بررسی قابلیت جذب یون‌های روی و نقره توسط گیاهچه‌های ازمک (Lepidium draba L.) و تاثیر این یون‌ها بر خصوصیات مورفولوژیکی و بیوشیمیایی گیاهچه‌ها

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، پژوهشکده علوم محیطی، گروه بیوتکنولوژی، کرمان، ایران

2 دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، دانشکده علوم و فناوری‌های نوین، گروه بیوتکنولوژی، کرمان، ایران

چکیده

هدف: هدف از انجام این تحقیق، بررسی توانایی گیاهچه‌های ازمک (Lepidium draba L.) در حذف یون‌های روی و نقره از محیط کشت بود. مواد و روش‌ها: بذرهای این گیاه در محیط MS جامد به‏مدت 15 روز در حضور غلظت‌های متفاوت دو یون نقره و روی کشت داده شدند. تجمع زیستی این فلزات در گیاهچه‌ها توسط دستگاه جذب اتمی اندازه‌گیری شد. علاوه بر این، خصوصیات بیوشیمیایی و مورفولوژیکی گیاهچه‌ها از قبیل فعالیت آنزیم‌های کاتالاز و سوپر اکسید دسموتاز، محتوی فلاونوئید کل، درصد جوانه‌زنی و طول ریشه و ساقه در تیمار با این یون‌ها مورد بررسی قرار گرفت. نتایج: نتایج نشان دهنده توانایی جذب هر دو فلز توسط گیاهچه‌های ازمک می‌باشد، به‏طوری‏که با افزایش غلظت فلزات در محیط کشت میزان جذب آن‏ها نیز افزایش یافت. از طرف دیگر، محتوی فلاونوئید کل و همچنین فعالیت آنزیم‌های کاتالاز و سوپر اکسید دسموتاز با افزایش غلظت فلز در محیط افزایش یافت. در تیمار با یون نقره میزان جوانه‌زنی بذرها افزایش نشان داد، در حالی‏که در تیمار با فلز روی، میزان جوانه‌زنی بذرها نسبت به شاهد تفاوت معنی‌داری نشان نداد. اگرچه طول ساقه در گیاهچه‌های تیمار شده با یون نقره به‏طور معنی‏داری افزایش یافته بود، رشد ریشه کاهش نشان داد. رشد ریشه و ساقه در گیاهچه‌های تیمار شده با یون روی به‏ویژه در غلظت‌های بالا به‏طور معنی‌داری کاهش نشان داد. نتیجه‌گیری: با توجه به نتایج، به‏نظر می‌رسد می‌توان گیاه ازمک را به‏عنوان گزینه مناسبی جهت پالایش فلزات مذکور در مناطق آلوده معرفی نمود.  

کلیدواژه‌ها


مقدمه

حضور ترکیبات سمی از قبیل فلزات سنگین یکی از مهم‏ترین مشکلات زیست محیطی در بسیاری از نقاط کره زمین می­باشد (1). فلزات سنگین از طریق فعالیت­های بشر، احتراق سوخت­های فسیلی، تصفیه سنگ­های حاوی فلز، فاضلاب­های شهری، آفت­کش­ها، مواد رنگی و باتری­ها و فرسایش طبیعی سنگ­ها می‫توانند به محیط زیست وارد شوند (2).

قرار گرفتن گیاهان در معرض سطوح سمی فلزات سنگین، باعث طیف گسترده­ای از تغییرات فیزیولوژیک و متابولیک می­شود (3 و 4). در حضور فلزات سنگین عواملی نظیرکلروز برگ­ها، نکروز، اختلال در تنفس میتوکندریایی، پیشرفت فرآیند پیری یا مرگ سلولی سبب کاهش رشد گیاه می­شوند (5 و 6). علاوه بر این، قرار گرفتن گیاهان در معرض شرایط تنش باعث افزایش سطح اتیلن می­شود که در مسیرهای مختلف پاسخ­ به تنش از جمله پیری اثر می­گذارد (7). یکی دیگر از نتایج سمیت فلزات سنگین، تجمع گونه­های اکسیژن واکنش‏گر (Reactive Oxygen species, ROS) در داخل سلول می­باشد. فعالیت ROSها منجر به اختلالاتی از قبیل آسیب به اسیدهای چرب­، اسیدهای نوکلئیک و پروتئین­ها تولید شده در سلول­ها می­شود که فرآیند پیری را با همکاری اتیلن و متیل جاسمونات افزایش می­دهند. در مقابل، گیاهان برای مقابله با استرس فلزات سنگین، سیستم­های آنتی­اکسیدانت  آنزیمی و غیر آنزیمی را فعال می­نمایند (8).

گیاه پالایی، یکی از روش­های زیست پالایی خاک­ها است که به‏دلیل  سادگی، ارزان بودن و امکان بهره­گیری در سطح وسیع نسبت به سایر روش­ها در دهه­های اخیر به آن توجه زیادی شده است. در این روش از گیاهان مقاوم، جهت پالایش خاک­های آلوده به ترکیبات آلی و معدنی به‏ویژه برای سیستم­هایی که غلظت آلاینده­های آن‏ها کم است استفاده می­گردد (9 -12).

گیاهان از روش­های مختلف برای مقابله با اثرات سمی فلزات و شبه فلزات استفاده می­کنند. مقاومت در برابر استرس فلزات سنگین را می‏توان با اجتناب (avoidance) هنگامی‏که گیاهان قادر به محدود کردن جذب فلز باشند، یا به‏وسیله مقاومت (tolerance) هنگامی که گیاه برای زنده ماندن  در معرض غلظت­ بالای  فلزات داخلی قرار می­گیرد، به‏دست آورد. اجتناب شامل کاهش غلظت فلز داخل سلولی به‏وسیله رسوب خارج سلولی، جذب به دیواره سلول، کاهش جذب است. از مهم‏ترین مکانیسم­های دخیل در مقاومت می­توان به افزایش محتوی اسیدهای آمینه و اسیدهای آلی، اتصال فلزات به لیگاندهایی از قبیل متالوتیونین­ها، فیتوکلاتین­ها، تجمع آن­ها در محفظه درون واکوئل و همچنین تنظیم بالای دفاع آنتی­اکسیدانتی، جهت مقابله با اثرات زیان بار ناشی از آزاد سازی ROSها اشاره نمود (13-15).

