کلون سازی و بیان ژن میدکاین نوترکیب انسانی در اشریشیاکولای سویه‌ی اوریگامی

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه آزاد اسلامی واحد پزشکی تهران

2 گروه ژنتیک و بیوشیمی دانشگاه صنعتی مالک اشتر تهران

3 گروه ژنتیک مولکولی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری تهران

چکیده

هدف: هدف این پژوهش کلون سازی و بیان ژن کد کننده‏ی میدکاین انسانی در اشریشیاکولای بوده که پس از انجام مراحل لازم در مقیاس آزمایشگاهی محقق گردید.
مواد و روش‏ها: روش‌ها شامل کشت سلول، استخراج RNA، ساخت cDNA، تکنیک‌های کلون‌سازی، القای بیان با IPTG (ایزوپروپیل‌تیوگالاکتوزیداز)، ارزیابی بیان به‏وسیله‌ی ژل پلی‌اکریل‌آمید و تایید توسط وسترن بلات بود.
نتایج: ژن میدکاین در pET-21a(+) کلون و سپس به اوریگامی منتقل شد. این فاکتور رشد در کلونی حاوی pET-21a(+) نوترکیب پس از 16 ساعت انکوباسیون در دمای 18 درجه سانتی‏گراد با هم زدن در 250 دور در دقیقه، در سطح سیتوپلاسمی بیان گردید. بیان پروتئین 13 کیلودالتونی دارای دم هیستیدینی از طریق وسترن بلات مورد تایید قرار گرفت.
نتیجه‌گیری: با‌توجه به اینکه سویه اوریگامی در ژن های TrxB و gor جهش یافته است، سینوپلاسم محیطی اکسید کننده می باشد، به‏همین سبب باعث افزایش تشکیل باندهای دی سولفید می‏شود. بنابراین به‏نظر می‏رسد که پس از بیان میدکاین، باقی مانده‏های سیتوزین به‏صورت محلول باقی می‏مانند. این شرایط باعث به‏وجود آمدن محیط مناسبی برای فولدینگ صحیح پروتئین و حل شدن آن می‏شود.
 

کلیدواژه‌ها


مقدمه

میدکاین (Midkine : mdk)، سایتوکاین یا فاکتور رشد متصل شونده به هپارین است که وزن مولکولی 13 کیلو دالتون دارد و عضو یک خانواده پروتئینی دو عضوی است که عضو دیگر این خانواده پلیوتروفین (Pleiotrophin : PTN) نام دارد (1). میدکاین اولین بار به‏عنوان محصول یک ژن پاسخ دهنده به رتینوئیک اسید در یک سیستم تمایز سلول سرطانی رویانی جدا شد (2). محصول ژن میدکاین که در انسان بر روی کروموزوم 11p11.2 بین ژن دی آسیل گلیسرول کینازz (Diacyl glycerol Kinase Z) و ژن موسکارنیک استیل کولین رسپتور4 (Muscarnic acetylcholine Receptor 4) قرار دارد (1 و 3)، یک پروتئین ترشحی با فعالیت راه اندازی رشد برای برخی رده‏های سلولی از جمله PC12 است. میدکاین به‏شدت در دوره حاملگی مخصوصا زمانی‏که میانکنش‏های اپی‏تلیال مزانشیمال صورت می‏گیرد بیان می‏شود (4). میدکاین انسانی (Human Midkine : hmdk) شامل 121 اسیدآمینه و از نظر اسیدهای آمینه ضروری و سیستئین غنی است (1 و 5) . این پروتئین به‏طور عمده از دو ناحیه تشکیل شده که توسط پیوندهای دی سولفید متصل به‏هم نگه داشته شده‏اند. ناحیه‏ای که در انتهای C قرار دارد (C-Domain)، عمده خاصیت اتصال به هپارین و فعالیت‏های بیولوژیکی را بر عهده دارد (1).

