تاثیر همزمان شیکونین و گلوتاتیون پروکسیداز-1 بر افزایش بقا نورون‏های دوپامین ساز در برابر مسمومیت پارکینسونی

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی تاثیر آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز-1 و شیکونین بر افزایش بقاء نورونهای دوپامین ساز در برابر مسمومیت پارکینسونی بود.
مواد و روش ها: برای افزایش بیان ژن گلوتاتیون پراکسیداز-1 (GPX-1) در نورونهای دوپامین ساز، لنتی ویروس‏های نوترکیب ناقل این ژن همراه با ژن گزارشگر GFP ساخته شد و برای آلوده سازی نورونها استفاده گردید. بدنبال افزایش بیان GPX-1 در نورونهای آلوده شده به ویروس، میزان بقاء این نورونها در برابر مسمومیت پارکینسونی و نیز تیمار آن‏ها با شیکونین، اندازه گیری شد.
نتایج: به دنبال بیان ژن GFP که در زیر میکروسکوپ فلورسنس مشاهده شد، افزایش بیان ژن GPX-1 نیز با تکنیک RT-PCR به اثبات رسید. نتایج این آزمایشات نشان داد که هم افزایش بیان ژن GPX-1 و هم تیمار نورون ها با شیکونین بطور جداگانه ای باعث افزایش معنی داری در بقاء این نورونها در برابر مسمومیت پارکینسونی نسبت به نورونهای طبیعی و نورونهای کنترل (آلوده شده با pLV-EGFP) گردید. درصد بقاء پس از افزایش بیان GPX-1 در حدود 14 درصد و پس از افزایش شیکونین 11 درصد بیشتر از حالت بدون تیمار برآورد گردید. مهم‏تر آنکه حضور توام این دو عامل درصد بقاء را تا 29 درصد افزایش داد.
نتیجه گیری: نتایج حاصله نشان داد که افزایش بیان ژن GPX-1 و تیمار سلول‏ها با شیکونین علاوه برآن‏که بطور جداگانه بر بقاء سلول‏ها در برابر توکسین پارکینسونی تاثیر فزاینده دارند، در صورت حضور هم‏زمان، یک تاثیر هم افزایی داشته و احتمالا بطور سینرژیک عمل می‏نمایند.
 

کلیدواژه‌ها


مقدمه

مرگ نورون ها مهم‏ترین مشخصه‏ی بیماری‏های نورودژنراتیو به شمار می رود (1). سیگنال‏های مرگ و به خصوص افزایش سطح رادیکال‏های آزاد در مغز باعث پدیده‏ی مرگ نورونی می‏گردند (2). مولکول‏های شدیدا واکنش‏گر که اصطلاحا           Reactive Species نامیده می‏شوند، احتمالا در مرگ نورون‏ها نقش ایفا می کنند وحتی عامل اصلی بیماری‏های      نورودژنراتیو مانند هانتینگتون، پارکینسون، ALS (Amyotrophic lateral sclerosis) و غیره می‏باشند (2و3).

گونه‏های واکنش‏گر اکسیژن(Reactive oxygen species, ROS) انواعی از رادیکال‏های آزاد اکسیژن از قبیل سوپراکسید، هیدروکسیل و مولکول‏های غیر رادیکالی مثل پراکسید هیدروژن را شامل می‏شوند (4). در مقابل استرس نیتراتیو، ناشی از تولید گونه‏های واکنش‏گر نیتروژن مانند نیتریک اکسید، نیتروژن دی اکسید و واسطه‏های واکنش‏گر آنها می باشد (4). این مولکول‏ها به ماکرومولکول‏های حیاتی از قبیل پروتئین‏ها، لیپیدها واسیدهای چرب حمله کرده و باعث آغاز آسیب استرس اکسیداتیو در بدن می‏شوند. در این میان، یک سیستم دفاعی بر علیه این آسیب در بدن شکل می گیرد که با تخریب‏های ناشی از این استرس‏ها در بدن مقابله می‏کند. گلوتاتیون احیا شده (GSH) بخش مهمی از این سیستم دفاعی در بسیاری از بافت‏های بدن از جمله مغز به شمار می رود و فعالیت آن دارای نقش اساسی در حفاظت نورون‏ها در برابر تخریب میتوکندریایی می باشد (5، 6و 7).

گلوتاتیون پروکسیداز-1 (GPX-1) یک آنزیم ضد اکسیدان وابسته به سلنیوم است که H2O2را به آب تبدیل و در طی این عمل GSH را به فرم دی سولفید آن (GSSG) تبدیل می‏کند (8). GPX-1 باعث حفظ تعادل در حالت احیا سلولی شده و با اکسیداسیون لیپیدها، پروتئین‏ها، NADPH و NADH مقابله می‏نماید (9). مطالعات نشان داده است که مدل‏های حیوانی که بیان ژن GPX-1 در آن‏ها افزایش پیدا کرده است، مقاومت بیشتری در مقابل استرس اکسیداتیو دارند در حالی‏که موش های تراریخته فاقد ژن GPX1-1 آسیب پذیری بسیار بیش‏تری نشان می دهند (10). مطالعه قبلی ما مشخصا تاثیر این آنزیم در حفاظت نورون‏های دوپامین ساز را به اثبات رسانده است (11).

