بررسی اثر جانبی بوسولفان در بافت بیضه و اسپرم اپی‏دیدیمی موش بالغ بدنبال تیمار با دوز درمانگاهی

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه آزاد اسلامی واحدعلوم و تحقیقات، فارس، گروه زیست شناسی، فارس، ایران

2 دانشگاه آزاد اسلامی واحد شیراز، گروه زیست شناسی، شیراز، ایران

3 دانشگاه شهید چمران اهواز، دانشکده دامپزشکی، گروه بیوشیمی و سلولی مولکولی، اهواز، ایران

4 دانشگاه آزاد اسلامی واحد کازرون، گروه زیست شناسی، کازرون، ایران

-

چکیده

هدف: هدف از این تحقیق بررسی آثار جانبی دوز درمانگاهی بوسولفان بر بافت بیضه و اسپرم اپی‏دیدیمی موش نر بالغ است. مواد و روش‏ها: موش‏های نر بالغ نژاد NMRI (25 تا 35 گرم) به دو گروه شانزده تایی تقسیم شدند. کنترل و گروه تیمار با بوسولفان که به‏ترتیب 100 میکرولیتر DMSO(Dimethyl Sulfoxide) و 2/3 میلی‏گرم بر کیلوگرم بوسولفان به‏مدت چهار روز دریافت کردند. حیوانات 35 روز بعد از آغاز درمان کشته شدند. تغییرات بافتی در لوله سمی نیفر، پارامترهای کیفی اسپرم (تعداد و مورفولوژی)، قابلیت حیات و شکست کروموزومی اسپرم به‏ترتیب به‏وسیله میکروسکوپ نوری، CASA (Computer–aided Sperm Analyzer) ، سنجش MTT (3-[4, 5-Dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 Diphenyltetrazolium Bromide) و سنجش تانل بررسی شدند. نتایج: بوسولفان به‏طور معنی‏داری منجر به کاهش پارامترهای اسپرم (تعداد و مورفولوژی طبیعی) و افزایش تخریب دیواره لوله سمی نیفر شد. ناهنجاری‏های سر، قطعه میانی و دم در اسپرم گروه درمان در مقایسه باکنترل به‏طور معنی‏داری کاهش یافته بود. از سوی دیگر، سطوح پایین‏تر MTT در گروه درمان در مقایسه با کنترل معنی‏دار بود. افزایش تعداد اسپرم‏های تانل مثبت در گروه درمان نشان دهنده افزایش شکست کروموزومی به‏دنبال درمان با بوسولفان بود. نتیجه گیری: نتایج نشان داد که دوزهای درمانگاهی بوسولفان آثار ژنوتوکسیک، پرآپوپتوتیک و سیتوتوکسیک بر روند اسپرماتوژنز می‏گذارد. علاوه بر آن، بوسولفان سیتوتوکسیستی را در بافت بیضه افزایش می‏دهد.  

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


بوسولفان یکی از رایج‏ترین داروهای شیمی درمانی است که قبل از پیوند مغز استخوان در کودکان و بالغین مورد استفاده قرار می‏گیرد (1 و 2). علاوه بر آن، این دارو در درمان لوسمی میلوژنیک مزمن و سرطان تخمدان نیز به‏طور وسیع کاربرد دارد (3 و 4). این در حالی است که بوسولفان به سلول‏های سالم فرد تحت شیمی درمانی آسیب می‏زند. آسیب داروهای شیمی درمانی مانند بوسولفان به DNA سلول‏ها منجر به القای پیری (5) و در شرایطی آپوپتوزیس (6) می‏گردد. این دارو توانایی القای آپوپتوزیس را در سلول‏های زایای بیضه  دارد (3 و 4).

پیر شدن سلولی در نتیجه مصرف بوسولفان در سلول‏های فیبروبلاست WI39 طی سیگنال خارج سلولی تنظیم کننده‏ی کیناز (Erk) و آبشارp38 MAPK  (p38 Mitogen-activated protein kinase) رخ می‏دهد. علاوه بر آن، دو مسیر Erk و p38 MAPK از جمله مسیرهای القای آپوپتوزیس می‏باشند. القای پیری وابسته به بوسولفان در سلول‏های WI139 با حذف سریع گلوتاتیون داخل سلولی و افزایش پیوسته در تولید ROS (Reactive Oxygen Species) همراه است، که  ناشی از فعالیت مسیر Erk و p38MAPK می‏باشند (7).

