اثر عصاره هیدروالکلی هسته انگور (Vitis vinifera) بر سندرم تخمدان پلی کیستیک در رت ماده نژاد ویستار

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم جانوری، تهران، ایران

2 دانشگاه آزاد اسلامی تهران، واحد علوم تحقیقات، ، تهران، ایران

3 دانشجوی کارشناسی ارشد زیست شناسی سلولی تکوینی، دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم جانوری، تهران، ایران

-

چکیده

هدف: در این مطالعه تجربی اثر عصاره هیدروالکلی هسته انگور بر سندرم تخمدان پلی کیستیک در رت ماده نژاد ویستار مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش‏ها: در این مطالعه تجربی ۳۰ سر موش صحرایی به ۶ گروه شامل کنترل، پلی کیستیک و 4 گروه تجربی تقسیم شدند. چهار گروه تجربی با تزریق درون صفاقی عصاره هسته انگور (دوزهای 50، 75، 100، 200 میلی‏گرم بر کیلوگرم به‏مدت 10 روز) تیمار شدند. تخمدان پلی کیستیک با روش تزریق زیر پوستی 2 میلی‏گرم هورمون استرادیول والرات در رت‏های بالغ القا شد. تخمدان‏های کلیه گروه‏ها خارج شد، در فیکساتور بوئن تثبیت گردید و برش‏های 5 میکرومتری با هماتوکسیلین – ائوزین رنگ آمیزی شدند.
نتایج: نتایج کاهش معنی‏داری را در تعداد فولیکول‏های بدوی، اولیه، پره آنترال، گراآف و جسم زرد درگروه پلی کیستیک در مقایسه با کنترل نشان داد (05/0>P). اندازه‏گیری ضخامت لایه گرانولوزا و تک , قطر فولیکول‏های مختلف و تعداد آن‏ها بهبود زیادی را در گروه‏های PCOS تیمار شده با عصارة هیدروالکلی هسته انگور نشان داد.  دوزهای ۵۰ و ۷۵ میلی‏گرم بر کیلوگرم به‏عنوان دوزهای موثر در نظر گرفته شدند.
نتیجه گیری: بر اساس نتایج این پژوهش می‏توان نتیجه گرفت که عصارة هیدروالکلی هسته انگور می‏تواند در بهبود علائم سندرم تخمدان پلی کیستیک مؤثر واقع شود.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

سندرم تخمدان پلی کیستیک(polycystic ovarian syndrome, PCOS)  شایع‏ترین اختلال غدد درون ریز جنسی در زنان است که ۵  تا۱۰ درصد از زنان را شامل می‏شود. ناباروری به‏علت اختلال بلوغ فولیکول و تخمک‏گذاری و تخمدان‏های پر از کیست و هیپرآندروژنیسم همراه با ناهنجاری‏های متابولیک شامل چاقی، هیپرانسولینما، افزایش خطر ابتلا به دیابت نوع۲ و بیماری‏های قلبی و عروقی است (۱).PCOS  اغلب با اختلالات فیزیولوژیکی شامل افسردگی و بیماری‏های روحی دیگر و اختلالات متابولیکی عمدتا مقاومت به انسولین و هیپر انسولینما، که به‏عنوان یک فاکتور اصلی مسئول تغییر در تولید آندروژن و متابولیسم تشخیص داده شده است همراه است. اغلب زنان مبتلا به PCOS اضافه وزن یاچاقی دارند (۲). از علائم دیگر سندرم PCOS هیپراندروژنیسم، ترشح زیاد هورمون زرده ای                  LH) Luteinizing Hormone- (، کمبود  هورمون محرک فولیکولی Stimulating Hormone-FSH) Follicle (، اختلال قاعدگی، پرمویی، ناباروری، عدم تخمک‏گذاری و افزایش فشار خون می‏باشد. اختلال بلوغ تخمک و  عدم شایستگی رشد و نمو جنینی در زنان مبتلا به  PCOS با غدد درون ریز غیر طبیعی، اختلال متابولیک و تغییردر میکرومحیط‏های داخل فولیکول در طی فولیکولوژنز و بلوغ فولیکول مرتبط است (۳). علت PCOS همچنان نامعلوم است، اما غیر طبیعی بودن ذاتی سنتز و ترشح آندروژن‏ها (تستوسترون و آندرستون دیون) احتمالا علت این سندرم باشد. شواهد روشنی از ترشح زیاد آندروژن توسط سلول تکای تخمدان و اختلال در تولید آندروژن غده آدرنال وجود دارد، علاوه بر این سنتز آندروژن‏ها (تستوسترون و آندرستون دیون) به‏خصوص در بافت چربی در پاتوفیزیولوژی درگیر است (۲). درگیری سیستم عصبی سمپاتیک در پاتولوژی به‏وسیله فیبرهای عصبی کاتکول آمینرژیک در PCOS است. افزایش فعالیت عصب سمپاتیک تخمدان در ایجاد PCOS از طریق تحریک ترشح آندروژن عمل می‏کند. فاکتور رشد عصبی(NGF)  یک مارکر قوی برای فعالیت عصب سمپاتیک است و اخیرا در زنان PCOS افزایش تولید NGF تخمدانی نشان داده شده است (۲). ویژگی‏های بیوشمیایی کمتر رایج PCOS شامل هیپرپرولاکتینمی و اختلال در ترشح هورمون رشد است (۴). انگور یکی از میوه‏هایی است که به‏طور گسترده در سراسر جهان مصرف و اهمیت قابل توجهی در صنایع دارویی و غذایی داشته است. انگور سرشار از پلی فنول است و60 تا70 درصد پلی فنول انگور در هسته آن موجود است. هسته انگور دارای خواص آنتی اکسیدانتی قابل توجهی است. ترکیبات فنولیک موجود در دانه انگور فلاونوئیدها هستند ازجمله اسید گالیک، مونومر فلاون ۳- اول و الیگومرهای دیگر و پلیمرهای مشتق از آن (پروسیانیدین). سه فلاون جدید اکسیداتیو به نام‏های وینیفرون‏های (Viniferones) A,B,C از هسته انگور جدا شده است. پلی فنول عصاره هسته انگور، پروآنتوسیانیدین (Proanthocyanidin) در فرانسه برای چندین دهه در درمان اختلالات وریدی و مویرگی (مثل رتینوپاتی، نارسایی سیاهرگی وشکنندگی عروق) به‏کار می‏رفته است (۵). مطالعات اخیر نشان داده که پروسیانیدین (procyanidins) در هسته انگور دارای اثرات ضدالتهاب، ضد درد مفاصل، ضد آلرژی (۶)، ضدآنژیوژنز (۷)، ضد باکتری (۸)، مهار تکثیر سلولی (۹)، القا آپوپتوزیس (۱۰)، ضد تومور (۱۱)، ضد دیابت (۱۲) و جلوگیری از بیماری‏های قلبی و پیری پوست می‏باشد. مطالعات دیگر نشان داده که پروآنتوسیانیدین هسته انگور از بدن در برابر آفتاب محافظت می‏کند، دید و گردش خون را بهبود می‏بخشد. (۵). این مطالعه با هدف تعیین اثر عصاره  هیدروالکلی هسته انگور (Grape seed extract, GSE) بر روی سندرم تخمدان پلی کیستیک در رت انجام گرفت.

