بررسی اثر محافظتی عصاره هیدروالکلی برگ گیاه پنیرک (Malva neglecta L.) برآسیب کبدی القا شده توسط تتراکلریدکربن(ccl4) در موش های صحرایی نر

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناسی ارشد فیزیولوژی جانوری، دانشگاه آزاد اسلامی واحد همدان، دانشکده علوم‏، گروه زیست شناسی

2 دانشگاه بوعلی سینا همدان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

3 دانشگاه علوم پزشکی همدان، دانشکده پزشکی، گروه فیزیولوژی

چکیده

هدف: هدف این بررسی، مطالعه اثر محافظتی عصاره هیدروالکلی برگ پنیرک(Malva neglecta L.)  بر کبد موش‌های القا شده با تتراکلرید‌ کربن می‌باشد.
مواد و روش‌‏ها: در این بررسی 35 موش صحرایی نر در محدوده وزنی 230 تا 250 گرم به گروه‌های کنترل، شم، شاهد، تیمار 1 و2 تقسیم شدند. گروه‌های تیمار توسط تتراکلرید‌کربن القا و دو ساعت بعد توسط عصاره با دز 300 میلی‏گرم بر کیلوگرم و 600 میلی‏گرم  بر کیلوگرم روزانه و به‏مدت چهار روز و درون صفاقی تیمار شدند. گروه شاهد 2 میلی لیتر بر کیلوگرم تتراکلریدکربن با نسبت 1:1 با روغن زیتون، تک دز دریافت کردند.گروه کنترل و شم به ترتیب سالین نرمال و روغن زیتون 5/0 میلی‏لیتر روزانه و درون صفاقی دریافت کردند. سپس خون‏گیری جهت اندازه‌گیری آنزیم‌های آسپارتات آمینوترانسفراز (AST)، آلانین آمینوترانسنفراز ALT)) و آلکالن فسفاتاز ((ALP انجام شد. نمونه‌های بافتی کبد تهیه و رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین صورت گرفت. داده‌ها توسط تست  ANOVA ارزیابی شد و معیار اختلاف معنی‌دار 05/0 p< می‌باشد.
نتایج: نتایج افزایش آنزیم‌هایALT,AST وAP در گروه شاهد نسبت به گروه کنترل را نشان می‌دهد (001/0.(p< گروه‌های تیمار نسبت به شاهد التهاب کمتری را نشان دادند (01/0(p<. یافته‌های بافت شناسی نکروز بافت کبد القا شده توسط تتراکلرید کربن را تایید می‌کند. حیوانات تیمار شده توسط عصاره کاهش سلول‏های نکروزی و افزایش ترمیم هپاتوسیت‌ها را نشان می‌دهد.
نتیجه‌گیری: نتایج نشان داد که تتراکلریدکربن بافت کبد را ملتهب و دچار نکروزه می‏کند. پنیرک دارای ترکیبات آنتی‌‌اکسیدانتی و فلاونوئیدی است و اثرات سمی تتراکلریدکربن را در کبد کاهش می‌دهد.
واژگان کلیدی

کلیدواژه‌ها


مقدمه

کبد یکی از اندام­های حیاتی بدن است که در تنظیم بسیاری از فعالیت­های فیزیولوژیک دخیل است. هرگونه اختلال در عمل‏کرد کبد باعث ایجاد مجموعه­ای از اختلالات می­شود که می­­تواند صدمات جبران ناپذیری را به این عضو وارد نماید. عواملی مثل استرس اکسیداتیو، رادیکال­های آزاد، الکل سفید، مواد شیمیایی، ویروس­ها و داروها می­توانند باعث تخریب بافت کبدی شوند (1). حساس­ترین و پر مصرف‏ترین آنزیم­های تشخیصی کبد، آمینوترانسفرازها هستند. که شامل: آسپارتات آمینوترانسفراز یا    ASTو آلانین آمینوترانسفراز یا ALT  می­باشند (2). این آنزیم‫ها به‏طور معمول توسط سلول‏های کبدی به مقدار معینی تولید می‏گردند. زمانی‏که کبد دچار آسیب می‏شود سلول‏های کبدی ترشح آنزیم های فوق را افزایش داده و موجب بالارفتن سطح پلاسمایی آن‏ها می‏گردند، که بالارفتن سطح این آنزیم­ها در خون نشانه‏ی آسیب کبدی است (3).

