مطالعه مقایسه ای مورفولوژی و بیوشیمی سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت قبل و بعد از تمایز استئوژنیک

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

چکیده

هدف: هدف این مطالعه مقایسه خصوصیات مورفولوژیک و بیوشیمیایی سلول‏های مزانشیم و استئوبلاست در محیط آزمایشگاهی می‏باشد.
مواد و روش‏ها: بعد از استخراج سلول‏های مزانشیم مغز استخوان رت و کشت آنها تا پاساژ سوم، این سلول‏ها در محیط کشت حاوی ترکیبات تمایزی شامل بتا گلیسرول فسفات، دگزامتازون و آسکوربیک اسید به مدت 21 روز کشت شد. سپس مورفولوژی سلول های مزانشیم و تمایز یافته توسط هوخست و آکریدین اورنژ بررسی گردید. همچنین میزان رسوب ماتریکس، میزان کلسیم، فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز در سلول‏های تمایزی و مزانشیم و فعالیت متابولیک سلول های تمایز یافته توسط روش MTT بررسی شد.
نتایج: بررسی‏های مورفولوژیک تغییراتی از قبیل تغییر موقعیت هسته و گرد شدن سیتوپلاسم در سلول‏های تمایز یافته را در مقایسه با سلول‏های مزانشیم نشان داد. همچنین معدنی شدن ماتریکس از روز دهم شروع و در روز 21 به بیشترین میزان خود رسید. در سلول‏های تمایز یافته از روز دهم میزان کلسیم داخل سلولی به صورت معنی داری (05/0P<) افزایش یافت ولی فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز کاهش معنی‏دار (05/0P<) نشان داد. افزایش معنی‏دار (05/0P<) فعالیت متابولیک سلول های تمایز یافته نیز در طی مراحل تمایز مشاهده شد.
نتیجه گیری: علاوه بر تفاوت‏های مورفولوژیک، میزان کلسیم، فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز و فعالیت متابولیک سلول‏های مزانشیم و استئوبلاست، با یکدیگر متقاوت هستند. لذا می توان برای تشخیص تمایز آزمایشگاهی سلول‏های بنیادی مزانیشیم مغز استخوان به استئوبلاست، علاوه بر رنگ آمیزی آلیزارین از فاکتورهای ذکر شده در این پژوهش نیز استفاده کرد.  
 

کلیدواژه‌ها


مقدمه

پیش از این بسیاری از اطلاعات و یافته ها از انجام آزمون‏ها بر جانوران یا مطالعات در شرایط آزمایشگاهی با استفاده از سلول‏های بسیار تمایز یافته، نامیرا و سلول‏های سرطانی حاصل می شد. اما امروزه سلول‏های بنیادی با توان خودنوزایی و تمایز مدل آزمایشگاهی مناسبی را در اختیار محققان قرار داده است (1و2). یکی از هدف‏های تحقیق بر سلول‏های بنیادی، تمایز آنها به سلول‏های تخصص یافته نظیر نورون‏ها، سلول‏های عضله قلبی، سلول‏های استخوانی، سلول‏های مولد انسولین و غیره می باشد. تمایز جهت دار سلول‏های بنیادی برای استفاده از آن‏ها در توسعه درمان‏های جدید بسیار حیاتی است (3و4). استخوان فراهم آورنده حمایت مکانیکی برای موجود، محلی برای خون سازی، ذخیره‏ای برای کلسیم و هومئوستازی یون‏ها است، بنابراین حفظ سلامت آن برای بقا لازم و ضروری می‏باشد (5). سلول‏های استئوبلاست نقش مهمی را در دوباره سازی استخوان (bone remodeling) ایفا کرده و امکان بررسی تمایز سلول‏های مزانشیم به پیش سازهای استئوبلاستی، بلوغ استئوبلاست‏ها       و تشکیل و معدنی شدن ماتریکس در شرایط in vitro (آزمایشگاهی) وجود دارد (6). سلول‏های بنیادی مزانشیمی از دسته سلول‏هایی هستند که در بازسازی بافت استخوان صدمه دیده نقش مهمی را بازی می‏کنند. از آن جایی که در استراتژی‏های سلول درمانی از سلول‏های کاملا تمایز یافته استفاده می‏شود اولین قدم در استفاده از سلول‏های مزانشیمی به منظور بازسازی ضایعات استخوانی، تمایز آن‏ها به استئوبلاست‏ها در شرایط آزمایشگاهی می‏باشد (3). علاوه بر آن در اغلب تحقیقات، تمایز به استخوان به عنوان بخشی از پتانسیل سلول مزانشیمی مورد توجه قرار گرفته است. ارزیابی تمایز سلول‏های مزانشیمی به استئوبلاست با استفاده از روش رنگ آمیزی اختصاصی برای معدنی شدن و بررسی بیان ژن ها انجام می‏گیرد (7و8). اما تا به حال  هیچ گزارشی از ویژگی های مورفولوژیکی، متابولیک و بیوشیمیائی این سلول‏ها قبل و بعد از تمایز استئوژنیک در محیط آزمایشگاه وجود ندارد. لذا مطالعه حاضر به بررسی ویژگی های سلول‏های مزانشیم مغز استخوان رت در شرایط آزمایشگاهی و پس از تمایز آن‏ها به استئوبلاست می پردازد. این مطالعه مقایسه‏ای می تواند اطلاعات قابل ملاحظه‏ای برای محققین و دانشجویانی که برای اولین بار درصدد انجام مطالعات تمایزی بر روی سلول‏های مزانشیم مغز استخوان هستند را فراهم نماید.