میدکاین رشد آکسونی و بقای سلول‏های عصبی رویانی را راه‏اندازی می‏کند و برای رده‏های سلولی فیبروبلاستی هدف و سلول‏های مشتق از نورواکتودرم خاصیت میتوززایی دارد (6). همچنین به‏عنوان یک عضو از خانواده‏ی جدید فاکتورهای رشد نوروتروفیک و آنژیوژنیک، که بیان آن به‏طور تکوینی تنظیم می‏شود، در آستروسیت‏های جنینی (Fetal Astrocytes) تولید می‏شود (7). تحقیقات اخیر نشان داده که نوروتروفیک فاکتورها، رشد و تکوین سلول‏های عصبی را در سیستم عصبی مرکزی و سیستم عصبی محیطی راه اندازی می‏کنند و نیز قادر به رشددهی مجدد سلول‏های عصبی آسیب دیده در لوله آزمایش و حیوانات مدل هستند (8). از طرفی نشان داده شده که انواعی از فاکتورهای رشد در مرحله اولیه بعد از ایسکمی، هم رگ‏زایی و هم نورون‏زایی را تحریک می‏کنند که منجر به بهبود عملکرد بعد از سکته مغزی می‏شود (9).

دسترسی به این پروتئین در شکل نوترکیب می‏تواند راهی  برای بررسی کارآیی آن در مطالعات درمانی برروی سلول و حیوان آزمایشگاهی فراهم آورد. بیان پروتئین‏های نوترکیب می‏تواند در انواع میزبان‏ها صورت گیرد لیکن  اشریشیاکولای گزینه‌ی مناسبی برای تولید پروتئین نوترکیب می‏باشد (10) و سیستم‏های بیانی مختلفی شکل گرفته‏اند که اجازه تولید پروتئین‏های نوترکیب در این میزبان را می‏دهند (11). بنابراین امکان تولید بسیاری از پروتئین‏های پروکاریوتی و یوکاریوتی در یک محیط کشت ساده و ارزان در این میکروارگانیسم وجود دارد. همچنین سلول‏های اشریشیاکولای  را برای دستیابی به پروتئین مربوطه می‏توان به‏راحتی تجزیه و پروتئین مورد بیان را استخراج نمود (12). بسیاری از پروتئین‏هایی که قبلا تصور بر مشکل بودن یا غیر ممکن بودن بیان آن‏ها با تاخوردگی صحیح در اشریشیاکولای بود، در حال حاضر در این باکتری بیان می‏شوند. برای مثال امکان تولید پروتئین‏هایی با پیوندهای دی سولفید چندگانه در فضای پری پلاسمی و یا در سیتوپلاسم سویه‏های جهش یافته‏ای که به‏میزان کافی شرایط اکسید برای تشکیل این پیوند‏ها را دارند فراهم شده است (13). هدف این پژوهش کلون سازی و بیان ژن میدکاین انسانی در باکتری اشریشیاکولای بود که این بیان به‏شکل محلول  محقق شد و با لکه گذاری وسترن مورد تایید قرار گرفت.

 

مواد و روش‏ها

پلاسمیدها و سویه های باکتری: پلاسمید به‏کاربرده شده در این تحقیق pET-21a(+) بوده، سویه‏های DH5α E. coli  و XL1 blue E. coli   به‏عنوان سویه‏های کلون‏سازی و نیز BL21 E. coli  و origami E. coli   به‏عنوان سویه‏های بیانی مورد استفاده قرار گرفت.

کشت باکتری: برای E. coli در مراحل کلونینگ  و ساخت سازواره‏ها از محیط LB مایع و جامد استفاده شد که در صورت نیاز به آن آنتی بیوتیک آمپی سیلین با غلظت نهایی 100 میکروگرم بر میلی‏لیتر افزوده شد. برای القای بیان باکتری‏ها در محیط TB  (ٰTerrific Broth) کشت داده شدند.