نقش عمل‏کردی آمینوترانسفرازها چنین است که باعث کاتالیز واکنش­های شیمیایی در سلول‏ها می­شوند که در آن گروه آمین از یک مولکول دهنده به مولکول گیرنده منتقل می­گردد. به‏همین دلیل به آن‏ها آمینوترانسفراز گفته می­شود. آنزیم AST به‏نام ترانس آمینازاگزالواستیک سرم (SGOT) نیز نامیده می‏شود و ALT نیز به‏نام ترانس آمینازپیرویک گلوتامیک سرم (SGPT) مشهور است (4). ضایعه وارده به کبد ممکن است بخش کوچک یا بزرگی از کبد را در برگیرد. در ضایعات سلول‏های کبدی محتویات آن‏ها از سلول خارج شده و وارد جریان خون می­شود. لذا آنزیم­هایی مانند AST، ALT و ALP در خون افزایش می­یابند. با توجه به وسعت ضایعه سطح آنزیم­ها نیز تغییرات متناسب پیدا می­کنند. افزایش نسبی ALT وAST سرم می­تواند نوع ضایعه را نشان دهد. در سلول‏های کبدی میزانAST بیشتر از ALT است وAST در میتوکندری و سیتوپلاسم وجود دارد در صورتی‏که ALT فقط در سیتوپلاسم سلول جای دارد. در بیماری­هایی مانند هپاتیت ویروسی که ابتدا جدار سلول‏ها دچار ضایعه می­شوند بیشتر آنزیم­های موجود در سیتوپلاسم وارد مایع خارج سلولی و خون می­شوند. در نتیجه میزان ALT بیشتر از AST است ولی در بیماری­هایی که ضایعه تمام قسمت­های سلول را فرا می­گیرد مانند سیروز و هیپوکسی به‏طور نسبی افزایش AST بیشتر از ALT است (3).          عوامل شیمیایی مختلفی می­تواند باعث ایجاد آسیب کبدی و در نهایت سیروز شوند که شامل پاراستامول (5)، کلرید کادمیوم (6)، تتراکلرید ­کربن (7)، پاراکورات (8)، پاراکسون (9)، ریفامپین (10)، دی-گالاکتوز آمین (11) و ... می­باشند. یکی از مهم‏ترین این مواد تترا‏کلرید کربن است که در اثر القا سمیت توسط تترا‏کلرید کربن آسیب کبدی شدیدی در نمونه­های حیوانی (موش صحرایی‏) دیده شده است (12). فیبروز و سیروز القا شده توسط تترا‏کلرید کربن یکی از قدیمی­ترین و گسترده‏ترین مدل­های تجربی براساس این نوع سم است. همچنین با استفاده از این مدل تجریبات جامعی درباره تغییرات بیو‏شیمیایی و هیستولوژیکی و تغییرات همراه با آسیب، التهاب و فیبروز به‏دست آمده است. تجویز تترا‏کلرید کربن در موش در مقایسه با سموم دیگر در زمان کوتاه­تری منجر به بروز آسیب کبدی و سیروز می‫شود که تقریبا شبیه سیروز در انسان است (13).

در بررسی­های صورت گرفته بر روی جوندگان که از تترا‏کلرید‏کربن برای القا آسیب کبدی استفاده شده است، دیده شده است که تجویز یک دوز از تترا‏کلرید کربن باعث فیبروز کبدی، سیروز و سرطان سلول‏های کبد (HCC) می­شود (14). تجویز تترا‏کلرید کربن به‏روش­های زیر جلدی، داخل صفاقی و استنشاقی نشان می­دهد که همه این روش­ها در نهایت به سیروز منتهی می­شوند، اما سریع­ترین روش ایجاد سیروز، روش تزریق داخل صفاقی است (15).

تجویز تترا‏کلرید کربن در رت­ها باعث افزایش گاماگلوتامیل ترانسفراز (GGT)، آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) و آلکالن فسفاتاز( ALP) می‏شود. همچنین میزان کلاژن و پراکسیداسیون لیپیدها را افزایش و مقدار گلوتاتیون را کاهش می­دهد (16). رادیکال­های آزاد مشتق از ccl4 ­ باعث تجمع مالون­دی­آلدهید (MDA )که یکی از محصولات نهایی پراکسیداسیون لیپیدهاست شده و این امر در نهایت باعث غیر فعال شدن آنزیم­های آنتی­اکسیدانتی سوپر اکسید دیسموتاز (SOD )، کاتالازCAT) ) و گلوتاتیون پراکسیداز (GPX) می‏گردد (17).

در حالات مولکولی، ccl4 تومور نکروز فاکتور آلفا (TNF-α)، نیتریک اکساید NO)) و فاکتور رشد ترانسفرمی آلفا و بتا (TGF-α,β ) در داخل سلول را فعال می­کند، که این فرآیندها سلول را به‏سمت تخریب یا فیبروزه شدن هدایت می‏کند.  TNF-αآپوپتوسیز و TGF-α,β فیبروز را به دنبال دارد (18).

یکی از اختلالات کبدی فیبروز است که در اثر تجمع بیش از اندازه پروتئین­های ماتریکس خارج سلولی مثل کلاژن اتفاق می‫افتد و در اکثر بیماری­های مزمن کبدی دیده می­شود (19). در واقع فیبروز کبدی پاسخ ژنتیکی به عوامل گوناگونی است که در نهایت به سیروز منتهی می­شوند و عوارضی چون نقص کلیوی، افزایش فشارخون و سرطان سلول‏های کبدی را به‏دنبال دارد (20). سیروز نیز به‏نوبه خود باعث تولید سلول‏های کبدی فاقد عمل‏کرد، افزایش مقاومت کبد به جریان خون و در نهایت افزایش فشارخون می­گردد (19). در سیروز خفیف کبد می­تواند خود را ترمیم کرده و اعمالش را انجام دهد اما در نوع پیشرفته، آسیب­های کبدی بیشتری ایجاد شده و کبد نمی­تواند اعمال خود را به درستی انجام دهد. عوارض اصلی سیروز شامل آسیت، خون‏ریزی، آنسفالوپاتی، سندرم کبدی-کلیوی و پریتونیت باکتریایی خودبه‏خودی می­باشد. سیروز عموما برگشت ناپذیر است و درمراحل پیشرفته تنها درمان انتخابی پیوند کبد است (21).

تحقیقات گسترده انجام شده نشان می­دهد که گیاهان مختلف با دارا بودن ترکیبات شیمیایی گوناگون می‏توانند اثرات تخریبی و آسیب کبدی ناشی از تترا کلرید کربن را بهبود داده و از پیشرفت آسیب جلوگیری کنند. گیاهانی مانند: مانند کلاله زعفران (10) برگ ویتکس (22)، سیلیبینین (23) برگ پونه (1)، ریشه گیاه فیزالیس (24).