شیکونین یک رنگدانه نفتوکوئینون از ریشه گیاه Lithospermum erythrorhizon است که سالیان دراز به‏عنوان یک ترکیب ضد التهابی و ضد زخم بکار برده شده است (12). شیکونین قادر است تاثیرات ضد میکروبی، ضد سرطانی و ضد التهابی بر جای بگذارد (12-15). به‏نظر می‏رسد که کلیه این فعالیت‏های شیکونین به‏نحوی با قدرت آن در پاکسازی رادیکال‏های اکسیژنی مرتبط باشد (16). با توجه به اینکه طبق گزارشات موجود شیکونین فعالیت ضد اکسیدانی موثری بر علیه چندین نوع گونه واکنش‏گر اکسیژن از جمله رادیکال آنیون سوپراکسید، رادیکال هیدروکسیل و غیره نشان می‏دهد (17)، بررسی نقش این ترکیب گیاهی در کاهش آسیب‏های اکسیداتیو بر نورون‏ها می‏تواند دامنه کاربرد آنرا به درمان بیماری‏های مرگ نورونی گسترش دهد.

باتوجه به اهمیت نقش استرس اکسیداتیو در آسیب رساندن به مغز این سوال مطرح است که آیا مقابله با استرس اکسیداتیو می‏تواند از مرگ نورون‏ها و آغاز یا پیشرفت بیماری‏های نورودژنراتیو مقابله کند؟ پاسخ به این سوال وابسته به اینست که آیا می‏توان از طریق تقویت دفاع ضد اکسیدان با مرگ نورون‏ها در مدل سلولی بیماری پارکینسون مقابله کرد؟ در مطالعه جاری، نقش گلوتاتیون پروکسیداز-1 بعنوان یک آنزیم آنتی اکسیدان مهم و نیز نقش شیکونین به‏عنوان یک ترکیب حمایت کننده در افزایش مقاومت نورون‏های دوپامین‏ساز در برابر مسمومیت پارکینسونی بررسی شده و تاثیر هم افزائی آن‏ها نیز مورد مطالعه قرار می گیرد.

 

مواد و روش‌ها

بیولوژی مولکولی: ناقل‏های ویروسی شامل ناقل بسته بندی (∆∆∆pCD/NL-BH*) ناقل پوششی (LTR-G) و ناقل انتقالی (PLV-GPX1) با استفاده از کیت Maxiprep از کیاژن خالص سازی شدند. مراحل مربوط به خالص سازی DNA مطابق دستور سازنده انجام شد (18).

کشت سلول: سلول‏های HEK-293T به عنوان مولد ویروس در محیط(DMEM)  Dulbeccos Modified Eagle Medium به همراه FBS 10 درصد در دمای 37 درجه و CO2 5 درصد کشت و پاساژ داده شدند. 2 میلیون سلول در پتری دیش‏های 10 سانتی‏متری مخصوص کشت سلول، 24 ساعت قبل از ترانسفکشن کشت داده شدند تا در روز بعد 50 تا 60 درصد پتری دیش را پر کنند. همچنین سلول‏های نورونی رده‏ی PC12 به عنوان سلول های هدف، در دمای 37 درجه وCO2 5 درصد کشت و پاساژ داده شدند. برای آلوده سازی ویروسی تعداد 50 هزار سلول PC12  در پلیت 24 خانه، 24 ساعت قبل از آلوده سازی کشت داده شدند.

تولید ویروس: برای تولید لنتی ویروس‏های نوترکیب و فعال، سلول‏های مولد ویروس (HEK-293T) هم‏زمان با سه ناقل لنتی ویروسی به مقدار 15 میکرو گرم از ناقل ترانسفر و 10 میکرو گرم از هریک از ناقلین بسته بندی و غشایی، با روش رسوب DNA-فسفات کلسیم ترانسفکت شد. برای تشکیل این رسوب،DNA  های مذکور همراه با 50 میکرو لیتر از کلرید کلسیم 5/2 میلی مولار، با آب استریل به حجم 500 میکرو لیتر رسید و هم حجم آن HEPES اضافه شد. محلول حاصل 20 دقیقه در زیر هود انکوبه تا رسوب مطلوب به دست آید. سپس این رسوب به آرامی و قطره قطره به محیط سلول‏های هدف اضافه شد. سلول‏ها به مدت 8 ساعت انکوبه و سپس محیط آن‏ها با محیط جدید تعویض شد. پس از این مراحل سلول ها تا زمان تولید ویروس و رها سازی آن به محیط کشت، در شرایط انکوباتوری ذکر شده نگهداری شدند.