مواد و روش‌ها

کشت سلول‏های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت: پس از کسب مجوز از کمیته اخلاق دانشگاه اراک و رعایت اصول اخلاقی، در این مطالعه تجربی موش های صحرائی نژاد ویستار  به کمک دی اتیلن اتر بیهوش شد و استخوان های ران و ساق پای آن‏ها جدا و سپس بافت های پیوندی اطراف استخوان‏ها به طور کامل پاک گردید. استخوان ها در محیط کشت (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) DMEM حاوی 15درصد سرم جنین گاوی (FBS) و پنی سیلین-استرپتومایسین به زیر هود لامینار منتقل شد (کلیه مواد شیمیایی مورد استفاده در این پژوهش از شرکت سیگما، کشور آلمان خریداری شد مگر در مواردی که ذکر خواهد شد). دو سر استخوان های ران و ساق پا با قیچی استریل قطع و سپس مغز استخوان با تزریق محیط کشت بوسیله یک سرنگ توسط تکنیک فلاشینگ خارج و به داخل لوله فالکون هدایت شد. لوله فالکن به مدت 5 دقیقه در rpm1200 سانتریفوژ و محیط رویی خارج و رسوب سلولی در یک میلی لیتر محیط تازه معلق گردید. محیط کشت حاوی سلولهای استخراج شده به یک فلاسک کشت منتقل و در انکوباتور در دمای 37 درجه سانتی گراد و غلظت 5 درصد CO2 نگهداری گردید. بعد از 24 ساعت، محیط رویی که حاوی سلول‏های مرده یا گویچه های قرمز بود خارج و سلول‏های چسبیده به کف ظرف کشت توسط PBS+(بافر فسفات نمکی حاوی کلرید کلسیم و کلرید منیزیم) شستشو داده شد و محیط کشت تازه و کامل به آن اضافه گردید. سپس به مدت 14 روز هر سه روز یک بار محیط کشت سلول‏ها به ترتیب فوق تعویض گردید. زمانی که کف فلاسک از سلول پر شد با کمک Trypsin/EDTA سلول‏ها از کف فلاسک جدا و به فلاسک‏های جدید منتقل شدند (اصطلاحا به آن پاساژ سلولی گفته می شود). سلول‏ها بعد از  سه مرحله پاساژ برای انجام آزمون‏های بعدی در این تحقیق مورد استفاده قرار گفتند.

تمایز به استخوان و اندازه گیری میزان معدنی شدن: به منظور تمایز به استخوان، سلول‏ها در مرحله پاساژ سوم با تعداد 70 هزار در چاهک‏های پلیت 6 خانه در حضور محیط کشت DMEM حاوی 15 درصد FBS و پنی سیلین استرپتومایسین کشت شدند. سپس به سلول‏ها اجازه داده شد تا کف ظرف را پر نمایند. پس از اطمینان از پر شدن کف ظرف توسط سلول‏ها، محیط کشت تمایزی حاوی 50 میکروگرم در میلی لیتر آسکوربیک اسید-2-فسفات، 10 نانومولار دگزامتازون و 10 میلی مولار بتا-گلیسرول فسفات جایگزین شد. کشت تمایزی به مدت 21 روز انجام و هر سه روز یک بار محیط کشت تعویض گردید و در پایان این مدت وقوع تمایز با رنگ آمیزی آلیزارین رد ارزیابی شد. آلیزارین رد یک ترکیب آلی است که به طور اختصاصی ماتریکس معدنی شده را در سلول‏ها به رنگ قرمز رنگ آمیزی می کند، به طوری که شدت رنگ پذیری بافت با میزان مواد معدنی موجود در ماتریکس آن ارتباط مستقیم دارد. به طور خلاصه و بر اساس روش ارائه شده (9)، سلول‏های استئوژنیک 2 بار با PBS شسته و به مدت 15 دقیقه با فرمالدئید 10 درصد در دمای اتاق فیکس شدند. سپس سلول‏ها با  یک میلی لیتر محلول 40 میلی مولار آلیزارین رد (1/4pH=) به مدت 20 دقیقه رنگ آمیزی شدند. بعد از خارج کردن اضافه رنگ از پلیت 6 خانه و شستشوی آن‏ها با آب مقطر نمونه‏ها توسط میکروسکوپ معکوس بررسی و مورد عکسبرداری قرار گرفتند. برای اندازه گیری کمی میزان معدنی شدن بر اساس رنگ آلیزارین، ابتدا چاهک‏های پلیت 6 خانه با آب مقطر شستشه شدند و سپس 800 میکرولیتر اسیداستیک 10 درصد به هر چاهک اضافه و به مدت 30 دقیقه بر روی شیکر قرار گرفت. پس از آن سلول ها از کف پلیت توسط اسکراپر جمع آوری و به همراه اسید استیک به لوله اپندورف منتقل شد. سپس به آرامی 500 میکرولیتر روغن معدنی (mineral oil) بر روی سلول‏های استخراج شده اضافه و به مدت 10 دقیقه در دمای 85 درجه سانتی گراد حرارت داده شد. پس از قرار دادن نمونه به مدت 5 دقیقه در حمام آب یخ،  به مدت 15 دقیقه در g20000 سانتریفیوژ گردید. در انتها  500 میکرولیتر از مایع رویی اپندورف به لوله دیگری         منتقل و به آن‏ها 200 میکرولیتر هیدروکسید آمونیوم 10   درصد اضافه و جذب آن ها به کمک دستگاه اسپکتروفتومتر (PG Instrument Company, England) در طول موج 405 نانومتر خوانده شد.