پنیرک گیاهی دو ساله و پایا از تیره Malvaceae است. ساقه­ای به ارتفاع 50 تا 120 سانتی­متر دارد و ریشه­ای سفید رنگ وگوشتدار دارد. برگ­های آن پنجه­ای 5 تا 7 لوبه، دندانه­دار می‏باشد. پنیرک گل­هایی به رنگ گلی مایل به بنفش منقوش به خطوط ارغوانی رنگ دارد. قسمت­های مورد استفاده انواع پنیرک از نظر درمانی برگ، گل و حتی ریشه می­باشد قسمت­های مورد استفاده انواع پنیرک از نظر درمانی برگ، گل و حتی ریشه می‏باشد. Malva neglecta دارای اثراتی چون: نرم کننده، رفع التهاب، معالج بیماری­های سینه می­باشد. زیرا در آن‏ها به‏خصوص در گل­های این گیاه مواد لعابی فراوانی وجود دارد (25).

نتایج نشان می­دهد که لینولنیک اسید، لینولئیک اسید، پالمیتیک اسید و اولئیک اسید بیش از 82 درصد کل اسیدهای چرب برگ و دمبرگ این گیاه را در برمی­گیرند (26). گیاه پنیرک تقویت کننده سیستم ایمنی می­باشد و به‏عنوان مکمل آبشاری در فعال‏سازی اثرات ضد التهابی، تحریک گلبول­های سفید خون و ماکروفاژها عمل می­کند (27). از گیاه پنیرک در رفع تحریکات دستگاه گوارش، التهابات مجاری ادراری، دستگاه تنفسی و میگرن استفاده می­شود (28).

با توجه به خواص درمانی پنیرک  و با توجه به اینکه در مورد خواص محافظت بافتی این گیاه تحقیقی صورت نگرفته است بر آن شدیم تا اثر حفاظتی عصاره این گیاه بر آسیب بافت کبد مورد مطالعه و بررسی قرار دهیم.

مواد و روش‏ها

در این تحقیق از 35 رت نر نژادWistar  در محدوده وزنی 230 تا 250 گرم استفاده شده است، که این حیوانات از موسسه انستیتو پاستور ایران خریداری شدند. حیوانات به منظور سازگاری با شرایط محیط در دمای حدود 2±22 درجه سانتی‏گراد و 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی، همچنین آب و غذا به‏صورت روزانه و آزاد، به‏مدت یک هفته در اتاق حیوانات نگه‏داری شدند.

تهیه عصاره: پس از شناسایی پنیرکMalva neglecta ، مقدار کافی از گیاه جمع آوری شد. گیاه جمع آوری شده را در سایه قرارداده تا کاملا خشک شود. سپس پودر از آن تهیه کرده و به‏مدت 12 روز در الکل 96 درصد قرار داده تا تمام مواد موثره آن خارج و در الکل حل گردد. سپس آن‏را صاف نموده و توسط دستگاه روتاری اپراتور اقدام به تهیه عصاره تقریبا خالص گردید.

 روش انجام آزمایش: در این بررسی، حیوانات به‏طور تصادفی به 5 گروه کنترل، شاهد، شم، تیمار1 و تیمار2 تقسیم شدند (7=n). گروه کنترل، نرمال سالین  9/0 درصد را به‏میزان 5/0 میلی‏لیتر روزانه و درون صفاقی دریافت کردند. گروه شم، 5/0 میلی‏لیتر روغن زیتون را فقط در روز اول آزمایش به‏صورت درون صفاقی دریافت کردند.گروه شاهد، محلول تتراکلرید کربن 50 درصد و روغن زیتون را که با فیلتر سر سرنگی استریل شده ( با نسبت 1:1 ) به‏میزان 2 میلی‏لیتر بر کیلوگرم به‏صورت تک دوز و درون صفاقی دریافت کردند. گروه تیمار 1، ابتدا محلول تتراکلرید کربن و روغن زیتون استریل شده (با نسبت 1:1) را به‏میزان 2 میلی‏گرم بر کیلوگرم وزن بدن دریافت کردند. بعد از 2 ساعت، عصاره الکلی پنیرک با غلظت 300 میلی‏گرم بر کیلوگرم که با فیلتر سر سرنگ استریل شده به‏صورت درون صفاقی دریافت کردند. تزریق تتراکلرید کربن و روغن زیتون در این گروه به‏صورت تک دوز فقط در روز اول انجام شد. گروه تیمار2، این گروه نیز، محلول تتراکلرید کربن و روغن زیتون استریل شده به میزان 2 میلی‏گرم بر کیلوگرم، به‏صورت تک دوز و درون صفاقی در روز اول دریافت کردند  و 2 ساعت بعد، عصاره الکلی پنیرک  با دز 600 میلی‏گرم بر کیلوگرم تزریق شد. تزریق عصاره به‏مدت 4 روز متوالی و 24 ساعت پس از تزریق اول انجام گرفت. حیوانات پس از هر نوبت تزریق، از نظر میزان آب و غذای مصرفی، سلامت، نحوه اثر عصاره و میزان مرگ و میر مورد ارزیابی قرار گرفتند. پس از گذشت 96 ساعت در روز پنجم، با رعایت اصول اخلاقی، پس از بی‏هوشی توسط اتر، خون‏گیری مستقیم از قلب از گروه­های مختلف انجام شد. پس از خونگیری نمونه­های خون به‏دست آمده از حیوانات گروه‏های مختلف، در داخل لوله آزمایش ریخته، نمونه­های خون سانتریفیوژ گردید و سرم آن‏ها جدا شد. سرم­های به‏دست آمده را به‏آرامی با سمپلر برداشته و به میکروتیوب­های مخصوص منتقل شد. نمونه­های سرم، جهت اندازه­گیری و سنجش آنزیم­های آسپارتات آمینوترانسفراز (AST) ،آلانین آمینوترانسنفراز ALT))  و آلکالن فسفاتاز ((ALP بلافاصله به آزمایشگاه منتقل شدند.