روی، یک عنصر ضروری برای رشد و نمو گیاهان است که در بسیاری از فرآیندهای متابولیسمی شرکت می­کند .ولی مقادیر خیلی کم یا زیاد آن، موجب اختلال در فرآیند­های مهم متابولیسمی و در نتیجه توقف یا کاهش رشد گیاهان می­شود (16). این عنصر در فعالیت آنزیم‏ها، بیوسنتز کلروفیل، اکسین، پروتئین و کربوهیدرات و همچنین متابولیسم لیپید­ها، اسیدهای نوکلئیک و استحکام غشا شرکت دارد (17). همچون سایر فلزات سنگین هنگامی‏که مقدار آن در خاک زیاد باشد نهایتا در بافت‏های گیاهی تجمع می­یابد، بسته به گونه گیاهی موجب تغییر در برخی فرآیندهای متابولیکی گیاه شده و از این طریق در رشد و نموگیاهان اختلال ایجاد می­کند (18). علائم سمیت روی در گیاهان شامل کاهش تولید محصول، توقف رشد، کاهش سنتز کلروفیل، تجزیه کلروپلاست و اختلال در جذب فسفر، منیزیم و منگنز می­باشد (19). اطلاعات منتشر شده نشان می‏دهد که روی زیادی باعث استرس اکسیداتیو به‏وسیله افزایش تولید ROS ها و پراکسیداسیون لیپیدها می­شود (20).

نقره با وزن مولکولی 868/107 گرم بر مول و چگالی 5/10 گرم بر سانتی‏متر مکعب از گروه فلزات سنگین است. مهم‏ترین فرم آن در طبیعت به‏صورت نیتراته است ولی برای رشد گیاهان ضروری نمی­باشد. نیترات نقره نقش مهمی در جنین­زایی سوماتیکی، شکل­گیری ریشه و ساقه بازی می­کند و در محیط کشت باعث فراوانی باززایی و افزایش شکل­گیری کالوس می­شود (21). ولی افزایش آن در محیط کشت می­تواند باعث القای تنش اکسیداتیو در گیاهان شود (22).

ازمک گیاه دولپه­ای و از خانواده شب­بو (Brassicaceae) است که به‏عنوان یک علف هرز شناخته شده است. این گیاه، بومی آسیا و اروپا بوده و دارای دو گونه L .draba subsp. draba  و L. draba subsp. chalepense  می­باشد که هر ­دو گونه در ایران گزارش شده­اند (23). بررسی تجمع عناصر سنگین توسط گیاهان مختلف جمع­آوری شده نشان داد که مقادیر زیادی از عناصـر سـرب، آهن، منگنـز و مس در انـدام­های هوایی این گیاه

تجمع می­یابد (24).

 در این تحقیق، میزان جذب دو فلز سنگین نقره و روی توسط گیاهچه­های ازمک در محیط آزمایشگاهی مورد بررسی قرار گرفت. علاوه بر این، اثر این فلزات بر برخی خصوصیات مورفولوژیکی و بیوشیمیایی این گیاه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

 

مواد و روش‏‏ها

جمع آوری بذر و کشت گیاه: بذر­های مورد استفاده در این تحقیق، از گیاهان رشد کرده در اطراف معدن مس سرچشمه کرمان جمع‏آوری و به‏وسیله اتانول 70 درصد به‏مدت 2 دقیقه و هیپوکلریت سدیم 2 درصد به‏مدت 15 دقیقه به‏صورت سطحی ضد عفونی شدند. از بذرهای ضد عفونی شده، تعداد 30 عدد در پلیت­هایی با قطر  10 سانتی‏متر و ارتفاع 5/1 سانتی‏متر در حضور غلظت­های مختلف یون نقره (AgNO3) (صفر، 25، 100 و 200 میلی‏گرم بر لیتر) و روی (ZnSO4)، (صفر، 25، 100 200، 500 و 1000 میلی‏گرم بر لیتر) در (7PH=) در محیط موراشیگ-اسکوگ (MS) کشت داده شدند (25).  پلیت­ها به ژرمیناتور با دمای 2±28درجه سانتی‏گراد، شرایط نوری 8 ساعت تاریکی و 16 ساعت روشنایی و رطوبت نسبی 2±56 درصد منتقل شدند. بعد از گذشت 15 روز گیاهچه­ها از سطح محیط جمع­آوری و بعد از شستشو و آبکشی به دو گروه تقسیم شدند. گروه اول جهت اندازه­گیری جذب فلز، در دمای 80 درجه سانتی­گراد به‏مدت 48 ساعت در آون خشک شدند. گروه دوم که برای اندازه­گیری محتوی فلاونوئید و آنزیم­های آنتی اکسیدانت مورد استفاده قرار گرفتند، بلافاصله پس از آبکشی در حضور نیتروژن مایع منجمد و در فریزر 80- درجه سانتی‏گراد تا زمان استفاده نگه‏داری شدند.

اندازه­گیری میزان جذب فلزات توسط گیاهچه­های ازمک: به‏منظور بررسی مقدار فلزجذب شده توسط گیاهچه­های ازمک، مقدار 50 میلی­گرم از گیاهچه­های خشک شده توسط هاون به‏خوبی ساییده و در 15 میلی‏لیتر اسیدنیتریک 65 درصد حل گردید. مقدار این عناصر به‏وسیله دستگاه طیف سنج جذبی اتمی شعله­ای (Varian SpectrAA 220) اندازه­گیری شد (26).

