل، محتوای قندهای محلول و نامحلول داشت. کاهش در محتوای کلروفیل a، محتوای پروتئین کل و فعالیت آنزیم کاتالاز در نمونه‌های تحت تیمارها در مقایسه با شاهد مشاهده شد. اثر نانو ‌اکسید ‌آلومینیوم بر سرعت جوانه‌زنی بذر و فعالیت آنزیم پراکسیداز معنی‌دار نبود. نتیجه‌گیری:  بر اساس نتایج بررسی حاضر تیمار با نانو ذرات ‌اکسید ‌آلومینیوم بر بیشتر ویژگی‏های تکوینی و فیزیولوژیک در لوبیا اثر مثبت را نشان داد که بیانگر فقدان اثر مسمومیت نانو ذره مورد مطالعه در غلظت‏های به‏کار رفته است. در مورد برخی از ویژگی‏ها (محتوای کلروفیل a، محتوای پروتئین کل و فعالیت آنزیم کاتالاز) اثر کاهشی مشاهده شد که می‏تواند مربوط به مکانیسم‏های مقاومت در گیاه مورد مطالعه باشد.  

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

نانو ذرات مجموعه­ای از اتم­ها یا مولکول­هایی با ابعاد 1 تا 100 نانومتر هستند که می­توانند خصوصیات فیزیکی و شیمیایی متفاوتی نسبت به درشت مولکول­ها داشته­ باشند (1 و 2). خصوصیات متمایز این ذرات با اندازه کوچک، افزایش سطح ویژه و سطح انرژی آن­ها مرتبط است. ویژگی­های خاص نانو ذرات باعث بهره­برداری از آن­ها در دامنه گسترده­ای از کاربرد در لوازم آرایشی، داروسازی، منسوجات، الکتریسیته، حس‏گرهای زیستی تا کاتالیزورها شده است (3).

استفاده از فناوری نانو در کشاورزی همگام با سایر عرصه­ها در حال گسترش است. عرضه کود­های شیمیایی به‏صورت نانو ذرات به­تازگی مورد توجه قرار گرفته است. نتایج تحقیقات نشان‏دهنده­ی واکنش­های مختلف گیاهان بوده است (4). با بهره­گیری از نانو­کودها عناصر غذایی با سرعتی مناسب و به­طور تدریجی در تمام فصول رشد گیاه آزاد می­شوند. این روند آزادسازی تدریجی، آبشویی عناصر را به­شدت کاهش می­دهد و بنابراین گیاهان قادر به جذب مواد غذایی بیشتری خواهند­ بود. تاکنون از فناوری نانو در کشاورزی، صنایع­غذایی و علوم دامی استفاده­های بسیاری شده است. از جمله ایجاد سیستم­های هوشمند برای پیشگیری و درمان بیماری­های گیاهی و بازیافت ضایعات حاصل از محصولات کشاورزی (5).

امروزه استفاده صنعتی از نانو ذرات نیز به‏سرعت رو­ به افزایش است. نانو­ ذرات آزاد در طبیعت، در تماس مستقیم با بدن انسان هستند و به‏نوعی دارای خطر بالقوه برای سلامتی انسان می‏باشند. گیاهان در معرض محیط­های خاکی، آبی و هوایی هستند. بنابراین نانو ذرات توسط سطوح گیاهی جذب شده، به‏دنبال آن به‏درون گیاه راه یافته و در آن­جا باقی می­مانند و بدین­طریق وارد چرخه غذایی می­شوند (6).

شیوه­ی در معرض قرارگیری با نانو ذرات مسیر ورود به گیاه را تعیین خواهد کرد. جذب اتمسفری نانو ذرات فلزی توسط برگ­ها به اثبات رسیده و توسط فاکتورهای مورفولوژیکی همانند ساختار کرک­ها، وجود هیپودرم و روزنه­ها تحت تاثیر قرار می­گیرد (7). همچنین تارهای­کشنده نقش خود را در جذب ذرات از محیط‏های خاکی و آبی ایفا می­کنند (8). نتایج محدودی درباره‏ی پیامدهای زیستی در ارتباط با جذب نانو ذرات توسط گیاهان وجود دارد و سوالات بسیاری درباره­ی سرنوشت و رفتار نانو ذرات در گیاهان باقی ­مانده­ است (9).

سنجش سمیت نانو ذرات آلومینیوم و سایر اکسیدهای فلزی بر روی نوعی پلانکتون به نام‏های Daphnia (10) و Ceriodaphniadubia (11) وابستگی شدید به غلظت را نشان داد. مطالعه­ای که بر رویCaenorhabditis elegans  برای بررسی سمیت نانو­ ذره آلومینیوم انجام شد، نشان­داد که در معرض قرار گرفتن با نانو ­ذره آلومینیوم به­طور قابل ­توجهی پاسخ‏های استرسی شدید، تولید رادیکال­های آزاد اکسیژن و آسیب­های­اکسیداتیو را القا می­کند (12). همچنین مطالعه بر روی لاین­های سلولی پستانداران، اثر سمیت بر فعالیت­های دهیدروژنازهای میتوکندریایی و لیزوزومی و تشکیل وزیکول­های پیش هسته­ای (perinuclear) در سلول­های CHO-K1 بعد از تیمار با نانو ذرات اکسید ­آلومینیوم و اکسید­ تیتانیوم به‏مدت 24 ساعت را نشان داد (13). شیوه­های متنوعی از عملکردهای درگیر در سمیت القا شده توسط نانو ذرات در جلبک­ها پیشنهاد شده است از جمله: برهم­کنش شیمیایی بین ذرات (14 و 15) و استرس­های اکسیداتیو که باعث مرگ سلولی می­شود (16 و 17) و سمیت یون­ها (18).

هوندریک و سیمون (19) در مطالعه­ای نشان دادند که اکسید تیتانیوم اثرات سمی و ممانعت­کننده­ی رشد بر جلبک سبز Desmodesmns sp. دارد. در تحقیقات دیگر مشخص شد که نانو ذرات روی و اکسید روی مانع جوانه­زنی دانه­هایLolium perenne  و Zea mays می­شوند. در معرض قرارگرفتن دانه رست­های Rhaphanus sativus ، Brassica napus، Lactuca sativa و Cucumis sativus با نانو ذرات اکسید ­روی منجر به از بین رفتن تقریبا کامل ریشه این گیاهان شد (20).

همچنین در تحقیقاتی که بر روی ذرت، خیار و کلم انجام گرفت نانو­ ذره اکسید آلومینیوم مانع رشد ریشه این گیاهان شد. در مقابل نانو ذرات آلومینیوم سبب افزایش رشد ریشه ترپچه شد (21 و 22).

