اثر غلظت‏های مختلف سرب بر برخی پارامترهای فیزیولوژیکی در دو جمعیت از گیاه اسپند (Peganum harmala L.)

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، اصفهان، ایران

2 دانشگاه تحصیلات تکمیلی و فناوری پیشرفته کرمان، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، گروه بیوتکنولوژی، کرمان، ایران

-

چکیده

هدف: هدف از مطالعه حاضر بررسی اثر غلظت‌های سرب بر رشد و میزان آنتوسیانین، کلروفیل، کاروتنوئید، قندهای محلول، قندهای احیاء و آمینو اسیدهای آزاد در جمعیت‌هایی از گیاه اسپند می‌باشد.
مواد و روش‌ها: گیاهانی از دو جمعیت مختلف اسپند (فلز دوست منطقه کوشک یزد و غیر فلز دوست منطقه کرمان) در شرایط هیدروپونیک کشت داده شدند. سپس گیاهان به‏مدت 14 روز تحت تیمار غلظت‌های 0، 5، 10، 25 و 50 میلی‌گرم در لیتر سرب قرار گرفتند. در پایان آزمایش میزان پارامترها توسط اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری و محاسبه شد.
نتایج: نتایج نشان دادند که افزایش غلظت سرب در محلول غذایی باعث کاهش طول ریشه گیاهان می‌شود و بین دو جمعیت تفاوت معنی‏داری وجود دارد. به‏طور کلی میزان رنگیزه‌های کلروفیل و کاروتنوئید تحت غلظت‌های سرب، به‏ویژه تحت بالاترین تیمار سرب (50 میلی‌گرم در لیتر) در هر دو جمعیت کاهش یافتند. همچنین میزان آنتوسیانین، قندهای محلول و آمینواسیدهای آزاد در هر دو جمعیت افزایش یافتند.
نتیجه گیری: مقادیر بالاتر آنتوسیانین، قندهای محلول و آمینواسیدهای آزاد در جمعیت فلز دوست، نشان دهنده ظرفیت بهتر مقاومت به سرب در این جمعیت است.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


وجود مقادیر سمی فلزات سنگین در محیط زیست گیاهان باعث ایجاد تغییرات فیزیولوژیک شده و می­­­تواند موجب کاهش توان رشد گیاه و در حالت شدیدتر باعث از بین رفتن گیاه شود. گیاهان حساس در چنین شرایطی آسیب دیده و از بین می­روند در حالی‏که گیاهان مقاوم در این شرایط همچنان به رشد و تولید مثل خود ادامه می­دهند. علائم سمیت سرب در گیاه شامل جلوگیری از رشد، کلروز و سیاه شدن سیستم ریشه می­باشد. وقتی سرب حتی در مقادیر کم وارد سلول می­شود گستره وسیعی از اثرات مضر را روی فرآیندهای فیزیولوژیکی گیاه ایجاد می­کند از جمله باعث ممانعت از فعالیت آنزیم‏ها، اختلال در تغذیه معدنی و تعادل آب گیاه می­شود. همچنین باعث تغییر وضعیت هورمون­ها شده و ساختار و نفوذپذیری غشا را تحت تاثیر قرار می­دهد. این اختلالات، فعالیت­های معمول فیزیولوژیکی گیاهان را بر هم زده و در غلظت­های بالا ممکن است منجر به مرگ سلول نیز شود (1). سمیت سرب باعث کاهش درصد جوانه­زنی، شاخص جوانه­زنی، شاخص تحمل، طول گیاه و توده خشک گیاه می­شود (2).

گیاهانی که در معرض سرب قرار می­گیرند کاهش میزان فتوسنتز را نشان می­دهند که ناشی از تخریب فرا ساختار کلروپلاست، جلوگیری از سنتز کلروفیل، پلاستوکوئینون و کارتنوئیدها، ممانعت از انتقال الکترون و جلوگیری از فعالیت آنزیم­های چرخه کالوین است. سرب با ایجاد اختلال در جذب فلزات ضروری مثل منیزیم و آهن مانع از سنتز کلروفیل می­شود (2 و 3). افزایش تخریب کلروفیل در گیاهان تیمار شده با سرب ناشی از افزایش فعالیت کلروفیلاز می­باشد. گزارش شده که در تیمار سرب کلروفیل b بیشتر از کلروفیلa  تحت تاثیر قرار می‏گیرد (4 و 5).

یکی از اثرات سمی سرب القا تنش اکسیداتیو در گیاهان به‏دلیل افزایش تولید گونه­های اکسیژن فعال(ROS)  می­باشد که نتیجه عدم تعادل حالت ردوکس سلولی است (6 و 7). در بسیاری از گیاهان نقش کربوهیدرات­ها به‏عنوان یک عامل تنظیم کننده اسمزی در تنش­های محیطی پذیرفته شده است. چندین گزارش بر روی تجمع کربوهیدرات در تنش­های زیستی و غیر­زیستی وجود دارد (8 و 9). آنتوسیانین­ها دسته ای از فلاونوئیدها هستند که به‏طور گسترده­ای در گیاهان وجود دارند (10). اتصال آنتوسیانین به برخی فلزات و کاهش اثرات سمی آن‏ها گزارش شده است (11). همچنین مطالعات دیگری افزایش تجمع آنتوسیانین را با افزایش یافتن غلظت فلز سنگین گزارش کردند  (12،13 و 14). اسپند با نام علمی Peganum harmala L. گیاهی چند ساله از خانواده Zygophylaceae است که مصارف دارویی فراوانی دارد. با توجه به دامنه رشد گسترده اسپند در خاک‏های نواحی مختلف فلز­دوست و غیرفلزدوست، بررسی مقاومت این گیاه به فلزات سنگین حائز اهمیت است. این تحقیق با هدف بررسی تغییرات رشد و برخی واکنش‏های فیزیولوژیک در شرایط تنش ناشی از افزایش سرب و مقایسه بین دو جمعیت فلزدوست و غیر فلز دوست اسپند انجام شده است.