اندازه­گیری محتوی فلاونوئید: محتوی فلاونوئید گیاهچه­های شاهد و تیمار شده بر اساس روش کریزک و همکاران (27) انجام گرفت. به این منظور، مقدار 2/0 گرم از بافت­تر در 10 میلی‏لیتر اتانول اسیدی ( شامل الکل اتیلیک 95 درصد و اسید استیک گلایسال به نسبت 99:1) ساییده شد و سپس به‏مدت 20 دقیقه با دورrpm  10000 در دمای 25 درجه سانتی­گراد سانتریفیوژ گردید. محلول رویی به مدت 10 دقیقه در بن ماری با دمای 80 درجه سانتی­گراد قرار گرفت. جذب نمونه­هادر طول موج­های 270، 300 و 330 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر (Varian, cary 50Australia) اندازه­گیری شد. با استفاده از فرمول 12A=خµCL'> (A، میزان جذب؛  ε، ضریب خاموشی؛ C، غلظت و L، طول مسیر نور) و ضریب خاموشی cm-1mM-13300 محتوی فلاونوئید کل محاسبه و محتوی آن بر حسب µM/g FW گزارش گردید.

سنجش فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانت:

عصاره­گیری آنزیم­ها: به‏منظور عصاره­گیری آنزیم­ها، مقدار 5/0 گرم بافت ­تر در بافر mM 50 پتاسیم فسفات (5/7=pH) که حاوی پلی وینیل پیرولیدون (PVP) 1 درصد و یک میلی­مولار EDTA بود، ساییده شد. سوسپانسیون حاصل به‏مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی­گراد با دورrpm 11000 سانتریفیوژ گردید. محلول رویی جهت اندازه­گیری محتوی پروتئینی و بررسی فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانت مورد استفاده قرار گرفت (28).

سنجش فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز (SOD): مخلوط واکنش شامل ( mL3) بافر mM 50 HEPES-KOH (8/7pH=)  حاوی mM 1/0EDTA ،mM  50  Na2CO3 (2/10pH=)، mM 12L-Methionine، µM 75 Nitro Blue Tetrazolium (NBT)،  µM 1  Riboflavin و عصاره آنزیمی بود.

یک واحد فعالیت SOD عبارت است از مقدار آنزیمی که منجر به مهار 50 درصد احیا NBT در 560 نانومتر گردد که به‏ازای میلی­گرم پروتئین در عصاره آنزیمی محاسبه می­شود (28). آنزیم SOD، NBT محلول در آب را مصرف و آن‏را از طریق رادیکال سوپراکسید بهNBT-diformazan  رنگی تبدیل می­کند، یعنی با احیا آنیون سوپراکسید، فورمازان رنگی محلول در آب تولید می­نماید.

سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT): فعالیت آنزیم کاتالاز به‏روش  Dhinsdaو همکاران  محاسبه گردید (29). سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز با استفاده از محاسبه کاهش جذب H2O2 در 240 نانومتر انجام شد. میزان H2O2 موجود در مخلوط واکنش با استفاده از ضریب خاموشی  cm-1 mM-128/0 محاسبه شد. فعالیت آنزیم به‏صورت واحد آنزیمی بر حسب مقدار پروتئین کل (میلی­گرم) موجود در 100 میکرولیتر عصاره در مدت زمان یک دقیقه محاسبه گردید. یک واحد آنزیمی کاتالاز مقدار آنزیمی است که یک میلی­مول آب اکسیژنه را در یک دقیقه تجزیه می­کند.

سنجش محتوی پروتئین محلول کل: غلظت پروتئین کل عصاره­های گیاهی توسط روشBradford  محاسبه گردید (30). از سرم آلبومین گاوی (BSA) به‏عنوان استاندارد استفاده و میزان جذب نمونه­ها در طول موج 595 نانومتر اندازه­گیری شد.

اندازه­گیری خصوصیات مورفولوژیک:

جوانه­زنی بذر: تعداد بذرهای جوانه زده (حداقل طول هیپوکوتیل حدود 1 میلی­متر) هر روز شمارش و یاداشت شد. جوانه زنی بذرها بر اساس درصد جوانه­زنی بذرها در روز چهارم گزارش گردید.

اندازه­گیری طول ساقه و ریشه گیاهچه­های تیمار شده: ازسه پلیت حاوی 30 گیاه، 20 گیاهچه (15 روزه)، به‏طور تصادفی انتخاب گردید. طول ریشه از محل یقه تا نوک ریشه و طول ساقه از محل یقه تا جوانه راس با استفاده از خط­کش با دقت یک میلی­متر اندازه­گیری و بر حسب میلی‏متر گزارش شد.

آنالیز آماری: کلیه آزمایش‏ها با سه تکرار مستقل و در قالب یک طرح کاملا تصادفی انجام شدند. میانگین داده­ها توسط آزمون دانکن (Duncan test) و با در نظر گرفتن سطح اطمینان  05/0  P ≤با استفاده از نرم افزار SAS، مورد تجزیه واریانس یک‏طرفه (One way ANOVA) قرار گرفتند.

 

نتایج

جذب فلزات توسط گیاهچه­های ازمک

همان‏طور که در شکل1، A قابل مشاهده است، میزان جذب یون نقره توسط گیاهچه­ها هماهنگ با افزایش غلظت این یون در محیط افزایش یافته است.

روند مشابهی برای جذب روی در گیاهچه­های رشد کرده در محیط حاوی این فلز مشاهده گردید. میزان جذب یون روی توسط گیاهچه‏های ازمک بیانگر افزایش جذب آن هماهنگ با افزایش غلظت این یون تا غلظت 500 میلی­گرم بر لیتر در محیط است، اما با افزایش غلظت آن در محیط میزان جذب آن در مقایسه با غلظت 500 میلی­گرم بر لیتر تغییر معنی­داری نشان نداد (شکل 1، B).

 

 

 

شکل 1: میزان جذب یون نقره (A) و روی (B) توسط گیاهچه­های 15 روزه ازمک. داده­ها بر اساس میانگین نتایج ±  انحراف معیار(SD) گزارش گردیدند. حروف کوچک بالای نمودارها نشان دهنده تفاوت معنی­دار بین نتایج در سطح 5 درصد است.

 

فعالیت آنزیم­ کاتالاز

در گیاهچه­های تیمار شده با غلظت­های مختلف یون نقره، فعالیت آنزیم کاتالاز نسبت به نمونه شاهد افزایش معنی­داری را نشان داد. همان‏طور که در شکل 2، A مشاهده می­شود، افزایش فعالیت آنزیم هماهنگ با افزایش غلظت این یون در محیط می‫باشد.