تهیه منحنی استاندارد: محلول 40 میلی مولار الیزارین  توسط مخلوطی (به نسبت 5 به 2 از اسید استیک 10 درصد و هیدروکسی آمونیوم 10 درصد)، 20 برابر رقیق شد، که بدین ترتیب محلول آلیزارین رد بدست آمده دارای غلظت 2000 میکرو مولار بود. سپس غلظت‏های 3/31 تا 2000 میکرو مولار از محلول آلیزارین رد در لوله‏های جداگانه توسط روش رقیق سازی سریالی با استفاده از محلول اسید استیک و هیدروکسی آمونیم تهیه و جذب آنها در 405 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر قرائت گردید. پس از رسم منحنی با استفاده از فرمول Y=0.179X+0.094 با R2=0.997 مقادیر نمونه های مجهول محاسبه گردید. در این فرمول Y بیانگر میزان جذب و X بیانگر غلظت بر حسب میکرو مولار می باشد.

سنجش فعالیت متابولیکی: در سنجش متیل تیازول تترازولیوم (MTT) فعالیت متابولیکی سلول‏ها مورد سنجش قرار می گیرد (10). MTT از نمک های تترازولیوم به رنگ زرد و محلول در آب است که توسط آنزیم‏های دهیدروژناز موجود در میتوکندری احیا شده و به فرم کریستال های فورمازان غیر محلول در سلول‏های زنده رسوب می نماید. این کریستال‏ها به رنگ بنفش بوده و میزان تولید کریستال غیر محلول متناسب با فعالیت سلول می باشد، از طرفی سلول‏هایی که از نظر متابولیکی فعال هستند روند احیای MTT را انجام داده که به‏عنوان سلول زنده در نظر گرفته می شوند (11). برای انجام این تست سلول‏ها پس از 21 روز کشت در حضور محیط استئوژنیک دوبار با PBS شستشو داده و به آنها محیط کشت فاقد FBS اضافه شد. سپس به ازای هر 100 میکرولیتر محیط کشت 10 میکرو لیتر محلول MTT (5 میلی گرم بر میلی لیتر) به هر چاهک از پلیت 6 خانه اضافه و پلیت‏ها به مدت 4 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد نگهداری شد. پس از این مدت محیط رویی به آرامی تخلیه و به کریستال های فورمازان حاصل، محلول دی متیل سولفوکسید (DMSO) اضافه و جذب نوری محلول حاصله با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 505 نانومتر قرائت شد. لازم به ذکر است که هر آزمایش سه بار تکرار گردید.

بررسی مورفولوژی : پس از 21 روز کشت، مورفولوژی هسته در سلول‏های استئوژنیک و غیر استئوژنیک با استفاده از رنگ فلورسنت هوخست (1 میکروگرم بر میلی‏لیتر) و مورفولوژی سیتوپلاسم با استفاده از رنگ فلورسنس آکریدین اورانژ      (01/0 گرم بر میلی‏لیتر) بررسی گردید. مطالعه        مورفولوژیک سلول‏ها با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت (Olympus IX70-Japan) انجام و پس از عکسبرداری توسط دوربین دیجیتال، قطر هسته ها به کمک نرم افزار موتیک (Motic) در هر دو گروه استئوژنیک و غیر استئوژنیک اندازه گیری و مقایسه گردید.

اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز: فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز با تجزیه پیروفسفات‏ها در محیط in vitro قابل اندازه گیری است. سلول‏‏ها پس از تریپسینه شدن و شستشو، در بافر لیز کننده (0.25 M Tris-HCl,)              5/7 Triton X-100, pH: قرار داده شد و سپس در           rpm 12000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ گردید. میزان پروتئین موجود در محلول رویی به کمک روش برادفورد (12)و با استفاده از سرم آلبومین گاوی (BSA) به عنوان استاندارد اندازه گیری شد. فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز در نمونه سلولی لیز شده بر حسب غلظت مساوی از پروتئین در حضور نیتروفنیل فسفات به عنوان سوبسترا با استفاده از کیت اندازه گیری آلکالین فسفاتاز ساخت شرکت درمان کاو انجام شد. سپس با افزودن سود 02/0 نرمال واکنش آنزیم متوقف و میزان جذب در طول موج 410 نانومتر اندازه گیری گردید. پس از رسم منحنی استاندارد با استفاده از فرمول Y=0.004X+0.002 با R2=0.999 فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز در نمونه‌های مجهول محاسبه گردید. در این فرمول Y بیانگر میزان جذب و X بیانگر فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز بر حسب U/L می باشد.

اندازه گیری میزان کلسیم داخل سلولی: جهت اندازه گیری میزان کلسیم موجود در سلول‏ها پس از شستشوی آنها توسط محلول ایزوتونیک، اوزان مساوی سلولی از نمونه‏های استئوژنیک و غیر استئوژنیک را در یک لوله اپندورف ریخته و سپس یک میلی‏لیتر اسید کلریدریک 6/0 نرمال به آن‏ها اضافه شد. پس از 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‏گراد  محتوای کلسیم داخل سلول استخراج و سپس نمونه‏ها در rpm 12000 سانتریفوژ شد. میزان کلسیم در محلول روئی توسط روش ارائه شده توسط کیت شرکت درمان کاو  پس از قرائت در طول موج 575 نانومتر بصورت میکروگرم در دسی لیتر مشخص گردید.