 

مواد و روش‏ها

به‏منظور ارزیابی مقاومت به سرب، بذر دو جمعیت گیاه اسپند انتخاب شد. یک جمعیت فلزدوست از خاک­های آلوده به سرب و روی منطقه معدنی کوشک بافق یزد و دیگری جمعیت غیرفلزدوست از خاک­های منطقه ماهان کرمان که غیرآلوده می‏باشد انتخاب شد. بذرها حداقل از 25 گیاه جمع آوری شده بودند. جهت کشت بذر، گلدان­های پلاستیکی به قطر 9 سانتیمتر حاوی مخلوطی از پرلیت ریز و درشت تهیه شد. در هرگلدان تعداد 6 عدد بذر گیاه اسپند کاشته شد و 3 تکرار در هر غلظت از تیمار در نظر گرفته شد. پس از گذشت 5 روز آبیاری با آب مقطر گیاهچه­های حاصل به‏مدت 40 روز با محلول غذایی هوگلند اصلاح شده تغذیه شدند (15). سپس گیاهان به محلول آزمایش منتقل شدند که ترکیب آن مشابه محلول هوگلند فوق بود اما بدون NH4H2PO4 و Fe(Na)-EDTA به‏دلیل جلوگیری از رسوب فسفات سرب و تشکیل کمپلکس Pb-EDTA ناشی از جایگزینی آهن تهیه شد. گیاهچه­ها به‏مدت 14روز تحت تاثیر غلظت­های مختلف سرب قرار گرفتند. غلظت­های مختلف سرب با استفاده از نمک نیترات سرب 2) (Pb(NO3) تهیه شد. تیمارها به‏صورت 0، 5، 10، 25 و 50 میلی­گرم در لیتر سرب در نظر گرفته شد. pH محلول غذایی و محلول غذایی حاوی سرب در محدوده 5/5 تنظیم شد. محلول­های غذایی هر هفته با محلول‏های تازه جایگزین گردید و گیاهان در اتاقک کشت با دمای متناوب 20/25 درجه سانتی­گراد (شب/روز)، تناوب نوری (16 ساعت نور)، شدت نور 200 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه رشد کردند.

اندازهگیریطولاندامهواییوریشه: در پایان تیماردهی، طول ساقه و ریشه با استفاده از خط­کش اندازه­گیری شد. طول ساقه از یقه تا قسمت انتهای ساقه و طول ریشه از یقه تا انتهای ریشه در نظر گرفته شد. برای هر تیمار بیش از 3 تکرار در نظر گرفته شد و مقادیر بر اساس سانتیمتر گزارش شد .

استخراج قند از بافت­های گیاهی: برای استخراج قند، بافت گیاهی مورد نظر را به‏مدت 24 ساعت در دمای 70 تا 80 درجه سانتی­گراد خشک کرده و سپس 01/0 گرم از بافت خشک به تعداد 3 تکرار در هر تیمار توزین شد و با 10 میلی‏لیتر آب مقطر گرم در هاون سائیده شد و با کاغذ صافی صاف گردید.

برای اندازه­گیری هیدرات­های کربن محلول از روش فنل- اسید سولفوریک استفاده شد. در این روش اکثر قندها شامل مونوساکاریدها، دی ساکاریدها، اولیگوساکاریدها قابل شناسایی می­باشند. اسید سولفوریک، دی ساکاریدها، اولیگوساکاریدها و پلی ساکاریدها را به واحدهای کوچکتر یعنی مونوساکارید می‏شکند. سپس پنتوزها یا قندهای پنج کربنه به فورفورال دهیدراته شده و هگزوزها یا قندهای شش کربنه به هیدروکسی متیل فورفورال دهیدراته می­شوند. این ترکیبات سپس با فنل واکنش داده و در اثر این واکنش، رنگ زرد طلائی حاصل می‏شود که این رنگ تا چند ساعت پایدار باقی می­ماند. با خواندن جذب ترکیب رنگی هر نمونه در طول موج 490 نانومتر می­توان به مقدار قند محلول نمونه پی برد. به این منظور 2 میلی­لیتر از عصاره گیاهی استخراج شده را با 50 میکرولیتر فنل 80 درصد وزنی (حل شده در آب مقطر) مخلوط کرده و سپس 5 میلی­لیتر اسید سولفوریک غلیظ به صورت عمود بر سطح مایع به آن اضافه شد. این مخلوط به‏مدت 10 دقیقه در محیط نگه‏داری شده و پس از آن به‏مدت 15 دقیقه در حمام آب­ گرم 25 تا 30 درجه سانتی­گراد قرار داده شد و سپس جذب محلول در 490 نانومتر خوانده  شد (16). سپس منحنی استاندارد با استفاده از گلوکز خالص رسم شده و مقدار قندهای محلول با کمک این نمودار در یک گرم بافت گیاهی به‏دست آمد.

برای سنجش قندهای احیا، DNS (دی نیترو سالیسیلیک اسید) 1 درصد ، سود 6/1 درصد و تارتارات سدیم-پتاسیم 25 درصد  با کمک مگنت و روی هیتر به‏آرامی حل شد. سپس 2 میلی­لیتر از عصاره گیاهی استخراج شده با 1 میلی­لیتر از رنگ ساخته شده مخلوط و به‏مدت 10 دقیقه در حمام آب جوش 100 درجه سانتی­گراد قرار داده شد، سپس کل محلول به‏دست آمده با 10 میلی­لیتر آب مقطر مخلوط شد و جذب نمونه‏ها در 546 نانومتر خوانده شد و با کمک از گلوکز خالص منحنی استاندارد مربوط به میزان قندهای احیا محاسبه شد (17).

سنجش آنتوسیانین­ها: جهت اندازه‏گیری مقدار آنتوسیانین­ها، 1/0 گرم از اندام هوایی تازه گیاه در هاون چینی با 10 میلی­لیتر متانول اسیدی (متانول خالص و اسید کلریدریک خالص به نسبت حجمی 1:99) کاملا سائیده و به‏مدت 24 ساعت در تاریکی و دمای 25 درجه سانتی­گراد قرار گرفت. سپس 10 دقیقه در g 4000 سانتریفوژ و جذب محلول بالایی در طول موج 550 نانومتر اندازه‏گیری شد. با استفاده از ضریب خاموشی 33000 مول بر سانتی‏متر مکعب غلظت آنتوسیانین­ها محاسبه و نتایج بر حسب میکرومولار بر گرم وزن تر ارائه شد (18).

