بیان فاکتور رونویسی دوپامینرژیکی Nurr1 در سلول‏های انسانی به‏وسیله لنتی ویروس‏های نوترکیب

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه آزاد اسلامی، آمل، واحد آیت اله آملی، گروه زیست شناسی، آمل، ایران

2 دانشجوی کارشناسی ارشد زیست شناسی سلولی- مولکولی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

3 کارشناس ارشد ژنتیک، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

چکیده

هدف: هدف این تحقیق تولید  لنتی ویروس‏های حامل ژن Nurr1 و بیان در سلول‏های انسانی می‏باشد. مواد و روش‏ها: قطعه ژنی IRES-EGFP با آنزیم‏های Bgl ll/Not1 از ناقل pIRES2-EGFP جدا و با Klenow کور (Blunt) گردید. ناقل لنتی ویروسی  pNL-EGFP/CMV/WPREdU3 با آنزیم‏های Nhe1/ Xho1 برش و دو سر آن  کور شد.  قطعه ژنی ایزوله شده به این ناقل منتقل شد تا سازه لنتی ویروسی (I) به‏وجود آید. سپس ژن Nurr1  با آنزیم‏های Xho1 و BamH1 از ناقل PCMX-NOT بریده و درون پلاسمید (I) خطی شده باSal1 و BamH1 منتقل شد تا سازه نهایی لنتی ویروسی (II) تولید گردد. برای تولید لنتی ویروس‏های نوترکیب، رده سلول انسانی HEK-293T  را با این پلاسمید نهایی، به‏همراه پلاسمیدهای غشایی و بسته بندی لنتی ویروس ترانسفکت شد. محیط این سلول‏ها که مملو از ذرات ویروسی شده بود جمع آوری و از ستون آمیکون عبور داده شد تا ذخیره غلیظ ویروس به‏دست آید. این ذخیره برای آلوده سازی سلول‏های هدف استفاده شد. بیان EGFP در زیر میکروسکوپ به اثبات رسید و بیان ژن Nurr1 با RT-PCR سنجیده شد. نتایج: درستی مراحل کلونینگ با آنزیم‏های مربوطه اثبات شد. با میکروسکوپ فلورسنس بیان Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) در هر دو مرحله ترانسفکشن و ترانسدوکشن ثابت گردید. تکنیک RT-PCR بیان Nurr1 را در هردو مرحله به اثبات رسانید. نتیجه گیری: لنتی ویروس‏های ناقل ژن انسانی Nurr1 تولید شده و به‏دنبال آلوده سازی سلول‏های انسانی HEK-293T با ویروس‏های مزبور، سلولهای فوق ژن Nurr1 را به‏طور موفقیت آمیز بیان کردند.  

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

جایگزینی سلولی و حفاظت نورونی در زمره روش‏های نوین و موثر مقابله با وقوع و پیشرفت بیماری‏های زوال نورونی از جمله بیماری پارکینسون مطرح است (1). افزایش بیان و عملکرد فاکتورهای رونویسی که در تکوین نورون‏های دوپامینرژیک از پیش سازان دوران جنینی نقش اساسی دارند می‏تواند راه‏گشای این روش‏های درمانی باشد.