جهت بررسی­های بافت شناسی، بعد از باز کردن بدن حیوان، بافت کبد را از بدن جدا کرده، سپس با سرم فیزیولوژی آن‏را شسته و در داخل ظروف مخصوص قرار ریخته و فرمالین 10 درصد روی آن می­ریزیم. بعد از یک هفته، قطعه­ای از بافت کبد به ابعاد 5 ­­×5  میلی‏متر را به کمک پنس و اسکالپر برای انجام مراحل مختلف تهیه بافت جدا شد. بعد از انجام مرحله فیکساسیون، مرحله آب‏گیری از بافت صورت گرفت که در این مرحله نمونه­ها در الکل­های 50، 70، 90، 96 درصد و الکل مطلق به‏مدت 2 ساعت قرار داده شد. تا عمل دهیدراسیون بافتی به‏خوبی صورت گیرد. سپس جهت شفاف کردن، نمونه­ها در زایلن به‏مدت 45 دقیقه قرار داده شدند. در مرحله بعد که مرحله آغشته سازی است نمونه­ها در پارافین مذاب به‏مدت45 دقیقه در انکوباتور قرار گرفتند. آخرین مرحله قالب­گیری و سپس تهیه برش توسط دستگاه میکروتوم صورت گرفت. مقاطع بافتی توسط میکروتوم با ضخامت 5 تا 7 میکرومتر تهیه و مطالعه شدند. بعد از تهیه لام­ها رنگ­آمیزی با رنگ هماتوکسیلین – ائوزین (H&E) انجام شد.

آنالیز آماری:  جهت مقایسه­ی سطوح سرمی AST، ALT و ALP در گروه­های کنترل،  شم،  شاهد، تیمار1 و تیمار2 از نرم افزار  ,SPSS   آزمون ANOVA استفاده شد. پس از بررسی وضعیت نرمال بودن داده­ها توسط تست کولموگروف اسمیرنوف، جهت تجزیه و تحلیل داده­ها از  آزمون آماری آنالیز واریانس یک­طرفه­ی بین آزمودنی و برای مقایسات دو به دو از آزمون تعقیبی LSD استفاده شد.

 

نتایج

با توجه به نتایج مندرج در نمودار 1 دیده شده است که سطح سرمی AST در موش­های صحرایی نر در گروه شاهد (دریافت کننده­ی تتراکلرید کربن 2 میلی‏لیتر بر کیلوگرم به‏صورت تک دوز و درون صفاقی نسبت به گروه کنترل اختلاف معنی­داری وجود دارد که با توجه به 0005/0p-value< دریافت تتراکلرید کربن باعث افزایش معنی‏دار سطح سرمی AST نسبت به گروه کنترل شده است (001/0.(p< این میزان در گروه­های تیمار1 (دریافت  عصاره­ی پنیرک 300 میلی‏گرم بر کیلوگرم) و تیمار2 (دریافت عصاره­ی پنیرک 600 میلی‏گرم بر کیلوگرم) نسبت به گروه کنترل معنی­دار نیست (05/0.(p> میزان AST سرم در گروه‫های تیمار1و تیمار2 نسبت به گروه شاهد اختلاف معنی­دار است (001/0.(p< همچنین بین گروه­های شم (دریافت کننده­ی روغن زیتون)، تیمار1 و تیمار2 به‏صورت مقایسه دو به دو اختلاف معنی­داری در سطح سرمی AST مشاهده نشده است (05/0.(p>

نتایج موجود در نمودار 2 بیان کننده این مطلب است که میزان سطح سرمی ALT در گروه دریافت کننده تتراکلرید کربن که گروه شاهد است نسبت به گروه کنترل که نرمال سالین دریافت کرده است، اختلاف معنی­داری وجود دارد (001/0 (p<که با توجه به 0005/0p-value< دریافت تتراکلریدکربن منجر به افزایش میزان ALT شده است. همچنین میزان ALT سرم در گروه­های تیمار1 و تیمار2 نسبت به گروه شاهد اختلاف معنی‫داری را نشان می­دهد (001/0 (p<که این اختلاف در مقایسه با گروه کنترل معنی­دار نیست (05/0.(p>

همچنین مقایسه بین گروه­های شم و شاهد نیز اختلاف معنی‫داری را در سطح سرمی ALT نشان می­دهد (001/0.(p<

 

 

 

نمودار 1: مقایسه­ی سطح سرمی آنزیم آسپارتات آمینوترانسفراز (AST) در گروه‏های مختلف مورد آزمایش. داده‏ها به‏صورت Maen±SEM ارائه شده است.

* بیانگر معنی‏داری نسبت به گروه کنترل و # بیانگر معنی‏داری نسبت به گروه دریافت کننده­ی تترا کلرید کربن (CCl4)  است. (***P<0.001) و (###P<0.001)

 

 

نمودار 2: مقایسه­ی سطح سرمی آنزیم آلانین آمینوترانسنفراز (ALT) در گروه­های مختلف مورد آزمایش. داده‏ها به‏صورت Maen±SEM ارائه شده است.