در گیاهچه­های تیمار شده با غلظت­های متفاوت یون روی، نیز افزایش معنی­دار فعالیت آنزیم­ کاتالاز نسبت به گیاه شاهد مشاهده شد. بیشترین میزان فعالیت آنزیم در غلظت 500 میلی‫گرم بر لیتر مشاهده گردید ولی با افزایش غلظت این یون در محیط فعالیت این آنزیم افزایش نیافت (شکل 2، B).

 

 

 

شکل 2: فعالیت آنزیم CAT در گیاهچه­های ازمک تیمار شده با غلظت­های مختلف یون­های نقره (A) و روی (B). داده­ها بر اساس میانگین نتایج ±  انحراف معیار(SD) گزارش گردیدند. حروف کوچک بالای نمودارها نشان دهنده تفاوت معنی­دار بین نتایج در سطح 5 درصد است.

 

 

فعالیت آنزیم سوپر اکسید دسموتاز

فعالیت آنزیم سوپر اکسید دسموتاز در گیاهچه­های تیمار شده با یون نقره نسبت به نمونه شاهد افزایش معنی­داری در سطح 5 درصد نشان داد. به‏طوری‏که افزایش فعالیت این آنزیم با افزایش غلظت این یون در محیط هماهنگ بود (شکل 3، A). فعالیت این آنزیم­ در گیاهچه­های تیمار شده با غلظت­های متفاوت یون روی نیز در مقایسه با گیاه شاهد به‏طور معنی­داری افزایش نشان داد (شکل 3، B). فعالیت آنزیم کاتالاز در تیمار با این یون تا غلظت 250 میلی­گرم در لیتر به‏صورت هماهنگ بود، در حالی‏که تفاوت معنی­داری در فعالیت آنزیم در تیمار با غلظت­های بالاتر روی در مقایسه با غلظت 250 میلی­گرم در لیتر مشاهده نشد.

 

 

 

شکل 3: فعالیت آنزیم SOD در گیاهچه­های ازمک تیمار شده با غلظت­های مختلف یون­های نقره (A) و روی (B).داده­ها بر اساس میانگین نتایج ±  انحراف معیار (SD) گزارش گردیدند. حروف کوچک بالای نمودارها نشان دهنده تفاوت معنی­دار بین نتایج در سطح 5 درصد است.

 

 

محتوی فلاونوئید کل

در گیاهچه­های تیمار شده با غلظت 25 میلی­گرم بر لیتر یون نقره، محتوی فلاونوئید کل نسبت به نمونه شاهد به‏صورت معنی­داری کاهش نشان داد. درحالی‏که در غلظت­های بالاتر این یون، محتوی فلاونوئید کل نسبت به نمونه شاهد به‏طور معنی‫داری افزایش یافت (جدول 1). همچنین محتوی فلاونوئید کل گیاهچه­های تیمار شده با یون روی در تمامی غلظت­ها در مقایسه با نمونه شاهد به‏طور معنی­داری (به‏جز پایین­ترین غلظت) افزایش نشان داد (جدول 2).

محتوی پروتئین کل

مقدار پروتئین کل گیاهچه­های تیمار شده با غلظت 25 میلی­گرم بر لیتر یون نقره نسبت به نمونه شاهد به‏صورت معنی­داری افزایش یافت، درحالی‏که در تیمار با غلظت­های 100 و 200 میلی­گرم بر لیتر این یون، کاهش معنی­دار محتوی پروتئین نسبت به نمونه شاهد مشاهده گردید (جدول 1). همچنین مقدار پروتئین کل گیاهچه­های تیمار شده با یون روی در همه غلظت‫ها به‏طور معنی­داری نسبت به گیاه شاهد کاهش نشان داد (جدول 2).

میزان جوانه­زنی

افزایش درصد جوانه­زنی در تیمار بذرها با یون نقره در تمامی غلظت­ها مشاهده گردید، اما این افزایش تنها در بالاترین غلظت یون نسبت به نمونه شاهد معنی­دار بود (جدول 1).میزان جوانه‏زنی بذرها در تیمار با یون روی مشابه نمونه شاهد بود و تفاوت معنی­داری در سطح 5 درصد نسبت به نمونه شاهد مشاهده نگردید (جدول 2).

 

جدول 1: محتوی فلاونوئید، پروتئین کل و درصد جوانه­زنی نمونه شاهد و گیاهچه­های تیمار شده ازمک با غلظت­های متفاوت یون  نقره. میانگین داده­ها از سه تکرار مستقل توسط آزمون دانکن مورد تجزیه واریانس یک عاملی قرار گرفتند. داده­ها بر اساس میانگین نتایج ±  انحراف معیار(SD) گزارش گردیدند. در هر ستون حروف متفاوت بیانگر معنی­داری در سطح 5 درصد می­باشد.

پروتئین کل

(میلی گرم بر گرم وزن تر)

محتوی فلاونوئید

(میکرو­مولار بر میلی­گرم)

جوانه­زنی

(درصد)

غلظت یون نقره (میلی­گرم بر لیتر)

b 04/0 ± 32/32

c 95/4 ± 2/154

b 44/1±7/86

0

a 54/0 ± 44/35

d 03/5 ± 7/130

ab 81/3± 2/89

25

c 04/0 ± 08/24

b 50/1 ± 5/157

ab 00/1 ± 0/91

100

d 11/0 ± 08/23

a 61/3 ± 03/172

a 44/1 ± 3/93

200

 

 

جدول 2: محتوی فلاونوئید، پروتئین کل و درصد جوانه­زنی نمونه شاهد و گیاهچه­های تیمار شده ازمک با غلظت­های متفاوت یون روی. میانگین داده­ها از سه تکرار مستقل توسط آزمون دانکن مورد تجزیه واریانس یک عاملی قرار گرفتند. داده­ها بر اساس میانگین نتایج ±  انحراف معیار(SD) گزارش گردیدند. در هر ستون حروف متفاوت بیانگر معنی­داری در سطح 5 درصد می­باشد.