 

مواد و روش‏ها

روش تهیه عصاره هیدروالکلی هسته انگور: انگور قرمز از باغ‏های شهر فراهان تهیه و پس از شستن و خشک کردن، هسته‏ها از میوه جدا و آسیاب شدند. مقدار 75 گرم پودر هسته انگور به 200 میلی‏لیتر اتانول70 درصد اضافه و به‏مدت 24 ساعت در دمای 40 درجه سانتی‏گراد در انکوباتور نگه‏داری شد. روزانه به‏مدت سه ساعت بر روی دستگاه روتاتور با200 دور در دقیقه چرخانده بعد با کاغذ صافی واتمن شماره 1 فیلتر و سپس حلال (اتانول) محلول فیلتر شده، با دستگاه تبخیر کننده چرخان (Hoilph آلمان) تبخیر شد (۱۳) و عصاره خشک به‏دست آمد. نمونه‏ها به‏مدت ۲ماه در یخچال تا زمان انجام آزمایش نگه‏داری شد.

تعیین LD50(Lethal dose 50) (دوز کشنده۵۰ درصد) به‏روش درون صفاقی: دوز کشنده۵۰ درصد دوزی است که سبب مرگ نیمی از حیوانات مورد آزمایش می‏گردد و مقدار آن بر حسب وزن ماده مورد تحقیق در واحد وزن حیوان مورد آزمایش محاسبه می‏شود. دوز کشنده۵۰ درصد درون صفاقی در گروه‏های 6 تایی‏، دوز۱۵۰۰  میلی‏گرم بر کیلوگرم وزن موش‏های ماده نژاد ویستار به‏دست آمد. وضعیت حیوانات بلافاصله پس از تجویز عصاره تا 4 ساعت پیوسته و بعد ا ز 72 ساعت هر چهار ساعت یک بار و سرانجام به‏مدت 14 روز روزانه تحت مراقبت قرار گرفتند (۱۴).