 برای تهیه‏ی این محیط 12 گرم تریپتون، 24 گرم عصاره مخمر، 5 گرم گلیسرول در 900 میلی لیتر آب مقطر به‏خوبی حل شد. یک محلول 17/0 مولار پتاسیم دی هیدروژن فسفات (KH2PO4) و 72/0 مولار پتاسیم هیدروژن فسفات (K2HPO4) تهیه شد. محلول‌های مرحله 1 و 2 به‏مدت 15 دقیقه در  دمای 121 درجه سانتی‏گراد اتوکلاو شدند. مقدار 100 میلی‏لیتر از محلول مرحله 2 به 900 میلی لیتر از محلول مرحله 1 افزوده شد و مورد استفاده قرار گرفت.

کشت سلول: رده سلولی HEK293 تهیه شده از بانک سلولی انستیتوپاستور ایران جهت انجام استخراج RNA به‏کار برده شد. کشت سلول‏ها در محیط کشت سلولی DMEM حاوی 10 درصد سرم جنین گاو (FBS) در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و 10  درصد CO2 انجام شد. DMEM و FBS هردو ساخت شرکت Gibco می‏باشند.

استخراج RNA: RNA‌ی سلول‏های HEK293 (به تعداد تقریبی 106 × 5 سلول) با استفاده از محلول اکیوزول )تولید شرکت (BIONEER طبق دستورالعمل مربوطه استخراج شد و کیفیت آن با استفاده از ژل آگارز 2/1 درصد بررسی شد.

جداسازی ژن mdk: مقدار 1 میکروگرم از RNA استخراج شده از سلول‏های HEK293 طبق دستورالعمل مربوطه با استفاده از کیت ساخت cDNA (Thermo Scientific K1641)) برای ساخت cDNA به‏کار برده شد. سپس با استفاده از پرایمرهای طراحی شده اختصاصی میدکاین و آنزیم pfu DNA polymerase و دستگاه ترموسایکلر Techne TC-312 ژن میدکاین از cDNA سنتز شده تکثیر و جداسازی شد. به‏منظور بررسی صحت آزمایش‏ها ژن hprt (Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyltransferase) به‏عنوان ژن استاندارد انتخاب شد. توالی پرایمرهای اختصاصی میدکاین و پرایمرهای hprt در جدول 1 نشان داده شده است.

 

جدول 1: پرایمرهای طراحی شده اختصاصی میدکاین و پرایمرهای اختصاصی hprt

پرایمرهای میدکاین

پیشرو

5’-CGAGCGCATATGAAAAAGAAAGATAAGGTGAAGAAG-3’

معکوس 1

5’-CTGATACTCGAGGTCCTTTCCCTTCCCTTTC-3’

معکوس 2

5’-CTGATACTCGAGCTAGTCCTTTCCCTTCCCT-3’

پرایمرهای hprt

پیشرو

5’-CTTCCTCCTCCTGAGCAGTC-3’

معکوس

5’-AACACTTCGTGGGGTCCTTT-3’

 

 

کلون‏سازی ژن در وکتور: از محصول واکنش RT-PCR بر روی ژل 1 درصد آگارز الکتروفورز و  باند مورد نظر از روی ژل جداسازی و تخلیص شد. ژن تخلیص شده و وکتور pET-21a(+) دارای توالی برش دو آنزیم Nde I و Xho I طی واکنش برش آنزیمی با دو آنزیم مذکور به‏مدت یک شب در دمای 37 درجه سانتی‏گراد تیمار شد. سپس طی واکنش اتصال  به‏مدت 4 ساعت تیمار با آنزیم T4 ligase در دمای 15 درجه سانتی‏گراد، ژن میدکاین به‏درون وکتور کلون گردید. محصول واکنش اتصال به سویه‌ی Xl1 blue منتقل و در محیط کشت LB Agar حاوی آمپی سیلین با غلظت 100 میکروگرم بر میلی‏لیتر کشت داده شد. پس از استخراج پلاسمید از کلونی‏های نوترکیب، صحت کلون‏سازی با استفاده از دو آنزیم مذکور و همچنین توالی یابی تایید شد.