 

پروتئین کل

(میلی گرم بر گرم وزن تر)

محتوی فلاونوئید

(میکرو­مولار بر میلی­گرم)

جوانه­زنی

(درصد)

غلظت یون روی

(میلی­گرم بر لیتر)

a04/0 ± 32/32

c 95/4 ± 2/154

a 44/1 ± 7/86

0

b15/0 ± 62/30

c 04/0 ± 16/152

a 50/2 ± 0/85

25

c89/0 ± 11/24

b 76/0 ± 16/173

a 44/1 ± 2/84

100

d79/0± 75/20

a 32/1 ± 50/191

a 50/7 ± 0/90

250

d 82/0 ± 95/20

a 76/0 ± 16/189

a 57/0 ± 8/87

500

d 98/0 ± 55/21

a 25/1 ± 31/191

a 88/2 ± 2/84

1000

 

 

 

طول ساقه

طول ساقه در گیاهچه­های رشد یافته در محیط حاوی یون نقره، افزایش معنی­داری را نسبت به گیاه شاهد نشان داد. با این وجود، تفاوت معنی­داری بین طول ساقه در بین تیمارها مشاهده نگردید (شکل 4، A). طول ساقه گیاهچه­های تیمار شده با یون روی، در تیمار با غلظت 25 و 100 میلی­گرم بر لیتر مشابه نمونه شاهد بود. ولی در تیمار با غلظت­های بالاتر از 100 میلی­گرم بر لیتر، طول ساقه به‏طور معنی­داری نسبت به نمونه شاهد کاهش نشان داد (شکل 4، B).

 

 

طول ریشه

طول ریشه در گیاهچه­های تیمار شده با هر دو یون نقره و روی نسبت به نمونه شاهد کاهش یافت. کاهش طول ریشه در تیمار با یون نقره به‏صورت جزئی بود و تفاوت معنی­داری در مقایسه با طول ریشه در شاهد مشاهد نگردید. در تیمار با یون روی کاهش معنی­دار طول ریشه مشاهده گردید. طول ریشه در غلظت­های بالاتر از 100 میلی­گرم بر لیتر در مقایسه با نمونه شاهد بیش از 90 درصدکاهش نشان داد (شکل 5، A و B).

 

 

 

شکل 4: طول ساقه در گیاهچه­های ازمک تیمار شده با غلظت­های مختلف یون­های نقره (A) و روی (B). داده­ها بر اساس میانگین نتایج ±  انحراف معیار(SD) گزارش گردیدند. حروف کوچک بالای نمودارها نشان دهنده تفاوت معنی­دار بین نتایج در سطح 5 درصد است.

 

 

 

شکل 5: طول ریشه در گیاهچه­های ازمک تیمار شده با غلظت­های مختلف یون­های نقره (A) و روی (B) به‏مدت 15 روز.داده­ها بر اساس میانگین نتایج ±  انحراف معیار(SD) گزارش گردیدند. حروف کوچک بالای نمودارها نشان دهنده تفاوت معنی­دار بین نتایج در سطح 5 درصد است

 

بحث

در این مطالعه، توانایی پالایش دو عنصر سنگین نقره و روی توسط گیاهچه­های ازمک مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج به‏دست آمده نشان دهنده توانایی بالای این گیاه در جذب عناصر مذکور می­باشد به‏طوری‏که با افزایش غلظت این عناصر در محیط، میزان جذب آن­ها نیز افزایش یافته است. این مشاهدات با نتایج به‏دست آمده توسط نوری و همکاران که نشان دادند گیاه ازمک جذب کننده مناسب فلزات مختلف می­باشد، مطابقت دارد (24). از طرف دیگر، ثابت شده است که اگرغلظت یون­های فلزی در درون سلول به حد اشباع برسد، گیاه از استرس اکسیداتیو ناشی از تولیدROS ها و مهار فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانت وابسته به فلزات آسیب می­بیند (31). گیاهان برای مقابله در برابر آسیب­های ناشی از تولید ROSها از دو مکانیسم­ دفاع آنزیمی و غیر آنزیمی استفاده می­کند (32). از سیستم­های دفاع آنزیمی می­توان به آنزیم­های آنتی اکسیدانت اشاره کرد (33). همان‏طور که در نتایج آورده شده است، در گیاهان تیمار شده با این یون‫ها، فعالیت آنزیم­های سوپراکسید دسموتاز و کاتالاز به‏طور معنی­داری در مقایسه با گیاه شاهد افزایش یافته است. آنزیم سوپراکسید دسموتاز در تبدیل رادیکال سوپر­اکسید به پراکسید هیدروژن نقش اساسی دارد و کاتالاز یکی از آنزیم­های اصلی در تجزیه پراکسید هیدروژن می­باشد (34 و 35). افزایش فعالیت این آنزیم­ها بیانگر تولید ROSها ناشی از جذب این فلزات می‏باشد (36 و 37). سیستم دفاع غیر­آنزیمی گیاهان، شامل ترکیباتی از قبیل آسکوربیک اسید، آلفا توکوفرول، کارتنوئیدها و ترکیب­های فنلی به خصوص فلاونوئیدها است که در گیاهانی که در معرض غلظت­های بالای فلزات سنگین قرار می­گیرند، بسیار فعال بوده و باعث حفظ گیاه در مقابل سمیت فلزات می­شوند (38 و 39). همان‏طور که در جدول 1 قابل مشاهده است محتوی فلاونوئید کل در تیمار با غلظت­های بالای یون نقره افزایش پیدا کرده است که می­تواند دلیلی بر مقابله گیاه در مقابل تنش اکسیداتیو حاصله توسط این فلزات باشد.