از سوی دیگر، این دارو واجد اثرات جانبی متعددی بر گنادهای هر دو جنس نر و ماده (1 و 8)، اسپرماتوژنز و تولید اسپرم طبیعی (9 و 10) است.در واقع بوسولفان به‏دلیل خاصیت آلکیله کنندگی، دارای تاثیر سوء بر  DNA سلول‏هایی است که دارای قدرت تقسیم بیشتری هستند. به‏ همین دلیل یکی از بیشترین اثرات خود را بروی اسپرماتوگونی های بیضه می‏گذارد. با وجود آن، تمام اسپرماتوگونی‏ها به‏دنبال مصرف بوسولفان از بین نمی‏روند (11).

 مطالعات اخیر نیز مؤید القای آزواسپرمی در موش به‏دنبال تیمار با بوسولفان است (12). تیمار با تک دوزهای 10، 20 و 40 میلی‏گرم بر کیلوگرم بوسولفان، آپوپتوزیس را در سلول‏های زایای نر به‏خصوص در اسپرماتوگونی‏ها و اسپرماتوسیت‏های اولیه القا می‏کند (11). از سوی دیگر تزریق منفرد 20 میلی‏گرم بر کیلوگرم بوسولفان منجر به حذف وسیع سلول‏های اسپرماتوژنیک در بافت بیضه موش نر و افزایش درصد اسپرم‏های واجد مورفولوژی       غیر طبیعی می‏گردد (13). نتایج کاربردی فراوانی از مطالعات آثار جانبی شیمی درمانی بر سیستم تولید مثلی، به‏ویژه در جنس نر بدست آمده است. اما عمدتا در مطالعات اخیر از دوزهای بالا و سمی بوسولفان استفاده شده است (6، 11 و 13). این در شرایطی است که دوزهای پایین و با سمیت کمتر بوسولفان و سایر داروهای شیمی درمانی طی درمان سرطان مد نظر قرار می‏گیرند. اما کمبود مطالعه ایی دقیق در تعیین آثار جانبی دوزهای پایین و درمانگاهی بوسولفان در بافت سالم فرد تحت شیمی درمانی و به‏ویژه در سیستم تولید مثل آشکار است. بنابراین، هدف از این تحقیق، مطالعه آثار سمی دوز درمانگاهی (2/3 میلی گرم بر کیلوگرم) بوسولفان بر بافت بیضه و اسپرم اپی‏دیدیمی موش بالغ نژاد NMRI بوده است.

مواد و روش‏ها

نگهداری حیوانات: برای انجام این تحقیق، موش‏های نر بالغ ن‍ژاد NMRI با میانگین وزنی 5±30 گرم (8 هفته ای) از خانه حیوانات دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز خریداری شدند. حیوانات در شرایط استاندارد (دمای 2±21 درجه سانتی‏گراد، 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی) با دسترسی به آب و غذای کافی و براساس راهنمای مراقبت از حیوانات آزمایشگاهی (National Institutes of Health publication No. 86-23) نگه‏داری شدند.

تیمار حیوانات: 32 سر موش نر بالغ نژاد NMRI به دو گروه 16 تایی تقسیم شدند. جهت تیمار موش‏ها، بوسولفان (Sigma, St. Louis, MO) در  DMSO(Dimethyl Sulfoxide) 2 درصد و آب مقطر استریل با نسبت 1:1 در دمای اتاق حل گردید. گروه کنترل به‏مدت 4 روز به‏صورت زیر جلدی 100 میکرولیتر DMSO (Sigma, St. Louis, MO) در روز و گروه تیمار با بوسولفان به‏مدت 4 روز 2/3 میلی گرم بر کیلوگرم بوسولفان به‏صورت درون صفاقی دریافت کردند.

تشریح حیوانات و استخراج نمونه: حیوانات با استفاده از تزریق داخل صفاقی ماده‏ی بی‏هوش کننده‏ی کتامین هیدروکلراید (80 میلی‏گرم بر کیلوگرم) و گزیلازین (10 میلی‏گرم بر کیلوگرم) بی‏هوش شدند. سپس در شرایط استریل تشریح و پس از باز نمودن ناحیه شکم، بیضه و اپی‏دیدیم چپ خارج گردید. اپی‏دیدیم به لوله‏ی اپندورف حاوی 1 میلی‏لیتر سالین فسفاته PBS (Phosphate Buffer Saline, pH=7.4) منتقل و به قطعات کوچکتر تقسیم شد. لوله‏های حاوی نمونه برای مدت 30 دقیقه در انکوباتور CO2 دار با دمای 37 درجه سانتی‏گراد قرار گرفت و سپس قطعات کوچک بافتی خارج شدند. نمونه‏های اسپرم 2 بار در محلول سالین فسفاته PBS (pH=7.4) شستشو داده و رسوب اسپرمی به‏منظور مطالعه آپوپتوزیس، قابلیت حیات و سنجش پارامترهای اسپرم به‏ترتیب توسط سنجش تانل(Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)–mediated dUTP-biotin nick end labeling assay: TUNEL assay)، سنجشMTT  (3-4, 5-Dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 Diphenyltetrazolium Bromide) و CASA (Computer–Aided Sperm Analysis) بررسی شدند. بیضه‏های استخراج شده نیز در محلول بوئن جهت مطالعات مورفولوژیکی تثبیت شدند.