* بیانگر معنی‏داری نسبت به گروه کنترل و # بیانگر معنی‏داری نسبت به گروه دریافت کننده­ی تترا کلرید کربن (CCl4) است. (***:P<0.001) و (###:P<0.001)

 

نمودار3 بیان کننده آن است که میزان ALP سرم در گروه شاهد دارای اختلاف معنی­دار نسبت به گروه کنترل می­باشد (001/0.(p< همچنین گروه­های تیمار1 و تیمار2 که دریافت کننده عصاره می­باشند دارای اختلاف معنی­داری در میزان سرمی ALP نسبت به گروه شاهد است (001/0 (p<که مقایسه این دو گروه با گروه کنترل اختلاف معنی­داری را نشان نمی­­دهد (05/0.(p>اختلاف بین گروه شم و گروه شاهد معنی­دار است(P<0.001) که این ختلاف نسبت به گروه تیمار1 و تیمار2 معنی­دار نیست (05/0.(p>

 

 

 

نمودار 3: مقایسه­ی سطح سرمی آنزیم آلکالن فسفاتاز (ALP)  در گروه­های مختلف مورد آزمایش. داده‏ها به‏صورت Maen±SEM ارائه شده است.

* بیانگر معنی‏داری نسبت به گروه کنترل و # بیانگر معنی‏داری نسبت به گروه دریافت کننده­ی تترا کلرید کربن (CCl4) است. (***:P<0.001) و (###:P<0.001)

 

 

نتایج بررسی­های میکروسکوپی نمونه‏های بافتی

نمونه­های بافتی تهیه شده توسط میکروسکوپ نوری (ZEISS,Axioskop 2, mot/plus,Germany) با بزرگنمایی ×400 مطالعه شدند. نتایج تاثیر عصاره هیدروالکلی برگ پنیرک و تغییرات بافتی کبد بعد از دریافت دز 2 میلی‏لیتر بر کیلوگرم محلول تترا کلرید کربن(CCl4) که با نسبت 1:1 با روغن زیتون استریل مخلوط شده بود نشان می­دهد که تترا کلرید کربندر مدت کوتاهی سبب آسیب حاد کبدی می‏شود که با نکروز هپاتوسلولار و تجمع سلول‏های التهابی در نواحی مرکز لوبولی همراه است (شکل 3).

تصاویر تهیه شده از مقاطع بافتی رنگ آمیزی شده با روش هماتوکسیلین-ائوزین در شکل­های1، 2، 3، 4 و 5 نشان داده شده است. بافت کبد حیوانات کنترل کاملا طبیعی بوده و طناب­های سلولی به‏طور منظم در اطراف سیاهرگ مرکزی قرار گرفته و هیچ نکروزی در هپاتوسیت­ها به چشم نمی­خورد (شکل1). تصاویر مربوط به مقاطع بافتی حیوانات شاهد دریافت کننده تترا کلرید کربن به‏میزان2 میلی‏لیتر بر کیلوگرم، نشان دهنده ایجاد نکروز گسترده هپاتوسلولار، به‏هم ریختگی نظم سلولی و سینوزوئیدهای کبدی و تجمع قابل توجهی از سلول‏های التهابی نظیر لنفوسیت­ها و نوتروفیل­ها در اطراف سیاهرگ مرکزی و فضاهای پورت می­باشد (شکل 3). در حیوانات تیمار شده با دز 300 میلی‏گرم بر کیلوگرم، ناحیه نکروزه به‏میزان قابل توجهی کوچک­تر شده و نیز از انبوه سلول‏های التهابی ارتشاح یافته در این ناحیه تا حد زیادی کاسته شده است (شکل4) که نسبت به گروه شاهد از اختلاف معنی‏داری برخوردار است (05/0 (p<. در گروه تیمار شده با دز600 میلی‏گرم بر کیلوگرم، بهبود حاصله و ترمیم بافت کبد بسیار چشم‏گیرتر و از نظر آماری با اختلاف بیشتری نسبت به گروه شاهد روبه­رو بوده است (001/0 (p<.در تصاویر به‏دست آمده تنها تعداد اندکی از سلول‏ها در اطراف سیاهرگ مرکزی و فضای پورت دچار نکروز شده و ارتشاح سلول‏های التهابی بسیار کاهش یافته است ( شکل 5). این تصاویر نشان دهنده این واقعیت است که عصاره هیدروالکلی برگ گیاه پنیرک توانسته است از نکروز هپاتوسلولار در کبد حیوانات القا شده توسط تتراکلرید کربن به‏میزان قابل توجهی جلوگیری نماید. به‏طوری‏که بافت کبد این گروه از حیوانات در اثر ترمیم و باز سازی سلولی بسیار شبیه به کبد حیوانات گروه کنترل می‏باشند (شکل 4 و5).

 

                     

شکل1: مقطع بافتی تهیه شده از کبد حیوانات گروه کنترل. هپاتوسیت­ها و طناب­های سلولی لوبول­ها به‏طور منظم در اطراف سیاهرگ مرکزی قرار گرفته و هیچ نکروزی به چشم نمی­خورد (پیکان). بزرگنمایی ×400 و رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین.