 تغلیظ ویروس و آلوده سازی سلول های هدف: محیط کشت سلول‏های ترانسفکت شده پس از 24 و48 ساعت جمع آوری و از فیلتر 45/0 میکرون عبور داده شد. سپس محیط فیلتر شده به درون ستون‏های آمیکون  MW100 ریخته ومدت 10 دقیقه در دور rpm 4000 سانتریفیوژ شد. محلول باقی‏مانده پشت فیلتر که پر از ذرات ویریونی بود جمع آوری شد. حجم های مختلف از این محلول  برای آلوده سازی سلول‏های هدف   (PC12)  استفاده شد و سپس سلول‏ها در شرایط انکوباتوری ذکر شده قرار داده شدند تا بیان ژن GFP موجود در ناقل انتقالی، در زیر میکروسکوپ فلورسنس مشاهده شود. پس از این مرحله با استفاده از تکنیک RT-PCR از افزایش بیان  ترانسژن GPX1 اطمینان حاصل گردید.

استخراج RNA و آزمایش RT-PCR: 96 ساعت پس از ترانسدوکشن سلولی، کل RNA سلولی با استفاده از کیت مربوطه (High Pure RNA Isolation Kit, Roche) استخراج شده و پس از اطمینان از سلامت کامل آن در روی ژل، 2 میکرو گرم از آن برای سنتز cDNA تحت شرایط گزارش شده بکار برده شد (19). ساخت cDNA به کمک ترانسکریپتاز معکوس از (Fermentas, Lithuania) و در حضور هگزامرهای راندوم و RNase Inhibitor صورت گرفت. برای تکثیر یک قطعه 387 جفت بازی از cDNA مربوط به GPX-1 انسانی، جفت پرایمر زیر بر اساس توالی کد کننده آن بشرح زیر طراحی و سنتز شد (20)(GenBank accession no. M83094):

Forward: 5'-CTTATCGAGAATGTGGCGTCCC-3’,

Reverse: 5'-GCCCACCAGGAACTTCTCAAAG-3’.

مقادیر یکسان از هر نمونه cDNA برای آزمایش PCR مورد استفاده قرار گرفت. پس از 2 دقیقه دناتوراسیون نمونه‏ها در درمای 95 درجه سانتی‏گراد، واکنش PCR با 30 سیکل دناتوراسیون در 94 درجه سانتی‏گراد، 45 ثانیه، Annealing  در 59 درجه سانتی‏گراد، 1 دقیقه و مرحله Extension در 72 درجه سانتی گراد، 45 ثانیه به انجام رسید. محصولات PCR با استفاده از ژل آگاروز 2/1 درصد آنالیز و تصویر برداری شد. شدت باندهای این تصاویر با استفاده از نرم افزار US-Scan-It Gel Analysis Software (Skill Scientific Inc. Orem, Utah) اندازه‏‏گیری گردید.

تیمار سلول ها با شیکونین: سلول‏های PC12 و PC12-GPX-1، 24 ساعت قبل از ایجاد مسمومیت پارکینسونی در پلیت 96 خانه، تحت تیمار با غلظت 4 میکرو گرو بر میلی لیتر از شیکونین قرار گرفتند و در شرایط انکوباتوری مذکور نگهداری شدند. همچنین یک گروه از سلولهای PC12 طبیعی (Wild-type, WT) و فاقد هرگونه آلودگی ویروسی نیز به عنوان سلولهای کنترل برای این تیمار، استفاده گردیدند.

ایجاد مسمومیت پارکینسونی و سنجش بقا :24 ساعت پس از تیمار با شیکونین، سلول‏ها در معرض غلظت 75 میکرومولار توکسین 6-OHDA بعنوان LD50 این سلول‏ها قرار گرفتند و پس از 30 ساعت میزان بقا آن‏ها با روش                            3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide  (MTT)اندازه‏گیری شد. جزئیات مربوط به طرز تهیه محلول 6-OHDA، تعیین دوز LD50 و سنجش  MTT قبلا گزارش شده است (20). به طور مختصر، استوک 5 میلی مولار 6-OHDA (سیگما) حاوی 9/0         درصد سالین (Phosphate buffered saline)،                  1/0 درصد آسکوربات و 10 میلی (DETAPAC) diethylenetriaminepentaacetic acid در نیتروژن حل شده و قبل از ذخیره سازی در دمای 20-  درجه سانتی گراد توسط فیلتراسیون، استریل گردید. برای تعیین LD50 توکسین، سلول‏ها توسط رقت‏های سریالی از 6-OHDA برای مدت 24 ساعت تیمار شدند و غلظتی از توکسین که در آن نیمی از سلول‏ها از بین رفتند به عنوان LD50انتخاب گردید. همچنین برای سنجش MTT، با حل کردن استوک این ماده در سالین، غلظت 5 میلی گرم در میلی لیتر از آن تهیه شد و پس از استریل کردن آن توسط فیلتراسیون، 20 میکرو لیتر از آن به180 میکرو لیتر محیط DMEM فاقد FBS در هر چاهک اضافه گردید و به مدت 3 ساعت در شرایط انکوباتوری فوق نگهداری شد. سپس این محیط با 200 میکرو لیتر (DMSO) Dimethyl Sulfoxide جایگزین شد وپس از 5 دقیقه انکوبه شدن، میزان جذب در طول موج 580 نانومتر اندازه گیری شد.