روش بررسی

در این تحقیق تجربی از ۳۰ سر رت ماده نژاد ویستار با وزن تقریبی 20±170 گرم استفاده شد که در قفس‏های مخصوص و تحت شرایط محیطی و درجه حرارت مطلوب تقریبا 22 درجه سانتی‏گراد و سیکل روشنایی و تاریکی 12 ساعته و با مصرف آزاد آب و غذا نگه‏داری شدند.  انجام آزمایشات بر اساس مصوبات کمیته اخلاق زیستی گروه علوم جانوری در دانشکده علوم زیستی صورت پذیرفت. یک استراتژی مهم برای درک بهتر علت PCOS  استفاده از مدل‏های حیوانی است (۱۵). روش القای PCOS انتخاب شده در این تحقیق از طریق تزریق زیر پوستی استرادیول والرات (EV) بود. به تمامی رت‏ها در مرحله استروس سیکل تولیدمثلی، دوز 2 میلی‏گرم استرادیول والرات که در۰/۲ میلی‏لیتر روغن کنجد به‏عنوان حلال حل شده بود، به‏صورت زیر پوستی و یک بارتزریق در ناحیه کشاله ران در سطح شکمی تزریق شد (۱). برای تعیین دوز مناسب عصاره هسته انگور، از غلظت‏های مختلف استفاده شد. موش‏ها به ۶ گروه 5 تایی که شامل گروه‏های کنترل،PCOS  و 4 گروه تجربی تقسیم شدند. گروه‏های تجربی روزانه به‏مدت 10 روزمتوالی دوزهای مختلف عصاره 50، 75، 100 و 200 میلی‏گرم بر کیلوگرم وزن بدن خود عصاره هیدروالکلی هسته انگور محلول در سالین نرمال به‏صورت درون صفاقی دریافت کردند. به موش‏های گروه کنترل نیز به همان اندازه سالین تزریق شد. 5 روز بعد از اتمام تزریق‏ها موش‏ها به‏وسیله دی اتیل اتر بی‏هوش شده و خون به‏صورت مستقیم از قلب آن‏ها گرفته شد. جهت مطالعه بیوشیمیایی مقدار 3 تا 5 میلی لیترخون استفاده شد و پس از یک ساعت قرار گرفتن در دمای اتاق به‏مدت 10 دقیقه با سرعت 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ گردید و پس از جدا کردن سرم تا زمان انجام آزمایش در دمای20-  درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شد. تخمدان‏ها بعد از خارج شدن از بدن موش و حذف چربی‏های اضافی با اسکالپل در محلول بوئن الکلی فیکس شدند. پس از قالب گیری، به‏صورت سریالی و با ضخامت 5 میکرومتر برش داده و با هماتوکسیلین می یر (Mayer) و ائوزین رنگ آمیزی شدند.

آنالیز آماری: برای تجزیه و تحلیل آماری داده‏ها، از آنالیز واریانس یک‏طرفه  و نرم افزارSPSS  استفاده شد.value - p کمتر از 05/0 معنی‏دار تلقی شد و نمودارهای مربوطه از طریق برنامهEXCEL  رسم گردید.

 

نتایج

در تخمدان‏های رت‏های بالغ تیمار شده با EV ، فولیکول‏های بزرگ کیستیک با لایه گرانولوزای باریک در حد یک یا دو لایه سلولی و تعداد کمی فولیکول‏های کوچک که از مشخصه‏های PCOS است، مشاهده شد. در این گروه جسم زرد مشاهده نشد. در گروه کنترل برخلاف گروه تیمار، تخمدان‏ها فاقد کیست و مملو از جسم زرد بودند که نشان‏دهنده تخمک‏گذاری طبیعی در این گروه است. همچنین میزان فولیکول‏های کوچک به مراتب بیشتر بود. بنابراین بر پایه مشاهدات ما، تیمار باEV  پس از 60 روز، منجر به ایجاد کیست و توقف رشد فولیکولی و عدم تخمک‏گذاری طبیعی در این گروه شده است. پس از تیمار تخمدان‏های پلی کیستیک با عصاره هیدروالکلی هسته انگور، بررسی‏های مورفولوژیکی تعدادی جسم زرد را در اکثر آن‏ها نشان داد که نشانه انجام و آغاز تخمک‏گذاری در آن‏هاست. افزایش مشخصی در فولیکول‏های کوچک بین گروه تیمار و PCOS مشاهده گردید.

به‏منظور تعیین اثر عصاره هیدروالکلی هسته انگور بر روی تکوین فولیکولی، فولیکول‏ها بر اساس مورفولوژی به 6 گروه: فولیکول‏های بدوی (PRI)، فولیکول‏های اولیه(PF) ، فولیکول‏های پره آنترال(PA) ، فولیکول‏های آنترال(A) ، فولیکول‏های کیستیک(C) ، و اجسام زرد(CL)  دسته بندی شدند.