ثابت شده است، مقدار بالای ROSها مانند رادیکال­های سوپر اکسید، H2O2 و OH• تحت شرایط پر تنش ایجاد می­شود و تولید این رادیکال­ها در گیاهان تحت تنش فلزات سنگین ثابت شده است (40). تولید ROS به همان اندازه که باعث تخریب سراسری در گیاه می‏شوند، به‏عنوان یک مولکول سیگنالینگ عمل می­کنند (41 و 42). H2O2  یکی از مهم‏ترین ROS­ها است که به‏عنوان یک مولکول سیگنال در پاسخ به استرس فلزات سنگین و سایر استرس­ها عمل می­کند (43). افزایش میزان H2O2 در تیمار آرابیدوپسیس با فلزات کادمیوم و مس و در تیمار گوجه ­فرنگی با جیوه گزارش شده است (44 و 45). افزایش تجمع H2O2 حالت احیائی سلول را تغییر می­دهد و تولید آنتی­اکسیدانت­ها القا و فعالیت مکانیسم آنتی­اکسیدانتی را تنظیم می­کند (44). بنابراین به‏نظر می­رسد، رشد گیاهان در حضور این فلزات منجر به رهاسازی ROSهایی از قبیل سوپراکسید و H2O2 می­شود. علاوه بر این، فعالیت آنزیم سوپراکسید دسموتاز جهت خنثی نمودن رادیکال­های­ سوپراکسید منجر به تولید بیشتر H2O2 می­شود که این مولکول می­تواند به‏عنوان سیگنالی جهت تحریک  سیستم آنتی­اکسیدانت آنزیمی و غیر آنزیمی از طریق افرایش بیان ژن­های مربوطه شود و این مساله می­تواند دلیلی بر افزایش محتوی فلاونوئید کل و همچنین فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانت باشد.

ثابت شده است که حضور نقره در محیط کشت از طریق مهار سنتز اتیلن که اثر مهاری بر تشکیل ریشه،  کالوس­زایی، رشد ساقه و گل‏زایی دارد باعث بهبود شرایط رشدی گیاهان می­شود (22 و 46). همان‏طور که در نتایج نشان داده شده، در حضور یون نقره، درصد جوانه­زنی بذرها و طول ساقه گیاهچه­ها در تمامی غلظت­ها بهبود یافت که با نتایج به‏دست آمده از مشاهدات Bais و همکاران (21) بر روی گیاه Cichorium intybus مطابقت دارد. مطالعات گذشته نشان داد که یون­های نقره از طریق ممانعت از بیوسنتز اتیلن موجب افزایش رشد و عمل‏کرد گیاه می­شوند (47). با این حال کاهش طول ریشه در تیمار با تمام غلظت­ها یون نقره به چشم می­خورد که در سطح 5 درصد معنی­دار است. کاهش طول ریشه می­تواند به‏دلیل دسترسی مستقیم این اندام به غلظت­های بالای این یون و جذب بالای آن باشد.  هرچند این فلز می­تواند باعث بهبود شرایط رشدی گیاه شود در غلظت­های بالا از طریق تحریک رها سازی ROSها برای گیاه سمی بوده و آسیب­های متفاوتی را در گیاهان موجب می­شوند. در حالی‏که افزایش طول ساقه در مقابل کاهش طول ریشه در گیاهچه­های رشد یافته در حضور نقره می­تواند مربوط به دسترسی کمتر ساقه به این یون به‏دلیل انتقال کمتر نقره از ریشه به ساقه باشد.

روی نقش بسیار مهمی در ساختار و راه اندازی بسیاری از فرآیندهای متابولیکی گیاه دارد. حضور بالای این فلز در گیاه سبب بروز برخی علایم ناشی از تنش وعدم رشد طبیعی گیاهان می­شود (48). مشخص شده است که سمیت روی باعث القای تنش اکسیداتیو به‏وسیله تولید ROSها می­شود (49). بنابراین کاهش رشد طولی ریشه و ساقه در غلظت بالای روی می­تواند به‏دلیل تنش اکسیداتیو بعد از جذب این عنصر باشد. برخی از محققین معتقدند که مهار رشد گیاهان در اثر غلظت­های بالای فلز روی، ممکن است به‏دلیل رقابت این فلز با فسفر در گیاه باشد (48). گزارش شده است که تجمع بالای فلز روی در سیتوزول سلول­های گیاهی از طریق اختلال در عمل‏کرد طبیعی سلول­ها و مهار فرآیند تنفس و واکنش­های انرژی خواه مرتبط با رشد سلول می­تواند سبب کاهش رشد و نمو ایده­آل گیاهان شود (50).

از طرف دیگر، محتوی پروتئین کل در تیمار با کمترین غلظت نقره (25 میلی­گرم بر لیتر) به‏صورت معنی­داری افزایش یافته است. پاسخ به استرس فلزات سنگین شامل یک شبکه پیچیده انتقال سیگنال است که با حضور فلزات فعال می­شود. این شبکه با تولید پروتئین­های درگیر در پاسخ به استرس و مولکول­های سیگنالینگ و همچنین با فعال شدن رونویسی از ژن­های مخصوص پاسخ به فلزات مرتبط می‏باشد (51). مطالعات گذشته نشان داده است که در تیمار با فلزات سنگین، سنتز پروتئین­های وابسته به استرس از قبیل پروتئین­های شوک حرارتی (HSP)، القا می­شوند تا وظیفه محافظت و ترمیم پروتئین­ها را به عهده داشته باشد و به‏عنوان چاپرون عمل نموده تا تاخوردگی صحیح پروتئین­ها را تضمین نمایند (52 و 53 و 54). در حالی‏که کاهش معنی­داری محتوی پروتئین کل در غلظت­های بالاتر یون نقره و تمامی غلظت­های یون روی می­تواند ناشی ار تخریب پروتئین­ها تحت تاثیر ROS‏ها باشد (41). ثابت شده است که تجمع رادیکال­های سوپر اکسید از طریق واکنش هابر-ویس (Haber-Weiss) تولید رادیکال­­های هیدروکسیل نموده  که این رادیکال‏ها می­توانند بیان ژن­ها و محتوی پروتئین­ها را کاهش داده و فعالیت آنزیم­ها را تحت تاثیر قرار دهد (55 و 56).