آنالیز آماری: داده‏های آماری به‏صورت mean±SEM بیان و حاصل سه آزمایش مجزا است که هرکدام به‏صورت تریپلیکیت تکرار شده اند. آنالیزهای آماری این داده ها با استفاده از نرم افزار SPSS, version 17.0 انجام پذیرفت. برای آنالیز تفاوت بین گروه‏های مختلف سلولی از آنالیز یکسویه واریانس(One-way analysis of variance, ANOVA) و سپس با تست دانکن (post-hoc Duncan Multiple-comparisons Test) استفاده گردید. مقادیر 01/0  p<و 001/0 p< به عنوان اختلاف بسیار معنی دار تفسیر شد.

 

نتایج

موفقیت مرحله ی ترانسفکشن:

مشاهده‏ی سلول‏ها با میکروسکوپ فلورسنس در فواصل زمانی متوالی پس از ترانسفکشن، آغاز بیان ژن GFP را در سلول‏های HEK-293T، 9 ساعت پس از ترانسفکشن نشان داد و در ساعات بعدی بیان این ژن  تشدید گردید تا نهایتا در 24 ساعت پس از ترانسفکشن این بیان به 100 درصد رسید (شکل 1).

 

شکل1: بیان ژن GFP در سلول‏های‏HEK 293T. این تصاویر بیست و چهار ساعت پس از ترانسفکشن سلول‏های HEK 293T، با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت و با فیلتر FITC تهیه شده است (A= سلول های طبیعی، B= سلول ها پس از ترانسفکشن). بزرگنمائی: ×100

ترانسداکشن نورون های هدف و بیان ژن گزارش‏گر:

حدود 36 ساعت پس از افزودن استوک ویروسی به سلول‏های PC12 اولین نشانه‏های بیان GFP با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس مشاهده شد و موفقیت آمیز بودن ترانسدوکشن را به اثبات رساند. بیان GFP در فاصله زمانی 72 ساعت به حداکثر خود رسید (شکل 2).

 

شکل2: بیان ژن GFP در سلول‏های PC12. این تصاویر بیست و چهار ساعت پس از آلوده‏سازی ویروسی (ترانسدوکشن) سلول‏های PC12 که با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت و با فیلتر FITC تهیه شده است (A= سلول های طبیعی، B= سلول ها پس از ترانسدوکشن). بزرگنمائی: ×200

 

افزایش بیان ژن GPX-1:

دو هفته پس از آلوده شدن سلول‏های PC12 به ویروس‏های هدف و اطمینان از بیان ترانسژن،  RNA این سلول‏ها استخراج شد و با استفاده از تکنیک RT-PCR میزان بیان ژن GPX-1 قبل و بعد از ترانسداکسیون مشاهده گردید (شکل3). این آزمایشات نشان داد که میزان بیان GPX-1 در سلول‏های آلوده شده به ویروس pLV-GPX1 نسبت به سلول های طبیعی افزایش یافته است. پس از سه بار تکرار آزمایش بطور مستقل و با استفاده از نرم افزار ذکر شده در بخش روشها محاسبات لازم انجام گردید و در نتیجه میزان این افزایش را بطور متوسط 8/2 برابر برآورد نمود. همانطور که انتظار می رفت بیان GPX-1 در سلول‏های آلوده به ویروس pLV-EGFP نیز افزایش نشان داد که میزان آن بطور متوسط 3/1 برابر سلولهای طبیعی (WT) بود (شکل 3).

تاثیر شیکونین و گلوتاتیون پروکسیداز بر افزایش بقا نورون‏ها: سلول‏های PC12 که افزایش بیان GPX-1 را به وضوح نشان دادند با شیکونین نیز تیمار شدند. پس از آن توکسین 6-OHDA به گروه‏های مختلف سلولی اضافه گردید تا میزان مقاومت آن‏ها در برابر مسمومیت پارکینسونی تعیین شود. شکل 4 تصویری از سلول‏ها را 24 ساعت پس از مسمومیت پارکینسونی نشان می‏دهد.