مطالعه مورفولوژی دیواره لوله‏های سمی نیفر بیضه: بیضه‏ها بعد از 48 ساعت تثبیت در بوئن، در پارافین قالب گیری شدند. برش‏های 5 میکرومتر تهیه و با هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) رنگ آمیزی گردید. سپس نمونه‏ها توسط میکروسکوپ نوری مورد مطالعه قرار گرفتند(Olympus/3H light microscope, Japan).

لوله‏های سمی نیفر با بررسی 15 میدان در 5 برش بافتی از هر بیضه به‏منظور مطالعه اثر تخریبی بوسولفان مطالعه شد. شدت تخریب لوله‏های سمی‏نیفر توسط دو فاکتور: حذف دیواره لوله‏های سمی‏نیفر و حضور اسپرم در لوله‏های سمی‏نیفر تعیین شد. براین اساس، 4 نوع لوله سمی نیفر در بافت بیضه مشخص شد که شامل: نوع اول) دیواره لوله‏های سمی‏نیفر طبیعی واجد اسپرم، نوع دوم) حذف دیواره لوله‏های سمی‏نیفر و وجود اسپرم، نوع سوم) حذف دیواره لوله‏های سمی نیفر و عدم حضور اسپرم، نوع چهارم) لوله‏های سمی‏نیفر خالی.

علاوه بر آن، قطر لوله‏های سمی‏نیفر توسط نرم افزارimage analyzer Leica (DMLB) and Leica Qwin بررسی شد. سپس، قطر و شدت تخریب لوله‏های سمی‏نیفر بین 2 گروه مورد مقایسه قرار گرفت.

سنجش پارامترهای اسپرم: پارامترهای مختلف شامل تعداد اسپرم، اسپرم با مورفولوژی طبیعی و اسپرم غیر طبیعی با استفاده از برنامه CASA  که بروی میکروسکوپ فاز کنتراست (Olympus Optical Co., Tokyo, Japan) نصب شده بود مطالعه شدند. سپس پارامترهای مختلف بین گروه‏های کنترل و تیمار با بوسولفان شده مقایسه شد. 

 

بررسی قابلیت حیات اسپرم، سنجش MTT: پودر زرد رنگ MTT (Sigma, USA) با نسبت 5/0 میلی‏گرم در میلی لیتر در محیط HAM’S F10 و 25mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) حل و pH آن به 4/7 رسید. سپس BSA با غلظت 10 درصد به محلول MTT اضافه و در دمای 4 درجه سانتی گراد و در تاریکی حداکثر برای مدت زمان یک هفته نگه‏داری شد.

رسوب اسپرم به‏منظور ایجاد غلظت نهایی 5/1 تا 2 میلیون اسپرم در 50 میکرولیتر در PBS (pH 7.4) حل شد. 50 میکرولیتر سوسپانسیون اسپرمی به 450 میکرولیتر MTT (که قبلا به‏مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‏گراد قرار گرفته بود) مخلوط شد. سپس نمونه‏ها به‏مدت 2 ساعت در انکوباتور CO2 دار با دمای 37 درجه سانتی‏گراد قرار گرفت. پس از گذشت 2 ساعت نمونه‏ها از انکوباتور خارج و 200 میکرولیتر DMSO جایگزین محلول MTT شد. سپس میزان جذب در طول موج تست 570 نانومتر و طول موج رفرنس 670  نانومتر قرائت گردید. جذب نوری نهایی براساس اختلاف جذب بین طول موج‏های رفرنس و تست محاسبه شد. نتایج به‏صورت درصد در مقایسه با کنترل بیان شد.

ارزیابی شکست کروموزومی، سنجش تانل: قطعه قطعه شدن DNA اسپرم توسط تکنیک تانل بررسی شد. این تکنیک توانایی شناسایی سلول‏های آپوپتوتیک را براساس نحوه‏ی قطعه قطعه شدن DNA آن‏ها در سوسپانسیون سلولی و بافتی دارد (14 و 15).