 

                         

شکل2 : مقطع بافتی تهیه شده از کبد گروه شم (دریافت کننده روغن زیتون به‏میزان 5/0 میلی‏لیتر). هپاتوسیت­ها کاملا سالم بوده و هیچگونه اختلالی در سلول‏ها و نظم آن­ها و سیاهرگ مرکزی اتفاق نیفتاده است (پیکان). بزرگنمایی ×400 و رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین.

 

 

 

                  

شکل3: مقطع بافتی تهیه شده از کبد گروه دریافت کننده تتراکلرید کربن به‏میزان 2 میلی‏لیتر بر کیلوگرم به‏مدت چهار روز. نکروز گسترده هپاتوسیت­ها (پیکان­ها)و تجمع قابل توجه سلول‏های التهابی حول سیاهرگ مرکزی و فضای پورت  قابل مشاهده می­باشد. طناب­های سلولی کبدی کاملا به‏هم ریخته شده و واکوئول­دار شدن هپاتوسیت­ها دیده می­شود. بزرگنمایی ×400 و رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین.

 

 

 

 

                          

شکل4: مقطع بافتی تهیه شده از کبد گروه تیمار شده با دز 300 میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی پنیرک هم‏زمان با دریافت تتراکلرید کربن به‏میزان 2 میلی‏لیتر بر کیلوگرم. روند نکروزه کند بوده و ناحیه ناحیه نکروزه به‏میزان قابل توجهی کوچک­تر شده است. کاهش در ارتشاح سلول‏های التهابی در ناحیه نکروزه رخ داده است (پیکان). بزرگنمایی ×400 و رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین.

 

شکل 5: مقطع بافتی تهیه شده از کبد گروه تیمار شده با دز 600 میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی پنیرک هم‏زمان با دریافت تتراکلرید کربن به‏میزان 2 میلی‏لیتر بر کیلوگرم. کاهش بسیار زیاد سلول‏های التهابی و تعداد بسیار اندک و قابل توجه سلول‏های نکروتیک در اطراف سیاهرگ مرکزی و فضای پورت. بازگشت نظم طناب­ها و بازسازی داربست سلولی (پیکان). بزرگنمایی ×400 و رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین.

 

 

بحث

مواد شیمیایی مانند آمونیاک، انواع داروها، الکل و ویروس­ها از جمله عواملی هستند که می­توانند باعث آسیب بافت کبد شده و بیماری‏های کبدی را به­دنبال داشته باشند. از جمله بیماری­هایی که در کبد دیده می‏شود، شامل هپاتیت ویروسی و هپاتیت حاد الکلی می­باشد که می­توانند منجر به سیروز کبدی گردند. یرقان یا زردی، کلستاز (3)، یرقان انسدادی، انسداد مجاری بدون وجود یرقان (29)، کبد چرب (30)، کارسینوم هپاتوسلولار، سیروز صفراوی اولیه و سیروز (29) از دیگر بیماری­های کبد می­باشند که تقریبا تمامی این بیماری­ها منجربه سیروز می­شوند، اما در بیشتر موارد سیروز، ناشی از هپاتیت مزمن است (29). از جمله اختلالاتی که در آسیب بافت کبد دیده می­شود، نکروز و به‏دنبال آن فیبروز است که به‏دلیل تجمع پروتئین­هایی مثل کلاژن در ماتریکس سلول صورت می­گیرد (19).

 تتراکلرید کربن یکی از مواد شیمیایی بسیار سمی و خطرناک است که مواجهه با آن باعث نکروز، سیروز، سرطان کبد و نهایتا کما یا مرگ می‏شود (30). در آسیب کبدی ناشی از تتراکلرید کربن افزایش ALT، AST، ALP (31-33) گزارش شده است.همچنین به­دنبال تزریق تتراکلرید کربن در موش، افزایش میزان فعالیت-α,β, NO  TGF (18)، وTNF-α (34)، دیده می­شود.