بیان میدکاین نوترکیب: وکتور نوترکیب جهت القای بیان به سویه‏های بیانی اشریشیاکولای منتقل شد و به‏منظور تولید پروتئین به‏صورت محلول، از سویه‌ی  اوریگامی استفاده شد. محیط کشت مورد استفاده TB Broth بود. از کلونی‏های نوترکیب در مقدار 5 میلی‏لیتر محیط کشت TB Broth حاوی آمپی سیلین با غلظت نهایی 100 میکروگرم بر میلی‏لیتر در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و گردش (shake) 100 دور در دقیقه کشت داده شد. پس از اینکه دانسیته‌ی نوری آن در طول موج 600 نانومتر به 8/0 رسید جهت القای بیان مقدار 100 میکرولیتر از آن به ارلن حاوی 40 میلی‏لیتر TB Broth حاوی آمپی سیلین با غلظت نهایی 100 میکروگرم بر میلی‏لیتر تلقیح شد و با شرایط بالا کشت داده شد. زمانی‏که دانسیته‌ی نوری به 8/0 رسید IPTG با غلظت نهایی 1 میلی مولار به آن افزوده شد. ارلن در دمای 18 درجه سانتی‏گراد به‏مدت یک شب با گردش 250 دور در دقیقه و سپس به‏مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد با همین دور قرار داده شد. در کنار نمونه‫های نوترکیب، نمونه‌ی شاهد یعنی نمونه‌ی دارای پلاسمید بدون قطعه الحاقی، به‏عنوان کنترل منفی مورد آزمایش قرار گرفت. نمونه‏های به‏دست آمده از کشت باکتری نوترکیب قبل و بعد از القا جهت بررسی بیان ابتدا با استفاده از SDS‑PAGE و سپس وسترن بلات مورد ارزیابی قرار گرفتند.

SDS-PAGE و وسترن بلات: با توجه به اندازه پروتئین میدکاین (13 کیلو دالتون)، ژل پلی اکریل آمید 16 درصد به‏کار برده شد. از دو روش تریسین SDS-PAGE (14) و گلایسین SDS-PAGE استفاده شد. نمونه‏های پروتئین پس از بارگذاری بر روی ژل با اختلاف پتانسیل 120 ولت به‏مدت 6 ساعت الکتروفورز شدند و سپس ژل به‏منظور رنگ آمیزی به‏مدت نیم ساعت در محلول کوماسی بلو قرار داده شد. جهت انجام وسترن بلات بار دیگر نمونه‏ها بر روی یک ژل جدید ران شد. پروتئین‏های جدا شده بر روی ژل، با جریان 200 میلی‏آمپر در طول یک شب به غشای پلی وینیلیدین فلوراید PVDF منتقل شدند. بعد از انجام عمل انتقال، غشای PVDF به‏مدت 2 ساعت در محلول 2 درصد BSA (Bovine serum albumin) همراه با هم زدن با دور ملایم قرار داده و سپس با بافر TBS-T (Tris Buffer Saline – Tween20) شستشو داده شد. محلول BSA از حل کردن آلبومین سرم گاوی در بافر TBS-T و بافر TBS-T از حل کردن 05/6 گرم تریس و 76/8 گرم NaCl در یک لیتر آب مقطر و افزودن 05/0 گرم توئین 20 به آن در 5/7pH= تهیه شدند. سپس غشای PVDF به‏مدت 90 دقیقه در محلول تهیه شده از آنتی بادی اول (Anti His-tag) و بافر TBS-T به نسبت 1 به 1000 قرار داده شد. پس از شستشو با بافر TBS-T به‏مدت 2 ساعت در محلول تهیه شده از آنتی بادی دوم (Anti rabbit conjugate) و TBS-T به نسبت 1 به 2500 قرار داده شد. مجددا شستشو انجام و مقدار 10 میلی‏لیتر TMB (Tetramethylbenzidine) محصول شرکت سیگما به غشا افزوده شد.

 

نتایج

استخراج RNA

 محصول به‏دست آمده در این مرحله با توجه به وجود اسمیر RNA در ژل آگارز و نیز وجود دو باند S28 و S18 مربوط به RNA‌های ریبوزومی یوکاریوتی مطابق شکل 1 تایید شد.