فاکتور رونویسی Nurr1 از مهم‏ترین عوامل شکل گیری و بقای سلول‏های دوپامین ساز به‏شمار می‏آید، به‏طوری‏که بیان آنزیم تیروزین هیدروکسیلاز به‏عنوان اولین و مهم‏ترین آنزیم دخیل در بیوسنتز دوپامین وابسته به حضور فاکتور Nurr1 می باشد (2 و 3). فاکتور رونویسیNurr1  یکی از اعضای خانواده گیرنده‏های هسته‏ای می‏باشد که دارای نقشی حیاتی در تکوین نورون‏های دوپامینرژیک می‏باشد (4 و5). مطالعات مختلف نشان دهنده این است که این پروتئین از دیگر گیرنده‏های هسته‏ای متفاوت بوده و ممکن است جزء گیرنده‏هایی باشد که بدون اتصال لیگاند عمل می‏کنند (6). در موش‏هایی که  فاقد ژن Nurr1 بودند، نورون‏های دوپامینرژیک قادر به تمایز نبوده و مارکرهای مربوط به نورون‏های دوپامینرژیک در آن‏ها حضور نداشتند (4، 7 و 8). اخیرا چندین مطالعه پیشنهاد کرده‏اند که تخریب عملکرد Nurr1 در نورون‏های دوپامینرژیک، در آسیب شناسی بیماری پارکینسون دارای نقش مهمی می‏باشد و برخی پلی مورفیسم‏های مشاهده شده در این فاکتور با بیماری پارکینسون در ارتباط می‏باشند (9-11). گزارش شده است که ژن Nurr1 در کنترل متابولیسم دوپامین نیز نقش ایفا می‏کند و بیان این ژن با افزایش سن به‏طور چشم‏گیری در سلول‏های جسم سیاه مغز کاهش می‏یابد که این امر منجر به کاهش میزان دوپامین می‏شود (12). تمایز سلول‏های بنیادی به نورون‏های دوپامین‏ساز به‏عنوان ابزار مهمی در سلول درمانی پارکینسون با روش جایگزینی سلولی مطرح شده است. در این فرآیند تمایز اختصاصی، Nurr1  نقش برجسته‏ای بر عهده دارد. با بیان سطح بالای فاکتور Nurr1 دو گروه مستقل توانسته‏اند جمعیت غنی شده از سلول‏های عصبی مغز میانی را تولید نمایند که ویژگی‏های الکتروفیزیولوژیکی و رفتاری مربوط به نورون‏های دوپامین ساز را از خود بروز می‏دهند (13).  در نهایت آن‏که افزون بر نقش تمایزی Nurr1، فعالیت حفاظت نورونی این فاکتور رونویسی بر ضدالتهاب عصبی نیز به اثبات رسیده است (14).

برای آن‏که بتوان به مطالعات فیزیولوژیک Nurr1 پرداخت و آزمایش‏های نورون‏زایی و حفاظت نورونی آن را به‏سهولت استمرار بخشید، اغلب بایستی افزایش بیان Nurr1 را در پیش گرفت. در این مطالعه لنتی ویروس‏های نوترکیب ساخته شده است که با آن‏ها بتوان سلول‏های تقسیم پذیر و همچنین سلول‏های تمایز یافته به‏ویژه نورون‏ها را قادر به بیان افزایشی Nurr1 ساخت.

مواد و روش‏ها

تهیه پلاسمیدهای ویروسی: ناقل‏های ویروسی شامل ناقل بسته بندی، پوششی و ناقل انتقال (15) با استفاده از کیت شرکت کیاژن خالص سازی شدند.

ساب کلونینگ در ناقل لنتی ویروسی: در مرحله اول قطعه 1.6Kb IRES-EGFP با استفاده از آنزیم‏های BglII/NotI از روی ناقل pIRES2-EGFP برش داده شد و با آنزیم Klenow  دو سر آن Blunt شد. به‏طور هم‏زمان ناقل pNL-EGFP  که یک ناقل بیانی لنتی ویروسی می‏باشد تحت تیمار آنزیم‏های NheI/XhoI قرار داده شد که با این تیمار آنزیمی یک قطعه‏ی 752 bp مربوطه به توالی GFP داخل ناقل از آن جدا شد. سپس با استفاده از آنزیم Klenow دو سر ناقل مزبور Blunt شد. پس از الکتروفورز محصولات  حاصل از واکنش‏های هضم آنزیمی بر روی ژل آگاروز، قطعات 1.6 Kb از ژن مورد نظر و 9 Kb ناقل از روی ژل بریده  شد و با استفاده از کیت استخراج از ژل از شرکت کیاژن تخلیص شد. واکنش اتصال (لیگاسیون) با نسبت 1 به 3  به ترتیب برای ناقل و قطعه هدف با آنزیم لیگازT4 در دمای 16 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 16 ساعت انکوبه شد. سپس  10 میکرولیتر از محصول واکنش اتصال به حجم 50 میکرولیتر از باکتری‏های مستعد Top10 افزوده شد و واکنش ترانسفورماسیون با روش شوک حرارتی در دمای 42 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 90 ثانیه  انجام شد. بعد از انتقال محصول  بر روی پلیت حاوی آنتی بیوتیک آمپی‏سیلین غربال کلون‏ها با استفاده از  تست‏های آنزیمی انجام گرفت و کلون مثبت به‏نام سازه شماره I نام‏گذاری شد.