 

 

شکل3: نتایج حاصل از واکنش RT-PCR. این تصویر ژل الکتروفورز، از نمونه های واکنش مزبور بر روی قطعه 387 جفت بازی در ناحیه کد کننده ژن GPX-1 تهیه شده است.  اندازه باندها بر اساس جفت باز مشخص شده است. M (مارکر 1500 جفت بازی RNAWild-type) WT سلول‏های طبیعی PC12pLV-EGFP (سلول PC12 آلوده شده با ویروس حاوی ژن GFPpLV-GPX1 (سلول PC12 آلوده شده با ویروس حاوی ژن GPX1)

 

pLV-GPX1

6-OHDA

WT

WT

SHKN

SHKN + pLV-GPX1

pLV-EGFP

1

2

3

4

5

6

شکل 4: بقاء نورون‏های PC12 در برابر مسمومیت پارکینسونی. این تصاویر میکروسکوپی بیست و چهار ساعت پس از تیمار سلول‏ها با توکسین         6-OHDA تهیه شده است. فلش بزرگ سلول‏های تیمار شده با توکسین را نشان می‏دهد. 1= سلول‏های طبیعی، 2= سلول های طبیعی به همراه توکسین، 3= نورونهای حاوی ژن GFP، 4= نورون های دارای ژن GPX1، 5= نورون های تیمارشده با شیکونین، 6= نورونهای دارای ژن GPX1 و تیمار شده با شیکونین. بزرگنمائی: ×100

 

 

 

شکل 5: میزان بقاء سلولها. این نمودار درصد بقاء سلولهای  PC12را پس از افزایش بیان ژن GPX-1 وتیمار باشیکونین نشان میدهد که از سنجش MTT بدست آمده است. سلولهای که از نقطه آغازین فلش بزرگ به بعد قرار دارند سلول‏های تیمار شده با توکسین میباشند در حالیکه سلولهای دو ستون اول توکسین دریافت نکرده اند.  هر ستون نماینده 3 آزمایش مستقل است که بصورت تریپلیکیت انجام شده است. اختلافات آماری داده ها بین گروههای مختلف و گروه طبیعی (WT) با علامت ** (P<0.01) یا *** (P<0.001)، بین گروه pLV-GPX1 و pLV-EGFP با علامت ## (P<0.01)، بین گروه pLV-GPX1+ SHKN و گروهpLV-GPX1 با علامت  ×× (P<0.01) و بین گروه pLV-GPX1+ SHKN و گروهWT+ SHKN با علامت  ^^^  (P<0.001)نشان داده می‏شود. SHKN، شیکونین و WT، سلول‏های طبیعی (Wild-type).


سنجش افزایش بقا نورون‏ها در حضور GPX-1 و شیکونین: داده‏های حاصل از سنجش MTT در شکل 5 نشان داده شده است. درصد بقا سلول‏های گروه pLV-EGFP  (2±54) نسبت به درصد بقا سلول‏های طبیعی(2±52)  (WT) از نظر آماری معنی‏دار نبود. از سوی دیگر درصد بقا سلول‏های گروه pLV-GPX1 در برابر مسمومیت مقاومت نشان دادند که این رقم نسبت به درصد بقا سلول‏های کنترل (pLV-EGFP)      14 درصد افزایش نشان داد و از نظر آماری معنی دار بود    (01/0 p< ). افزایش درصد بقا سلول‏های گروه شیکونین به سلول‏های طبیعی (WT) میزان بقاء این سلولها را به 65± 4% رسانید که نسبت به سلول‏های طبیعی و کنترل افزایش بسیارمعنی داری را نشان داد (01/0 .(P<نهایتا آنکه افزایش شیکونین به سلولهای گروه pLV-GPX1 میزان بقاء این سلول‏ها را تا 4±83 درصد افزایش داد که در مقایسه با درصد بقاء همین گروه سلولی در غیاب شیکونین 15 درصد افزایش نشان می‏دهد (01/0 .(P< همچنین سلول‏های مزبور در مقایسه با سلول‏های طبیعی که در معرض شیکونین بودند 18 درصد افزایش بقا نشان می‏دهند (001/0 .(P<

 

بحث

در این مطالعه، ویروس‏های نوترکیب ناقل ژن GPX-1 با موفقیت تولید شده و برای ترانسدوکشن سلول‏های PC12 که مدلی مناسب برای نورون های دوپامین ساز بشمار می‏روند بکار گرفته شدند. همچنین از ماده شیکونین که نقش حمایتی از سلول‏های پستانداران ایفا می‏کند برای تیمار سلول‏های دوپامین ساز مزبور استفاده گردید. پس از ایجاد مسمومیت سلولی توسط توکسین 6-OHDA میزان بقا سلول‏ها به‏روش MTT اندازه گیری شد. نتایج حاصله نشان داد که هم گلوتاتیون پروکسیداز و هم شیکونین به‏عنوان عوامل حفاظت نورونی عمل می‏کنند. بر اساس نتایج این مطالعه هر یک از دو عامل مزبور به تنهایی می‏توانند میزان مقاومت سلول‏ها را در برابر مسمومیت پارکینسونی افزایش دهند. بعلاوه، فعالیت همزمان آندو بصورت هم افزایی عمل کرده و مقاومت را باز هم بطور معنی داری افزایش می‏دهد.