نانو ذرات آلومینیوم رشد، بیوماس و کارایی فتوسنتزی در گیاه Lemna minor را افزایش داد (23). همچنین رمضانی و همکاران (24) هیچ تفاوت معنی‏داری بین گروه شاهد و گروه تیمار شده با نانو ذرات روی-مس از نظر فعالیت آنزیم­های سوپر اکسید­دسموتاز و آسکوربات­دسموتاز در گیاه یونجه مشاهده نکردند.

گیاه مورد استفاده در این پژوهش، لوبیا (رقم شکوفا) با نام علمی Phaseolus vulgaris از تیره Fabaceae بود. تیره حبوبات بعد از تیره کاسنی، تقریبا دومین تیره مهم گیاهان گلدار است که نزدیک به430 جنس و13000گونه دارد (25). این گیاه بومی آمریکاست. گیاهی یک­ساله، قدکوتاه، راست یا پیچنده که گل‏های کوچک، سفیدرنگ، برگ­های سه برگچه­ای و نیام باریک دارند. لگوم­ها ارزش­غذایی بسیار بالایی دارند. آن­ها مواد پروتئینی بسیار بیشتری را نسبت به سایر محصولات گیاهی دارا هستند. کربوهیدرات­ها و چربی­ها نیز در لگوم­ها وجود دارند. پروتئین­ها به­صورت دانه­های آلرون در سلول­های مشابه سلول‏های واجد دانه­های نشاسته دیده می­شوند. محتوای بالای پروتئین در ارتباط با حضور گرهک­های واجد باکتری­های­ تثبیت­کننده نیتروژن در ریشه­های لگوم­ها می­باشد. بقولات همچنین به­عنوان منبع تغذیه­ای برای حیوانات اهمیت دارند که دراین مورد دانه­ها، پوسته میوه­ها و بخش­های سبز آن­ها مورد استفاده قرار می­گیرد. لگوم­ها در سراسر دنیا کاشته می­شوند و به­عنوان غذا و دارو مورد استفاده قرار می­گیرند (26).

با توجه به اینکه در سال‏های اخیر استفاده از نانو ذرات اکسید آلومینیوم استفاده و کاربرد فراوانی در صنایع مختلف پیدا کرده است و آلودگی‏های زیست محیطی احتمالی قابل پیش بینی است، پژوهش حاضر، با هدف بررسی تاثیر محلول­پاشی نانو­ ذره اکسید ­آلومینیوم بر برخی ویژگی­های فیزیولوژیکی و شاخص­های رشد گیاه لوبیا که دارای ارزش غذایی ویژه­ای است، طراحی و اجرا شد.

مواد و روش‏ها

کشت گیاه لوبیا: بذر گیاه لوبیا (Phaseolus vulgaris) رقم شکوفا، از مرکز تحقیقات کشاورزی همدان، در شهریور ماه سال1393 تهیه و در گلخانه پژوهشی دانشگاه بو­علی­سینا همدان، به‏صورت کشت گلدانی در چهار گروه دوازده­تایی کاشته شد. طراحی آزمایش به‏صورت طرح بلوک‏های کاملا تصادفی طرح ریزی شد. گیاهان گروه تیماری با سه غلظت از نانو­ اکسید آلومینیوم شامل 01/0، 5/0 و 1 گرم بر لیتر مورد تیمار قرارگرفت. یک گروه هم به­عنوان شاهد انتخاب شد. بعد از گذشت یک ماه، محلول­پاشی شروع و تا بعد از گلدهی ادامه پیدا کرد. نانو ذرات مورد استفاده در این پژوهش از شرکت پیشگامان مشهد تهیه شد. نانو ­اکسید ­آلومینیوم کاربردی در این پژوهش از نوع گاما، با 9/99 درصد خلوص و ابعاد10 تا20 نانومتر بود (شکل 1).

 

 

 

شکل 1: تصویر ذرات نانو  اکسید ­آلومینیوم (سمت راست) توسط میکروسکوپ SEM و طیف اشعه X  نانو ذرات اکسید ­آلومینیوم

 

 

 

 

 

 

 

سرعت و درصد جوانه­زنی: ابتدا بذرهای سالم و یکنواخت انتخاب و به‏مدت 10 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم 20 درصد قرار داده و ضد عفونی سطحی شدند. سپس بذرها چندین بار با آب مقطر شستشو داده و به­منظور کشت در پتری­ دیش‏های استریل دارای پنبه و کاغذ صافی قرارگرفتند. به­منظور انجام مطالعات آماری برای هر گروه تیماری و گروه شاهد50 بذر در نظر گرفته ­شد. درصد و سرعت جوانه­زنی در هریک از گیاهان مورد تیمار و گروه شاهد طی 7 روز محاسبه و مقایسه شد. خروج ریشه اصلی از بذر به­عنوان زمان شروع جوانه­زنی در نظر گرفته (23) و سپس در صد جوانه زنی بذر­ها Germination Percentage(GP) از رابطه زیر به‏دست آمد:

PG=100(N' /N) (در صد)

N: تعداد کل بذر­ها ، N': تعداد بذر­های جوانه زده می‏باشد.

فرمول سرعت جوانه­زنی (27):

GS= ∑jI ni/Di 

ni تعداد بذرهای جوانه­زده در روزهای شمارش و Di تعداد روز پس از شروع آزمایش.

بذرهایی که طبق روش ذکرشده کشت داده شدند، بعد از 72 ساعت مورد اندازه­گیری طول ریشه قرار­گرفتند. طول ریشه در هر 4 گروه، نسبت به یکدیگر مقایسه شد.

سنجش رنگیزه­های فتوسنتزی: سنجش رنگیزه‏های فتوسنتزی با روش آرنون (28) انجام شد. 1/0گرم برگ تازه گیاه لوبیا را وزن کرده و با 5 میلی­لیتر استون 80 درصد سائیده شد. بعد از یکنواخت شدن، محلول حاصل را به‏مدت 20 دقیقه با سرعت4800 دور در دقیقه با دستگاه سانتریفیوژ مدل 5417R، سانتریفیوژ گردید. درگام بعدی، مجداد 5 میلی­لیتر استون 80 درصد به محلول شفاف رویی اضافه کرده، جذب محلول­ها در دو طول موج663 و 645 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر )مدلBiowave II  ساخت کشور انگلستان) خوانده ­شد. میزان کلروفیل a، b و کل در هریک از نمونه­ها با استفاده از فرمول­های زیر بر حسب میلی­گرم بر گرم وزن تر محاسبه شد:

645A×00269/0- 663A×0127/0= غلظت کلروفیلa

663A×0046/0- 645A×0229/0= غلظت کلروفیل b

663A×00802/0 +645A×0202/0= غلظت کلروفیل(a+b)

645A = میزان جذب در طول موج 645

663A= میزان جذب در طول موج 663 

سنجش کمی پروتئین­ها و فعالیت آنزیمی

تهیه محلول عصاره­گیری: بدین­منظور، 2/1گرم تریس، 1/0گرم اسیدآسکوربیک، 2/17گرم ساکارز، 1/0گرم سیستئین کلراید و 8/26 میلی­لیتر اسید­کلریدریک2/0 نرمال را مخلوط کرده و با آب مقطر به حجم 100 میلی­لیتر با 5/7:pH رسانده شد.