 

 

 

شکل 1: محصول استخراج RNA بر روی ژل آگارز 1درصد. اسمیر و نیز دو باند به‏خوبی مشاهده می‌شوند.

 

 

جداسازی و ساخت cDNA‌ی میدکاین

 پس از انجام واکنش RT-PCR، مرحله دوم تایید صحت استخراج RNA که همان بیان ژن hprt است به‏همراه سنتز cDNA‌ی میدکاین که نشان دهنده‌‌ی بیان شدن این ژن می‏باشد، انجام گردید. نتیجه‌ی حاصله در شکل 2 نشان داد که این ژن یک مولکول mRNA به‏طول 370 باز تولید می‏نماید.

کلون‏سازی ژن در وکتور: وکتور pET-21a(+) پس از انتقال

 به‏میزبان و تکثیر، استخراج و مورد هضم آنزیمی با دو آنزیم Nde I و Xho I قرار گرفت. قطعه‌ی تکثیر شده نیز با دو آنزیم مذکور برش داده شد. سپس وکتور و قطعه‌ی تکثیر‌شده، طی واکنش اتصال به‏هم متصل و به‏میزبان منتقل شدند. شکل 3 وجود قطعه‌ی الحاقی خارج شده از وکتور پس از تکثیر در میزبان را نشان می‏دهد که با همان دو آنزیم ذکر شده مورد برش قرار گرفت. تایید نهایی با توالی یابی انجام شد.

 

 

شکل 2: محصول RT-PCR بر روی ژل آگارز. چاهک شماره 1 مربوط به محصول RT-PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی میدکاین حاوی باند با اندازه تقریبی 400 جفت باز و چاهک شماره 2 مربوط به محصول RT-PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن hprt دارای باند با اندازه 550 جفت باز می‌باشند. مارکر از نوع 1 کیلو جفت باز ساخت شرکت  Fermentas و دارای محدوده 250 تا 10000 جفت باز می‌باشد.

 

 

شکل 3: نتیجه برش آنزیمی pET-21 کلنی‌های نوترکیب در مقایسه با پلاسمید بدون قطعه اضافیبا دو آنزیم Nde I و Xho I  مشاهده شده بر روی ژل آگارز. نمونه‌ها به‏ترتیب عبارتند از: 1) pET-21 نوترکیب قبل از برش 2) pET-21 نوترکیب برش داده شده 3) مارکر 1KB 4و5) یک نمونه دیگر از pET-21 در دو حالت برش خورده و برش نخورده. قطعه مورد نظر که با پیکان نشان داده شده، از نمونه‌‌ی 3، جدا شده و در مکان اختصاصی خودش قرار گرفته است. مارکر از نوع 1 کیلو جفت باز می‌باشد.

 

 

القای بیان، SDS-PAGE و وسترن بلات

 نمونه‌های حاصل از بیان بر روی ژل SDS-PAGE مورد بررسی قرار گرفت و وجود یک باند در جایگاه حدود 17کیلو دالتون مشاهده شد که نشان‌دهنده‏ی بیان این پروتئین بود. شکل 4 نشان دهنده‌ی باند مربوط به میدکاین در نمونه‌های القا‌شده و نیز عدم وجود این باند در نمونه‌های شاهد و قبل از القا است. برای اطمینان از صحت این باند، روش وسترن بلات به‏کار گرفته شد. در شکل 4 و 5 نمونه‌های القای بیان بر روی ژل SDS-PAGE و در شکل 6 نتیجه‌ی وسترن بلات همان نمونه‌ها، بر روی غشای PVDF نشان داده شده است. باند‌های مربوط به پروتئین به‏خوبی قابل مشاهده‏اند و در مقایسه با باندهای نمونه‌های قبل از القا بر روی ژل SDS-PAGE وجود پروتئین میدکاین دارای His-tag را اثبات می‌کند.