رنگدانه­های فتوسنتزی: اندازه‏گیری مقدار رنگیزه­های فتوسنتزی شامل کلروفیل a، b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها با استفاده از روش Lichtenthaler (1987) انجام پذیرفت. 2/0 گرم از برگ­های تازه گیاه با 15 میلی‏لیتر استن 80 درصد سائیده شده و پس از صاف کردن جذب آن‏ها با دستگاه اسپکتروفتومتر (Carry 50  استرالیا) در طول موج­های 8/646، 20/663 و 470 نانومتر خوانده شد و غلظت رنگیزه­ها با استفاده از رابطه‏های زیر و بر حسب میلی­گرم بر گرم وزن تر محاسبه شد:

Chla= (12.25 A663.2-2.79 A646.8)

Chlb= (21.21 A646.8-5.1 A663.2) 

ChlT= chla+chlb                             

Car= [1000 A470-1.8 chla-85.02 chlb] /198

در این فرمول chla، chlb، chlT و car به‏ترتیب غلظت کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها (شامل کاروتن­ها و گزانتوفیل­ها) می­باشد (19).

                :(FAA)اندازه­گیری مقدار آمینواسیدهای آزاد

مقدار آمینواسیدهای آزاد در نمونه‏ها از طریق رنگ سنجی با نین­هیدرین به‏دست آمد. 2/0 گرم بافت تازه برگی در 5 میلی‏لیتر بافر پتاسیم فسفات سرد 50 میلی مولار )8/6= (pH سائیده، به‏مدت 20 دقیقه در g18000 سانتریفیوژ شد. از محلول رویی برای سنجش آمینواسیدهای آزاد استفاده شد. یک میلی­لیتر معرف نین­هیدرین به 5 میلی لیتر نمونه افزوده شد. سپس، لوله­ها 4 تا 7 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 95 درجه سانتی­گراد قرار داده شدند. پس از سرد شدن، جذب نمونه ها در 570 نانومتر خوانده شد. برای محاسبه مقدار آمینواسیدهای آزاد از منحنی استاندارد گلیسین استفاده شد (20).

آنالیز آماری

تجزیه و تحلیل آماری داده­ها با استفاده از نرم افزار SPSS انجام شد. برای آنالیز نتایج، از روش آنالیز واریانس دو­ طرفه استفاده شد که در آن معنی‏دار بودن یا نبودن اثر تیمار سرب و جمعیت مورد آنالیز قرار گرفت. به‏منظور پی بردن به معنی­دار بودن یا نبودن تفاوت میانگین­ها در هر جمعیت بین تیمارهای مختلف از آزمون Tukey HSD استفاده شد. همچنین تفاوت بین دو جمعیت در هر غلظت از تیمار سرب با استفاده از آزمون t-test بررسی شد. کلیه نمودارها با استفاده از نرم افزار Excel رسم شدند.

نتایج

­شکل 1 نتایج آنالیز واریانس داده­های حاصل از اثر تیمار سرب را بر رشد طولی اندام هوایی گیاه اسپند نشان می دهد. طبق شکل، تیمار سرب باعث کاهش معنی­دار طول اندام هوایی گیاه نسبت به شاهد در هر دو جمعیت شده است. کمترین طول اندام هوایی در تیمار سرب 50 میلی­گرم در لیتر در هر دو جمعیت مشاهده شد (شکل 1).

 

 

شکل 1: اثر غلظت­های مختلف سرب بر طول اندام هوایی در دو جمعیت گیاه Peganum harmala (جمعیت فلزدوست کوشک و جمعیت غیر فلزدوست کرمان) بعد از دو هفته تیمار (میانگین طول اندام هوایی 12 گیاه از هر جمعیت ± خطای استاندارد. حروف غیر مشترک، به‏طور جداگانه در هر سری از جمعیت فلز دوست یا غیر فلز دوست، بیانگر وجود اختلاف معنی­دار بین تیمارها بر اساس آزمون Tukey HSD (05/0p<) است.

 

 

اولین نشانه قابل مشاهده سمیت سرب ممانعت از رشد ریشه می­باشد. جهت ارزیابی میزان مقاومت به سرب، پس از 14 روز تیمار میزان رشد ریشه گیاهان جمعیت­های مختلف اسپند اندازه­گیری شد (شکل 2). همان‏طور که در شکل 2 مشاهده می‏شود 14 روز پس از تیمار سرب، کاهش طول ریشه در هر دو جمعیت فلز دوست و غیر­ فلزدوست گیاه اسپند که در معرض تیمار سرب قرار گرفته بودند مشاهده می­گردد. نتایج آنالیز نشان داد که بین دو جمعیت تفاوت معنی‏داری وجود دارد، به‏طوری‏که کمترین طول ریشه در تیمار سرب 50 میلی­گرم در لیتر جمعیت غیر­فلزدوست مشاهده می‏شود. طول ریشه در تیمار سرب 50 میلی­گرم در لیتر جمعیت غیر­فلزدوست نسبت به شاهد 25 درصد کاهش نشان داد.

 

 

شکل 2: اثر غلظت­های مختلف سرب بر طول ریشه در دو جمعیت گیاه Peganum harmala (جمعیت فلزدوست کوشک و جمعیت غیر فلز دوست کرمان) بعد از دو هفته تیمار (میانگین طول ریشه 12 گیاه از هر جمعیت ± خطای استاندارد) حروف غیر مشترک، به‏طور جداگانه در هر سری از جمعیت فلزدوست یا غیر فلزدوست، بیانگر وجود اختلاف معنی‏دار بین تیمارها بر اساس آزمون Tukey HSD (05/0p<) است. علامت * نشان دهنده تفاوت معنی­دار بین دو جمعیت است.

 

 

تغییرات محتوای کلروفیل a، b و کل برگ در اثر تیمار سرب در شکل 3 نشان داده شده است. بر اساس شکل 3، میزان کلروفیل a، b و کل در غلظت­های مختلف تیمار سرب کاهش معنی­داری را نسبت به شاهد در هر دو جمعیت نشان می­دهند. نتایج حاصل از آنالیز واریانس تفاوت معنی­داری را در محتوای کلروفیل b و کل، بین دو جمعیت نشان می­دهد، به‏طوری‏که کمترین مقدار کلروفیل b و کل در تیمار سرب 50 میلی­گرم در لیتر سرب در جمعیت غیر فلزدوست مشاهده می­شود. بنابراین مقدار کلروفیل a، b و کل در تیمار سرب 50 میلی­گرم در لیتر نسبت به شاهد در جمعیت غیرفلزدوست به‏ترتیب 26، 40 و 29 درصد کاهش نشان داد.