 

نتیجه گیری

در مجموع نتیجه­گیری می­شود که این گیاه توانایی جذب بالای یون­های روی و نقره را دارد. تجمع این فلزات در گیاه با رها­سازی ROS­ها همراه است. گیاه با فعال نمودن سیستم آنتی‏اکسیدانت سعی در خنثی نمودن این رادیکال­ها دارد. در عین حال، کاهش محتوی پروتئین و همچنین کاهش رشد ریشه می­تواند ناشی از تاثیرات منفی ROSها باشد. اگر چه مطالعات بیشتری لازم است تا اثرات دقیق این عناصر بر ویژگی­های بیوشیمیایی و مورفولوژیکی این گیاه مشخص گردد. ولی بر اساس نتایج حاصله در این تحقیق، به‏نظر می­رسد که ازمک گیاهی مناسب جهت پالایش مناطق آلوده به این عناصر (به‏ویژه در غلظت­های کم)است. در عین حال، آزمایشات بیشتری لازم است تا محل ذخیره فلزات و مکانیسم عمل‏کرد گیاه در برابر جذب فلزات به‏طور کامل مشخص گردد.

 

تشکر و قدردانی

این تحقیق با حمایت مالی دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، کرمان  انجام شده است. بنابراین مجری و همکاران مراتب سپاس و قدردانی خود را از آن دانشگاه محترم اعلام می­دارند.

  1. Blaster P, Zimmermann S, Luster J, Shotyk W. Critical examination of trace element enrichment and depletion in soils: As, Cr, Cu, Ni, Pb and Zn in Swiss forest soil. Sci Total Environ. 2000; 249(1-3): 257- 280.
  2. Ismail S. Phytoremediation: a green technology. IJPP. 2012; 3(1): 567-576.
  3. Dubey RS. Metal toxicity, oxidative stress and antioxidative defense system in plants. In reactive oxygen species and antioxidants in higher plants, S. D. Gupta, Ed. CRC Press, Boca Raton, Fla, USA. 2011; 177–203.
  4. Villiers F, Ducruix C, Hugouvieux V, Jarno N, et al. Investigating the plant response to cadmium exposure by proteomic and metabolomic approaches. Proteomics. 2011; 11(9): 1650–1663.
  5. Dalcorso G, Farinati S, Furini A. Regulatory networks of cadmium stress in plants. Plant Signal Behav. 2010; 5(6): 1–5.
  6. Carrier P, Baryla A, Havaux M. Cadmium distribution and microlocalization in oilseed rape (Brassica napus) after long-term growth on cadmium-contaminated soil. Planta. 2003; 216(6): 939–950.
  7. Deikman J. Molecular mechanisms of ethylene regulation of gene transcription. Physiol Plant. 1997; 100(3): 561–566.
  8. Gamalero E, Lingua G, Berta G, Glick BR. Beneficial role of plant growth promoting bacteria and arbuscular mycorrhizal fungi on plant responses
 

to heavy metal stress. Can J Microbiol. 2009; 55(5): 501–514.

  1. McCutcheon S.C, Schnoor I.L. Overview of phytoremediation and control of wastes. In: McCutchon, S.C., Schoor, J.L. (eds), Phytoremediation-Transformation and control of contaminants. Wiley, Hoboken, NJ; 2003; 3-58.
10. Schnoor JL. Phytoremediation. Ground-water remediation technologies analysis center (GWRTAC) Pittsburg. 1997; 1250- 1256.

11. Erakhrumen  AA. Phytoremediation: an environmentally sound technology for pollution prevention, control and remediation in developing countries. Educational Research and Review 2007; 2(7): 151-156.

12. Taebi A, Jeirani K, Mirlohi A, Zadeh Bafghi A. Phytoremediation of Cyanide-Polluted Soils by Non-woody Plants. JWSS. 2008; 11(42): 515-523.

13. Hossain MA, Hossain MZ, Fujita M. Stress-induced changes of methylglyoxal level and glyoxalase I activity in pumpkin seedlings and cDNA cloning of glyoxalase I gene. Aust J Crop Sci. 2009; 3(2); 53–64.

14. Yadav SK. Heavy metals toxicity in plants: an overview on the role of glutathione and phytochelatins in heavy metal stress tolerance of plants. S Afr J Bot. 2010; 76(2): 167–179.

15. Seth CS, Remans T, Keunen E, Jozefczak M, et al. Phytoextraction of toxic metals: a central role for glutathione. Plant Cell Environ. 2012; 35(2): 334–346.

16. Broadle  MR, White PJ, Hammond JP, Zlko IV. Zinc in plants. New Phytol. 2007; 173: 677-702.

17. Madhava Rao KV, Srestry TVS. Antioxidative parameters in the seedlings of pigeonpea (Cajanus cajan (L.) Millspaugh) in response to Zn and Ni stresses. Plant Sci. 2000; 157(1): 113–128.

18. Stoyanova Z, Doncheva S. The effect of Zinc supply and succinate treatment on plant growth and mineral uptake in pea plant. J Plant Physiol. 2002; 14(2): 111–116.

19. Chaney R.L. Zinc phytotoxicity. In: Robson A. D, (eds), Zinc in Soil and Plants. Dordrecht, the Netherlands: Kluwer Academic Publishers; 1933; 135-150.

20. Marschner H. Mineral nutrition of higher plants, 2nd edn. London. UK Academic Press. 1995; 123-128.

21. Bais HP, Sudha GS, Ravishankar GA. AgNO3 influences shoot multiplication In vitro flowering and endogenous titres of polyamines in Chichorium intybus L cv Lucknow Local. J Plant Growth Regul. 2000; 19(2): 238-248.

  1. 22.  Zhao J, Davis LC. Verpoorte R. Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites. Biotech Adv. 2005; 23: 283–333.
23. Gaskin F, Zhang D, Claude M. Invasion of Lepidium draba (Brassicaceae) in the western United States: distributions and origins of chloroplast DNA haplotypes. Mol Ecol Resour. 2005; 14: 2331–2341.

  1. 24.  Nouri J, Lorestani B, Yousefi N,  Khorasani N, et al. Phytoremediation potential of native plants grown in the vicinity of Ahangaran lead–zinc mine (Hamedan, Iran). Environ Earth Sci. 2011; 62:639–644.
25. Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 1962; 15(3): 473–497.