 

 

شکل 4: نتیجه بیان پروتئین بر روی ژل SDS-PAGE. در شکل سمت چپ 1) کلونی دارای پلاسمید بدون ژن در محیط TB قبل از القا 2) کلونی دارای پلاسمید بدون ژن در محیط TB بعد از القا 3) کلونی نوترکیب در محیط TB قبل از القا 4) کلونی نوترکیب در محیط TB  16 ساعت در دمای 18 درجه سانتی‏گراد بعد از القا 5) کلونی نوترکیب در محیط TB  16 ساعت در دمای 18 درجه سانتی‏گراد بعد از القا و پس از گذشت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد. مارکر به‏کار رفته مارکر پروتئین ساخت شرکت Fermentas با محدوده 14 تا 116 کیلو دالتون می‌باشد که مقیاس آن در شکل سمت راست نشان داده شده است.

 

 

شکل 5: نتیجه SDS-PAGE جهت انجام وسترن بلات. 1 و 2 نمونه‌های قبل از القا و نیز 3 و 4 بعد از القای بیان هستند که باند پروتئین نوترکیب بر روی آن قابل رویت است. شماره 5 مارکر به‏کار رفته همان مارکر پروتئین شکل 4 است.

 

 

شکل 6: نتیجه وسترن بلات نمونه‌های شکل 5 بر روی غشای PVDF. در ستون‌های 1 و 2 باندهای مربوط به پروتئین میدکاین به‏خوبی قابل رؤیت است.

 

بحث

در این تحقیق با توجه به فعالیت‌های مهم میدکاین و با توجه به بیان پایین این پروتئین ارزشمند در سیستم بیانی میزبان اصلی آن، امکان کلون‏سازی و بیان آن در میزبان‌های دیگر مورد بررسی و ارزیابی قرار گرفته است. استفاده از سویه‌ی اوریگامی طبق آنچه که در منابع آورده شده و در ادامه به آن پرداخته شده است، امکان تولید پروتئین به‏صورت محلول را می‌دهد (15).

جهت استخراج mRNA‌ی میدکاین می‌بایست از بافت یا سلولی استفاده می‌شد که به‏میزان کافی بیان این پروتئین را حاصل کند. با توجه به این که میدکاین در طول دوران حاملگی در بافت‌های مختلفی بیان می‌شود و با رسیدن به اواخر بارداری به‏تدریج از شدت بیان آن کاسته می‌شود، تا آنجا‏که پس از زایمان و تا دوران بلوغ میزان بیان آن تنها در بافت‌های محدود و به‏میزان بسیار کم دیده شده است (1، 3 و 16)، که از آن جمله میتوان به  بافت‌هایی مانند مغز استخوان و کلیه اشاره نمود (5 و 16)، بنابراین از میان گزینه‌های مورد مطالعه توجه بیشتر به‏سمت سلول‌های طبیعی مغز استخوان، خون محیطی و رده سلولی HEK293 معطوف شد. رده‌ی سلولی HEK293 به‏دلیل اینکه منشا جنینی داشته و از بافت کلیه جدا شده، به‏علاوه از حیث ریخت شناسی یک رده سلولی عصبی محسوب می‌شود و نیز سلول سرطانی متازتاز دهنده می‌باشد، جهت استخراج mRNA مورد استفاده قرار گرفت. حصول نتیجهی رضایت‌بخش از وجود mRNA‌ی میدکاین در این رده سلولی و اطمینان از بیان این ژن در آن، نشان دهنده‌ی بیان میدکاین در رده‌های سلولی سرطانی است. لذا می‏توان از آن به‏عنوان یک مارکر سرطان استفاده کرد و با بررسی این ویژگی در سلول‏های طبیعی بدن و مقایسه‌ی آن‏ها با رده های سلولی هم منشا روش‌هایی جهت تشخیص و ردیابی سرطان ابداع کرد (17 و 18).

پس از الحاق ژن به حامل، صحت کلون‏سازی با PCR ارزیابی و تایید شد و پلاسمیدهای دارای قطعه ژن هدف به‏سویه Bl21 و اوریگامی انتقال یافت.