آنالیز آماری:  تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از نرم افزار SPSS و بر اساس روش آنالیز واریانس یک طرفه و دو طرفه        (one and two way ANOVA) با استفاده از تست Tukey انجام و 05/0p< به عنوان سطح معنی‏داری در نظر گرفته شد.

 

نتایج

پس از رنگ آمیزی هسته سلول‏ها با رنگ هوخست در پایان کشت 21 روزه، اندازه قطر هسته‏ها در گروه استئوژنیک (سلولهای استئوبلاست) با میانگین 28/0 ±05/10 میکرومتر و در گروه غیر استئوژنیک (سلولهای مزانشیم) با میانگین       39/0 ±01/10 میکرومتر تفاوت معنی داری (05/0p>) را نشان نداد (شکل B1 و A1). رنگ آمیزی  سیتوپلاسم سلول‏ها با آکریدین اورنژ در پایان دوره کشت نشان داد که سلول‏های غیر استئوژنیک در مقایسه با سلول‏های استئوژنیک دارای زواید قابل تشخیص، سیتوپلاسم چند وجهی و هسته آن‏ها در موقعیت مرکزی بود. در حالی که هسته در سلول‏های استئوژنیک از موقعیت مرکزی خارج و به کناری رانده شده بود و از طرفی سیتوپلاسم نیز از حالت چندوجهی خارج شده و تقریبا گرد به نظر می‏رسید (شکل D1 و C1).


 

شکل1: بررسی مورفولوژی هسته و سیتوپلاسم توسط رنگ آمیزی فلورسنت- رنگ آمیزی  هسته‏ها درسلول‏های مزانشیم در محیط غیر استئوژنیک (A) و در محیط استئوژنیک (B) توسط رنگ هوخست. رنگ آمیزی سلول های مزانشیم در محیط غیر استئوژنیک (C) و در محیط استئوژنیک (D) توسط رنگ آکریدین اورنژ (بزرگنمائی X400).


سنجش MTT در روزهای 5، 10، 15و 21 از دوره کشت استئوژنیک نشان داد که میانگین میزان جذب در روزهای مختلف تفاوت معنی داری (05/0p<) داشت (جدول 1). بدین صورت فعالیت متابولیکی سلول‏ها در طی این دوره رو به رشد بوده و در روز 21 به حداکثر میزان خود رسیده بود.

 

جدول 1:  مقایسه میانگین میزان جذب MTT (در طول موج 405 نانومتر) در نمونه های استئوژنیک در روزهای 5، 10، 15 و 21.

میزان جذب

روز

0/352 a±0/020

5

0/630b ±0/029

10

0/916c ±0/047

15

1/635d  ±0/078

21

مقادیر به صورت ±sd means می‏باشد. میانگین‏های با کد       حرف‏های متفاوت دارای تفاوت معنی‏دار می‏باشد                       .(one way ANOVA, Tukey test, p<0.05)

 

در طی دوره تمایز در روزهای 5، 10، 15 و 21 وقوع استئوژنز توسط روش رنگ آمیزی آلیزارین رد نشان داد که ترشح ماتریکس معدنی از روز 10 شروع و با افزایش ترشح ماتریکس در روزهای 15و 21 همراه بود (شکل 2) . در حالی که سلول‏های گروه کنترل که در معرض محیط DMEM فاقد فاکتورهای استئوژنیک قرار داشتند با رنگ آلیزارین رد رنگ نشدند. همچنین نتایج آزمون کمی در جدول 2 نشان داد که تفاوت آماری معنی‏داری (‏05/0p<) در رابطه با میزان جذب رنگ آلیزارین در روزهای 15 و 21 در مقایسه با روزهای 5 و 10 مشاهده شد. از طرفی با توجه به تغییر ماهیت سلول ها و تمایز آنها، مشاهده شد که محیط کشت در فلاسک‏های حاوی سلول‏های تمایز یافته هر روز نیاز به تعویض دارد این در حالی است که تعویض محیط کشت در سلول‏های مزانشیم (غیر تمایزی) هر 4 روز یکبار انجام شد.

 

جدول 2:  مقایسه میانگین میزان جذب نور مرئی در طول موج 405 نانومتر بر اساس رنگ آلیزارین(میلی مولار) استخراج شده از نمونه‏های استئوژنیک در روزهای 5، 10، 15و 21.

آلیزارین رد (میلی مولار)

روز

130/0  a± 022/0

5

404/0  a±025/0

10

871/16 b±329/0

15

242/30 c±635/0

21

مقادیر به صورت ±sd means می‏باشد. میانگین‏های با کد       حرف‏های متفاوت دارای تفاوت معنی‏دار می‏باشد                       .(one way ANOVA, Tukey test, p<0.05)

 

 

شکل 2: رنگ آمیزی با آلیزارین رد در نمونه‏های غیر استئوژنیک و استئوژنیک (رنگ قرمز نشان دهنده رسوب کلسیم در ماتریکس سلول‏های تمایز یافته می باشد). در نمونه های غیر استئوژنیک (a1 تا  a4) هیچگونه معدنی شدن در روزهای 5، 10، 15 و 20 بر اساس رنگ آمیزی آلیزارین رد مشاهده نشد. در نمونه های استئوژنیکb1)  تا b4) معدنی شدن در روزهای  10، 15 و 20 بر اساس رنگ آمیزی آلیزارین رد مشاهده شد ولی در روز 5 هیچگونه رنگ قرمزی که نشان دهنده رسوب کلسیم باشد مشاهده نشد (بزرگنمائی X200).