شکل‏های ۱تا ۶ نشان‏دهنده تخمدان کنترل،  PCOS و گروه‏های تیمار شده با دوزهای مختلف 50، 75، 100 و 200 میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور است. . در بررسی مورفولوژی تخمدان های گروه کنترل هیچ فولیکول کیستی مشاهده نشد و تخمدان ها مملو از اجسام زرد و فولیکول های مختلف از جمله آنترال بودند که نشان دهنده تخمک گذاری طبیعی در این گروه است( شکل۱). در تخمدان‫های گروه PCOS فولیکول های کیستیک متعدد با لایه گرانولوزای باریک در حد یک یا دو لایه سلولی که از مشخصات تخمدان های پلی کیستیک است و  تعداد کمی فولیکول های کوچک مشاهده شد (شکل۲). پس از تیمار تخمدان های PCOS با عصاره هسته انگور٬ بررسی های مورفولوژیکی نشان داد که تعداد کیست ها و اندازه آن ها کاهش یافته است و اجسام زرد  ظهور پیدا کرده اند و میزان فولیکول های کوچک در گرو های تیماری بیشتر از گروه کنترل است. در تخمدان های PCOS تیمار شده با دوز 50 میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره هسته انگور فولیکول های مختلف از جمله آنترال و اجسام زرد (تعداد اندک) مشاهده شد (شکل۳).

در گروه تیمار شده با دوز ۷۵ میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره تشکیل اجسام زرد  و فولیکول های مختلف از جمله اولیه و پره آنترال مشاهده شد (شکل۴). تخمدان های تیمار شده با دوز ۱۰۰ میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره هسته انگور فولیکول های مختلف از جمله آنترال و جسم زرد را نشان دادند (شکل۵). در بررسی مقطع تخمدان گروهPCOS تیمار شده با دوز 200 میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره فولیکول‏های آنترال٬ پرآنترال و گراف مشاهده گردید (شکل۶).

 

 

 

شکل۱: مقطع تخمدان گروه کنترل که  اجسام زرد متعدد را نشان می‏دهد (بزرگ‏نمایی میکروسکوپی ×۱۰۰). رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین٬ CL: جسم زرد A: فولیکول آنترال

 

شکل ۲: مقطع تخمدان PCOS که کیست‏های متعدد درگروه PCOS را نشان می‏دهد (بزرگ‏نمایی میکروسکوپی ×100) . رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین٬CF : فولیکول کیستیک

 

 

شکل ۳: مقطع تخمدان گروه PCOS  تیمار شده با دوز ۵۰ میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره  هیدروالکلی هسته انگور که تشکیل جسم زرد و فولیکول‏های آنترال را نشان می‏دهد ( بزرگ‏نمایی میکروسکوپی ×100). رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین٬  CL: جسم زرد A: فولیکول آنترال

 

 

 

شکل۴: مقطع تخمدان گروه PCOS تیمارشده با دوز ۷۵ میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور که تشکیل اجسام زرد و فولیکول‏هایاولیه و پره آنترال را نشان می‏دهد)  بزرگ‏نمایی میکروسکوپی × ۱۰۰(. رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین٬  CL: جسم زرد، PA: فولیکول پره آنترال، PF: فولیکول اولیه

 

 

شکل ۵: مقطع تخمدان گروه PCOS تیمارشده با دوز ۱۰۰ میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور که تشکیل جسم زرد و فولیکول آنترال را نشان می‏دهد (بزرگ‏نمایی میکروسکوپی ×۱۰0). رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین٬  CL: جسم زرد، A: فولیکول آنترال

 

شکل۶: مقطع تخمدان گروه PCOS تیمارشده با دوز ۲۰۰ میلی‏گرم بر کیلوگرم عصارههیدروالکلی هسته انگور که تشکیل فولیکول گراف، آنترال و پره آنترال را نشان می‏دهد (بزرگ‏نمایی میکروسکوپی × 10۰). رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین٬  G: فولیکول گراآف، A: فولیکول آنترال،PA : فولیکول پره آنترال

 

 

بررسی آماری تعداد فولیکول‏های بدوی اختلاف معنی‏دار (001/0>p)، تعداد فولیکول اولیه اختلاف معنی‏دار (002/0>p)، تعداد فولیکول‏های پره آنترال، آنترال، گراف، جسم زرد و کیست اختلاف معنی‏داری (001/0>p)  را  در گروه PCOS با مقایسه گروه کنترل نشان داد (نمودار۱).

با مقایسه تخمدان‏های گروه پلی کیستیک تیمار شده با عصاره هیدروالکلی هسته انگور با دوز۵۰ میلی‏گرم بر کیلوگرم با PCOS اختلاف معنی‏دار (008/0>p) در فولیکول بدوی، اختلاف معنی‏دار (001/0>p) در فولیکول گراآف و کیستیک و جسم زرد مشاهده گردید، در حالی‏که در تعداد فولیکول‏های آنترال و پره آنترال بین این دو گروه اختلاف معنی‏داری مشاهده نشد (نمودار۲).

با مقایسه تخمدان‏های گروه PCOS  تیمار شده با دوز ۷۵ میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره هسته انگور و گروه PCOS اختلاف معنی‏دار (021/0>p) درتعداد فولیکول بدوی، (018/0>p) در تعداد پره آنترال، (004/0>p) در تعداد گراف،(007/0>p) در تعداد جسم زرد و (001/0>p) در تعداد فولیکول کیستیک مشاهده گردید واختلاف معنی‏داری در تعداد فولیکول آنترال در این دو گروه مشاهده نگردید (نمودار۳).