تتراکلرید کربن با تولید رادیکال‏های آزاد، با مولکول­های مختلف مانند اسید­­آمینه، نوکلئوتیدها، اسیدهای چرب، پروتئین­ها، اسیدهای نوکلئیک و لیپید واکنش داده (35) و باعث تخریب شدید فرآیندهای سلولی می­شود. این اثرات در میتوکندری، شبکه آندوپلاسمی و غشا پلاسمایی دیده شده وآسیب سلولی شدیدی را در پی دارند. از جمله تاثیرات پاتولوژِیک ccl4 در میتوکندری می­توان به عدم ایجاد فسفریلاسیون اکسیداتیو و اختلال در انتقالCa+2 اشاره کرد (18). گیاهان دارای ترکیباتی چون آلکالوییدها، فلوباتانین، تانن، ترپنوئید، گلیکوزید و آنتراکوتینون (36) و فلاونویید هستند که می­توانند از طریق فعالیت آنتی­اکسیدانتی (37) خود باعث حفظ ثبات و پایداری غشا سلول شوند و آسیب وارده به بافت را بهبود بخشند (23). استفاده از عصاره­های آبی و الکلی گیاهان مختلف می­تواند اثرات تخریبی کبد ناشی از تزریق تتراکلرید کربن را کاهش داده و باعث بهبود بافت کبد شوند. در آسیب کبدی ناشی از تتراکلرید کربن حل شده در روغن زیتون (با نسبت 1:1) دیده شده که تزریق عصاره گیاه Gink gobiloba از نکروز و فیبروز کبد در برابر آسیب ناشی از تتراکلرید کربن جلوگیری می­کند. اثر محافظتی گیاه فوق از طریق کاهش آنزیم­های مارکرکبدی و پراکسیداسیون لیپیدها صورت می پذیرد (38). در تحقیقی مشخص شد که عصاره آبی و الکلی ساقه­های گیاهCapparis decidua دارای فعالیت محافظت کبدی در برابر هپاتوتوکسیسیته ناشی از تتراکلرید کربن  حل شده در روغن پارافین در رت است که از  این گیاه در طب سنتی در درمان یرقان و زردی استفاده می­شود. این تحقیق نشان داد که وجود ترکیباتی چون آلکالوئیدها، فلاونوئیدها، تانن­ها، استرول­ها، ساپونین،گلیکوزیدهای سیانوژنیک و کومارین­ها اجزای اصلی عصاره هستند که می­­توانند از آسیب بافت کبد در برابر  تتراکلرید کربن جلوگیری کنند (39). بررسی صورت گرفته روی عصاره آبی و اتانولی برگ گیاه Vitex trifolia  مشخص شد، که این گیاه از آسیب بافت کبدی ناشی از ccl4 جلوگیری می­کند. که با کاهش توتال بیلی­روبین و آنزیم­های کبدی از آسیب ناشی از تتراکلرید کربن محافظت می­شود. بررسی­های هیستوپاتولوژی بافت کبد این نتایج را تایید می­کند (40). آنالیز فیتوشیمیایی عصاره متانولی برگ گیاه Carissa Opaca   نشان می­دهد که ترکیباتی چون فلاونوئید، تانن، آلکالوئید، فلوباتانین، ترپنوئید، کومارین، آنتراکوتینون و گلیکوزیدها در این عصاره وجود دارد که می­توانند از بافت کبدی در برابر آسیب ایجاد شده توسط  ccl4 از طریق فعالیت آنتی­اکسیدانتی و حفظ ثبات و پایداری غشا محافظت کند (41). برگ­ها و دمبرگ گیاه پنیرک برای تعیین نوع و مقدار ترکیبات اسیدهای چرب، عناصر معدنی، فلاونوئید کل و موسیلاژ مورد آنالیز قرار گرفت. میزان ترکیباتی مانند تانن و نیترات نیز تعیین شدند. نتایج نشان داد که لینولنیک اسید، لینولئیک اسید، پالمیتیک اسید و اولئیک اسید بیش از 82 درصد کل اسیدهای چرب برگ و دمبرگ این گیاه را در بر می­گیرند. تجزیه کروماتوگرافی طیف سنجی جرمی عصاره متانولی مشخص کرد که 2- متوکسی-4- وینیل فنل، ترکیب اصلی در عصاره این گیاه است که گیاه پنیرک با داشتن این ترکیبات می­تواند فعالیت آنتی اکسیدانتی و جذب رادیکال­های آزاد داشته باشد. (42). علاوه بر پژوهش­های فوق سایر گیاهان دارویی مانند کلاله زعفران(10)، برگ پونه (1)، ریشه گیاه فیزالیس (24)، پیکانتوس (32) کرکیوما (43)، فیکوس (33)، سیلیبینین (23) نیز از طریق داشتن ترکیبات شیمیایی مختلف و فعالیت آنتی اکسیدانتی و جذب رادیکال­های آزاد می­توانند اثرات تخریبی ناشی از تزریق تتراکلرید کربن در کبد را کاهش داده و باعث بهبود بافت کبد شوند. پنیرک دارای ترکیباتی چون لینولنیک اسید، لینولئیک اسید، پالمتیک اسید (26)، موسیلاژ می­باشد. این گیاه همچنین حاوی تانن، لوکوآنتوسیانین، آنتوسیانین (44)، فنول­ها، فلاونوئیدها، کاروتنوئیدها، آلکالوئید، که سبب افزایش آنزیم­های آنتی­اکسیدانتی مانند سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز،گلوتاتیون پراکسیداز می‏گردد (45).

از آنجائی‏که آنتی­اکسیدانت­ها قادرند با کاهش پراکسیداسیون لیپیدی و نکروز هپاتوسیتی تا حد زیادی کبد را در مقابل آسیب­ها محافظت کنند، تصور می­شود علت کاهش تعداد سلول‏های نکروتیک، در اثر القا بافت کبد به تتراکلرید کربن وجود آنتی اکسیدانت­های موجود در عصاره گیاه پنیرک باشد (46).

با توجه به نتایج تحقیقات انجام شده بر روی گیاهان مختلف که وجود ترکیبات آنتی­اکسیدانتی آن‏ها اثبات شده است، و با توجه به اثبات وجود این ترکیبات در گیاه پنیرک می­توان اذعان نمود که احتمالا گیاه پنیرک از طریق فعالیت آنتی­اکسیدانتی و جاروکنندگی رادیکال‏های آزاد با کمک این ترکیبات دارای فعالیت محافظت بافتی به ویژه در بافت کبد می­باشد.

 

نتیجه گیری

نتایج تحقیق حاضر نشان داد که تیمار با عصاره هیدروالکلی پنیرک (Malva neglecta L.) به‏دلیل دارا بودن آنتی‏اکسیدانت‏ها موجب تخفیف آسیب کبدی القا شده توسط تتراکلرید­کربن شده و به‏صورت معنی­داری تمامی شاخص های آسیب بافتی را بهبود بخشد. عصاره گیاه پنیرک احتمالا با مهار برهم کنش­های شیمیایی رادیکال­های آزاد ناشی از تتراکلریدکربن که آغاز کننده استرس اکسیداتیو، پراکسیداسیون لیپید و تغییرات مولکولی هستند و همچنین با سرکوب روند التهاب بافتی در کبد، اثر حفاظت کنندگی خود در کبد را اعمال می‏کند.