گلوتاتیون پروکسیداز یک آنزیم ضد اکسیدانت بوده و باعث مصرف و کاهش رادیکال‏های آزاد درون سلولی به‏خصوص پروکسید هیدروژن می‏شود (8). مطالعه قبلی ما بر روی یک رده نورون دوپامین‏ساز فعالیت ضد اکسیدانی آنزیم فوق را به‏خوبی اثبات کرده است (11). گزارش‏هایی نیز از فعالیت ضد مرگ شیکونین در دست است (21 و 22). در عین حال گزارش روشنی از تاثیر ضد مرگ شیکونین اختصاصا در نورون‏های دوپامین ساز در دست نیست. به این ترتیب مطالعه حاضر در صدد پاسخ به این دوسوال برآمد: 1) آیا شیکونین نیز همانند GPX-1 می‏تواند مانع مرگ نورون‏های دوپامین‏ساز در برابر آسیب‏های اکسیداتیو شود؟ 2) آیا حضور و فعالیت هم‏زمان دو عامل حفاظتی فوق در یک سلول دوپامین‏ساز می‏تواند شانس بقا آن را در برابر مسمومیت پارکینسونی افزایش دهد و این افزایش نسبت به افزایش ناشی از فعالیت هر یک از دو عامل بتنهایی تفاوت آماری محسوسی دارد؟ داده‏های این مطالعه نشان میدهد که نه تنها هر یک از دو عامل GPX-1 و شیکونین بر بقا سلول‏های دوپامین‏ساز بطور مثبت و معنی دار موثر است، بلکه فعالیت توام آن‏ها درصد بقا را باز هم به‏طور معنی دار بالا برده و با تاثیرکشنده توکسین 6-OHDA بیش از پیش مقابله می‏کند. بر اساس نتایج بدست آمده، این فعالیت توام به‏صورت هم افزایی بروز می‏کند به‏طوری‏که تاثیر آن بر بقا نسبت به تاثیر انفرادی هر یک از دو عامل حفاظتی تفاوت چشم‏گیر و از نظر آماری بسیار معنی دار بود.

مطالعات انجام شده روی GPX-1 وابستگی این آنزیم را به گلوتاتیون درون سلولی برای انجام وظیفه خود بخوبی نشان می‏دهد (8). تیمار نورون‏های غیر دوپامینرژیکی با شیکونین نیز نشانگر تاثیر این ترکیب بر رادیکال‏های آزاد می‏باشد (21). اما مکانیسم هم افزایی مشاده شده در مطالعه جاری چیست و این دو عامل در کدام نقطه از شاه‏راه‏های بقا به‏ یکدیگر می‏رسند و یا چه تاثیری برهم دارند؟ مطالعات پیش روی ما درصدد یافتن پاسخ به این سوالات می‏باشد.

مرگ نورون‏های دوپامین‏ساز مهمترین شاخصه بیماری پارکینسون در مقیاس سلولی است. سم 6-OHDA از جمله توکسین‏هایی است که در صد بالایی از علائم سلولی پارکینسون را در لوله آزمایش و نیز در مدل‏های حیوانی باز تولید می‏کند. به این دلیل مطالعات آزمایشگاهی که جوانب مختلف پارکینسون را هدف قرار می‏دهد بر اساس مدل 6-OHDA و دیگر مدل‏ها استوار است. چنین مطالعاتی در مقیاس سلولی قابل پیگیری در مدل‏های حیوانی 6-OHDA بوده و می‏تواند برتعیین استراتژی‏های حفاظت نورونی تاثیر گذار باشد.

 

نتیجه گیری

نهایتا نتایج این مطالعه نشان داد که هم افزایش بیان آنزیم GPX-1 و هم تیمار سلول‏ها با شیکونین بصورت انفرادی و به‏خصوص بطور توام بر کاهش آسیب‏های ناشی از رادیکال‏های آزاد بر سلول‏ها موثر است. آیا این تاثیر توام نتیجه همکاری دو عامل بصورت هم افزایی یا سینرژیک است؟ مکانیسم چنین واکنش‏هایی چیست و چه شاه‏راه‏های درون سلولی را تحت تاثیر قرار می‏دهد؟ آیا می‏توان این تاثیر را در مدل‏های حیوانی بیماری نیز مشاهده و اثبات کرد؟ مطالعات آینده می‏تواند با دادن پاسخ به این سوالات در بهینه سازی مقامت نورونی در برابر مسمومیت‏های پارکینسونی و تعیین استراتژی‏های حفاظت نورونی موثر واقع شود.

 

تشکر و قدردانی

از همکاری تکنیکی خانم سحر شجاعی در تولید این مقاله سپاسگزاری می‏شود.