 

 

 

 

نمودار۱: مقایسه نتایج حاصل از مورفومتری گروه‏های مختلف فولیکولی در رت‏های تیمار شده با استرادیول والرات (پلی کیستیک) در مقایسه با کنترل(۵ =n) (میانگین ± انحراف معیار).  001/0>p***٬ 01/0>p**٬ 05/0>p*.

 

 

نمودار 2: مقایسه نتایج حاصل از مورفومتری گروه‏های مختلف فولیکولی در تخمدان پلی کیستیک رت‏های تیمار شده با دوز ۵۰  میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور در مقایسه با تخمدان پلی کیستیک تیمار نشده (۵ =n) (میانگین ± انحراف معیار).  001/0>p***٬ 01/0>p**٬ 05/0>p*.

 

 

 

نمودار ۳: مقایسه نتایج حاصل از مورفومتری گروه‏های مختلف فولیکولی در تخمدان پلی کیستیک رت‏های تیمار شده با دوز ۷۵ میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور در مقایسه با تخمدانپلی کیستیک تیمار نشده (۵ =n)(میانگین ± انحراف معیار).001/0>p***٬ 01/0>p**٬ 05/0>p*.

 

با مقایسه تخمدان‏های گروه پلی کیستیک تیمار شده با دوز ۱۰۰ میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره هسته انگور وPCOS  اختلاف معنی‏دار(01/0>p) در تعداد فولیکول بدوی، (009/0>p) در تعداد فولیکول اولیه، (015/0>p) درتعداد پره آنترال، (007/0>p) در تعداد جسم زرد و (001/0>p) در تعداد کیست مشاهده گردید و در تعداد فولیکول آنترال و گراف اختلاف معنی‏داری مشاهده نگردید (نمودار۴).

با مقایسه تخمدان‏های گروه PCOS تیمار شده با دوز ۲۰۰ میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره  هیدروالکلی هسته انگور با PCOS   اختلاف معنی‏دار (01/0>p) در تعداد فولیکول کیستیک، (001/0>p) در تعداد جسم زرد و (029/0>p) در تعداد گراف مشاهده گردید. در حالی‏که در تعداد فولیکول‏های پریموردیال، اولیه، پره آنترال و آنترال  اختلاف معنی‏داری مشاهده نگردید (نمودار۵).

 

 

 

 

نمودار ۴: مقایسه نتایج حاصل از مورفومتری گروه‏های مختلف فولیکولی در تخمدان پلی کیستیک رت‏های تیمار شده با دوز ۱۰۰ میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور در مقایسه با تخمدان پلی کیستیک  تیمار نشده (۵ =n) (میانگین ± انحراف معیار).001/0>p***٬ 01/0>p**٬ 05/0>p*.

 

 

نمودار۵: مقایسه نتایج حاصل از مورفومتریگروه‏های مختلف فولیکولی در تخمدان پلی کیستیک رت‏های تیمار شده با دوز  ۲۰۰ میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور در مقایسه با تخمدان پلی کیستیک تیمار نشده (۵ =n) (میانگین ± انحراف معیار). 001/0>p***٬ 01/0>p**٬ 05/0>p*.

 

 

اندازه‏گیری ضخامت لایه گرانولوزا گروه‏های PCOS  تیمارشده با عصاره  هیدروالکلی هسته انگور  در مقایسه باPCOS  افزایش معنی‏داری (05/0>p) را نشان داد (نمودار۶).

اندازه‏گیری قطرلایه تک فولیکول آنترال در گروه‏های PCOS تیمار شده با عصاره  هیدروالکلی هسته انگور در مقایسه با PCOS کاهش معنی‏داری (05/0>p) را در دوز های۵۰ و ۷۵ میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره  هیدروالکلی هسته انگور در مقایسه با گروه PCOS نشان داد (نمودار۷).

اندازه گیری قطر فولیکول‏های آنترال در گروه PCOS نسبت به کنترل افزایش معنی‏داری (001/0>p) را نشان داد که به‏علت وجود کیست‏های بزرگ و پر از مایع است. کاهش معنی‏داری در اندازه قطر فولیکولی بین گروه تیمار با دوز ۵۰ (01/0>p) و دوز ۷۵ (05/0>p) عصاره هسته انگور و پلی کیستیک مشاهده شد (نمودار۸).