تکنیک تانل با استفاده از کیت سنجش تانل In Situ Cell Death Detection Kit Fluorescein (Roche Diagnostics, Germany) و براساس دستورالعمل آن انجام شد. رسوب اسپرم در PBS (pH 7.4) به‏منظور ایجاد غلظت نهایی 2 تا 3 میلیون سلول در 200 میکرولیتر حل شد. سپس 200 میکرولیتر از سوسپانسیون اسپرم در 300 گرم به‏مدت 5 دقیقه سانترفیوژ شد. رسوب حاصل در 100 میکرولیتر پارافرم آلدئید 4 درصد )در (PBS برای 1 ساعت در دمای اتاق معلق گردید و مدام نمونه تکان داده شد تا از چسبیدن اسپرم‏ها به هم جلوگیری شود. بعد از پایان تثبیت، نمونه ابتدا 2 بار در 100 میکرولیتر PBS شستشو شدند و سپس جهت افزایش نفوذپذیری در غشای سلولی به‏مدت 2 دقیقه بروی یخ در محلول 1/0 درصد تریتون 100x- در 1/0 درصد سدیم قرار گرفتند. محلول 1/0 درصد تریتون 100x- در 1/0 درصد سدیم مورد استفاده برای افزایش نفوذپذیری به‏وسیله 1 مرحله سانترفیوژ و 3 بار شستشو در PBS حذف شد. سپس نمونه در 50 مخلوط واکنش ( 45میکرولیتر محلول نشاندار نمودن و 5 میکرولیتر TdT) معلق شد و به‏مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد قرار گرفت. در انتها نمونه 2 بار در PBS شستشو داده شد.

50 میکرولیتر از نمونه بروی لام منتقل و 200 اسپرم در 8 تا 10 میدان دید تصادفی در زیر میکروسکوپ فلورسنس (Olympus, BX51, Japan) شمارش شد. سپس تعداد اسپرم‏های تانل مثبت در گروه‏های کنترل و تیمار با بوسولفان مقایسه شدند.

آنالیز آماری

آنالیز آماری داده‏ها با استفاده از نرم افزار 16.0 SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) انجام شد آزمون- تی (T-test) نمونه‏های مستقل برای مقایسه مقادیر مختلف بین گروه تیمار و کنترل استفاده شد. نتایج به‏صورت mean ± SD با درجه معنی‏داری 05/0p< بیان شد.

نتایج

مطالعه مورفولوژیک لوله‏های سمی نیفر

رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین جهت بررسی اثر مخرب بوسولفان بر دیواره لوله‏های سمی نیفر در گروه‏های کنترل و تیمار شده مورد استفاده قرار گرفت (شکل 1). سطح بالایی از تخریب دیواره لوله‏های سمی نیفر 35 روز بعد از آغاز تیمار با 2/3 میلی‏گرم بر کیلوگرم بوسولفان (به‏طور روزانه به‏مدت 4 روز) در گروه درمان مشاهده شد. از سوی دیگر، لوله‏های سمی‏نیفر در حیوانات کنترل طبیعی بودند.

 

 

 

شکل 1: تصاویر میکروسکوپ نوری لوله‏های سمی نیفر در موش‏های تیمار شده و کنترل. A)  لوله‏های سمی نیفر واجد دیواره‏ی طبیعی و نرمال در گروه کنترل. B) حذف وسیع سلول‏های زایا در دیواره لوله سمی نیفر و افزایش فضای لومن در گروه تیمار با بوسولفان. (فلش: حذف سلول‏های دیواره لوله‏های سمی نیفر، ستاره: فضای لومن).

 

 

درصد لوله‏های که تخریب دیواره لوله‏های سمی نیفر را نشان داده و فاقد اسپرم بودند (لوله‏ی نوع 3) و درصد لوله‏های خالی از سلول (لوله‏ی نوع 4) در گروه تیمار با بوسولفان به‏ترتیب حدود 52/2±67/62 و 1 ± 16 درصد بود (شکل 2). درصد تخریب دیواره لوله‏های سمی‏نیفر و لوله‏های سمی‏نیفر فاقد سلول زایا در موش‏های تیمار شده با بوسولفان اختلاف معنی‏دار را در مقایسه با گروه کنترل نشان داد (05/0(p<.

قطر لوله‏های سمی‏نیفر در گروه‏های کنترل و درمان به‏ترتیب جدود 8/35 ± 93/831 و 32±87/743 میکرومتر بود (شکل 3). بنابراین، قطر لوله‏های سمی نیفر در گروه درمان کاهش معنی‏دار را در مقایسه با کنترل نشان داد (05/0p<).