 

منابع

1. Wolozin B, Behl C. Mechanisms of neurodegenerative disorders: Part 2: control of cell death. Arch Neurol. 2000; 57(6): 801-4.

2. Culmsee C, Landshamer S. Molecular insights into mechanisms of the cell death program: role in the progression of neurodegenerative disorders. Curr Alzheimer Res. 2006; 3(4): 269-83.

3. Poon HF, Butterfield DA. Free radicals and brain aging. Clin Geriatr Med. 2004; 20(2): 329-59.

4. Halliwell B. Oxidative stress and neurodegeneration : where are we now. J Neurochem. 2006; 97: 1634–1658.

5. Dringen R. Metabolism and functions of glutathione in brain. Prog Neurobiol. 2000; 62(6): 649-71.                                

6. Wullner U, Klockgether T. Glutathione depletion potentiates MPTP and MPPtoxicity in nigraldopaminergic neurons. Neuroreport. 1996; 7: 921-923.

7. Zeevalk GD, Nicklas WJ. Role of oxidative stress and the glutathione system in loss of dopamine neurons due to impairment of energy metabolism, J Neurochem. 1998; 70: 1421-1430.

8. Halliwell B, Gutteridge JM.  Biologically relevant metal ion-dependent hydroxyl radical generation. An update. Febs Lett. 1992; 307(1): 108-112.

9. Cheng W, Fu YX, Porres JM, Ross DA, et al. Selenium-dependent cellular glutathione peroxidase protects mice against a pro-oxidant-induced oxidation of NADPH, NADH, lipids, and protein. FASEB J. 1999; 13(11): 1467-1475.

10. Cheng WH, Ho YS, Valentine BA, Ross DA, et al. Cellular glutathione peroxidase is the mediator of body selenium to protect against paraquat lethality in transgenic mice. J Nutr. 1998; 128: 1070–76.

11. Gardaneh M, Gholami M, Maghsoudi N. Synergy between glutathione peroxidase-1 and astrocytic growth factors suppresses free radical generation and protects dopaminergic neurons against 6-hydroxydopamine, Rejuvenation Res. 2011; 14(2): 195-204.

12. Papageorgiou VP, Assimopoulou, AN, Couladouros, EA, Hepworth D, et al. The chemistry and biology of alkannin, shikonin, and related naphthazarin natural products. Angew. Chem. Int. Ed. 1999; 38: 270–300.

13. Yoshimi N, Wang A, Morishita Y, Tanaka T, et al. Modifying effects of fungal and herb metabolites on azoxymethane- induced intestinal carcinogenesis in rats. Jpn. J. Cancer Res. 1992; 83(12): 1273–1278.

14. Hisa T, Kimura Y, Takada K, Suzuki  F, et al. Shikonin, an ingredient of Lithospermum erythrorhizon, inhibits angiogenesis in vivo and in vitro. Anticancer Res. 1998; 18: 783–790.

15. Tanaka S, Tajima M, Tsukada M, Tabata M. A comparative study on antiinflammatory activities of the enantiomers, shikonin and alkannin. J. Nat. Prod. 1986; 49: 466–469.

16. Kourounakis AP, Assimopoulou AP, Papageorgiou VP, Gavalas A, et al. Alkannin and shikonin: effect on free radical processes and on inflammation - a preliminary pharmacochemical investigation. Arch. Pharm. (Weinheim). 2002; 335, 262-266.

17. Gao D, Kakuma M, Oka S, Sugino K. et al.  Reaction of beta-alkannin (shikonin) with reactive oxygen species: detection of beta-alkannin free radicals.  Bioorg Med Chem. 2000; 8, 2561-2569.

18. Rahimi ShamAbadi A, Gardaneh M, Alipanah M, Gharib E. Transfectability and Transducibility of chicken liver cell line LMH compared to human cell line HEK-293T. J Cell Tissue. 2011; 1(2): 47-56][Persian].

19. Gharib E, Gardaneh M, Montasser Kouhsari Sh. Cooperative effects of glutathione peroxidase-1 and glial cell line-derived neurotrophic factor on dopaminergic neuron resistance against 6-OHDA and H2O2 toxicities, J Neurosci Res. 2012 (submitted).

 

20. Moscow JA, Morrow CS, He R, Mullenbach GT, et al. Structure and function of the 5'-flanking sequence of the human cytosolic selenium-dependent glutathione peroxidase gene (hgpx1). J Biol Chem. 1992; 267(9): 5949.

21. Wang Z, Liu T, Gan L, Wang T, et al. Shikonin protects mouse brain against cerebral ischemia/reperfusion injury through its antioxidant activity, Eur J Pharmacol. 2010; 643(2-3): 211-7.

22. Nam KN, Son MS, Park JH, Lee EH. Shikonin attenuate microglial inflammatory responses by inhibition of ERK, Akt, and NF-kappaB: neuroprotective implications, Neuropharmacol. 2008; (5):819-25.