 

 

 

 

 

نمودار ۶: مقایسه قطر لایه گرانولوزا درگروه‏های پلی کیستیک تیمارشده با عصاره هیدروالکلی هسته انگوربا پلیکیستیک  تیمار نشده (05/0>p) *

 

 

نمودار 7: مقایسه قطر لایه تک درگروه‏های پلی کیستیک تیمارشده با عصاره هیدروالکلی هسته انگور با پلی کیستیک تیمار نشده (05/0>p*

 

 

نمودار 8: مقایسه قطر فولیکول آنترال در گروه‏های مختلف. a: معنی‏داری گروه پلی کیستیک با کنترل را نشان می‏دهد (001/0>p).

**: کاهش معنی‏دار قطر فولیکول دوز ۵۰ را نسبت به گروه پلی کیستیک نشان می‏دهد 01/0>p).

*: کاهش معنی‏دار قطر فولیکول دوز ۷۵ را نسبت به گروه پلی کیستیک نشان می‏دهد (05/0>p).

 

مقایسه دوزهای 50، 75، 100 و 200 میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور که در این تحقیق به رت‏های مبتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک به‏صورت درون صفاقی به‏مدت ۱۰ روز تزریق شد نشان می‏دهد که در اکثر موارد تعداد فولیکول‏های کوچک و همچنین تعداد فولیکول‏های آنترال و گراف افزایش یافته است، به‏علاوه جسم زرد در هر۴ دوز افزایش چشم‏گیری را نشان داد که بیان‏گر بهبود چشم‏گیر در وضعیت تخمدان‏های پلی کیستیک است. با این حال، بین دوزهای مورد مطالعه در دوز۲۰۰ میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره  هیدروالکلی هسته انگور تورم شدید شکمی، تجمع مایع در حفره صفاق و تغییر حالت شدید ظاهری در اندام‏های بدن مشاهده گردید. با توجه به نتایج این تحقیق دوزهای پایین ۵۰ و ۷۵ میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور به‏عنوان دوزهای موثر در نظر گرفته شدند.

 

بحث

در این تحقیق تجربی سندرم تخمدان پلی کیستیک  با استفاده از تزریق زیر پوستی استرادیول والرات القا شد و اثر دوزهای مختلف عصاره هسته انگور بر میزان رشد و نمو فولیکولی و بهبود علائم این بیماری بر اساس مشاهدات مورفولوژیکی، مورفومتری و هورمونی بررسی گردید. مدل رت برای القا تجربی تخمدان پلی کیستیک(PCO)  به‏وسیله یک‏بار تزریق استرادیول والرات ایجاد می‏شود که مشابهPCOS  انسان است. در این مدل کیست‏ها بعد از 8 تا 9 هفته بعد از یک بار تزریق EV ظاهر می‏شوند. رت‏های ماده عدم تخمک گذاری منظم، فاز اسمیر واژینال شاخی پایدار  (PVC) و تخمدان پلی کیستیک را بعد از ۸ هفته از تیمار با EV نشان دادند. (۱۶). در این تحقیق نیز کیست‏ها 8 تا 9 هفته بعد از یک بار تزریق EV ظاهر شدند که هم‏سو با نتایج مطالعه فوق می‏باشد.

چرخه رت‏های بالغ ماده با یک بار تزریق استرادیول والرات دچار اختلال سیکل عدم تخمک گذاری و تخمدان پلی کیستیک شدند که شامل افزایش تعداد فولیکول‏های آترتیک و کیستیک با لایه سلولی گرانولوزای نازک و لایه تکای ضخیم غیرطبیعی می‏باشد (۱). در این تحقیق القا با استفاده از EV صورت گرفت و افزایش فولیکول‏های آترتیک و کیستیک با لایه سلولی گرانولوزای نازک و تکای ضخیم  هم‏سو با مطالعه فوق مشاهده گردید.

غلظت هورمون LH پایه پلاسما در حیوانات PCOS  در ۲ تا ۸ هفته بعد از تیمار باEV  در محدوده کمتر از نرمال است در حالی‏که بعد از ۲۲ هفته  LH پلاسما بالاتر از محدوده نرمال است (۱۷). در این تحقیق نیز LH پلاسما در رت‏های تیمار شده باEV  افزایشی مشابه با تحقیقات فوق داشته است.  

در شرایط پاتولوژیک مثل PCOS معمولا تخمدان‏ها بزرگ و با هیپرپلازی سلول‏های تک بینابینی  (Ti)همراه هستند که با اختلال عملکرد تخمدان مرتبط است. سلول‏های Ti نقش مهمی در تنظیم عمل‏کرد تخمدان بازی می‏کنند.             آنتی اکسیدانت‏ها، رشد سلول‏های Ti را مهار می‏کنند. رزواترول یک پلی فنول طبیعی است که در غلظت بالا در انگور، انواع توت، آجیل و شراب قرمز  وجود دارد و دارای خواص بالقوه مفید ضد سرطان، ضدالتهاب، آنتی اکسیدانت و محافظت از قلب است. نشان داده شده که رزواترول تکثیر سلولی را مهار می‏کند و آپوپتوزیس سلول‏های Ti تخمدان را از طریق محدود کردن سنتز DNA و زنده ماندن سلول‏ها، افزایش فعالیت کاسپاز ۳/۷ و قطعه قطعه شدن DNA  و القای تغییرات مورفولوژیکی هسته ای و سایتواسکلتونی موجب می‏شود (۱۸). در این تحقیق تیمار با عصاره هسته انگور باعث کاهش قطر تک در گروه‏های PCOS شده است که احتمالا رزواترول  موجود در عصاره هسته انگور رشد سلول‏های Ti را مهار کرده است که هم‏سو با نتایج مطالعه فوق می‏باشد.