 

 

شکل 2: درصد تخریب دیواره لوله‏های سمی نیفر و لوله‏های سمی نیفر فاقد سلول زایا در موش‏های تیمار شده و کنترل. A) درصد حذفدیواره لوله‏های سمی نیفر در گروه تیمار شده در مقایسه با کنترل نشان دهنده‏ی تغییرات معنی‏دار بود. B) تعداد لوله‏های سمی نیفرخالی در گروه تیمار با بوسولفان بسیار زیاد و اختلاف معنی‏داری با گروه کنترل را نشان داد. نتایج به‏صورت mean ± SD با درجه معنی‏داری 05/0p< بیان شد (آزمون tمستقل).

 

شکل 3: بررسی قطر لوله‏های سمی نیفر در موش‏های تیمار شده و کنترل. قطر لوله‏های سمی نیفر در گروه تیمار با بوسولفان کاهش معنی‏داری را در مقایسه با کنترل نشان داد. نتایج به‏صورت mean ± SD با درجه معنی‏داری 05/0p< بیان شد (آزمون t مستقل).

 

بررسی پارامترهای اسپرم

نتایج نشان دهنده‏ی تغییرات در تعداد اسپرم و درصد اسپرم با مورفولوژی طبیعی در گروه تیمار در مقایسه با کنترل بود (جدول 1). تعداد اسپرم (شکل 4) و درصد اسپرم واجد مورفولوژی طبیعی (شکل 5) کاهش معنی‏داری را در گروه درمان در مقایسه با کنترل نشان داد (05/0p<).

درصد بالای اسپرم غیرطبیعی در گروه درمان  در مقایسه با کنترل مشاهده شد (05/0p<). (شکل A5 و جدول 1). علاوه بر آن، اسپرم‏های گروه تیمار شده با بوسولفان افزایش معنی‏داری را در ناهنجاری‏های سر، بخش میانی و دم  در مقایسه با کنترل نشان دادند (شکلB 5 و جدول 1).

 

 

شکل 4: بررسی تعداد اسپرم (×106 / میلی لیتر) در گروه‏های تیمارشده و کنترل. کاهش تعداد اسپرم در گروه تیمار با بوسولفان درمقایسه با کنترل معنی‏دار بود. نتایج به‏صورت mean ± SD با درجه معنی داری 05/0p< بیان شد (آزمون t مستقل).

 

جدول1: نتایح تعداد اسپرم (×106/میلی لیتر)، مورفولوژی طبیعی و اسپرم با مورفولوزی غیرطبیعی در موش‏های تیمار شده و کنترل. نتایج به‏صورت mean ± SD با درجه معنی‏داری 05/0p< بیان شد (آزمون t مستقل).

Groups

Sperm Count

(×106/ml)

Normal Morphology

(%)

Head abnormality

(%)

Neck abnormality

(%)

Tail  abnormality

(%)

Control

9.78 ± 1.02 a

75.3 ± 4.7 a

8.3 ± 1.3 a

13.5 ± 2.9 a

2.7 ± 0.9 a

Busulfan treated group

3.92 ± 0.66 b

38.5 ± 3.5 b

30.8 ± 5.1b

23.1 ± 6.4 b

7.6 ± 2.2 b

 

 

 

ارزیابی شکست کروموزومی به‏روش TUNEL

قطعه قطعه شدن DNA اسپرم‏های اپی‏دیدیمی توسط سنجش تانل مطالعه شد (شکل 6). اختلاف معنی‏دار در درصد اسپرم‏های تانل مثبت (TUNEL positive) بین گروه‏های تیمار شده با بوسولفان و کنترل مشاهده شد (شکل 7). درصد اسپرم‏های تانل مثبت در گروه‏های کنترل و تیمار با بوسولفان به‏ترتیب          18/2 ± 23/4 و 65/9± 07/40 بود. بنابراین، درصد اسپرم‏های تانل مثبت در موش‏های گروه درمان افزایش معنی‏داری را در مقایسه با کنترل نشان داد  (05/0p<).

سنجش حیات اسپرم

اختلاف معنی‏داری در قابلیت حیات اسپرم بین گروه‏های درمان با بوسولفان و کنترل مشاهده شد (شکل 8). درصد حیات اسپرم در گروه‏های کنترل و تیمار شده با بوسولفان به‏ترتیب 100 و       62/7 ± 26/45 درصد بود.