شکل 4 نتایج آنالیز واریانس داده­های حاصل از اثر تیمار سرب را بر محتوای کاروتنوئید گیاه اسپند نشان می­دهد. تمام غلظت­های سرب باعث کاهش معنی­دار محتوای کاروتنوئید در هر دو جمعیت گیاه اسپند نسبت به شاهد شدند. غلظت­های 25 و 50 میلی­گرم در لیتر سرب جمعیت غیرفلزدوست و 50 میلی­گرم در لیتر سرب جمعیت فلزدوست، کمترین مقادیر کاروتنوئید را نسبت به بقیه غلظت­ها نشان دادند. بنابراین غلظت­های 25 و 50 میلی­گرم در لیتر سرب جمعیت غیرفلزدوست نسبت به شاهد به ترتیب 31 و 26 درصد کاهش نشان دادند و  50 میلی­گرم در لیتر سرب جمعیت فلزدوست نسبت به شاهد 27 درصد کاهش نشان داد.

نتایج حاصل از تاثیر غلظت­های مختلف سرب در شکل 5 نشان می­دهد که افزایش معنی­دار مقدار آنتوسیانین­ها در غلظت­های 25 و 50 میلی­گرم در لیتر سرب نسبت به شاهد در هر دو جمعیت مشاهده می‏شود، اما در غلظت­های 5 و 10 میلی­گرم در لیتر سرب در هر دو جمعیت تفاوت معنی­داری نسبت به شاهد مشاهده نمی­شود.

شکل 6 نتایج آنالیز واریانس داده­های حاصل از اثر تیمار سرب را بر محتوای قندهای محلول گیاه اسپند نشان می دهد. غلظت‏های مختلف سرب باعث افزایش معنی­دار این قندها در جمعیت فلز دوست گیاه اسپند شدند اما در جمعیت غیر فلز دوست تنها در غلظت 25 میلی­گرم در لیتر سرب باعث افزایش معنی­دار قندهای محلول نسبت به شاهد شدند، همچنین در بقیه غلظت­ها در جمعیت غیرفلزدوست تفاوت معنی­داری نسبت به شاهد مشاهده نشد.

بنابراین بین دو جمعیت در غلظت‏های 5 و 25 میلی­گرم در لیتر تفاوت معنی­داری مشاهده شد، به‏طوری‏که بیشترین مقدار قندهای محلول در غلظت 25 میلی­گرم در لیتر سرب در جمعیت فلزدوست مشاهده شد، به‏طوری‏که نسبت به کنترل 129 درصد افزایش نشان داد. نتایج نشان داد که غلظت‏های 5، 10 و 50 میلی­گرم در لیتر سرب در جمعیت غیر فلزدوست مقادیر کمتری را نشان دادند اما تفاوت معنی­داری نسبت به شاهد نشان ندادند. 

 

 

 

شکل 3: اثر غلظت­های مختلف سرب بر تغییرات غلظت کلروفیل a، b و کل در دو جمعیت گیاه Peganum harmala (جمعیت فلزدوست کوشک و جمعیت غیر فلزدوست کرمان) بعد از دو هفته تیمار (میانگین 3 تکرار ± خطای استاندارد). حروف غیر مشترک، به‏طور جداگانه در هر سری از جمعیت فلزدوست یا غیر فلزدوست، بیانگر وجود اختلاف معنی­دار بین تیمارها بر اساس آزمون Tukey HSD (05/0p<) است. علامت * نشان دهنده تفاوت معنی­دار بین دو جمعیت است.

 

 

شکل 4: اثر غلظت­های مختلف سرب بر تغییرات غلظت کاروتنوئید در دو جمعیت گیاه Peganum harmala (جمعیت فلز دوست کوشک و جمعیت غیر فلز دوست کرمان) بعد از دو هفته تیمار (میانگین 3 تکرار ± خطای استاندارد). حروف غیر مشترک، به‏طور جداگانه در هر سری از جمعیت فلزدوست یا غیر فلز دوست، بیانگر وجود اختلاف معنی­دار بین تیمارها بر اساس آزمون Tukey HSD (05/0p<) است. علامت * نشان دهنده تفاوت معنی­دار بین دو جمعیت است.

 

 

 

شکل 5: اثر غلظت­های مختلف سرب بر مقدار آنتوسیانین در دو جمعیت گیاه Peganum harmala (جمعیت فلزدوست کوشک و جمعیت غیر فلزدوست کرمان) بعد از دو هفته تیمار (میانگین 3 تکرار ± خطای استاندارد). حروف غیر مشترک، به‏طور جداگانه در هر سری از جمعیت فلز دوست یا غیر فلز دوست، بیانگر وجود اختلاف معنی­دار بین تیمارها بر اساس آزمون Tukey HSD (05/0p<) است.

 

شکل 6: اثر غلظت­های مختلف سرب بر مقدار قندهای محلول در دو جمعیت گیاه Peganum harmala (جمعیت فلزدوست کوشک و جمعیت غیر فلز دوست کرمان) بعد از دو هفته تیمار (میانگین 3 تکرار ± خطای استاندارد). حروف غیر مشترک، به‏طور جداگانه در هر سری از جمعیت فلزدوست یا غیر فلزدوست، بیانگر وجود اختلاف معنی­دار بین تیمارها بر اساس آزمون Tukey HSD (05/0p<) است. علامت * نشان دهنده تفاوت معنی­دار بین دو جمعیت است.

 

 

نتایج حاصل از تاثیر غلظت­های مختلف سرب در شکل 7 نشان می­دهد که غلظت­های مختلف سرب باعث افزایش معنی­دار قندهای احیا در جمعیت فلزدوست گیاه اسپند می­شوند اما در جمعیت غیر فلز دوست تنها در غلظت 25 میلی­گرم در لیتر سرب افزایش معنی­دار نسبت به شاهد مشاهده می­شود، در بقیه غلظت­های جمعیت غیر فلز دوست تفاوت معنی­داری نسبت به شاهد مشاهده نمی­شود. نتایج آنالیز نشان داد که بین دو جمعیت فلز دوست و غیر فلز دوست تفاوت معنی­داری مشاهده می­شود، به‏طوری‏که بیشترین مقدار قندهای احیاء در غلظت 25 میلی­گرم در لیتر سرب در جمعیت فلزدوست مشاهده می­شود، به‏طوری‏که نسبت به کنترل 281 درصد افزایش نشان داد. نتایج نشان داد که غلظت­های 5، 10 و 50 میلی­گرم در لیتر سرب در جمعیت غیر فلز دوست مقادیر کمتری را نشان دادند اما تفاوت معنی­داری نسبت به شاهد نشان ندادند. بنابراین در غلظت­های مختلف سرب، جمعیت فلز دوست افزایش معنی­داری در محتوای قندهای احیا نسبت به جمعیت غیر فلز دوست نشان می­دهد.