 


در نمونه‏های استئوژنیک میزان کلسیم نیز روند رو به رشدی را داشت به گونه‏ای که این میزان در روز 10 نسبت به روز 5 و همچنین روزهای 15 و 21 نسبت به روزهای 5 و 10 افزایش معنی‏دار (‏05/0p<) نشان داد. این در حالی بود که در نمونه‏های غیر استئوژنیک نیز تفاوت معنی‏داری بین روزهای 15 و 21 نسبت به روزهای 5 و 10 مشاهده شد (جدول 3). آنالیز واریانس دو طرفه نشان داد که میزان افزایش غلظت کلسیم داخل سلولی در سلول‏های استئوژنیک نسبت به سلول‏های غیر استئوژنیک در زمان‏های مشابه بسیار معنی‏دار (001/0 p<) بود (جدول 4). از  طرفی آنالیز واریانس یک طرفه نشان دهنده کاهش معنی‏دار (05/0p<)  میزان فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز در سلول‏های استئوژنیک در روزهای مخلتف بود، همچنین این کاهش در سلول‏های غیر استئوژنیک نیز قابل مشاهده بود (جدول 3). علاوه بر این آنالیز واریانس دو طرفه نشان دهنده  تفاوت آماری معنی‏داری (001/0 p<) در میزان فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز در نمونه‏های استئوژنیک در مقایسه با نمونه‏های غیراستئوژنیک بود (جدول 5).

 

 

جدول 3:  مقایسه میانگین میزان کلسیم  (میکرو گرم بر دسی لیتر) و میزان فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز (U/L)  در نمونه های استئوژنیک و غیر استئوژنیک در روزهای 5، 10، 15 و 21.

روز

میزان کلسیم  (میکرو گرم در دسی لیتر) در نمونه‏های غیراستئوژنیک

میزان کلسیم (میکرو گرم در دسی لیتر) در نمونه‏های استئوژنیک

میزان فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز (U/L) در نمونه‏های غیراستئوژنیک

میزان فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز (U/L) در نمونه‏های استئوژنیک

5

0/41 a±0/02

2/87 a±0/01

109/9 a±2/45

153/4 a±14/7

10

0/47 a±0/02

23/32b ±0/13

90/2 b±2/8

114/9 b±3/8

15

0/84 b±0/03

35/52c ±0/02

52/3 c±2/1

74/8 c±1/9

21

0/96 b±0/01

37/32 c ±0/01

3/4 d±0/2

63/9 c±1/2

 

مقادیر به صورت ±sd means می باشد. میانگین های با کد حرف‏های متفاوت دارای تفاوت معنی‏دار می باشد .(One way ANOVA, Tukey test, p<0.05)

 

 

جدول شماره4: مقایسه میانگین فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز (U/L) در نمونه های استئوژنیک و غیر استئوژنیک در روزهای 5، 10، 15 و 21.

روز

میزان کلسیم (میکروگرم در دسی لیتر)در نمونه های غیر استئوژنیک

میزان کلسیم (میکروگرم در دسی لیتر)در نمونه های استئوژنیک

P-Value

5

0/41 ±0/02

2/87 ±0/01

001/0

10

0/47 ±0/02

23/32 ±0/13

15

0/84 ±0/03

35/52 ±0/02

21

0/96 ±0/01

37/32  ±0/01

روز و میزان کلسیم در نمونه‏ها

 

001/0

مقادیر به صورت ±sd means می‏باشد .(Two way ANOVA, Tukey test, p<0.05)

 

جدول شماره5: مقایسه میانگین کلسیم (میکروگرم بر دسی لیتر) در نمونه های استئوژنیک و غیر استئوژنیک در روزهای 5، 10، 15 و 21.

روز

میزان فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز (U/L) در نمونه‏های غیر استئوژنیک

میزان فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز (U/L) در نمونه های استئوژنیک

P-Value

5

109/9 a±2/45

153/4 a±14/7

001/0

10

90/2 b±2/8

114/9 b±3/8

15

52/3 c±2/1

74/8 c±1/9

21

3/4 d±0/2

63/9 c±1/2

روز و میزان کلسیم در نمونه‏ها

 

001/0

مقادیر به صورت ±sd means می‏باشد .(Two way ANOVA, Tukey test, p<0.05)

 


بحث

با وجودی که در برخی تحقیقات، پتانسیل تمایز به استخوان سلول‏های بنیادی مزانشیمی به عنوان یک شاخص برای این سلول‏ها مورد مطالعه قرار گرفته است (13)، گزارشی در مورد شکل ظاهری، ویژگی‏های متابولیکی و بیوشیمیائی این سلول‏ها در محیط آزمایشگاه وجود ندارد. اهمیت تمایز به استخوان سلول‏های مزانشیمی از نظر سلول درمانی و پیوند در ضایعات استخوانی بدیهی و مسلم است (5 و 14). از آن‏جا که روند تمایز سلول‏های مزانشیم مغز استخوان به استئوبلاست در آزمایشگاه‏ها مکررا انجام می‏شود وجود اطلاعات مورفولوژیک و بیوشیمیایی سلول‏های تمایز یافته امری ضروری است.