تهیه عصاره: یک گرم از بافت تر گیاه را وزن کرده، 5 میلی­لیتر از محلول عصاره­گیری را بر روی آن تزریق و محلول حاصل تا مرحله همگن­سازی سائیده شد. سپس به‏مدت 10 دقیقه به‏حالت سکون باقی ماند و با دستگاه سانتریفیوژ با سرعت 10000 دور در دقیقه، سانتریفیوژ شد. تمامی مراحل استخراج در دمای 4- درجه سانتی‏گراد انجام شد و محلول حاصل در دمای 20- درجه سانتی‏گراد نگه‏داری گردید.

سنجش مقدار پروتئین کل: سنجشِ کمی پروتئین­ها با استفاده از روش برادفورد (29) انجام گرفت. 1/0میلی­لیتر از عصاره تهیه ­شده را در لوله ­آزمایش ریخته و به آن 5 میلی­لیتر معرف برادفورد اضافه کرده و به سرعت ورتکس شد. جذب نمونه­ها پس­از 25 دقیقه با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول­ موج 595 نانومتر خوانده­شد. محتوای پروتئین کل بر اساس میلی­گرم بر گرم وزن ‌تر نمونه با استفاده از منحنی استاندارد سرم آلبومین گاوی (BSA) گزارش شد.

سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز: 1/0میلی­لیتر از عصاره تهیه ­شده را در لوله­آزمایش ریخته و به آن 2 میلی­لیتر تامپون استات 02/ مولار0با 8/4:pH ، 2/0 میلی­لیتر آب اکسیژنه 3 درصد و 1/0 میلی­لیتر بنزیدین (02/0 مولار در متانول 50 درصد) اضافه کرده و جذب نوری محلول با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول­موج 530 نانومتر خوانده شد. در نهایت فعالیت آنزیم برحسب واحد جذب در دقیقه به ازای هر میلی­گرم پروتئین در گرم وزن تر محاسبه شد (30).

سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز: بررسی میزان فعالیت آنزیم کاتالاز و میزان کاهش H2O2 با مطالعه تغییرات جذب در 530 نانومتر انجام شد. 2/0 میلی‌لیتر عصاره­ی آنزیمی به 5/2 میلی‏لیتر تامپون فسفات با 7pH= و 3/0 میلی­لیتر آب اکسیژنه 3 درصد افزوده شد. و پس از مخلوط شدن کامل آن­ها تغییرات جذب در طول موج 530 نانومتر خوانده شد و فعالیت آنزیم بر حسب واحد جذب در دقیقه به‏ازای هر میلی‌گرم پروتئین در گرم وزن تر محاسبه شد (31).

سنجش کربوهیدرات­ها (32)

قندهای محلول: سنجش قندهای محلول و نامحلول با استفاده از روش فنل- اسیدسولفوریک انجام گرفت. 1/0 گرم از ماده خشک اندام گیاهی در 10 میلی­لیتر اتانول 70 درصد ریخته شد و پس از یک هفته، 5/0 میلی­لیتر از بخش رویی محلول برداشته و با آب مقطر به حجم 2 میلی­لیتر رسانده شد. سپس به آن 1 میلی­لیتر فنل 5 درصد اضافه و بعد از آنکه خوب به‏هم زده شد به آن 5 میلی­لیتر سولفوریک اسید غلیظ اضافه شد، حدود نیم ساعت پس از خنک شدن کامل محلول، جذب آن توسط اسپکتروفتومتر در طول موج 485 نانومتر خوانده شد. برای اندازه­گیری مقدار قند از منحنی استاندارد تهیه شده از گلوکز استفاده شد.

قندهای نامحلول: محلول اتانولی حاصل از قندهای محلول را صاف کرده و رسوب حاصل خشک و وزن شد. 10میلی­لیتر آب بر روی رسوب ریخته و به‏مدت 15دقیقه در بن­ماری درحال جوش قرار گرفت. سپس محلول رویی را صاف کرده و با آب به حجم 25میلی­لیتر رسانده شد. 2 میلی­لیتر از محلول را برداشته و به آن 1 میلی­لیتر محلول فنل 5 درصد به­علاوه 5 میلی­لیتر اسید سولفوریک غلیظ اضافه و به­منظور همگن­سازی هم­زده شد. با گذشت نیم ساعت در دمای آزمایشگاه، میزان جذب محلول­ها با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول­موج 485 نانومتر خوانده شد.

آنالیز آماری

در این پژوهش، تمام محاسبات آماری با حداقل 3 تا 5 تکرار با استفاده از نرم­افزار SAS (version9.1) توسط آزمون دانکن بر پایه طرح کاملا تصادفی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نمودارهای مربوطه با استفاده از نرم ­افزارExcell 2007 رسم شد.

نتایج

سرعت و درصد جوانه­زنی

جدول 1 اثر تیمار نانو ذرات اکسید آلومینیوم بر درصد جوانه­زنی، سرعت جوانه­زنی و طول ریشه را نشان می­دهد. با افزایش غلظت نانو ذرات اکسید آلومینیوم در محیط درصد جوانه­زنی، سرعت جوانه­زنی و طول ریشه افزایش یافت. از نظر آماری افزایش در درصد جوانه­زنی در سطح (05/0p≤) و افزایش در طول ریشه در سطح (01/0p≤) معنی­دار بود. تیمار با نانو ذرات بر سرعت جوانه­زنی فاقد تاثیر آماری معنی‏دار بود. درصد جوانه­زنی از 33/72 درصد در نمونه شاهد به 33/90 درصد در تیمار 1 گرم بر لیتر رسید. اختلاف معنی­دار در درصد جوانه­زنی بین تیمار شاهد و غلظت­های 01/0 و 5/0 مشاهده نشد (جدول 1).

 

جدول 1: اثر غلظت­های مختلف نانو ذرات اکسید ­آلومینیوم (0، 01/0، 5/0 و 1 گرم بر لیتر) بر برخی پارامترهای رشد در گیاه لوبیا. هر ستون معرف میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف متفاوت بیانگر اختلاف آماری معنی‏دار است.