 

 

 

شکل 7: اثر غلظت­های مختلف سرب بر مقدار قندهای احیا شده در دو جمعیت گیاه Peganum harmala (جمعیت فلز دوست کوشک و جمعیت غیر فلز دوست کرمان) بعد از دو هفته تیمار (میانگین 3 تکرار ± خطای استاندارد). حروف غیر مشترک، به‏طور جداگانه در هر سری از جمعیت فلز دوست یا غیر فلز دوست، بیانگر وجود اختلاف معنی­دار بین تیمارها بر اساس آزمون Tukey HSD (05/0p<) است. علامت * نشان دهنده تفاوت معنی­دار بین دو جمعیت است.

 

با توجه به شکل 8 مشخص است که تیمار سرب در تمام غلظت‏‏ها باعث افزایش معنی­دار محتوای آمینواسیدهای آزاد نسبت به گیاهان شاهد در هر دو جمعیت شده است اما در غلظت 5 میلی­گرم در لیتر سرب در جمعیت غیر فلز دوست تفاوت معنی­داری نسبت به شاهد مشاهده نشد. همچنین بر طبق آنالیزهای انجام شده بین دو جمعیت تفاوت معنی­داری وجود دارد، به‏طوری‏که بیشترین مقدار آمینواسیدهای آزاد در غلظت 25 میلی­گرم در لیتر سرب در جمعیت فلزدوست در مقایسه با سایر غلظت­ها مشاهده شد، به‏طوری‏که نسبت به شاهد 338 درصد افزایش نشان داد. کمترین مقدار آمینو اسیدهای آزاد در غلظت 5 میلی­گرم در لیتر سرب در جمعیت غیر فلز دوست مشاهده شد اما تفاوت معنی داری نسبت به شاهد مشاهده نشد. بنابراین در غلظت­های مختلف سرب، جمعیت فلزدوست افزایش معنی­داری در محتوای آمینو اسیدهای آزاد نسبت به جمعیت غیر فلز دوست نشان داد.

 

 

*

*

شکل 8: اثر غلظت­های مختلف سرب بر مقدار آمینو اسیدهای آزاد در دو جمعیت گیاه Peganum harmala (جمعیت فلز دوست کوشک و جمعیت غیر فلز دوست کرمان) بعد از دو هفته تیمار (میانگین 3 تکرار ± خطای استاندارد). حروف غیر مشترک، به‏طور جداگانه در هر سری از جمعیت فلز دوست یا غیر فلز دوست، بیانگر وجود اختلاف معنی­دار بین تیمارها بر اساس آزمون Tukey HSD (05/0p<) است. علامت * نشان دهنده تفاوت معنی­دار بین دو جمعیت است.

 

 

بحث

وجود فلزات سنگین در محیط زیست گیاهان نوعی عامل تنش­زا می­باشد که باعث ایجاد تغییرات فیزیولوژیک شده و می­تواند موجب کاهش توان رشد گیاه و در حالت شدیدتر باعث از بین رفتن گیاه شود. گیاهان را بر اساس قابلیت رشد در خاک­های آلوده به فلزات سنگین به دو گروه حساس و مقاوم تقسیم می­­کنند. گیاهان حساس در این شرایط آسیب دیده و از بین می­روند، در حالی‏که گیاهان مقاوم در این شرایط همچنان به رشد و تولید مثل خود ادامه می­دهند (21). سرب از جمله عناصر سمی و غیر‏ضروری برای گیاهان است. آلودگی شدید سرب خاک ممکن است باعث مشکلات محیطی گوناگونی از جمله کاهش رویش، آلودگی آب‏های زیر زمینی و سمیت سرب در گیاهان، حیوانات و انسان شود (22). برای ارزیابی میزان مقاومت نسبت به سرب در گیاه اسپند، اثر غلظت­های مختلف سرب بر عملکرد طول ریشه و اندام هوایی دو جمعیت گیاه اسپند در شرایط هیدروپونیک مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج حاصله، افزایش غلظت سرب در محلول غذایی سبب کاهش طول ریشه و بخش هوایی در هر دو جمعیت شده است. اثر ممانعت­کنندگی سرب می‏تواند ناشی از تداخل سرب با فعالیت تعدادی از آنزیم‏های ضروری برای متابولیسم طبیعی و فرآیندهای نموی و همچنین عملکردهای متنوع فتوسنتزی باشد. مهار فتوسنتز علامت شناخته شده سمیت سرب است. این مهار به‏علت تمایل سرب به لیگاندهای پروتئینی N و S، کاهش فعالیت فردوکسین­-­­NADP+ ردوکتاز، کاهش فعالیت دلتا-آمینولوولینیک اسید دهیدراتاز به‏دلیل اتصال سرب به گروه­های –SH این آنزیم و مهار سنتز کلروفیل، مهار کاتالیز آنزیمی چرخه کالوین و افزایش فعالیت کلروفیلاز می­باشد (23 و 24).

سرب برای گیاهان بسیار سمی بوده و عموما ریشه­ها بسیار حساس­تر از بخش­های هوایی هستند (25). میزان رشد ریشه یک گیاه به‏عنوان یکی از شاخص­های مهم مقاومت گیاه نسبت به غلظت­های مختلف یک فلز سنگین می­باشد (26). همچنین از آن‏جا که ریشه به‏طور ویژه­ای به حضور فلزات سمی حساس می­باشد، طول ریشه به‏عنوان یکی از مهم­ترین معیارهای اثرات سمیت فلزات بر گیاهان معرفی شده است (27). علاوه بر این، اولین نشانه قابل مشاهده سمیت سرب، ممانعت از رشد ریشه می­باشد (28، 29 و 30). بنابراین در این بخش میزان رشد ریشه در غلظت­های مختلف سرب اندازه گیری شد. به‏وسیله تعدادی از محققین در مورد یک‏سری از گیاهان تغییرات نامطلوب در ظاهر ریشه­های تیمار شده با سرب از جمله قهوه­ای شدن ریشه، ممانعت از رشد و کاهش بیوماس گزارش شده است (30 و 31). دو هفته پس از تیمار سرب، کاهش طول ریشه به‏طور مشهودی در هر دو جمعیت فلز دوست و غیر فلزدوست گیاه اسپند که در معرض تیمار سرب قرار گرفته بودند قابل مشاهده بود. نتایج آنالیز نشان داد که بین دو جمعیت تفاوت معنی­داری از نظر رشد ریشه وجود دارد، به‏طوری‏که کمترین طول ریشه در تیمار سرب 50 میلی­گرم در لیتر جمعیت غیر ­فلز دوست مشاهده می شود که نشان دهنده وجود هر گونه سازش ریز تکاملی به غلظت بالای سرب در منطقه معدنی کوشک است. همچنین Mohtadi و همکاران (32) نشان دادند که Silene vulgarisو Noccaea caerulescens مقاومت به سرب در جمعیت‏های فلزدوست به‏طـور معنـی­داری بیشتـر از جمعیت­هـای غیر فلـزدوست