در این مطالعه سلول‏های جدا شده از مغز استخوان رت به مدت 21 روز در محیط استئوژنیک قرار گرفت. بررسی ظاهری سلول‏های تمایز یافته با رنگ آمیزی فلورسنت ظهور مورفولوژی متمایز از سلول‏های بنیادی مزانشیمی را از نظر سیتوپلاسم و موقعیت هسته نشان داد که از وقوع تمایز این سلول‏ها حکایت می‏کرد ولی از نظر اندازه هسته تغییر در این سلولها مشاهده نشد. در بسیاری از سلول‏ها و به ویژه سلول‏های جوان، هسته به طور معمول در وسط سلول قرار دارد و وقتی سلول‏ها تمایز می‏یابند، هسته به طرف کناره های سلول رانده شده و در محل ویژه‏ای قرار می گیرد (15). در این مطالعه در سلول‏های تمایز یافته استئوژنیک، سلول‏ها از حالت چندوجهی به حالت گرد درآمده و موقعیت هسته در سلول‏های بنیادی مزانشیمی از موقعیت مرکزی خارج و به کناری رانده شده بود. تفاوت قابل توجه در وضع ظاهری سلول‏ها در حالت مزانشیمی و تمایز یافته را می‏توان به اختلاف در سازمان اسکلت سلولی در این دو سلول نسبت داد. در سلول‏ها با منشا مزودرمی (میوسیت‏ها، استئوبلاست‏ها، سلول های اندوتلیال و .....) تفاوت‏های عملکردی و ساختاری سیتواسکلتون داخلی این سلول ها باعث ایجاد تفاوت مورفولوژیک آن‏ها بعد از تمایز سلولی می شود (16)، مثلا وجود دسته های ضخیم از رشته‏های اکتین با فیبرهای کششی در سلول‏های بنیادی مزانشیمی که در سرتاسر سیتوپلاسم گسترده شده‏اند از یک‏طرف و حضور شبکه‏های فشرده و ظریف اکتین‏ها در استئوبلاست‏ها از طرف دیگر باعث ایجاد تفاوت‏های مورفولوژیک این سلول‏ها از یکدیگر می‏شود (16و 17).

نتایج این مطالعه نشان داد که طی دوره تیمار استئوژنیک فعالیت متابولیکی سلول‏ها در حال تمایز افزایش یافت که می‏توان این افزایش در فعالیت متابولیکی سلول‏ها را ناشی از سنتز پروتئین دخیل در روند تمایز دانست. در روند تمایز استئوژنیک 8 گروه پروتئینی شناسائی شده‏اند که بزرگترین دسته پروتئین‏های شناسایی شده در روند تمایز مربوط به متابولیسم سلولی نظیر آنزیم‏های چرخه کربس، متابولیسم آمینو اسیدها، بیوسنتز پروتئین‏ها و گلیکولیز گزارش شده اند (18). لذا در این تحقیق افزایش معنی دار متابولیسم بر اساس میزان تولید کریستال بنفش فومازان دور از انتظار نبود.

مثبت شدن رنگ آمیزی آلیزارین رد دلیلی بر تشکیل نودول‏های کلسیمی در ماتریکس سلول (9) و تمایز سلول‏های مزانشیم مغز استخوان به سلول‏های استئوبلاست است (19). نتایج مشاهدات ما نشان داد که تشکیل نودول‏های کلسیمی بعد از روز پنجم شروع می‏شود، بطوری که در روز دهم رنگ قرمز ناشی از رنگ آمیزی نودول‏های تشکیل شده با آلیزارین رد مشاهده و از نظر کمی نیز افزایش معنی‏داری را نسبت به روز پنجم نشان داد. همچنین از آنجائی که تشکیل این نودول کلسیم وابسته به حضور کلسیم در داخل سلول است (20) در مطالعه حاضر در روز دهم میزان کلسیم داخل سلولی افزایش قابل ملاحظه ای را نسبت به روز پنجم نشان می دهد که تایید بر تشکیل نودول‏های کلسیم در روز دهم می باشد. از آنجائی که استئوبلاست ها نقش عمده‏ای در تشکیل هیدروکسی آپاتیت [Ca5(PO4)3(OH)] دارند (21) لذا حضور فسفات در سلول برای ورود کلسیم به داخل سلول ضروری  می باشد (6 و 22). برای حضور کلسیم فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز ضروری است. در مطالعه حاضر فعالیت این آنزیم در سلول روز پنجم در سلول های استئوژنیک  نسبت به همان روز در سلول‏های غیر استئوژنیک شدیدا افزایش نشان داد. البته عدم تشکیل نودول کلسیم در روز پنجم مغایرتی با فعالیت این آنزیم ندارد بدلیل اینکه فعالیت این آنزیم باعث تجزیه پیروفسفات در سلول شده (23) که متعاقبا ورود کلسیم و تشکیل هیدروکسی آپاتیت را امکان پذیر می‏نماید. در فرایند تمایز سلول‏های مزانشیم به استئوبلاست ژن‏های مختلفی دخالت دارند که بعضی از آن‏ها عبارتند از استئوپوینتن، استئوکلسین، BMP یک و دو، آلکالین فسفاتاز و غیره (22) که البته آلکالین فسفاتاز بعنوان اولین ژنی که در روند تمایز بیان می شود مطرح است (22و 23). لذا در این تحقیق نیز بیشترین فعالیت این آنزیم در روز پنجم گزارش شده است که به تدریج از فعالیت آن کاسته شده تا به حداقل میزان خود در روز 21 برسد. البته فعالیت این آنزیم در سلول‏های مزانشیم نیز وابسته به زمان کاهش یافت که با توجه به افزایش میزان کلسیم در روزهای 15 و 21 در سلولهای مزانشیم قابل توجیح است. افزایش کلسیم در روزهای 15 و 21 در مقایسه با روزهای 5 و10 در سلول‏های مزانشیم خارج از میزان طبیعی کلسیم (100 نانومولار) نیست. ولی در صورتی که میزان فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز کاهش نیابد (با توجه به نسبت یون‏های کلسیم به فسفات) میزان کلسیم از غلظت متعارف داخل سلول خارج شده و باعث مرگ سلول می‏گردد، لذا برای نگهداری غلظت کلسیم داخل سلول کاهش میزان فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز توجیه پذیر است.