طول ریشه (mm)**

سرعت جوانه­زنی (n/d) NS

جوانه­زنی (%)*

تیمار

46/11±27/3 b

43/49±35/8

33/72±05/12 b

شاهد

38/12±45/7 b

33/38±42/7

33/75±31/13 ab

نانو اکسید آلومینیوم 0.01 (g/l)

69/18±18/9 a

23/53±09/9

90±21/7 ab

نانو اکسید آلومینیوم 0.5 (g/l)

2/12±63/5 b

93/53±77/5

33/90±50/6 a

نانو اکسید آلومینیوم 1 (g/l)

       * اختلاف معنی­دار با گروه شاهد در سطح 05/0p≤

       **اختلاف معنی­دار با گروه شاهد در سطح 01/0p≤

                     NS نتایج فاقد اختلاف آماری معنادار هستند.

 

 

 نتایج نشان داد که طول ریشه به‏میزان 23/7 میلی­متر در تیمار 5/0 نسبت به شاهد افزایش یافته است. نتایج حاکی از این است که سرعت جوانه­زنی با افزایش غلظت نانو ذرات افزایش نسبی نشان داد اما از نظر آزمون مقایسه­ای دانکن این افزایش معنی‏دار  نیست.

 

سنجش رنگیزه­های فتوسنتزی

آنالیز داده­ها مشخص کرد که اثرات تمار با نانو ذرات اکسید آلومینیوم در غلظت­های مختلف بر روی میزان کلروفیل a، b و a±b از نظر آماری معنی­دار بوده است (01/0p≤). با افزایش غلظت نانو­ ذره اکسید ­آلومینیوم در محیط، میزان کلروفیل a، از 0097/0 میلی­گرم در هر گرم بافت تر گیاهی در گیاهان شاهد، به 0076/0 میلی­گرم در هر گرم بافت تر گیاهی در محیط حاوی 1 گرم بر لیتر نانو ­ذره اکسید آلومینیوم کاهش یافت. در این گیاه هم­زمان با افزایش غلظت نانو­ ذره اکسید ­آلومینیوم، میانگین کلروفیل b افزایش یافت. بر­اساس آزمون دانکن میزان کلروفیل b در هریک از تیمارها با میزان کلروفیل b در نمونه­های شاهد تفاوت معنی­دار داشت (01/0p≤)، به­طوری‏که نمونه­های با تیمار 1 گرم بر لیتر، دارای 0072/0 میلی­گرم بر لیتر در هر گرم بافت تازه گیاه بیشترین میزان کلروفیل b و گیاهان شاهد با 003/0 میلی­گرم بر لیتر در هر گرم بافت تازه گیاه کمترین میزان کلروفیل b را دارا بودند. در گروه‏های تیمار شده با نانو­ ذره اکسید ­آلومینیوم تغییر محتوای کلروفیل کل افزایش معنی­داری را نشان داد، بدین‏صورت که میزان کلروفیل کل در نمونه­های شاهد و گروه‏های تحت تیمار با غلظت‏های 01/0، 5/0 و 1 گرم بر لیتر نانو­ ذره اکسید ­آلومینیوم به‏ترتیب 0126/0، 0137/0، 0088/0 و 0148/0 میلی­گرم بر لیتر در هر گرم بافت تازه گیاه بود (شکل 2).

 

 

 

 

شکل 2: اثر غلظت­های مختلف نانو ­ذره اکسید ­آلومینیوم (0، 01/0، 5/0 و 1 گرم بر لیتر) بر محتوای انواع کلروفیل در گیاه لوبیا. هر ستون معرف میانگین چهار تکرار ± انحراف معیار است. ستون­های با حداقل یک حرف مشترک، فاقد اختلاف آماری معنی‏دار هستند

 

.

 

سنجش کمی پروتئین­ها و فعالیت آنزیمی

تیمار با نانو­ ذره اکسید ­آلومینیوم موجب کاهش در محتوای پروتئین کل شد (شکل 3). اما کاهش در مقدار پروتئین کل تنها در غلظت 01/0 گرم بر لیتر دارای اختلاف معنی­دار (05/0p≤) با گروه شاهد بود.

 

 

 

 

 

شکل 3: اثر غلظت­های مختلف نانو­ ذره اکسید ­آلومینیوم (0، 01/0، 5/0 و 1 گرم بر لیتر) بر محتوای پروتئین کل در گیاه لوبیا. هر ستون معرف میانگین چهار تکرار ± انحراف معیار است. ستون­های با حداقل یک حرف مشترک، فاقد اختلاف آماری معنی‏دار هستند.

 

 

نتایج آزمون مقایسه­ای دانکن نشان داد که نانو ­ذره اکسید آلومینیوم بر فعالیت آنزیم پراکسیداز اثر معنی­داری نداشته است

 

 

 

(شکل 4).

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 4: اثر غلظت­های مختلف نانو ­ذره اکسید ­آلومینیوم (0، 01/0، 5/0 و 1 گرم بر لیتر) بر فعالیت آنزیم پراکسیداز در گیاه لوبیا. هر ستون معرف میانگین چهار تکرار ± انحراف معیار است. ستون­های با حداقل یک حرف مشترک، فاقد اختلاف آماری معنی‏دار هستند.

 

 

 

نتایج حاصل از اندازه­گیری اثر غلظت­های مختلف نانو­ ذره اکسید

آلومینیوم بر فعالیت آنزیم کاتالاز در شکل 5 نشان داده شده است. میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در گیاهان تحت تیمار نانو ­ذره اکسید ­آلومینیوم کاهش نشان داد که این کاهش در همه غلظت‏ها معنی­دار بود. میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در گیاهان شاهد به‏میزان 0016/0 واحد جذب در دقیقه به‏ازای میلی­گرم پروتئین گزارش شد. این مقدار در گیاهان تیمار شده با غلظت‏های 01/0، 5/0 و 1 گرم بر لیتر نانو­ ذره اکسید ­آلومینیوم به مقدار 0002/0، 0003/0 و 0004/0 واحد جذب در دقیقه به‏ازای میلی­گرم پروتئین رسید.

 

 

 

 

 

شکل 5: اثر غلظت­های مختلف نانو ­ذره اکسید ­آلومینیوم (0، 01/0، 5/0 و 1 گرم بر لیتر) بر فعالیت آنزیم کاتالاز در گیاه لوبیا. هر ستون معرف میانگین چهار تکرار ± انحراف معیار است. ستون­های با حداقل یک حرف مشترک، فاقد اختلاف آماری معنی‏دار هستند.

 

 

سنجش کربوهیدرات­ها

بررسی آنالیز داده­ها نشان داد که اثرات نانو ­ذره اکسید ­آلومینیوم بر قندهای محلول معنی­دار بوده (01/0p≤) و با افزایش غلظت نانو ­ذره محیط، به­تدریج مقدار قند محلول افزایش یافته است.

کمترین میزان قندهای محلول 151/0 میلی­گرم در هر گرم بافت خشک گیاهی به مربوط به گیاهان شاهد بود. در حالی­که گیاهان تیمار شده با غلظت‏های 01/0، 5/0 و 1 گرم در لیتر نانو­ ذره به‏ترتیب دارای 154/0، 154/0 و 172/0 میلی­گرم قند محلول در هر گرم بافت خشک گیاهی بودند (شکل 6).