در مرحله دوم قطعه 2/2 کیلو بازی ژن Nurr1  با استفاده از آنزیم‏های XhoI و BamHI از روی ناقل PCMX-NOT بریده شد و هم‏زمان سازه شماره I که اینک IRES-EGFP به آن متصل شده بود نیز با استفاده از آنزیم‏های SalI و BamHI  خطی شد. استخراج قطعات هدف از روی ژل و واکنش اتصال مانند مرحله قبل انجام شد. بعد از مرحله ترانسفورماسیون، کشت بر روی پلیت حاوی آمپی‏سیلین انجام گرفت. شناسایی و حصول اطمینان از کلون مثبت به‏نام سازه (II) به‏وسیله آنزیم‏های محدود کننده انجام شد. بعد از تایید کلون مثبت با برش‏های‏ مختلف آنزیمی غلظت بالای سازه نهایی به‏نام CMV-Nurr1-IRES-EGFP  با استفاده از کیت کیاژن آماده شد تا در نهایت برای تولید لنتی ویروس نوترکیب به‏کار گرفته شود.

 کشت سلول‏های HEK-293T: سلول‏های HEK-293T به‏عنوان مولد ویروس در محیط DMEM+10% FBS  در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و CO2، 5 درصد کشت و پاساژ داده شدند.  روز قبل از ترانسفکشن، دو میلیون سلول در پلیت‏های 10 سانتی‏متری مخصوص کشت سلول کشت داده شدند تا در روز بعد 50 تا 60 درصد پتری دیش را پر کنند. برای مرحله ترانسدوکسیون یا  آلوده سازی ویروسی نیز تعداد 50 هزار سلول HEK-293T  در پلیت 24 خانه، 24 ساعت قبل از آلوده سازی کشت داده شدند.

تولید ویروس‏های نوترکیب:  بعد از این‏که سلول‏ها 50 تا 60 درصد پلیت را پر کردند مرحله ترانسفکشن سلول‏ها انجام گرفت.  ترانسفکشن سلول‏ها با پلاسمیدهای ویروسی با روش رسوب DNA- فسفات کلسیم و به‏کمک محلول HEPES انجام شد (16). در این مرحله سلول‏های HEK-293T با استفاده از 3 ناقل ویروسی که شامل ناقل انتقال (CMV-Nurr1-IRES-EGFP)، ناقل بسته بندی و ناقل غشایی می‏باشند، به‏صورت هم‏زمان ترانسفکت شد و برای مدت 48 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد و CO2، 5 درصد  قرار داده شد. دوازده ساعت بعد محیط سلول‏ها تعویض شد و چهل و هشت ساعت بعد از ترانسفکشن، محیط رویی (سوپرناتان) سلول‏ها  که حاوی ویروس‏های نوترکیب می­باشد جمع آوری و با فیلترهای سرنگی 4/0 میکرونی عبور داده شد. برای تهیه ذخیره غلیظی از ویروس که جهت ترانسدوکسیون موثر مورد نیاز بود، محیط رویی فیلتر شده به  ستون‏های Amicon-100 (شرکت Millipore) منتقل شده و به‏مدت 10 دقیقه در 3500 دور در دمای 4 درجه  سانتی‏گراد سانتریفوژ شد. در این مرحله بخش اعظم محیط رویی از فیلتر ستون عبور کرده و بخش کوچکی از آن که حاوی ذرات ویروسی بود به‏عنوان ذخیره (استوک) تغلیظ شده ویروسی جمع آوری شد.