 

 

شکل 5: مورفولوژی اسپرم اپی‏دیدیمی در موش‏های تیمار شده و کنترل. A) کاهش معنی‏دار در تعداد اسپرم با مورفولوژی طبیعی در گروه تیمار با بوسولفان در مقایسه با کنترل دیده شد. B) گروه تیمار با بوسولفان تعداد بیشتری اسپرم غیرطبیعی را در مقایسه با کنترل نشان داد. نتایج به‏صورت mean ± SD با درجه معنی داری 05/0p<  بیان شد (آزمون t مستقل).

 

 

 

شکل 6: ارزیابی شکستگی DNA اسپرم توسط تکنیک تانل، A) گروه کنترل نشان دهنده‏ی تعداد محدودی اسپرم تانل مثبت بود. B) گروه تیمار شده با دوز درمانگاهی بوسولفان تعداد بالای اسپرم تانل مثبت را نشان داد. C) نمونه کنترل مثبت که تمامی اسپرم‏های موجود در نمونه تانل مثبت بودند (فلش‏ها نشان دهنده‏ی اسپرم‏های تانل مثبت است. بزرگنمایی x400).

 

شکل 7: اختلاف در درصد اسپرم‏های تانل مثبت در گروه‏های تیمار شده و کنترل. درصد اسپرم‏های تانل مثبت در گروه دریافت کننده بوسولفان در مقایسه با کنترل کاهش معنی‏داری را نشان داد. نتایج به‏صورت mean ± SD با درجه معنی‏داری 05/0p< بیان شد (آزمون tمستقل).

 

 

 

 

شکل 8: بررسی حیات اسپرم توسط سنجش MTT در موش‏های تیمار شده و کنترل. حیات اسپرم کاهش معنی‏داری را در گروه تیمار با بوسولفان در مقایسه با کنترل نشان داد. نتایج به‏صورت mean ± SD با درجه معنی داری 05/0p< بیان شد (آزمون tمستقل).

 

 

بحث

بوسولفان داروی شیمی درمانی است که در کودکان و بالغین به‏صورت ترکیب با سیکلوفسفامید و کلوفارابین قبل از پیوند مغز استخوان درسرطان خون کاربرد رایجی دارد (16). بوسولفان در تک دوزهای بیش از 10 میلی‏گرم بر کیلوگرم اثرات جانبی متعددی بر گنادهای هر دو جنس نر و ماده (1 و 2)، اسپرماتوژنز و تولید اسپرم طبیعی (9 و 10) می‏گذارد.براساس بررسی‏های انجام شده بوسولفان واجد اثرات مضر بر باروری موش بوده (17 و 18) و منجر به آزواسپرمی می‏شود (10).

سنجش پارامتـرهای کیفی اسپـرم شامل مورفولوژی و تعداد در

موش‏های تیمار شده با دوز درمانگاهی 2/3 میلی‏گرم بر کیلوگرم بوسولفان به‏مدت چهار روز نشان دهنده‏ی درصد بالایی از آسیب و ناهنجاری اسپرمی در این گروه در مقایسه با کنترل بود. کاهش معنی‏دار در تعداد اسپرم‏های واجد مورفولوژی طبیعی و افزایش ناهنجاری‏های سر، قطعه میانی و دم در گروه تیمار شده با بوسولفان در مقایسه با کنترل بیانگر سمیت بالای این دارو بر روند اسپرماتوژنز طبیعی حتی در دوزهای کم و درمانگاهی می‏باشد.

تحقیقات اخیر نشان داد که تیمار موش با تک دوز‏های بالای 20، 30 و 40 میلی‏گرم بر کیلوگرم منجر به ایجاد حفراتی در ضخامت لوله‏های سمی‏نیفر اپی‏دیدیم و کاهش ارتفاع سلول‏های دیواره کسیه‏های منی ساز (10)، دژنراسیون لوله‏های سمی‏نیفر، لوله‏های طبیعی فاقد اسپرماوتوزوآ، کاهش تعداد اسپرم‏ها و کاهش ضخامت کپسول در بیضه می‏شود (1).