26. McGrath SP, Cunliffe CH. A simplified method for the extraction of the metals Fe, Zn, Cu, Ni, Cd, Pb, Cr, Co and Mn from soils and sewage sludges. J Sci Food Agric. 1985; 36: 794-798.

27. Krizek DT, Britz SJ, Mirecki RM. Inhibitory effects of ambient levels of solar UV-A and UV-B radiation on growth of cv. new red fire lettuce. Physiol Plant. 1998; 103: 1-7.

28. Giannopolitis CN, Ries SK. Superoxide dismutases I. Occurrence in higher plants. Plant Physiol. 1977; 59(2): 309-314.

29. Dhindsa RS, Plumb-Dhindsa P, Thorpe TA. Leaf senescence: correlated with increased levels of membrane permeability and lipid peroxidation, and decreased levels of superoxide dismutase and catalase. J Exp Bot. 1981; 32: 93-101.

30. Bradford  MM. rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein–dye binding. Anal Biochem. 1976; 72: 248-254.

31. Schützendübel A, Polle A. Plant responses to abiotic stresses: heavy metal-induced oxi oxidative stress and protection by mycorrhization. J Exp Bot. 2002; 53(372): 13351-1365.

32. Ajay Arora R, Sairam K, Srivastava GC. Oxidative stress and antioxidativ system in plants. Plant Physiol. 2002; 82: 10-25.

33. Mazhoudi S, Chaoui A, Ghorbal MH, Elferjani E. Response of antioxidant enzymes to excess copper in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.). Plant Sci. 1997; 127(2): 129-137.

34. Del-Rio LA, Lyon DS, Olah I, Glick B, et al. Immunocytochemical evidence for a peroxisomal localization of manganese superoxide dismutase in leaf protoplasts from a higher plant. Planta. 1983; 158: 216-224.

35. Khatun S, Ali MB, Hahn EJ, Paek KY. Cooper toxicity in Withania somnifera: Growth and antioxidant enzymes responses of in vitro grown plants. Environ Exp Bot. 2008; 64(3): 279-285.

36. Fabre N, Urizzi P, Souchard JP, Ferchard A, et al. An antioxidant sinapic acid ester isolated from Iberis amara. Fitoterapia. 2000; 71(4): 425-428.

37. Apel K, Hirt H. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction. Annu Rev Plant Biol. 2004; 55: 373-399.

38. Posmyk M, Dobranowska A, Janas K. Role of anthocyanins in red cabbage seedlings response to copper stress. Ecol Chem Eng. 2005; 12: 1107-1112.

39. Dai LP, Xiong ZT, Huang Y, Li MJ. Cadmium-induced changes in pigments, total phenolics, and phenylalanine ammonia-lyase activity in fronds of Azolla imbricata. Environ Technol. 2006; 21: 505-512.

40. Galligo SM, Benavides MP, Tomoro ML. Effect of Cd ions on antioxidant defense system in sunflower cotyledons. Biol Plantarum. 1999; 42:  49-55.

41. Lombardii L, Sebastiani L. Copper toxicity in Prunus cerasifera: growth and antioxidant enzymes responses of in vitro grown plant. Plant Sci. 2005; 168(3): 797-802.

42. Romero-Puertas MC, Corpas FJ, Rodríguez-Serrano M, Gómez M, et al. Differential expression and regulation of antioxidative enzymes by cadmium in pea plants. J Plant Physiol. 2007; 164: 1346-1357.

43. Dat J, Vandenabeele S, Vranova E, Van Montaqu M, et al. Dual action of the active oxygen species during plant stress responses. Cell Mol Life Sci. 2000; 57(5): 779-795.

44. Maksymiec W, Krupa Z. The effects of short-term exposition to Cd, excess Cu ions and jasmonate on oxidative stress appearing in Arabidopsis thaliana. Environ Exp Bot. 2006; 57(1): 187-194.

45. Cho UH, Park JO. Mercury-induced oxidative stress in tomato seedlings. Plant Sci. 2000; 156(1): 1-9.

46. Pan ZW, Zhong J. Scale-up study on suspension cultures of Taxus chinensis cells for production of taxane diterpene. Enzyme Microb Tech. 2000; 27: 714-721.

47. Belimov AA, Satronova VI, lergeyera TA, Egorova TN, et al. Characterization of plant growth promoting rhizobacteria isolated from polluted soils and containing 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase. Can J Microbiol. 2001; 47: 642-652.

48. Rout GR, Das P. Effect of metal toxicity on plant growth and metabolism; Zinc. Arch Agron Soil Sci. 2003; 23: 3–11.

49. Weckx JEJ, Clijsters H. Zn phytotoxicity induces oxidative stress in primary leaves of Phaseolus vulgaris. Plant Physiol Biochem. 1997; 35(5): 405–410.

50. Candan N, Tarhan L. Change inchlorophyll–carotenoid contents, antioxidantenzyme activities and lipid peroxidation levelsin Zn–stressed Mentha pulegium. Turk J Chem. 2003; 27: 21– 30.

51. Maksymiec W, WianowskaD, Dawidowicz AL, Radkiewicz S, et al. The level of jasmonic acid in Arabidopsis thaliana and Phaseolus coccineus plants under heavy metal stress. J Plant Physiol. 2005; 162(12): 1338-1346.

52. Zhen Y, Qi JL, Wang SS, Su J, et al. Comparative proteome analysis of differentially expressed proteins induced by Al toxicity in soybean. Physiol Plant. 2007; 131: 542–554.

53. Zhao L, SunYL, CuiSX. Cd-induced changes in leaf proteome of the hyperaccumulator plant Phytolacca americana. Chemosphere. 2011; 85: 56–66.

54. Vierling E. The roles of heat shock proteins in plants. Annu Rev Plant Biol. 1991; 42(1): 579-620.

55. Agarwal S, Shaheen R. Stimulation of antioxidant system and lipid peroxidation byabiotic stresses in leaves of Momordica charantia. Braz J Plant physiol. 2007; 19(2): 149-161.

56. Sharma P, Jha AB, Dubey RS, Pessarakli M. Reactive oxygen species, oxidative damage, and antioxidative defense mechanism in plants under stressful conditions. J Bot. 2012; 24(3):1-26.