آلوده کردن سلول‏های هدف با ویروس نوترکیب: غلظت‏های مختلف ذخیره ویروسی مستقیما برای آلوده کردن سلول‏های هدف مورد استفاده قرار گرفت و 72 ساعت بعد نیز از سلول‏های بیانگر EGFP در زیر میکروسکوپ فلورسنس عکس‏برداری شد.

RT PCR: برای انجام RT-PCR ابتدا cDNA سلولی تهیه شد. برای این‏کار سلول‏های ترانسفکت شده با تریپسین تیمار و جمع‏آوری شد. پس از سانتریفوژ، RNA سلول‏ها با محلول RNAX و طبق دستورالعمل مربوطه با استفاده از کیت شرکت کیاژن استخراج شد. بعد از تعیین غلظت RNA استخراج شده به‏ازای یک میکرولیتر از RNA استخراج شده یک میکرولیتر DNase به آن اضافه شد. سپس به‏کمک آنزیمReverse Transcriptase و یک هگزامر تصادفی از آن cDNA ساخته شد. برای انجام PCR از یک جفت پرایمر اختصاصیNurr1  استفاده شد تا بخشی از cDNA مربوط به این ژن تکثیر شد.

 

نتایج

تولید موفقیت آمیز سازه­ها

برای آنکه ترانسفکشن و ترانسدوکشن در مراحل اولیه تست و از تولید موفقیت آمیز ویروس نوترکیب اطمینان حاصل شود، لازم است که ژن گزارشگر (Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP) نیز همراه با Nurr1 در سازه لنتی ویروسی شماره نهایی گنجانده شود. برای این‏کار، ابتدا IRES-EGFP در ناقل انتقال لنتی ویروسی وارد شد تا سازه شماره I به‏دست آید. صحت ساخت این سازه با برش آن به‏وسیله آنزیم‏های مختلف به اثبات رسید (شکل 1).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1:ساخت سازه لنتی ویروسی (I). A: شمای خطی از سازه لنتی ویروسی (I) که ناقل قطعهIRES-EGFP می باشد. B: تست درستی پلاسمید I با برش آنزیمی و ژل الکتروفورز. از چپ به راست: 1- 1Kb DNA Ladder ، 2- پلاسمید اولیه انتقال، 3- پلاسمید حاوی قطعه IRES-EGFP ، 4- سازه لنتی ویروسی (I). تمام نمونه‏ها با آنزیم‏های Sfi1/BamH 1  برش یافته اند. قطعات مورد انتظار برای پلاسمیدها شامل 9 KB برای پلاسمید اولیه انتقال،  قطعات 3.2 KB و 2.8 KB برای پلاسمید حاوی قطعه IRES-EGFP ، و قطعات 1.6 KB . 8.8 KB برای پلاسمید (I).

 

 

 

پلاسمید بیانی (A) ناقل ژن Nurr1  به‏نام PCMX-NOT از آزمایشگاه Dr.T.Perlmann در سوئد تهیه و با آنزیم‏های XhoI و BamHI برش داده شد تا قطعه 2/2 کیلوبازی Nurr1 جدا شود. سازه شماره I نیز با آنزیم‏های SalI و BamHI برش داده شد تا پذیرای قطعه 2/2 کیلوبازی Nurr1 شود. بدین ترتیب سازه لنتی ویروسی (II) به‏عنوان سازه نهایی انتقال به‏وجود آمد که مجموعه CMV-Nurr1-IRES-EGFP را با خود حمل می‏کرد (شکل 2-A).  آنالیز نمونه کلون به‏دست آمده با چندین دسته برش آنزیمی و ژل الکتروفورز درستی آنرا به اثبات رساند و برای نمونه این آنالیز با یک ست آنزیم در شکل (2-B) نشان داده شده است.