میزبان Bl21 به‏دلیل اهمیتش در بیان پروتئین در شرایط متنوع به‏کار برده شد و بیان این پروتئین به‏صورت محلول در این باکتری مشاهده نشد. با توجه به اینکه بلافاصله بعد از بیان برخی از پروتئین‌ها‏ی نوترکیب در این باکتری تشکیل توده‌های به هم پیوسته یا اینکلوژن بادی می‌دهند به‏نظر می‏رسد که میدکاین نیز به‏دلیل نیاز به تشکیل پیوند دی‌سولفید برای داشتن ساختار محلول و فعال، شرایط مساعدی برای تشکیل توده‏های پروتئینی را داراست و به‏همین دلیل در فاز محلول مشاهده نمی‏شود (15). برای دستیابی به پروتئین بیان شده به شکل محلول وکتورهای نوترکیب در  سویه اوریگامی نیز وارد شد.

TrxB و gor دو آنزیمی هستند که در احیای سیستئین پروتئین‏های موجود در سیتوپلاسم نقش دارند (13 و 19) و اختلال در فعالیت آن‏ها که در سویه‌ی اوریگامی صورت گرفته است باعث تسهیل در شکل گیری پیوند دی‌سولفید و محلول شدن پروتئین می‏گردد.

باکتری‌ها پس از اتمام شرایط القای بیان، لیز شده و پروتئین‌های سیتوپلاسمی به‏صورت محلول مورد ارزیابی قرار گرفت. بررسی پروتئین از طریق دو روش به‏کارگیری ژل SDS-PAGE شامل روش تریسین SDS-PAGE و روش متداول گلایسین SDS-PAGE انجام شد. بر‌اساس یافته‏های شاگر و همکارانش (14) روش تریسین برای جداسازی و مشاهده پروتئین‌های با وزن مولکولی پایین کاربرد دارد و به‏جهت کوچک بودن اندازه میدکاین در این پژوهش مورد استفاده قرار گرفت.

در مشاهده پروتئین بیان شده بر روی ژل اختلافاتی از حیث اندازه در محل قرارگیری پروتئین با آنچه که با توجه به اندازه‌ی واقعی پروتئین پیش‏بینی می‏شد، مشاهده شد و باند مربوط به بیان، بالاتر از جایگاه مورد نظر قرار گرفت. علت این پدیده که در بیان این پروتئین توسط یان و تیم همکار نیز مشاهده شده است (15)، می‏تواند مربوط به کانفورماسیون‏های متعدد پروتئین و نیز اتصالات دی‌سولفید بین مونومرهای پروتئین و تشکیل دایمر باشد. همچنین وجود توالی هیستیدینی در پایان زنجیره‌ی پروتئین به تغییر ساختار فضایی آن و تغییر سرعت حرکت آن بر روی ژل کمک می‏کند. لذا با توجه به‏وجود دو نمونه‌ی کنترل منفی به‏موازات نمونه‌های بیانی و نیز نتیجه‌ی وسترن بلات می‏توان از ماهیت پروتئین بیان شده اطمینان داشت.

بر روی ژل اکریل آمید نمونه‏های کنترل منفی درست در ناحیه‏ی بیانی مورد نظر دارای باند هستند که در نتیجه وسترن بلات این باند مشاهده نمی‏شود و قطعا یکی از پروتئین‏های موجود در باکتری بوده که اتفاقا هم‌وزن میدکاین بوده و به‏موازات آن قرار گرفته است. این مشاهده نیز مشابه نتایج یان (15) می باشد.

 

نتیجه گیری

همان‏گونه که ذکر گردید پروتئین میدکاین، در زمینه‌های مختلف دارای کاربرد‌های متنوعی است. با توجه به تولید اندک، و همچنین در برخی مواقع تولید غیر‌اختصاصی این پروتئین در شرایط بدن، استفاده از سیستم‌های بیانی به‏خصوص سیستم‌های باکتریایی می‌تواند قدمی موثر در جهت تولید این پروتئین ارزشمند باشد. چنانچه انتظار می‌رفت تولید این پروتئین در باکتری E. coli محقق شد. امید است در آینده با تدابیری که در جهت بهینه سازی روند تولید این پروتئین اندیشیده می‌شود، این باکتری به سویه‌ای مناسب با میزان بیان بالای این پروتئین، تبدیل گردد.