از سوی دیگر نتایج ارزیابی مورفولوژیک بافت بیضه در تحقیق حاضر موید تحقیقات اخیر بود و نشان داد که 4 روز تیمار با دوز درمانگاهی روزانه 2/3 میلی‏گرم بر کیلوگرم بوسولفان (گروه تیمار با بوسولفان) منجر به افزایش تخریب بافت بیضه در موش‏های بالغ نژاد NMRI شد. کاهش قطر لوله‏های سمی‏نیفر و حذف وسیع سلول‏های زایای دیواره لوله سمی‏نیفر در گروه درمان با بوسولفان در مقایسه با موش‏های کنترل معنی‏دار بود. بنابراین مصرف 4 دوز پایین از بوسولفان به‏صورت روزانه می‏تواند مانند دوزهای بالای این دارو (1، 10 و 19) تخریب بافتی وسیع را در بافت بیضه القا کند.ًًًًًًًًً حذف شدید دیواره لوله‏های سمی‏نیفر (نوع دوم و سوم) و لوله‏های سمی‏نیفر خالی از سلول (نوع چهارم) بیانگر سمیت  بالای سلولی و بافتی شیمی درمانی با دوز پایین است.

داروهای شیمی درمانی می توانند آپوپتوزیس را در سلول‏های زایای بافت بیضه القا کنند (3 و 4). تزریق تک دوز 10، 20 و 40 میلی‏گرم بر کیلوگرم بوسولفان سبب آپوپتوزیس در سلول‏های زایای نر به‏خصوص در اسپرماتوگونیا و اسپرماتوسیت‏های اولیه شده است (11) و می‏تواند اشکال فراساختاری آپوپتوزیس را در سیستم تولید مثلی نر القا کند .تغییراتی مانند چروکیدگی هسته سلول‏های زایا به‏خصوص اسپرماتوگونی‏ها، جدا شدن سلول‏های زایا، حضور فضاهای بزرگ بین سلول‏های مجاور، چروکیدگی سلولی، حضور واکوئل در سلول‏های زایا و اجسام آپوپتوتیک در سلول‏های سرتولی غالبا چندین روز بعد از تزریق تک دوز سمی بوسولفان مشاهده می‏شود (6).

نتایج ارزیابی شکستگی کروموزومی اسپرم در مطالعه حاضر، سطوح بالا و معنی‏دار از آسیب DNA و آپوپتوزیس را در اسپرم اپی‏دیدیمی موش‏های تیمار شده با بوسولفان در مقایسه با کنترل نشان داد. درصد بالای اسپرم‏های تانل مثبت و مرگ سلولی آپوپتوزیس در اسپرم‏های اپیدیدیمی موش‏های گروه  درمان تاییدی بر نتایج مطالعات اخیر بوده (6) و بیانگر نقش ژنوتوکسیک و پرآپوپتوتیک دوزهای پایین بوسولفان بر سلول‏های سالم بیماران تحت شیمی درمانی است.

کاهش معنی‏دار در قابلیت حیات اسپرم در گروه تیمار با بوسولفان در مقایسه با کنترل می‏تواند ناشی از اسپرماتوژنز ناموفق باشد. نتایج سنجش MTT نشان‏دهنده‏ی سمیت سلولی بالای شیمی درمانی با دوزهای درمانگاهی طی اسپرماتوژنز در موش است.

بنابراین، جتی دوزهای پایین داروهای آلکیله کننده مورد استفاده در درمان سرطان واجد نتایج ناخواسته ایی در بافت‏های سالم بیماران و به‏خصوص در سلول های جنسی بوده و منجر به تغییرات در مورفولوژی طبیعی بافت بیضه، پارامترهای منی و آسیب DNA سلول‏های جنسی می‏شوند. عوارض مخرب داروهای مختلف ضد سرطان به‏عنوان اثر جانبی درمان سرطان در سلول‏های سوماتیک و جنسی قابل توجه هستند.

نتیجه گیری

نتایج ما بیانگر آثار سوء و سمیت بالای دوز پایین و درمانگاهی داروی شیمی درمانی بوسولفان در سیستم تولید مثلی نر می‏باشد. این مطالعه نشان داد که سمیت بالای سلولی و بافتی حتی طی شیمی درمانی با دوزهای پایین و درمانگاهی در موش مشاهده می‏شود. این امر موید آثار وسیع سیتوتوکسیک، ژنوتوکسیک و پرآپوپتوتیک بوسولفان در سلول‏های سالم فرد تحت شیمی درمانی بوده و لزوم کاربرد درمان‏های محافظتی مکمل را طی شیمی درمانی در فرد بیمار نشان می‏دهد.

تشکر و قدردانی

بر خود لازم می‏دانیم که از زحمات خانم سمیه بهرام زاده و آقای محسن صارمی در انجام موفق این تحقیق کمال سپاس و تشکر را داشته باشیم.