 

 

 

شکل 6: اثر غلظت­های مختلف نانو ­ذره اکسید ­آلومینیوم (0، 01/0، 5/0 و 1 گرم بر لیتر) بر محتوای قندهای محلول در گیاه لوبیا. هر ستون معرف میانگین چهار تکرار ± انحراف معیار است. ستون­های با حداقل یک حرف مشترک، فاقد اختلاف آماری معنی‏دار هستند.

 

 

آنالیز داده­های مربوط به میزان قندهای نامحلول تفاوت معنی‏داری بین گروه‏های تحت تیمار با غلظت­های مختلف نانو

ذرات را نشان داد. تاثیر غلظت­های مختلف نانو­ ذره اکسید آلومینیوم بر میزان قندهای نامحلول در سطح یک درصد (01/0p≤) معنی­دار بود. میزان قند تامحلول در گیاهان شاهد 1122/0 میلی­گرم در هر گرم بافت خشک گیاهی بود که این میزان در غلظت 1 گرم بر لیتر نانو­ ذره اکسید ­آلومینیوم به 1173/0 میلی­گرم افزایش یافت (شکل 7).

 

 

 

 

شکل 7: اثر غلظت­های مختلف نانو ­ذره اکسید ­آلومینیوم (0، 01/0، 5/0 و 1 گرم بر لیتر) بر محتوای قندهای نامحلول در گیاه لوبیا. هر ستون معرف میانگین چهار تکرار ± انحراف معیار است. ستون­های با حداقل یک حرف مشترک، فاقد اختلاف آماری معنی‏دار هستند

 

.

بحث

استفاده صنعتی از نانو ذرات به سرعت در حال افزایش است و

این باعث نگرانی در مورد سرنوشت زیست­ محیطی و اثرات

بیولوژیکی بالقوه این ذرات شده است. گیاهان عالی به شدت با محیط جوی و زمینی خود در تعامل هستند و انتظار می­رود با  نانو ذرات تحت تاثیر قرار گیرند (33 و 34).

نتایج مطالعه حاضر نشان داد که نانو­ ذره اکسید­ آلومینیوم درصد جوانه­زنی و طول ریشه گیاه لوبیا را افزایش داده است. افزایش سرعت جوانه­زنی تحت تاثیر این ذرات از نظر آماری معنی­دار نبود. علومی و همکاران (35) در مطالعات خود نشان دادند که درصد جوانه­زنی گیاه شیرین­بیان در تیمار با نانو­ اکسید ­مس کاهش یافته است. در مطالعه­ی دیگر افزایش جوانه­زنی ذرت در تیمار با نانو­ ذره روی گزارش شده ­است (20) که با نتایج پژوهش

 

حاضر مطابقت دارد. دلیل افزایش جوانه­زنی را می­توان به نفوذپذیری بالای نانو ذرات به‏درون پوسته بذر و در نتیجه افزایش جذب آب و افزایش جذب نور و فعالیت آنزیم روبیسکو نسبت داد (34 و 36).

در گروه‏های تیماری با نانو­ اکسید ­آلومینیوم، طول ریشه نیز افزایش معنی­داری را نشان داد. به­نظر می­رسد دلیل این افزایش، افزایش قدرت جذب آب درحضور نانو ذرات باشد. قبلا اثر نانو آلومینیوم به­عنوان تشدید­کننده طول ریشه دانه ­رست­های Arabidopsis thaliana نشان داده شده­ است (37). جاهل و همکاران (22) نشان دادند که  نانو ذرات آلومینیوم رشد ریشه Lemna minor را در مقایسه با گروه شاهد افزایش داد. افزایش در جوانه­زنی و رشد گیاهان گوجه­فرنگی تحت تیمار نانو ­لوله­های کربنی از طریق افزایش قدرت جذب آب (38) و همچنین افزایش تحریک رشد اسفناج تحت تیمار نانو اکسید تیتانیوم گزارش شده است (34). نتایج گزارش‏های فوق با نتایج پژوهش حاضر هم­سو است. در غلظت 1 گرم بر لیتر روند افزایش متوقف و رشد ریشه کاهش یافت به‏نظر می­رسد همانگونه که در مطالعات قبلی گزارش شده نانو ذرات آلومینیوم در غلظت­های بالا اثر مهارکنندگی بر رشد تعدادی از گونه­های گیاهان دارد (21, 20).

سرعت جوانه­زنی بذر گیاه لوبیا، تحت تیمار با نانو ذرات آلومینیوم  افزایش یافت. اما این افزایش از نظر آماری معنی­دار نبود. تیمار با نانو ذرات در سرعت جوانه­زنی موثر بوده و رشد گیاه را افزایش می­دهند. کلید افزایش سرعت جوانه­زنی بذر در گروه‏های تحت تیمار یا نانو ذرات، در نفوذ این ذرات به داخل بذرهاست (39). صابر و همکاران (40) اثر دو نوع نانو ماده شامل: نانو­ رس و نانو­ نقره بر جوانه­زنی و رشد بذور کلم­گل مورد بررسی قرار دادند نتایج نشان داد نانو­ رس تاثیر مثبت بر درصد و سرعت جوانه­زنی داشت در حالی‏که نانو نقره به­طور کامل از جوانه­زنی بذور کلم گل ممانعت کرد.

نتایج به­دست آمده از این تحقیق نشان داد که تیمار با ذرات نانو­ آلومینیوم محتوای کلروفیل a را کاهش، کلروفیل b و a±b را افزایش داده است. افزایش میزان کلروفیل در مطالعات قبلی نیز مشاهده شده است. ترابیان و همکاران (41) گزارش کردند که محتوای کلروفیلa  و کلروفیل کل آفتاب‏گردان تحت تیمار کود نانو سولفات آهن به‏ترتیب به میزان 30 و 13 درصد نسبت به نمونه­های شاهد افزایش یافته است. در تحقیقی که روی Pelargonium zonale انجام گرفت مقدار کلروفیل a، b و کل در گروه تیمار شده با غلظت 60 میلی­گرم در لیتر نانو­ نقره افزایش و سپس در غلظت 80 میلی­گرم در لیتر کاهش یافت (42).

هیچگونه تغییر معنی­داری برای کلروفیل a در Chlamydomonas reinhardtii در سطوح مختلف نانو ­اکسید تیتانیوم مشاهده نشد در حالی‏که محتوای کلروفیل b و کارتنوئیدها در گروه‏های تحت تیمار بعد از 3 و 4 روز در معرض نانو ذرات قرار گرفتن افزایش یافت (43). طبق نظر آندرسون و همکاران (44) افزایش میزان کلروفیل دلیلی بر فعال بودن سلول­ها و افزایش تولید مواد قندی آن­ها است و افزایش مواد قندی از طریق تنظیم تنفس و فشار اسمزی موجب کاهش پیری گل­ها می­شود. به­نظر می­رسد افزایش میزان کلروفیل با مصرف نانو ­آلومینیوم از طریق افزایش فعالیت سلولی بوده است.