می‏باشد.

سرب طیف گسترده­ای از اثرات سمی مورفولوژیک، فیزیولوژیک و بیوشیمیایی را در موجودات زنده ایجاد می‏کند. این فلز رشد گیاه، افزایش طول ریشه، جوانه زنی بذر، تکوین گیاهچه، تعرق، تولید کلروفیل، سازماندهی لاملار در کلروپلاست و تقسیم سلولی را مختل می­سازد (33). فلزات سنگین عملکرد فتوسیستم های I و II را تحت تاثیر قرار داده و با تخریب و تجزیه پروتئین­های کلروفیلی گیرنده پروتون در فتوسیستم II، ظرفیت گرفتن پروتون و در نتیجه بازده فتوسنتز را کاهش می­دهند. کاهش نسبت chla/chlb تحت تیمار فلزات سنگین در مطالعات متعدد گزارش شده است (34). سرب رشد برگ، محتوای رنگیزه‏های فتوسنتزی و فعالیت های آنزیمی برای جذب CO2 را کاهش داده از طریق مهار بیوسنتز کلروفیل، محتوای کلروفیل کل و نسبت کلروفیل a و b را کاهش می­دهد. جایگزینی منیزیم مرکزی کلروفیل با سرب مانع از گرفتن نور و منجر به نقص فتوسنتز می­شود (35).Gupta  و همکاران (36) نشان دادند که مقدار رنگیزه­های فتوسنتزی ذرت در گیاهک­های رشد یافته هیدروپونیک تحت تنش سرب تنها در صورت مواجهه با غلظت­های بالای سرب کاهش می­یابد. کاروتنوئیدها در سمیت زدایی کلروفیل نقش دارند و باعث کاهش اثرات سمی رادیکال‏های آزاد می­شوند. همچنین کاهش چشمگیر محتوای کلروفیل و کاروتنوئید در گیاه لوبیا و حرا تحت تیمار سرب گزارش شده است (37 و 38). به‏طور کلی نتایج مطالعات مختلف نشان داد که تمامی فلزات سنگین به‏دلایل ذکر شده می­توانند باعث کاهش میزان کلروفیل شوند. در این پژوهش نیز اثر سرب بر گیاه اسپند باعث کاهش معنی‏دار در مقادیر کلروفیل­ها نسبت به گیاهان کنترل شد که با یافته­های دیگر همسو می­باشد (39 و 40).

یکی از ترکیبات فنلی آنتوسیانین است، که در پاسخ به انواع استرس­های اکسیداتیو افزایش می­یابد (41). همچنین نقش آنتوسیانین در سمیت­زدایی فلزات سنگین از طریق تشکیل کمپلکس­های فلز-آنتوسیانین می­باشد (11). Kumar و همکاران (42) پیشنهاد کردند که در گیاهان، سنتز آنتوسیانین استراتژی موثری بر علیه تولید ROS با توجه به تنش سرب می­باشد. غلظت­های 5/0 و 75/0 میلی­مولار سرب سنتز آنتوسیانین را در Talinum triangulare تحریک می­کنند. آنتوسیانین­ها از طریق مسیر فنیل پروپانوئید سنتز شده­اند. اولین مرحله آنزیمی تبدیل فنیل­آلانین به ترانس­سینامیک­اسید است که توسط فنیل­آلانین­آمونیوم­لیاز کاتالیز می­شود. بنابراین غلظت­های 25 و 50 میلی­گرم در لیتر سرب باعث تحریک فعالیت فنیل­آلانین­ آمونیوم­لیاز می ­شوند و در نتیجه تولید آنتوسیانین در گیاه اسپند افزایش می­یابد، که ممکن است آنتوسیانین به فلز باند شده و در سم­زدایی نقش داشته باشد. برخی از آمینو اسیدها و مشتقات آن‏ها در زمره مهم‏ترین کلاتورها و یا لیگاندهای فلزات سنگین می­باشند و در مقاومت به فلزات سنگین حایز اهمیت می­باشند (43). در این پژوهش نیز محتوای آمینواسیدهای آزاد در پاسخ به سرب در هر دو جمعیت روندی افزایشی داشت.

تنش­هایی مانند خشکی، شوری و حضور فلزات سنگین منجر به تغییر وضعیت و اختلال در تعادل اسمزی گیاهان می­شوند. گیاهان برای مقابله با تنش اسمزی ناشی از فلزات سنگین، مکانیسم­های سازشی مختلفی را به‏کار می­گیرند. گیاهان دارای مقاومت بالا از قبیل ذرت، تعادل اسمزی خود را با افزایش بیوسنتز متابولیت های محافظ مانند پرولین، بتائین و کربوهیدرات‏های احیا کننده حفظ می­نمایند. متابولیت­های قندی با تبدیل پلی­ساکاریدها و اولیگوساکاریدها به یکدیگر، تعادل اسمزی را کنترل می‏نمایند. کربوهیدرات­های احیا­کننده باعث کاهش خسارت­های اکسیداتیو و حفظ ساختار پروتئین­ها و آنزیم­ها در طول تنش می­شوند (44). افزایش قندهای محلول در اغلب شرایط تنش زا به‏عنوان یک مکانیسم تحمل در برابر تنش است و در واقع باعث تنظیم پتانسیل آب سلول در بخش سیتوزول برای مقابله با غلظت بالای یون‌های جذب شده و تجمع یافته در واکوئل می‌گردد. با کاهش انتقال آب به برگ­ها و به‏دنبال تجمع کادمیوم در سلول­ها، میزان قندهای محلول در گیاه افزایش می‏یابد. این ویژگی یک روش سازگاری گیاه برای حفظ شرایط اسمزی است. علاوه بر این افزایش قندهای محلول به گیاه کمک می­کند تا بتواند ذخیره کربوهیدراتی خود را برای حفظ متابولیسم پایه در شرایط تنش در حد مطلوب نگه دارد. Dubey (45)، Hurry (46) و Verma (47) گزارش کرده­اند که تنش ناشی از کادمیوم باعث افزایش قندهای محلول در 2 واریته از برنج شده است، به‏طوری‏که تنش ناشی از کادمیوم با تاثیر بر فعالیت آنزیم­های اینورتاز و سوکروز سنتتاز باعث افزایش قندهای محلول شده است.Aldoobie  و همکاران (37) افزایش معنی­دار قندهای احیا کننده گیاه لوبیا را تحت تیمار سرب نشان دادند (37). افزایش محتوای این قندها تحت آلودگی کادمیوم در گیاه جو نیز گزارش شده است (48).