 

 

شکل 2:ساخت سازه لنتی ویروسی (II)A: شمای خطی از سازه لنتی ویروسی (II) که ناقل ژن Nurr1 و ژن گزارشگر EGFP  می‏باشد. B: تست صحت پلاسمید (II) با برش آنزیمی و ژل الکتروفورز. نمونه‏ها به‏ترتیب از چپ به راست:1- 1KB DNA Ladder ، 2- سازه لنتی ویروسی (I)، 3- پلاسمیدA حاوی ژن hNurr1 ، سازه لنتی ویروسی (II) به‏عنوان کلون مثبت. همگی این نمونه‏ها با آنزیم EcoR1 برش یافته‏اند. قطعات مورد انتظار برای پلاسمیدهای برش یافته به‏ترتیب عبارتند از: 1.8Kb و12.1Kb برای پلاسمید (II) و12Kb برای پلاسمید  (I)،  1.8 و5.9Kb برای پلاسمید A .

 

موفقیت ترانسفکشن و ترانسدوکشن با بیان ژن گزارشگر EGFP

برای تولید ویروس نوترکیب و بر طبق دستور العمل بخش روش‏ها، سلول‏های HEK-293T با سازه لنتی ویروسی (II) به‏همراه سازه‏های بسته بندی و غشایی ویروس ترانسفکت شدند.  سلول‏های ترانسفکت شده 24 ساعت بعد در زیر میکروسکوپ فلورسنس بررسی شده و تصویر آن‏ها تهیه شد. این بررسی بیان ژن EGFP را نشان داد (شکل 3). برای ترانسدوکشن ویروسی، محیط رشد سلول‏های ترانسفکت شده که مملو از ذرات ویریونی بود جمع آوری وتغلیظ شد تا ذخیره ویروسی غلیظ به‏دست آید. سپس گروه جدیدی از سلول‏های HEK-293T برای ترانسدوکشن با این ذخیره غلیظ به‏کار برده شد. این سلول‏ها نیز 48 ساعت پس از ترانسدوکشن در زیر میکروسکوپ مشاهده شد و این بررسی بیان EGFP را به اثبات رسانید (شکل 4).

 

 

شکل 3: بیان EGFP در  24 ساعت بعد از ترانسفکشن در سلول‏های HEK-293T . سلول‏های مزبور با سازه لنتی ویروسی (II) به‏همراه سازه‏های بسته بندی و غشائی ویروس ترانسفکت شده‏اند.

 

شکل 4: بیان EGFP در  48 ساعت بعد از ترانسدوکشن سلول‏های HEK-293T. سلول‏های مزبور با ذخیره تغلیظ شده لنتی ویروسی آلوده شده اند.

 

افزایش بیان ژن Nurr1

متعاقب بیان موفقیت آمیز ژن گزارشگر EGFP هم در مرحله ترانسفکشن و هم ترانسدوکشن، میزان بیان Nurr1 نیز به‏عنوان ترانسژن اصلی با روش RT-PCR سنجیده شد. پرایمرهای زیر برای تکثیر قطعه 301 جفت بازی از ژن Nurr1 مورد استفاده قرار گرفت:

Fwd: 5’-5'-CGACATTTCTGCCTTCTCCT-3'

Rv: 5’-5'-GAAAGGTAAGGTGTCCAGGA-3'

نتیجه آزمایش‏های مزبور نشان داد که ژن Nurr1 به مقدار قابل توجهی در مرحله ترانسفکشن و تا حدود متوسط در مرحله ترانسدوکشن بیان شده است (شکل 5). این نتایج موفقیت تولید ویروس‏های نوترکیب و بیان ژن Nurr1 را در سلول‏های انسانی به اثبات رسانید.

1

2

3

4

شکل5: بیان ژن Nurr1 در سطح RNA  در سلول‏های ترانسفکت شده و ترانسدوکت شده. (1) مارکر 100 bp Ladder ، (2) کنترل آب بدون سلول، (3) سلول‏های ترانسفکت شده با pLV-hNurr1، (4) سلول‏های ترانسفکت شده با pLV-hNurr1.

 

بحث

ژن درمانی یک روش  قدرتمند برای درمان بیماری‏های ژنتیکی به‏شمار می‏رود که در این راستا لنتی ویروس‏ها به‏دلیل توانایی بالای آن‏ها در القا و بیان طولانی مدت ژن هدف در ژنوم سلول، یکی از ابزارهای بسیار قوی برای ژن درمانی محسوب می‏شود.