 

1. Wolozin B, Behl C. Mechanisms of neurodegenerative disorders: Part 2: control of cell death. Arch Neurol. 2000; 57(6): 801-4.

2. Culmsee C, Landshamer S. Molecular insights into mechanisms of the cell death program: role in the progression of neurodegenerative disorders. Curr Alzheimer Res. 2006; 3(4): 269-83.

3. Poon HF, Butterfield DA. Free radicals and brain aging. Clin Geriatr Med. 2004; 20(2): 329-59.

4. Halliwell B. Oxidative stress and neurodegeneration : where are we now. J Neurochem. 2006; 97: 1634–1658.

5. Dringen R. Metabolism and functions of glutathione in brain. Prog Neurobiol. 2000; 62(6): 649-71.                                

6. Wullner U, Klockgether T. Glutathione depletion potentiates MPTP and MPPtoxicity in nigraldopaminergic neurons. Neuroreport. 1996; 7: 921-923.

7. Zeevalk GD, Nicklas WJ. Role of oxidative stress and the glutathione system in loss of dopamine neurons due to impairment of energy metabolism, J Neurochem. 1998; 70: 1421-1430.

8. Halliwell B, Gutteridge JM.  Biologically relevant metal ion-dependent hydroxyl radical generation. An update. Febs Lett. 1992; 307(1): 108-112.

9. Cheng W, Fu YX, Porres JM, Ross DA, et al. Selenium-dependent cellular glutathione peroxidase protects mice against a pro-oxidant-induced oxidation of NADPH, NADH, lipids, and protein. FASEB J. 1999; 13(11): 1467-1475.

10. Cheng WH, Ho YS, Valentine BA, Ross DA, et al. Cellular glutathione peroxidase is the mediator of body selenium to protect against paraquat lethality in transgenic mice. J Nutr. 1998; 128: 1070–76.

11. Gardaneh M, Gholami M, Maghsoudi N. Synergy between glutathione peroxidase-1 and astrocytic growth factors suppresses free radical generation and protects dopaminergic neurons against 6-hydroxydopamine, Rejuvenation Res. 2011; 14(2): 195-204.

12. Papageorgiou VP, Assimopoulou, AN, Couladouros, EA, Hepworth D, et al. The chemistry and biology of alkannin, shikonin, and related naphthazarin natural products. Angew. Chem. Int. Ed. 1999; 38: 270–300.

13. Yoshimi N, Wang A, Morishita Y, Tanaka T, et al. Modifying effects of fungal and herb metabolites on azoxymethane- induced intestinal carcinogenesis in rats. Jpn. J. Cancer Res. 1992; 83(12): 1273–1278.

14. Hisa T, Kimura Y, Takada K, Suzuki  F, et al. Shikonin, an ingredient of Lithospermum erythrorhizon, inhibits angiogenesis in vivo and in vitro. Anticancer Res. 1998; 18: 783–790.

15. Tanaka S, Tajima M, Tsukada M, Tabata M. A comparative study on antiinflammatory activities of the enantiomers, shikonin and alkannin. J. Nat. Prod. 1986; 49: 466–469.

16. Kourounakis AP, Assimopoulou AP, Papageorgiou VP, Gavalas A, et al. Alkannin and shikonin: effect on free radical processes and on inflammation - a preliminary pharmacochemical investigation. Arch. Pharm. (Weinheim). 2002; 335, 262-266.

17. Gao D, Kakuma M, Oka S, Sugino K. et al.  Reaction of beta-alkannin (shikonin) with reactive oxygen species: detection of beta-alkannin free radicals.  Bioorg Med Chem. 2000; 8, 2561-2569.

18. Rahimi ShamAbadi A, Gardaneh M, Alipanah M, Gharib E. Transfectability and Transducibility of chicken liver cell line LMH compared to human cell line HEK-293T. J Cell Tissue. 2011; 1(2): 47-56][Persian].

19. Gharib E, Gardaneh M, Montasser Kouhsari Sh. Cooperative effects of glutathione peroxidase-1 and glial cell line-derived neurotrophic factor on dopaminergic neuron resistance against 6-OHDA and H2O2 toxicities, J Neurosci Res. 2012 (submitted).

 

20. Moscow JA, Morrow CS, He R, Mullenbach GT, et al. Structure and function of the 5'-flanking sequence of the human cytosolic selenium-dependent glutathione peroxidase gene (hgpx1). J Biol Chem. 1992; 267(9): 5949.

21. Wang Z, Liu T, Gan L, Wang T, et al. Shikonin protects mouse brain against cerebral ischemia/reperfusion injury through its antioxidant activity, Eur J Pharmacol. 2010; 643(2-3): 211-7.

22. Nam KN, Son MS, Park JH, Lee EH. Shikonin attenuate microglial inflammatory responses by inhibition of ERK, Akt, and NF-kappaB: neuroprotective implications, Neuropharmacol. 2008; (5):819-25.