نتیجه‏گیری

نتایج این پژوهش، افزایش معنی­دار محتوای قندهای احیا کننده تحت غلظت­های مختلف سرب را در هر دو جمعیت اسپند نشان داد. غلظت بالای کربو هیدرات­های احیا­ کننده باعث کاهش خسارت­های اکسیداتیو و حفظ ساختار پروتئین­ها و آنزیم­ها در طول تنش می­شود. همچنین با افزایش میزان قندهای محلول در گیاه اسپند، سازش گیاه را برای حفظ شرایط اسمزی نشان می­دهد. کاهش میزان رنگیزه­های فتوسنتزی، کاهش رشد طولی ریشه گیاه اسپند نشان از آثار سمیت سرب است. بنابراین با توجه به نتایج فوق به‏طور کلی می­توان بیان کرد که مقادیر بالاتر آنتوسیانین، قندهای محلول، قندهای احیا و آمینواسیدهای آزاد در جمعیت فلزدوست، نشان دهنده ظرفیت بهتر مقاومت به سرب در این جمعیت است.

تشکر و قدردانی

از معاونت پژوهشی دانشگاه اصفهان و همچنین قطب علمی تنش های گیاهی (دانشگاه اصفهان) به دلیل حمایت مالی از این تحقیق صمیمانه سپاسگزاری می شود.

1. Seregin IV, Ivaniov VB. Physiological aspects of cadmium and lead toxic effects on higher plants. Russ J Plant Physiol. 2001; 48(4): 606-630.

2. Sharma P, Dubey RS. Lead toxicity in plants. Braz J Plant Physiol. 2005; 17(1): 35–52.

3. Burzynski M. The influence of lead and cadmium on the absorbtion and distribution of potassium, calcium, magnesium and iron in cucumber seedlings. ACTA Physiol Plant. 1987; 9: 229-238.

4. Drazkiewiez M. Chlorophyll-occurrence, functions, mechanism of action, effects of internal and external factors. Photosynthetica. 1994; 30: 321-331.

5. Piotrowska A, Bajguz A, Godlewska-Z-Ylkiewicz B, Zambrzycka EB. Changes in growth, biochemical components, and antioxidant activity in aquatic plant Wolffia arrhiza (Lemnaceae) exposed to cadmium and lead. Arch Environ Contam Toxicol. 2010; 58: 594-604.

6. Reddy AM, Kumar SG, Jyonthsnakumari G, Thimmanaik S, et al. Lead induced changes in antioxidant metabolism of horsegram (Macrotyloma uniflorum (Lam.) Verdc.) and bengalgram (Cicer arietinum L.). Chemosphere. 2005; 60: 97–104.

7. Verma S, Dubey RS. Lead toxicity induces lipid peroxidation and alerts the activities of antioxidant enzymes in growing rice plants. Plant Sci. 2003; 164(4): 645-655. 

8. Meier H, Reid J.S. Reserve polysaccharides other than starch in higher plants. In: Encyclopedia of Plant Physiol, New series. Loewus FA., Tanner W (eds.). Springer- Verlag, Berlin; 1982; 13: 418-471.

9. Prado FE, Boero C, Gallarodo M, Gonzalez JA. Effect of NaCl on germination, growth and soluble sugar content in Chenopodium quinoa willd seeds. Bot Bull Acad Sinica. 2000; 41: 27-34.

10. Pascual-Teresa S, Sanchez-Ballesta MT. Anthocyanins: from plant to health. Phytochemistry Rev. 2007; 7: 281-299.

11. Boulton R. The copigmentation of anthocyanins and its role in the color of red wine: A critical review. Am J Enol Vitic. 2001; 52: 67-87.

12. Ayala-Silva T, Al-Hamdani SH. Interactive effects of polylactic acid with different aluminum concentrations on growth pigment concentrations, and carbohydrate accumulation of Azolla. Am Fern J. 1997; 87: 120-126.

13. Gardner JL, Al-Hamdani SH. Interactive effect of aluminum and humic substances on Salvinia. J Aquat Plant Manage. 1997; 35: 30-34.

14. Wilson G, Al-Hamdani SH. Effects of chromium (VI) and humic substances on selected physiological responses of Azolla caroliniana. Am Fern J. 1997; 87: 17-27.

15. Mohtadi A, Ghaderian SM. Evaluation of auxin (IAA) and kinetin effects on lead uptake and accumulation in Matthiola flavida Boiss. J Cell Tissue (JCT). 2012; 3(2): 161-169.

16. Dubois M, Gilles K, Hamilton J, Rebers P, et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem. 1956; 28(3):350–356.

17. Jeffries TW, Yang VW, Davis MW. Comparative study of xylanase kinetics using dinitrosalicylic, arsenomolybdate, and ion chromatographic assays. Appl Biochem Biotech. 1988; 70–72, 257–265.

18. Wagner GJ. Content and vacuole/extravacuole distribution of neutral sugars, free amino acids, and anthocyanin in protoplasts. Plant Physiol. 1979; 64(1): 88–93.

19. Lichtenthaler H.K. Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes. In: Methods in Enzymology, eds. L. Packer, and R. Douce. New York: Academic Press; 1987; 350–382.