در مطالعه‏ای نشان دادند که سم زنبور عسل با اثرات آنتی اکسیدانتی و ضد التهابی در رت‏های مبتلا به تخمدان پلی کیستیک باعث افزایش تعداد فولیکول‏های کوچک و پیدایش اجسام زرد در تخمدان شده است (۱۹).

هم‏سو با مطالعه فوق در این تحقیق نیز عصاره هسته انگور احتمالا به‏علت خاصیت آنتی اکسیدانتی و ضد التهابی باعث افزایش تعداد فولیکول‏های تخمدان و تشکیل اجسام زرد در تخمدان پلی کیستیک شده است.

آروماتاز آنزیمی است که آندروژن را به استروژن تبدیل می‏کند. عصاره  هیدروالکلی هسته انگور  شامل سطوح بالای دیمرهای پروسیانیدین است که نشان داده شده به‏عنوان مهار کننده قوی آروماتاز عمل می‏کند (۲۰) بسیاری از اجزای عصاره هسته انگور، به‏عنوان مثال پروسیانیدینB نشان داده شده که مهار کننده آروماتاز هستند. این مواد شیمیایی در سطوح بالا درهسته انگور یافت شده است. (۲۱). اعتقاد بر این است که یک کاهش نسبی در آروماتاز در زنان مبتلا به PCOS وجود دارد که تولید فولیکول رسیده و تخمک‏گذاری کارآمد را کاهش می‏دهد. برای رفع نسبی این نقص مهار کننده‏های آروماتاز به‏منظور تحریک تخمک‏گذاری استفاده می شوند که عمل انتخابی آن‏ها مهار تبدیل آندروژن‏ها به استروژن است و به این ترتیب مقدار استروژن را کاهش می دهند، در نتیجه فیدبک مثبت در هیپوفیز باعث افزایش FSH و تخمک‏گذاری بهینه می‏شود (۲۲).

در این تحقیق نیز احتمالا عصاره هیدروالکلی هسته انگور با خاصیت مهارکنندگی آروماتاز باعث تحریک تخمک‏گذاری در گروه‏های PCOS تیمار شده با عصاره و افزایش تعداد گروه‏های مختلف فولیکولی شده است.

جلودار و همکارانش (۲۳) گزارش کردند که عصاره میوه گیاه پنج انگشت در دوز  ۳۶۵ میلی‏گرم بر کیلوگرم در موش‏های مبتلا به pcos  سبب افزایش فولیکول‏های مختلف و تعداد جسم زرد و کاهش در تعداد فولیکول‏های کیستی موجود بر روی تخمدان شده است. پژوهش‏های داروشناسی نشان داده اند که عصاره گیاه پنج انگشت اثر غیر مستقیم تحریک جسم زرد همراه با اثرات ضد استروژنی را داراست (۲۴).

 

نتیجه گیری

با توجه به یافته‏های این تحقیق می‏توان نتیجه گیری کرد که دوزهای پایین (50 و 75 میلی‏گرم بر کیلوگرم) عصاره هیدروالکلی هسته انگور به‏صورت  تزریق درون صفاقی می‏تواند در بهبود علائمPCOS  موثر واقع شود و منجر به جهت گیری تخمدان مبتلا به PCOS به‏سمت تخمدان طبیعی شود. دوز ۲۰۰ میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور به‏‏صورت  تزریق درون صفاقی با اثرات تخریبی (تورم در ناحیه شکم، تجمع مایع در حفره صفاق و تغیرات شدید ظاهری در اندام‏ها) همراه بود.  بنابراین یک پاسخ وابسته به دوز مشاهده شد. به‏علاوه با توجه به اثر تخریبی دوزهای بالاتر در مصرف آن جهت درمان باید احتیاط گردد.

 

تشکر و قدردانی

این مقاله منتج از پایان نامه کارشناسی ارشد می‏بـاشـد. بدین وسیله از ریاست محترم دانشکده علوم زیستی دانشگاه خوارزمی تشکر به‏عمل می‏آید. از زحمات سرکارخانم لطیفه کریم زاده که در انجام این تحقیق همکاری نمودند تشکر می‏گردد.

Walters K, Allan C, Handelsman D. Rodent Models For Human polycystic Ovary Syndrome. Biology of Reproduction. 2012; 86 (5): 149,1-12.