 

نتیجه گیری

سلول‏های مزانشمی مغز استخوان بعد از تمایز به استئوبلاست دچار تغییرات مورفولوژیک از قبیل حذف زائده های سلولِی، گرد شدن سلول و تغییر موقعیت هسته در سیتوپلاسم می شوند. علاوه بر آن در این سلول‏ها تغییرات بیوشیمیایی از قبیل افزایش فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز، افزایش غلظت کلسیم، رنگ پذیری توسط آلیزارین رد از روز دهم و افزایش متابولیسم سلولی نیز بروز می کند. لذا برای اطمینان از تمایز این سلول‏ها به استئوبلاست علاوه بر رنگ آمیزی آلیزارین رد می توان از فاکتورها مذکور نیز برای شناسائی استفاده کرد.

 

منابع

  1. Kim SK,  Kim BK, Shim JH, Gil JE, et al. Nonylphenol and Octylphenol-induced apoptosis in human embryonic stem cells is related to fas-fas ligand pathway, Toxicological Scince. 2006; 94: 310-321.

2. Kermani SH, Karbalaie KH, Madani H, Jahangirnejad AA, et al. Bone marrow-mesenchymal stem cells as a suitable model for assessment of environmental pollution, Journal of Arak University of Medical Sciences. 2008; 11: 117-125.(abstract in English)

3. Baghban Islami Nejad MR, Aghbibi NM, Piriaiee A. Study of the bone produced from canine mesenchymal stem cell differentiation Scientific, Journal of Kurdistan University of Medical Sciences. 2007; 12 (3): 8-22. (Abstract in English)

4. Baghban Islami Nejad MR, Jafarian M, Khojasteh A, Mashhadi AF, et al. In vivo Bone Formation by Canine Mesenchymal Stem Cells Loaded onto HA/TCP Scaffolds: Qualitative and Quantitative Analysis, Yakhteh Medical Journal. 2008; 10(3): 205-212.

5. Jabbarpour Bonyadi M, Mahdavi N. Studing the effect of mitogen activated protein kinase inhibitor (MAPKI) on mesenchymal stem cells in vitro, Pharmaceutical Science. 2005; 3: 39-44. (Abstract in English)

6. Hartmann C. A Wnt canon orchestrating osteoblastogenesis, Trends in cell biology. 2006; 16: 151-158.

7. Eslaminejad MB, Nazarian H, Taghiyar L. Mesenchymal stem cell isolation from the removed medium of rat’s bone marrow primary culture and their differentiation into skeletal cell linage, yakhteh medical journal. 2008; 10(1): 65-72.

8. Eslaminejad MB, Talkhabi M, Zeynali B. Effect of Lithium Chloride on Proliferation and Bone Differentiation of Rat Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in Culture, Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 2008; 11(3): 143-151.

9. Gregory CA, Gunn WG, Peister A, Prockop DJ. An Alizarin red-based assay of mineralization by adherent cells in culture: comparison with cetylpyridinium chloride extraction, Analytical Biochemistry. 2004; 329: 77-84.

10. Wyllie, A, Donahue, V, Fischer, B, Hill, D, et al. Apoptosis and Cell Proliferation. 2th Ed. Boehringer Mannheim; 1998.

11. Momeni HR, Soliemani Mehranjani M, Abnosi MH, Nasimi P. Evaluation of viability in adult mouse spinal cord slices by MTT, Iranian Journal of biology. 2010; 23(2): 267-274. (Abstract in English)

12. Bradford MM. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem. 1976; 72: 248–254.

13. Bakhsh D, Song L, Tuan RS. Adult stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy, Journal of cellular and molecular medicine. 2004; 8: 301-316.

14. Baharvand, H. Differentiation and application of stem cells. 1th Ed. Vol 3. Tehran; khaneh zistshenasi; 2008.

15. Majd, A, Shariatzadeh S,M,A. cell and molecular biology. 4th Ed. Tehran; Aeeizh; 2002.

16. Titushkin I, Cho M. Modulation of cellular mechanics during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells, Biophysical Journal. 2007; 93(10): 3693–3702.

17. Melissa L, Knothe T. The Osteocyte, the International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2004; 36(1): 1–8.

18. Zhang AX, Yu WH, Ma BF, Yu XB, et al. Proteomic identification of differently expressed

 

proteins responsible for osteoblast differentiation from human mesenchymal stem cells,  Molecular and Cellular Biochemistry. 2007; 304(1-2): 167-179.

19. Zaminy A, Ragerdi Kashani I, Barbarestani  M, Hedayatpour A, et al. Melatonin Influences the Proliferative and Differentiative Activity of Rat Adipose-Derived Stem Cells, Yakhteh Medical Journal. 2008; 10(1): 25-32.

20. Dvorak MM,  Siddiqua A, Ward DT,  Carter DH, et al. Physiological changes in extracellular calcium concentration directly control osteoblast function in the absence of calciotropic hormones. PNAS. 2004; 101(14): 5140-5145.