20. Hwang M, Ederer GM. Rapid hippurate hydrolysis method for presumptive identification of group B streptococci. J Clin Microbiol. 1975; 1: 114-117.

21. Baker A.J.M, Mc Grath S.P, Reeves R.D, Smith J.A.C. Metal hyperaccumulator plants: a review of the ecology and physiology of a biological resource for phytoremediation of metal-polluted soils. In: Phytoremediation of contaminated soil and water (eds. Terry, N. and Banuelos, G.). CRC Press, Boca Raton, Florida, USA; 2000; 85-107.

22. Sekhar KC, Kamala CT, Chary NS, Balaram V, et al. Potential of Hemidesmus indicus for phytoextraction of lead from industrially contaminated soils. Chemosphere. 2005; 58(4): 507-514.

23. Han YL, Huang SZ, Gu JG, Qiu S, et al. Tolerance and accumulation of lead by species of Iris L. Ecotoxicology. 2008; 17(8): 853-859.

24. Sayed SA. Effects of lead and kinetin on the growth, and some physiological components of safflower. Plant Growth Regul. 1999; 29: 167-174.

25. Joseph LU, Andrea LC, Tarun KM. Effects of lead contamination on the growth of Lythrum salicaria (Purple loosestrife). Environ Pollut. 2002; 120(2): 319-323.

 

26. Archambault CJ, Winterhalder K. Metal tolerance in Agrostis scabra from the Sudbury Ontario area. Can J Bot. 1995; 73(5): 766-775.

27. Baker AJM, Walker PL. Ecophysiology of metal uptake by tolerant plants. In: Heavy metal tolerance in plants: evolutionary aspects (ed. Shaw, A. J.). CRC Press, Boca Raton, Florida. 1990; 155-177.

28. Almeida AF, Valle AA, Mielke MS, Gomes FP, et al. Tolerance and prospection of phytoremediator woody species of Cd, Pb, Cu and Cr. Plant Physiol. 2007; 19(2): 83-98.

29. Huang JW, Cunningham SD. Lead phytoextraction: species variation in lead uptake and translocation. New Phytol. 1996; 134(1): 75-84.

30. Piechalak A, Tomaszewaska B, Baralkiewisaz D. Accumulation and detoxification of lead ion in legumes. Phytochemistry. 2002; 60(2): 153-162.

31. Yang Y, Jung J, Song W, Sun H, et al. Identification of rice varieties with high tolerance or sensivity to lead and characterization of the mechanism of tolerance. Plant Physiol. 2000; 124: 1019-1026.

32. Mohtadi A, Ghaderian SM, Shat H. A comparison of lead accumulation and tolerance among heavy metal hyperaccumulating and non-hyperaccumulating metallophytes. Plant Soil. 2012; 352(1-2): 267-276.

33. Pourrut B, Shahid M, Dumat C, Winterton P, et al. Lead uptake, toxicity and detoxification in plants. Rev Environ Contam Toxicol. 2011; 213: 113-136.

34. Cheng S. Effect of heavy metals on plants and resistance mechanisms. Environ Sci Pollut Res. 2003; 10(4): 256-264.

35. Patra M, Bhowmik N, Bandopadhyay B, Sharma A. Comparison of mercury, lead and arsenic with respect to genotoxic effects on plant systems and the development of genetic tolerance. Environ Exp Bot. 2004; 52(3): 199-223.

36. Gupta DK, Nicoloso FT, Schetinger MRC, Rossato LV, et al. Antioxidant defense mechanism in hydroponically grown Zea mays seedlings under moderate lead stress. J hazard mater. 2009; 172(1): 479-484.

37. Aldoobie NF, Beltagi MS. Physiological, biochemical and molecular responses of common bean (phaseolus vulgaris L.) plants to heavy metals stress. Afr J Biotechnol. 2013; 12(29): 4614-4622.

38. Wang P, Zhang S, Wang C, Lu J. Effects of Pb on the oxidative stress and antioxidant response in a Pb bioaccumulator plant Vallisneria natans. Ecotoxicol Environ Saf. 2012; 78: 28-34.

39. Akinci IE, Akinci S, Yilmaz K. Response of tomato (Solanum lycopersicum L.) to lead toxicity: growth, element uptake, chlorophyll and water content. Afr J Agric Res. 2010; 5: 416–423.

40. Shu X, Yin LY, Zhang QF, Wang WB. Effect of Pb toxicity on leaf growth, antioxidant enzyme activities, and photosynthesis in cuttings and seedlings of Jatropha curcas L. Environ Sci Pollut Res. 2012; 19(3): 893–902.

41. Doong RL, MacDonald GE, Shilling DG. Effect of fluoridone on chlorophyll, carotenoid, and anthocyanin content of Hydrilla. J Aquat Plant Manage. 1993; 31: 55-59.

42. Kumar A, Prasad MNV, Sytar O. Lead toxicity, defense strategies and associated indicative biomarkers in Talinum triangulare grown hydroponically. Chemosphere. 2012; 89(9): 1056-1065.

43. Baker A.J.M, McGrath S.P, Reeves R.D, Smith J.A.C. Metal hyperaccumulator plants: a review of the ecology and physiology of a biological resource for phytoremediation of metal-polluted soils. In: Phytoremediation of Contaminated Soil and Water (eds. Terry, N. and Banuelos, G.). CRC Press, Boca Raton, Florida, USA; 2000; 85-107.

44. Dubey R.S. Photosynthesis in plants under stressfull conditions.In:Pessarakli, M.(eds) Hand book of photosynthesis. Dekker New York; 1997; 859-876.

45. Dubey RS, Singh AK. Salinity induces accumulation of soluble sugars and alters the activity of sugar metabolizing enzymes in rice plants. Plant Biol. 1999; 42: 233-239.

46. Hurry VM, Strand Å, Tobiæson M, Gardeström P, et al. Cold hardening of spring and winter-wheat and rape results in differential effects on growth, carbon metabolism, and carbohydrate content. Plant Physiol. 1995; 109(2): 697-706.

47. Verma S, Dubey RS. Effect of cadmium on soluble sugars and enzymes of their metabolism in rice. Plant Biol. 2001; 44: 117-123.

48 . Gubrelay U, Agnihotri RK, Singh G, Kaurl R, et al. Effect of heavy metal cd on some physiological and biochemical parameters of Barley (Hordeum vulgare L.). Intl J Agri Crop Sci. 2013; 5(22): 2743-2751.