2. Pasquali R, Stener-Victorin E, Ylidiz B, Duleba A, et al. PCOS Forum: research in polycystic Ovary syndrome today and tomorrow. Clinical Endocrinology. 2011; 74(4): 424-433.

3. Qiao J, Feng H. Extra and intra-ovarian factors in polycystic ovary syndrome: impact on oocyte maturation and embryo developmental competence. Human Reproduction Update. 2011; 17(1): 17-33.

4. Franks S. Polycystic Ovary Syndrome. The new England Jornal of Medicine. 1995; 333:853-861.

5. Arora P, Ansari S, Nazish I. Bio-Functional Aspects of Grape seeds- A Review International. Journal of Phytomedicine. 2010; 2: 177-185.

6. Chen B, Hung M, Chen J, Chang H, et al. Anti-allergic activity of grape seed extract (GSE) on RBL-2H3 mast cells. Food  chemistry. 2012; 132(2): 968-974.

7. Huang S, Yang N, Liu Y, Hu L, et al. Grape seed proanthocyanidins inhibit angiogenesis via the down regulation of both vascular endothelial growth factor and angiopoietin signaling. Nutrition Research. 2012; 32(7): 530-536.

8. Silvan J, Mingo E, Hidalgo M, Pascual-Teresa  S, et al. Antibacterial activity of a grape seed extract and its fractions against Campylobacter spp.Food control. 2013; 29(1): 25-31.

9. Leifert W, Abegwardena M. Grape seed and red wine polyphenol extracts inhibit cellular cholesterol uptake, cell proliferation, and5-lipoxygenase activity. Nutrition Research. 2008; 28: 842–850.

10. Dinicola S, Cucina A, Pasqualato A, Proietti S, et al. Apoptosis inducing factor and caspase dependent apoptotic pathways triggered by different grape seed extracts on human colon cancer cell line. British Journal of Nutrition. 2010; 104(6): 824–832.

11. Alfy A, Eahmed A, Fatani A. Protective effect  of  red grape seeds proanthocyanidins against  induction of diabetes by alloxan in rats. Pharmacological Research. 2005; 52: 264–270

 

12. Zhao J, Wang J, Chen Y, Agarwal R. Anti tumor-promoting activity of a polyphenolic fraction isolated from grape seed. Carcinogenesis. 1999; 20(9): 1737-1745.

13. Harborne, J.B. Phytochemical Methods-A Guide to Modern Techniques of Plant Analysis. 3th Ed. London: Chapman and Hall; 1998.

14. Twaij H, Kery A, Khazraji N. some pharmacological, toxicological and phytochemical investigations on centaurea phyllocephala. Journal of Ethnopharmacology . 1983; 9: 299-314.

15. Franks S. Animal Models and the Developmental Origins of Polycystic Ovary Syndrome: Increasing Evidence for the Role of Androgens in Programming Reproductive and Metabolic Dysfunction. Endocrinology. 2012; 153(6): 2536–2538.

16. Brawer R, Munoz M, Farookhi R. Development of the Polycystic Ovarian Condition (PCO) in the Estradiol Valerate-Treated Rat. Biology Of Reproduction.1986; 35: 647-655.

17. Schulster A, Farookhi R, Brawer J. Polycystic ovarian condition in Estradiol Valerate-Treated Rats: Spontaneous Changes in characteristic Endocrine Feature. Biology of Reproduction. 1984; 31:587-593.

18. Wong D, Villanueva J, Cress A, Duleba A. Effects of resveratrol on proliferation and apoptosis in rat ovarian theca-interstitial cells. Molecular Human Reproduction. 2010; 16(4): 251– 259.

19. Kouchesfahani H, Nabyooni M, Adham H. [Effect of bee venom on polycystic ovarian syndrome in rats]. J Beheshti univ of Med Sci. 2010; 15(73):1-6.  persian

20. Kijima L, Phung S, Hur G, Kwok S, et al. Grape Seed Extract Is an Aromatase Inhibitor and a Suppressor of Aromatase Expression. Cancer Res. 2006; 66(11): 5960-5967.

21. Eng E, Ye J, Williams D, Phung S, et al. Suppression of Estrogen Biosynthesis by Procyanidin Dimers in Red Wine and Grape Seeds. Cancer Research. 2003; 63: 8516 – 8522.

22. Badawy  A, Elnashar A. Treatment options for polycystic ovary syndrome. International Journal of Women’s Health. 2011;8(3): 25–35.

23. Jelodar G, Karami E. [Effect of Hydroalcoholic Extract of vitex Agnus-castus Fruit on Ovarian Histology in rat with induced polycystic ovary syndrome (PCOS)]. J Babol univ Med sci. 2013; 15(3). persian

24. Borrione P, Di Luigil, Maffulli N, Pigozzi F. [Herbal supplement: cause for concern?]. J Sports Sci Med.2008; 7(4):562-4. Persian