نتایج نشان ­دهنده­ی عدم اختلاف معنی­دار میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز در گروه‏های تیماری با گروه شاهد و کاهش معنی­دار فعالیت آنزیم کاتالاز در گروه‏های تحت تیمار بود. ساز و کار دفاعی گیاهان برای مقابله با خسارت­های ناشی از تنش اکسیداتیو و حذف گونه­های فعال اکسیژن شامل آنزیم­های آنتی‏اکسیدانت و ترکیبات آنتی­اکسیدانت‏­ها است. ساز و کارهای آنزیمی، شامل سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، پراکسیداز، گلوتاتیون­ ردوکتاز، دهیدرو ­آسکوربات­ ردوکتاز و غیره، غلظت سوپر­اکسید و پراکسید­هیدروژن را کاهش می­دهند. آنتی‏اکسیدانت­های تولید شده توسط ساز و کارهای غیر­آنزیمی در گیاهان نیز شامل ویتامین E، آسکوربات، گلوتاتیون، ترکیبات فلاوونوئیدی، کارتنوئیدها و غیره هستند (45).

عدم اختلاف معنی­دار میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز و کاهش میزان فعالیت کاتالاز ممکن است نشان­دهنده یک مکانیسم محافظتی بهتر در این گیاه باشد. اختمال می­رود تنش حاصل از تیمار با نانو ذرات آلومینیوم سبب از بین رفتن سیستم دفاعی شده باشد و فعالیت آنتی­اکسیدانتی را کاهش داده است. بهتر است دیگر آنزیم­های دخیل در سیستم دفاعی نیز بررسی شود.

حاتمی و همکاران (46) در تحقیقات خود نشان دادند که در گروه‏های تیمار شده با غلظت­های مختلف نانو ذرات نقره، تغییر فعالیت آنزیم سوپر­اکسید ­دسموتاز در دو رقم شمعدانی (آنتونی و بلوواندر) بعد از پنج روز در شرایط تاریکی از نظر آماری تفاوت معنی­دار داشت. در تیمار 60 میلی­گرم در لیتر نانو ذرات، فعالیت آنزیم سوپر ­اکسید ­دیسموتاز در دو رقم افزایش یافت و سپس با افزایش غلظت نانو ذرات در سطح 80 میلی­گرم در لیتر کاهش نشان داد. همچنین افزایش فعالیت دو آنزیم کاتالاز و پراکسیداز با افزایش غلظت نانو­ نقره و سپس کاهش فعالیت این دو آنزیم در شمعدانی­های تحت تیمار مشاهده شده است (42).

در گیاه پریوش میزان فعالیت آنزیم­های سوپر ­اکسید دیسموتاز، کاتالاز و گایاکول­ پراکسیداز در غلظت صفر میکرومول نانو اکسید ‏روی کاهش و سپس در غلظت‏های 2، 4 و 10 میکرومول افزایش یافت. (5).

در گیاهان آفتاب‏گردان که با محلولی از آهن، مس و کادمیوم تیمار شده بودند فعالیت لیپوکسیژناز و پراکسیداسیون بیشتری نسبت به گروه شاهد داشتند. برخلاف یون­های آهن و کادمیوم که سبب کاهش فعالیت سوپراکسید دیسموتاز شدند یون مس آن را افزایش داد. البته هر سه یون به کاهش دیگر آنزیم­های آنتی­اکسیدانت (کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز، گلوتاتیون­ردوکتاز و دهیدروآسکوربات) منجر شدند (47). که همسو با نتایج پژوهش حاضر است. مطالعات گذشته نشان می­دهد که واکنش آنزیم­های آنتی­اکسیدانتی به فلزات مبهم است و می­تواند بین گونه­های گیاهی و حتی بین بافت­های مختلف یک گیاه متفاوت باشد (48).

نتایج سنجش محتوای پروتئین نشان داد که هم‏زمان با افزایش غلظت آلومینیوم، محتوای پروتئین کل کاهش یافت (کاهش پروتئین تنها در غلظت 01/0 گرم بر لیتر معنی­دار بود). برخی شواهد وجود دارد که کاهش سنتز پروتئین و افزایش پروتئولیز دلایلی برای کاهش پروتئین در طول تنش هستند (49 و 50). به‏نظر می­رسد در اینجا نیز کاهش سنتز پروتئین و افزایش پروتئولیز عوامل کاهش دهنده پروتئین در شرایط تیماری هستند. در بررسی اثر نانو ذرات­ نقره بر محتوای پروتئین کل دو رقم Foxi و Flowerfairy گیاه Pelargonium zonale مشخص شد که محنوای پروتئین کل در هر دو رقم ابتدا افزایش و سپس به‏سرعت کاهش یافته است (42). بهبودی و همکاران (51) نشان دادند که با افزایش میزان نانو ­ذرات اکسید مس و اکسید ­روی مقدار پروتئین دانه لوبیا چیتی کاهش یافت که با نتایج مطالعه حاضر همسو است. محتوای پروتئین برگ Abelmoschus esculantus در همه­ی تیمارهای نانو­ روی به جز ppm  200 افزایش یافت (52). به­طور مشابه پروتئین کل در غلظت­های 20، 40 و ppm 60 تیمار لوبیا و ذرت با  نانو ذرات نقراه افزایش یافت اما در تیمار80 و ppm 100 کاهش نشان داد (53). نتایج آزمون مقایسه­ای دانکن نشان داد که با افزایش غلظت نانو اکسید ­آلومینیوم محیط، مقدار قندهای محلول و نامحلول افزایش یافته است. برخی از تحقیقات نشان داده است که با افزایش غلظت فلزات سنگین، میزان تعادل آب درون سلولی دچار اختلال شده و سبب تغییرات فراساختاری در اندامک­های سلولی و آنزیم­های مسیر متابولیسم قندها می­شود و با افزایش غلظت فلزات سنگین میزان فعالیت آنزیم اینورتاز کاهش می­یابد. به‏دنبال کاهش میزان انتقال آب به برگ­ها و تجمع این عناصر سنگین در سلول، میزان کربوهیدرات­ها در برگ­ها افزایش می‏یابد. در واقع افزایش قندها یک نوع مکانیسم تطابقی و سازگار یافته برای حفظ و نگه‏داری پتانسیل اسمزی تحت تنش آلومینیوم است. تجمع کربوهیدرات­ها در حفظ غشای سلولی و تنظیم اسمزی موثر است (54 و 55).