در بیماری‏های زوال نورونی همچون پارکینسون حفاظت نورون‏ها در برابر تخریب مطرح می‏شود. تحقیقات نشان داده است که بیان فاکتورهای موثر مانند Nurr1  نقش موثری در حفاظت و بقاء نورون‏ها ایفا می‏کنند به‏طوری‏که Nurr1  به‏عنوان مهم‏ترین فاکتور شکل‏گیری و بقای سلول‏های دوپامین ساز در ناحیه جسم سیاه به‏شمار می‏آید (17 و 18). تقویت بیان این فاکتور در مغز و یا پیوند سلول‏های مناسب بیان کننده این فاکتور به بافت مغزی می‏تواند راه‏گشای حفاظت نورونی در بیماری‏های زوال نورونی باشد (18 و 19).

در این پژوهش فاکتور رونویسی Nurr1  تحت سیستم‏های بیان دو ژنی در ناقلین لنتی ویروسی کلون شد به‏طوری‏که بعد از ژن قطعه IRES-EGFP قرار گرفت تا بیان ژن‏ها را در سلول‏های هدف در زیر نور فلورسنت به‏طور مستقیم مشاهده کنیم. IRES  در زمان نسخه برداری سبب می‏شود که tRNA بعد از رسیدن به کدون پایانی ژن اول، اتصال  خود را به mRNA ادامه داده و ژن دوم را نیز نسخه برداری کند بنابراین بیان ژن EGFP نشان‏دهنده بیان ژن اول در سیستم های بیان دو ژنی می‏باشد.

در این مطالعه از ناقلین لنتی ویروسی برای انتقال ژن استفاده شد. لنتی ویروس‏ها به‏دلیل داشتن خصوصیات برجسته در سال‏های اخیر مورد توجه قرار گرفته اند. این ویروس‏ها متعلق به خانواده رترو ویریده بوده و همانند رترو ویروس‏ها قادرند پس از ورود به سلول میزبان ژنوم خود را به‏داخل ژنوم میزبان وارد سازند. رترو ویروس‏ها زمانی قادرند این کار را انجام دهند که سلول در حال تقسیم باشد ولی لنتی ویروس‏ها می‏توانند بدون نیاز به تقسیم سلولی وارد هسته سلول میزبان شده و ژنوم خود را به‏داخل ژنوم میزبان متصل کنند، از این رو نامزد مناسبی برای ژن درمانی سلول‏های غیر تقسیم شونده از قبیل سلول‏های عصبی به‏شمار می‏روند (20). در این مطالعه ما توانستیم لنتی ویروس‏های نوترکیب ناقل ژن Nurr1 را با موفقیت تولید کنیم که می‏توانند در مطالعات بعدی به‏منظور بررسی افزایش بیان این ژن در مقابله با عوامل گوناگون از جمله رادیکال‏های آزاد و فاکتورهای متاثر کننده سلول‏های عصبی مورد استفاده قرار گیرند.

نتیجه گیری

در این پژوهش کاربرد موفقیت آمیز ناقلین لنتی ویروسی در انتقال ژن به سلول‏های یوکاریوتی مشخص شد و نشان داده شد که این ناقلین می توانند در درمان بیماری های درگیر کننده سیستم عصبی از قبیل آلزایمر و پارکینسون مورد استفاده قرار گیرند.

 

تشکر و قدردانی

این مقاله حاصل یک طرح پژوهشی مصوب دانشگاه آزاد اسلامی، واحد آیت اله آملی در آمل، مازندران می‏باشد و کلیه هزینه‏های آن توسط این دانشگاه تامین شد.

منابع

1-Mandel S, Grünblatt E, Riederer P, Gerlach M, et al. Neuroprotective strategies in Parkinson's disease : an update on progress. CNS Drugs. 2003; 17(10): 729-62.