 

تشکر و قدردانی

از همکاری تکنیکی آقای حسین خواجه علی در تهیه این مقاله سپاس‏گزاری می‏شود.

1. Muramatsu T. Midkine, a heparin-binding cytokine with multiple roles in development, repair and diseases. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2010; 86(4): 410-25.

2. Miyashiro M, Kadomatsu K, Ogata N, Yamamoto C, et al. Midkine expression in transient retinal ischemia in the rat. Curr Eye Res. 1998; 17(1): 9-13.

3. Muramatsu T. Midkine: a promising molecule for drug development to treat diseases of the central nervous system. Curr Pharm Des. 2011; 17(5): 410-23.

4. Mitsiadis TA, Salmivirta M, Muramatsu T, Muramatsu H, et al. Expression of the heparin-binding cytokines, midkine (MK) and HB-GAM (pleiotrophin) is associated with epithelial-mesenchymal interactions during fetal development and organogenesis. Development. 1995; 121(1): 37-51.

5. Zhang ZH, Du LJ, Xiang D, Zhu SY, et al. Expression and purification of bioactive high-purity human midkine in Escherichia coli. J Zhejiang UnivSci B. 2009; 10(2): 79-86.

6. Take M, Tsutsui J, Obama H, Ozawa M, et al. Identification of nucleolin as a binding protein for midkine (MK) and heparin-binding growth associated molecule (HB-GAM). J Biochem. 1994; 116(5): 1063-8.

7. Mishima K, Asai A, Kadomatsu K, Ino Y, et al. Increased expression of midkine during the progression of human astrocytomas. Neurosci Lett. 1997; 233(1): 29-32.

8. Deister C, Schmidt CE. Optimizing neurotrophic factor combinations for neurite outgrowth. J Neural Eng. 2006; 3(2): 172-9.

9. Talwar T, Srivastava MV. Role of vascular endothelial growth factor and other growth factors in post-stroke recovery: Ann Indian Acad Neurol. 2014 Jan; 17(1): 1-6.

10. Cornelis P. Expressing genes in different Escherichia coli compartments. Curr Opin Biotechnol. 2000; 11(5): 450-4.

11. Tof I. Recombinant DNA Technology in the Synthesis of Human Insulin. Little Tree Pty. 2007; 12(2): 211-220.

12. Reece RJ. Analysis of genes and genomes, 2004; 18(3): 314-321.

13. Bessette PH, Aslund F, Beckwith J, Georgiou G. Efficient folding of proteins with multiple disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96(24): 13703-8.

14. Schägger H. tricine–sds-page. Nature protocols. 2006; 1(1): 16-22.

15. Yan WK, Goette M, Hofmann G, Zaror I, et al. High-level soluble expression, purification and characterization of active human midkine from Escherichia coli. Protein Expr Purif. 2010; 70(2): 270-6.

16. Tsutsui J, Uehara K, Kadomatsu K, Matsubara S, et al. A new family of heparin-binding factors: strong conservation of midkine (MK) sequences between the human and the mouse. Biochem Biophys Res Commun. 1991; 176(2): 792-7.

17. Jono H, Ando Y. Midkine: A Novel Prognostic Biomarker for Cancer. Cancers. 2010; 2(2): 624-41.

 

18. Ma Z, Li H, Wang B, Shen Q, et al. Midkine mRNA level in peripheral blood mononuclear cells is a novel biomarker for primary non-small cell lung cancer: a prospective study. Journal of cancer research and clinical oncology. 2013; 139(4): 557-62.

19. Levy R, Weiss R, Chen G, Iverson BL, et al. Production of Correctly Folded Fab Antibody Fragment in the Cytoplasm of Escherichia coli trxBgor Mutants via the Coexpression of Molecular Chaperones. Protein expression and purification. 2001; 23(2): 338-47.