در تیمار Abelmoschus esculantus (L.) Moench با نانو  ذره نقره محتوای کربوهیدرات­ها در تمام غلظت‏ها کاهش یافت (52). محتوای کربو هیدرات­ها در گیاهان لوبیا و ذرت تیمار شده با غلظت­های 20، 40 و ppm 60 نانو­ ذرات نقراه افزایش یافت اما در تیماز 80 و 100 ppmکاهش نشان داد (53). در تیمار Ocimum basilicum با نانو ذرات ­آهن (Fe3O4) با افزایش غلظت ذرات سطح کربوهیدرات کل به­طور معنی‏داری افزایش یافت (56) که با نتایج پژوهش حاضر همسو است.

نتیجه گیری

مطالعه­ی حاضر به‏منظور ارزیابی پاسخ­های تکوینی و بیوشیمیایی لوبیا به تیمار نانو­ اکسید­ آلومینیوم انجام گرفت. نتایج مطالعه حاضر موثر بودن تیمار با نانو ذرات ­اکسید ­آلومینیوم بر ویژگی‏های بیوشیمیایی و فیزیولوژیک لوبیا را اثبات کرد. نانو ذرات اکسید ­آلومینیوم سبب افزایش درصد جوانه­زنی، طول ریشه، محتوای کلروفیل b و کل، محتوای قندهای محلول و نامحلول و کاهش محتوای پروتئین کل و فعالیت آنزیم کاتالاز در گروه‏های تحت تیمار با ناو ذرات آلومینیوم در مقایسه با گروه شاهد شد. اثر نانو ذرات ­اکسید ­آلومینیوم بر سرعت جوانه­زنی بذر و فعالیت آنزیم پراکسیداز معنی­دار نبود.

1. Ball P. Natural strategies for the molecular engineer. Nanotechnology. 2002; 13(5): R15.

2. Nel A, Xia T, Mädler L, Li N. Toxic potential of materials at the nanolevel. Science. 2006; 311(5): 622-7.

3. Handy RD, Owen R, Valsami-Jones E. The ecotoxicology of nano-particles and nanomaterials: current status, knowledge gaps, challenges, and future needs. Ecotoxicology. 2008; 17(5): 315-25.

4. Zhu H, Han J, Xiao JQ, Jin Y. Uptake, translocation, and accumulation of manufactured iron oxide nano-particles by pumpkin plants. J Environ Monit. 2008; 10(6): 713-7.

5. Amirjani MR, Askari M, Askari F. Effect of nano zinc oxide on alkaloids, enzymatic and antienzymatic antioxidant contents and some physiological parameters of catharantus roseus. Journal of Cell & Tissue (JCT). 2014; 5(2): 173-83.

6. Dietz K-J, Herth S. Plant nanotoxicology. Trends in plant science. 2011; 16(11): 582-9.

7. Da Silva LC, Oliva MA, Azevedo AA, De Araújo JM. Responses of restinga plant species to pollution from an iron pelletization factory. Water, Air, and Soil Pollution. 2006; 175(1-4): 241-56.

 8. Ovečka M, Lang I, Baluška F, Ismail A, et al. Endocytosis and vesicle trafficking

during tip growth of root hairs. Protoplasma. 2005; 226(1-2): 39-54.

9. Ma X, Geiser-Lee J, Deng Y, Kolmakov A. Interactions between engineered nano-particles (ENPs) and plants: phytotoxicity, uptake and accumulation. Science of the total environment. 2010; 408(16): 3053-61.

10. Zhu X, Zhu L, Duan Z, Qi R, et al. Comparative toxicity of several metal oxide nano-particle aqueous suspensions to Zebrafish (Danio rerio) early developmental stage. Journal of Environmental Science and Health, Part A. 2008; 43(3): 278-84.

11. Li M, Czymmek KJ, Huang C. Responses of Ceriodaphnia dubia to TiO2 and Al2O3 nano-particles: a dynamic nano-toxicity assessment of energy budget distribution. Journal of Hazardous Materials. 2011; 187(1): 502-8.

12. Yu S, Rui Q, Cai T, Wu Q. et al. Close association of intestinal autofluorescence with the formation of severe oxidative damage in intestine of nematodes chronically exposed to Al2O3 nano-particle. Environmental Toxicology and Pharmacology. 2011; 32(2): 233-41.

13. Di Virgilio A, Reigosa M, Arnal P, De Mele MFL. Comparative study of the cytotoxic and genotoxic effects of titanium oxide and aluminium oxide nano-particles in Chinese hamster ovary (CHO-K1) cells. Journal of Hazardous Materials. 2010; 177(1): 711-8.

14. Dabrunz A, Duester L, Prasse C, Seitz F, et al. Biological surface coating and molting inhibition as mechanisms of TiO2 nano-particle toxicity in Daphnia magna. PLoS One. 2011; 6(5): e20112.

15. Sadiq IM, Pakrashi S, Chandrasekaran N, Mukherjee A. Studies on toxicity of aluminum oxide (Al2O3) nano-particles to microalgae species: Scenedesmus sp. and Chlorella sp. Journal of Nano-particle Research. 2011; 13(8): 3287-99.

16. Armelao L, Barreca D, Bottaro G, Gasparotto A, et al. Photocatalytic and antibacterial activity of TiO2 and Au/TiO2 nanosystems. Nanotechnology. 2007; 18(37):375709.

17. Aruoja V, Dubourguier H-C, Kasemets K, Kahru A. Toxicity of nano-particles of CuO, ZnO and TiO2 to microalgae Pseudokirchneriella subcapitata. Science of the total environment. 2009; 407(4): 1461-8.

18. Franklin NM, Rogers NJ, Apte SC, Batley GE, et al. Comparative toxicity of nano-particulate ZnO, bulk ZnO, and ZnCl2 to a freshwater microalga (Pseudokirchneriella subcapitata): the importance of particle solubility. Environmental Science & Technology. 2007; 41(24): 8484-90.

 

19. Hund-Rinke K, Simon M. Ecotoxic effect of photocatalytic active nano-particles (TiO2) on algae and daphnids (8 pp). Environmental Science and Pollution Research. 2006; 13(4): 225-32.

20. Lin D, Xing B. Phytotoxicity of nano-particles: inhibition of seed germination and root growth. Environmental Pollution. 2007; 150(2): 243-50.

 

21. Yang L, Watts DJ. Particle surface characteristics may play an important role in phytotoxicity of alumina nano-particles. Toxicology Letters. 2005; 158(2): 122-32.

 

22. Juhel G, Batisse E, Hugues Q, Daly D, et al. Alumina nano-particles enhance growth of Lemna

 

 

minor. Aquatic toxicology. 2011; 105 (3): 328-36.

 

 23. Pandy BP. Textbook of Botany Angiosperms : Taxonomy, Anatomy, Embryology (including tissue culture) and Economic Botany. Publisher: New Delhi : S. Chand & Co. 2004;  990p.