21. Hessle L, Johnson KA, Anderson HC, Narisawa S, et al. Tissue-nonspecific alkaline phosphatase and plasma cell membrane glycoprotein-1 are central antagonistic regulators of bone mineralization, PNAS. 2002; 99(14): 9445–9449.

22. George R, Beck Jr, Zerler B, Moran E. Phosphate is a specific signal for induction of osteopontin gene expression, PNAS. 2000; 97(15): 8352–8357.

23. Golub Ellis E, Boesze-Battaglia K. The role of alkaline phosphatase in mineralization, Current Opinionin Orthopaedics. 2007; 18(5): 444–448.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  1. Kim SK,  Kim BK, Shim JH, Gil JE, et al. Nonylphenol and Octylphenol-induced apoptosis in human embryonic stem cells is related to fas-fas ligand pathway, Toxicological Scince. 2006; 94: 310-321.

2. Kermani SH, Karbalaie KH, Madani H, Jahangirnejad AA, et al. Bone marrow-mesenchymal stem cells as a suitable model for assessment of environmental pollution, Journal of Arak University of Medical Sciences. 2008; 11: 117-125.(abstract in English)

3. Baghban Islami Nejad MR, Aghbibi NM, Piriaiee A. Study of the bone produced from canine mesenchymal stem cell differentiation Scientific, Journal of Kurdistan University of Medical Sciences. 2007; 12 (3): 8-22. (Abstract in English)

4. Baghban Islami Nejad MR, Jafarian M, Khojasteh A, Mashhadi AF, et al. In vivo Bone Formation by Canine Mesenchymal Stem Cells Loaded onto HA/TCP Scaffolds: Qualitative and Quantitative Analysis, Yakhteh Medical Journal. 2008; 10(3): 205-212.

5. Jabbarpour Bonyadi M, Mahdavi N. Studing the effect of mitogen activated protein kinase inhibitor (MAPKI) on mesenchymal stem cells in vitro, Pharmaceutical Science. 2005; 3: 39-44. (Abstract in English)

6. Hartmann C. A Wnt canon orchestrating osteoblastogenesis, Trends in cell biology. 2006; 16: 151-158.

7. Eslaminejad MB, Nazarian H, Taghiyar L. Mesenchymal stem cell isolation from the removed medium of rat’s bone marrow primary culture and their differentiation into skeletal cell linage, yakhteh medical journal. 2008; 10(1): 65-72.

8. Eslaminejad MB, Talkhabi M, Zeynali B. Effect of Lithium Chloride on Proliferation and Bone Differentiation of Rat Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in Culture, Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 2008; 11(3): 143-151.

9. Gregory CA, Gunn WG, Peister A, Prockop DJ. An Alizarin red-based assay of mineralization by adherent cells in culture: comparison with cetylpyridinium chloride extraction, Analytical Biochemistry. 2004; 329: 77-84.

10. Wyllie, A, Donahue, V, Fischer, B, Hill, D, et al. Apoptosis and Cell Proliferation. 2th Ed. Boehringer Mannheim; 1998.

11. Momeni HR, Soliemani Mehranjani M, Abnosi MH, Nasimi P. Evaluation of viability in adult mouse spinal cord slices by MTT, Iranian Journal of biology. 2010; 23(2): 267-274. (Abstract in English)

12. Bradford MM. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem. 1976; 72: 248–254.

13. Bakhsh D, Song L, Tuan RS. Adult stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy, Journal of cellular and molecular medicine. 2004; 8: 301-316.

14. Baharvand, H. Differentiation and application of stem cells. 1th Ed. Vol 3. Tehran; khaneh zistshenasi; 2008.

15. Majd, A, Shariatzadeh S,M,A. cell and molecular biology. 4th Ed. Tehran; Aeeizh; 2002.

16. Titushkin I, Cho M. Modulation of cellular mechanics during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells, Biophysical Journal. 2007; 93(10): 3693–3702.

17. Melissa L, Knothe T. The Osteocyte, the International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2004; 36(1): 1–8.

18. Zhang AX, Yu WH, Ma BF, Yu XB, et al. Proteomic identification of differently expressed

 

proteins responsible for osteoblast differentiation from human mesenchymal stem cells,  Molecular and Cellular Biochemistry. 2007; 304(1-2): 167-179.

19. Zaminy A, Ragerdi Kashani I, Barbarestani  M, Hedayatpour A, et al. Melatonin Influences the Proliferative and Differentiative Activity of Rat Adipose-Derived Stem Cells, Yakhteh Medical Journal. 2008; 10(1): 25-32.

20. Dvorak MM,  Siddiqua A, Ward DT,  Carter DH, et al. Physiological changes in extracellular calcium concentration directly control osteoblast function in the absence of calciotropic hormones. PNAS. 2004; 101(14): 5140-5145.

21. Hessle L, Johnson KA, Anderson HC, Narisawa S, et al. Tissue-nonspecific alkaline phosphatase and plasma cell membrane glycoprotein-1 are central antagonistic regulators of bone mineralization, PNAS. 2002; 99(14): 9445–9449.

22. George R, Beck Jr, Zerler B, Moran E. Phosphate is a specific signal for induction of osteopontin gene expression, PNAS. 2000; 97(15): 8352–8357.

23. Golub Ellis E, Boesze-Battaglia K. The role of alkaline phosphatase in mineralization, Current Opinionin Orthopaedics. 2007; 18(5): 444–448.