  1. Anjamrooz SH, Movahedin M, Mowla SJ, Bairanvand SP. Assessment of morphological and functional changes in the mouse testis and epididymal sperms following busulfan treatment. Iran Biomed J. 2007; 11: 15-22.
  2. Temitope AA, Tolulope OA, Funlola CT, Khaleed TB, et al. Protective Effect of Tahitian Noni Juice on the Reproductive Functions of Male Wistar Rats Traeted with Cyclophosphamide. Iran J Pharmacol Ther. 2011; 10(1): 39-43.
3. Nieto Y, Thall P, Valdez B, Andersson B, et al. High-Dose Infusional Gemcitabine Combined with Busulfan and Melphalan with Autologous Stem-Cell Transplant in Patients with Refractory Lymphoid Malignancies. Biol Blood Marrow Transplant. 2012; 18(11): 1677–1686.

4. Choi YJ, Ok DW, Kwon DN, Chung JI, et al. Murine male germ cell apoptosis induced by busulfan treatment correlates with loss of c-kit-expression in a Fas/FasL- and p53-independent manner. FEBS Letters. 2004; 575(1-3): 41-51.

5. Probin V, Wang Y, Zhou D. Busulfan – induced upsenescence is dependent upon ROS production upstream of the MAPK pathway. Free Radic Biol Med. 2007; 42(12):1858–1865.

6. Mohammad Ghasemi F, Bahadori MH, Faghani M, Nasiri E, et al. Buserelin Inhibits Apoptosis in Male Germ Cells Induced by Busulfan in Mouse Testis. J of Iran Anat Sci. 2009; 7: 45-54.

7. Probin V, Wang Y, Bai A, Zhou D. busulfan selectively induces cellular senescence but not apoptosis in WI38 fibroblasts via a P53-independent but ERK-P38 MAPK-dependent mechanism. JPET. 2006; 319(2): 551-60.

8. Vahdati A, Fathi AR, Nasimi P, Saki GH. Busulfan induces apoptotic and cytotoxic effects on testis and epididymal sperm of adult male mouse following low dose treatment. IJB. 2015; 6(5):70-78.

9. Khaki A, Fathiazad F, Nouri M, Khaki AA, et al. The effects of Ginger on spermatogenesis and sperm parameters of rat. Iran J Reprod Med. 2009; 7(1): 7-12.

10. Mohamad-Ghasemi F, Faghani M, Fallahkarkan M. The protective effect of melatonin on sperm parameters, epididymis and seminal vesicle morphology in adult mouse treated with busulfan. J Iran Anat Sci. 2010; 8: 25-36.

11. Mohammadghasemi F, Soleimanirad J, Ghanbari AA. An Ultrastructural Study on the Apoptotic Features of Spermatogenic Cells following Busulfan Treatment in Adult Mice. J Reprod Infertil. 2008; 8(4): 319-329.

12. Azizollahi S, Aflatoonian R, Sedigi-Gilani MA, Asghari Jafarabadi M, et al. Recruiting Testicular Torsion Introduces an Azoospermic Mouse Model for Spermatogonial Stem Cell Transplantation. Urol J. 2014; 11(3); 1648-1655.

13. Kawashima A, Osman BAH, Takashima M, Kikuchi A, Kohchi S, Satoh E, Tamba M, Matsuda M, Okamura N. CABS1 is a Novel Calcium-Binding Protein Specifically Expressed in Elongate Spermatids of Mice. Biology of reproduction. 2009; 80: 1293-1304.

14. Momeni HR, Nasimi P. Caspase-dependent apoptosis in motor neurons of adult mouse spinal cord slices. Iran J Sci Technol. 2014; 38A1: 55-60.

15. Nasimi, P, Roohi, S. Cell death in animals and plants; Apoptosis, Necrosis & Autophagy. 1th Ed. Islamic Azad University of Masjed Soleyman press; 2012.

16. Andersson BS, Valdez BC, Lima MD, Wang X. Clofarabine ± Fludarabine with Once Daily IV Busulfan as Pretransplant Conditioning Therapy for Advanced Myeloid Leukemia and MDS. Biol Blood Marrow Transplant. 2011; 17(6): 893–900.

17. Wenzhi M, Lei A, Wu Z, Wang X, et al. Efficient and Safe Recipient Preparation for Transplantation of Mouse Spermatogonial Stem Cells: Pretreating Testes with Heat Shock1. Biol Rep. 2011; 85: 670-677.

18. Olooto WE. Infertility in male; risk factors, causes and management- A review. JMicrobiol. Biotech. Res. 2012; 2(4): 641-645.

19. Stellflug JN, Green JS, Leathers CW. Ant fertility effect of busulfan and procarbazine in male and female coyotes. Biol of Rep. 1983; 33: 1237-1243.