24. Ramezani F, Shayanfar A, Tavakkol Afshari R, Rezaee K. Effects of silver, nickel, zinc and zinc- copper nano-particles on germination, seedling establishment and enzyme activity of alfalfa (Medicago sativa) seed. Iranian Journal of Field Crop Science. 2014; 45(1); 107-118.

25. Ghahraman A. Iranian's Chromophyts (Plant systematic) Tehran: University Publishing Center; 1993; 504-505.

26. Shakirova FM, Sakhabutdinova AR, Bezrukova MV, Fatkhutdinova RA, et al. Changes in the hormonal status of wheat seedlings induced by salicylic acid and salinity. Plant Science. 2003; 164(3): 317-22.

27. Agrawal RL. Seed technology. India: Oxford & IBH Publishing Co.; 1980. 685 p.

28. Arnon DI. Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant physiology. 1949; 24(1): 1-15.

29. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 1976; 72(1): 248-54.

30. Koroi SAA. Gelektrophers tissue and spectral photometris chon under change Zomeinfiussdr temperature and structure Peroxidase isoenzyme. Physiology Vegetation. 1989; 20:15-23.

31. Chance B, Maehly A. Assay of catalases and peroxidases, Method  enzymology. 1995; 11:746-775.

32. Kochert G. Carbohydrate determination by the phenol-sulfuric acid method. In: J.A. Hellebust and J.S. Craigie (Editors), Handbook of Phycological Methods: Physiological and Biochemical Methods. . London: Cambridge University Press; 1978.

33. Monica RC, Cremonini R. Nano-particles and higher plants. Caryologia. 2009; 62(2): 161-5.

34. Gao F, Hong F, Liu C, Zheng L, et al. Mechanism of nano-anatase TiO2 on promoting photosynthetic carbon reaction of spinach. Biological Trace Element Research. 2006; 111(1-3): 239-53.

35. Olomi H, Solatani Nezhad R. Effect of Nano-particles of zinc oxide and copper oxide on germination and morphological characteristics Glycrrhiza glabra L. seedlings. 1st national conference on plant stresses (abiotic). 2012. University of Esfahan.

36. Boonyanitipong P, Kositsup B, Kumar P, Baruah S, Dutta J. Toxicity of ZnO and TiO2 Nano-particles on Germinating Rice Seed. International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics. 2011; 1: 282-5.

37. Lee CW, Mahendra S, Zodrow K, Li D, et al. Developmental phytotoxicity of metal oxide nano-particles to Arabidopsis thaliana. Environmental Toxicology and Chemistry. 2010; 29(3): 669-75.

38. Khodakovskaya M, Dervishi E, Mahmood M, Xu Y, et al. Carbon nanotubes are able to penetrate plant seed coat and dramatically affect seed germination and plant growth. ACS Nano. 2009; 3(10): 3221-7.

39. Khot LR, Sankaran S, Maja JM, Ehsani R, et al. Applications of nanomaterials in agricultural production and crop protection: a review. Crop Protection. 2012; 35: 64-70.

40. Saber S, Ghasimi Hagh Z, mostafavi Sh. Effects of nano materials on the germination and seedling growth of brassica seeds. 1st NANO Technology and It’s Application in Agriculture and Natural Resources conference. 2012. University College of Agriculture & Natural Resources, University of Tehran- Karaj.

41. Torabian sh. Zahedi M. Effects of Foliar Application of Common and Nano-sized of Iron Sulphate on the Growth of Sunflower Cultivars under Salinity. Iranian Journal of Field Crop Science. 2013; 44(1): 109-118.

42. Hatami M, Ghorbanpour M. Defense enzyme activities and biochemical variations of Pelargonium zonale in response to nanosilver application and dark storage. Turkish Journal of Biology. 2014; 38(1): 130-9.

43. Chen L, Zhou L, Liu Y, Deng S, et al. Toxicological effects of nanometer titanium dioxide (nano-TiO 2) on Chlamydomonas reinhardtii. Ecotoxicology and Environmental Safety. 2012; 84: 155-62.

44. Andersen L, Williams MH, Serek M. Reduced water availability improves drought tolerance of potted miniature roses: Is the ethylene pathway involved?. Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 2004; 79(1): 1-13.

45. Noctor G, Foyer CH. Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control. Annual Review of Plant Biology. 1998; 49(1): 249-79.

46. Hatami M, Hhatamzadeh A, Ghasemnezhad M, Hasan sajedi R, et al. Changes in antioxidant enzymes activity in two Pelargonium zonale cultivars by nanosilver particles during dark storage. Plant Production Technology. 2014; 13(2): 99-108.

47. Gallego SM, Benavídes MP, Tomaro ML. Effect of heavy metal ion excess on sunflower leaves: evidence for involvement of oxidative stress. Plant Science. 1996; 121(2): 151-9.

48. Mazhoudi S, Chaoui A, Ghorbal MH, El Ferjani E. Response of antioxidant enzymes to excess copper in tomato (Lycopersicon esculentum, Mill.). Plant Science. 1997; 127(2): 129-37.

49. Winterbourn CC. Superoxide-dependent production of hydroxyl radicals in the presence of iron salts. Biochemical Journal. 1982; 205(2): 463.

50. Droillard MJ, Bate NJ, Rothstein SJ, Thompson JE. Active translation of the D-1 protein of photosystem II in senescing leaves. Plant Physiology. 1992; 9(2): 589-94.

51. Behboudi F, Allahdadi E, Mohamadi Goltape E. The effect of vermicompost containing copper oxide (CuO) and zinc oxide (ZnO) nano-particles on some characteristics of the wax bean. EJCP. 2013; 6 (2): 33-49.

52. Gokak I, Taranath T. Morphological and biochemical responses of Abelmoschus esculantus (L.) Moench to zinc nano-particles. Advances in Natural Sciences: Nanoscience and Nanotechnology. 2015; 6(2): 025017.

53. Salama H. Effects of silver nano-particles in some crop plants, common bean (Phaseolus vulgaris L.) and corn (Zea mays L.). Int Res J Biotech. 2012; 3(10): 190-7.

54. Prasad M. Cadmium toxicity and tolerance in vascular plants. Environmental and Experimental Botany. 1995; 35(4): 525-45.

55. Sato F, Yoshioka H, Fujiwara T, Higashio H, et al. Physiological responses of cabbage plug seedlings to water stress during low-temperature storage in darkness. Scientia Horticulturae. 2004; 101(4): 349-57.

56. Elfeky AS, Mohanned MA, Khater MS, Osman YAH, et al. Effect of magnetite nano-fertilizer on growth and yield of Ocimum basilicum L. International Journal of Indigenous Medical Plants. 2013; 46(3): 1286-1293