2-Sakurada K, Ohshima-Sakurada M, Palmer TD, Gage FH. Nurr1, an orphan nuclear receptor, is a transcriptional activator of endogenous tyrosine hydroxylase in neural progenitor cells derived from the adult brain. Development. 1999; 126: 4017–4026.

3-Kim KS, Kim CH, Hwang DY, et al. Orphan nuclear receptor Nurr1 directly transactivates the promoter activity of the tyrosine hydroxylase gene in a cell-specific manner. J. Neurochem. 2003; 85 (3): 622–34.

Le WD, Conneely OM, Zou L, He Y, et al. Selective agenesis of mesencephalic dopaminergic neurons in Nurr1-deficient mice. Exp. Neurol. 1999; 159: 451– 458.

4-Zetterstrom RH, Solomin L, Jansson L, Hoffer BJ, et al. Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice. Science. 1997; 276: 248–250.

5-Wang Z, et al. Structure and function of Nurr1 identifies a class of ligand-independent nuclear receptors. Nature. 2003; 423(6939): 555–560.

6-Saucedo-Cardenas O, et al. Nurr1 is essential for the induction of the dopaminergic phenotype and the survival of ventral mesencephalic late dopaminergic precursor neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 1998; 95(7): 4013–4018.

6-Castillo SO, et al. Dopamine biosynthesis is selectively abolished in substantia nigra/ventral tegmental area but not in hypothalamic neurons in mice with targeted disruption of the Nurr1 gene. Mol Cell Neurosci. 1998; 11(1-2): 36–46.

7-Zheng K, Heydari B, Simon DK. A common NURR1 polymorphism associated with Parkinson disease and diffuse Lewy body disease. Arch Neurol. 2003; 60(5): 722–725.

8- Grimes DA, et al. Translated mutation in the Nurr1 gene as a cause for Parkinson’s disease. Mov Disord. 2006; 21(7): 906–909.

9- Le W, Conneely OM, He Y, Jankovic J, et al. Reduced Nurr1 expression increases the vulnerability of mesencephalic dopamine neurons to MPTP-induced injury. J Neurochem. 1999; 73(5): 2218–2221.

10- Zhang L, Le W, Xie W, et al. Age-related changes in dopamine signaling in Nurr1 deficient mice as a model of Parkinson’s disease. Neurobiol Aging. 2012; 33(5): 1001.

11- Kitagawa H, Ray WJ, Glantschnig H, et al. A regulatory circuit mediating convergence between Nurr1 transcriptional regulation and Wnt signaling. Mol Cell Biol. 2007; 27(21): 7486-7496.

12- Saijo K, Winner B, Carson CT, et al. A Nurr1/CoREST pathway in microglia and astrocytes protects dopaminergic neurons from inflammation-induced death, Cell. 2009; 137(1): 47-59.

13- Esmaeilzadeh E, Gardaneh M, Vaziri HR. The Concomitant Effect of Shikonin and Glutathione Peroxidase-1 on Enhanced Survival of Dopaminergic Neurons against Parkinsonian Toxicity. J  Cell Tissue. 2012; 3(2): 153-160.

14- Rahimi Shamabadi A, Gardaneh M, Alipanah M, Gharib E. Transfectability and transducibility of chicken liver cell line LMH compared to human cell line HEK-293T. J Cell Tissue (Arak). 2011; 1(2): 47-56.

15- Alavian KN, Scholz C, SimonHH. Transcriptional regulation of mesencephalic dopaminergic neurons: the full circle of life and death. Mov Disord. 2008; 23:319 –328.

16-  Gardaneh M. Dopamine-synthesizing neurons: an overview of their development and function. Irn J Biotechno. 2010: l 8: 213-28. Review

17- Hermanson E, Joseph B, Castro D, Lindqvist E, et al. Nurr1 regulates dopamine synthesis and storage in MN9D dopamine cells. Exp Cell Res. 2003;  288: 324 –334.

18- Wong L-F, Goodhead L, Prat C, Mitrophanous KA, et al. Lentivirus-Mediated Gene Transfer to the Central Nervous System: Therapeutic and Research Applications. HUMAN GENE THERAPY. 2006; 17(1): 1–9