 

تشکر و قدردانی

در این تحقیق لازم است از زحمات مسئول محترم آزمایشگاه تشخیص طبی بزرگمهر جناب آقای دکتر جواد رشیدی و همچنین از پرسنل محترم آزمایشگاه فیزیولوژی و بافت شناسی دانشگاه آزاد اسلامی واحد همدان صمیمانه تشکر نمائیم.

1. Mokhtari M, Shariati M, Khodaparast L. Hepatoprotective effect of Mentha pulegium aqua-ethanolic leaf extract in rats.Jurnal of medical university of Sabzevar. 2008; 15: 2(48):73-78.

2. Badalzadeh R, Ghasemi K, RastkgarFarajzade A. Ganong’s review of medical Physiology.23th Ed.Tehran:Jahan Adib and Sina Teb;1390.

3. Amirrasuli, H. Clinical Biochemistry. 4th ED.Tehran: Jafari; 1384.

4. Shahbazi P, Maleknia, N, General Biochemistry. 20th Ed.Tehran: University of Tehran; 1381.

5. Oyagbemi AOdetola A. Oyagbemi AOdetola A.  Hepatoprotective effects of ethanolic extract of Cnidoscolus aconitifolius on paracetamol-induced hepatic damage in rats.  2010; 13(4): 164-169.

6. Koriem KFarrag ABadawy MEl-Toumy S. Role of some Egyptian medicinal plants against liver and kidney toxicity induced by cadmium chloride.  2009; 19(8): 524-534.

7. Rudnicki MSilveira MPereira TOliveira M, et al. Protective effects of Passiflora alata extract pretreatment on carbon tetrachloride induced oxidative damage in rats.  2007; 45(4): 656-61.

8. Mohamadi B, Ghazi K. The study of antioxidant effect of Captopril on liver mitochondry induced with Parakurat in rat. Journal of medical university of Kerman. 2005; 13(3): 132-140

9. Haji Gholamali M, Jafari M, Asgari A, HajiHoseini R, Effect of Paraxon on antioxidant and Peroxidation lipid on liver of rat.Journal of Guilan University of medical sciences. 2011; 75:1-10.

10. Mohajeri D, Dustar Y, Rezaei A, Mesgari A.  Hepatoprotective effect of Saffron ethanolic extract induced with Rifampin in comparision with silimarin in rat. Zahedan journal of research in medical sciences. 2010; 12(5): 53-59.

11. Banu SBhaskar BBalasekar P. Hepatoprotective and antioxidant activity of Leucas aspera against d-galactosamine induced liver damage in rats. Harm Biol.  2012; 50(12):1592-1595.

12. Surendran S, Eswaran M, Vijayakumar M, Rao C. In vitro and in vivo hepatoprotective activity of Cissampelos pareira against carbon-tetrachloride induced hepatic damage, Indian J Exp Biol. 2011; 49(12): 939-45.

13. Constandinou C, Henderson N, Iredale JP. Modeling liver fibrosis in rodents, Methods in molecular medicine. 2005; 117: 237-250.

14. Pierece RA. Increased procollagen mRNA levels in carbon tetrachloride induced liver fibrosis in rats, J Biol Chem.1987; 262(2): 1652-1658.

15. Domenicali M. Anovel model of CCl4-induced cirrhosis with ascites in the mouses.Journal of Hepatology. 2009; 51(1): 92-97.

16. Marino G. N-acetylcysteine prevents carbon tetrachloride-induced liver cirrhosis, role of liver transforming growth factor-beta and oxidative stress, European Journal of Gastroenterology & Hepatology. 2008; 21: 908-914.

17. Ha B, Lee JY. The Effect of Chonderitin Sulfate against CCl4-induced Hepatotoxidcity.Biol.Pharm. Bull. 2003; 26: 622-626.

 18. Weber LWBoll MStampfl A. Hepatotoxicity and mechanism of action of haloalkanes,    carbon tetrachloride as a toxicological model.  2003; 33(2): 105-136.

19. Gines P. Management of cirrhosis and ascites. Engl N, Med J. 2004; 350: 1646-1654.

20. Ramachandran P, Iredale J. Liver fibrosis a bidirectional model of fibrogensis and resolution. QJM. 2012; 105(9): 813-881.

21. Ariel M, Rene T, Hyacinthe L. The Man behind the Stethoscope.Clinical Medicine & Research. 2006; 4(3): 230-235.

22. Manjunatha BK, Vidya SM. Hepatoprotective Activity of Vitex trifolia against Carbon T etrachloride-induced Hepatic Damage. Indian J Pharm Sci. 2008; 70(2): 241–245.

23. Ezhilarasan DKarthikeyan SVivekanandan P. Ameliorative effect of silibinin against N-nitrosodimethylamine-induced hepatic fibrosis in rats.Environ Toxicol Pharmacol. 2012; S1382-6689(12): 106-108.

24. Gengaihi SHassan EHamed MZahran Het al. Chemical composition and biological evaluation of Physalis peruviana root as hepato-renal protectiveagent. 2013; 10(1): 39-53.

25. Zargari. A. Medicinal plants, 7th, Tehran, University of Tehran; 1997.

26. Tabaraki R, Yousefi Z, Asadi Gharneh H. The study of compound and antioxidant properties of Malva sylvestris.Journal of research in Agricultural Science. 2012; 86(1):59-68.

27. Gonda R, Tomoda M, Kanari M, Shimizu N, et al. Constituents of the seed of Malva verticillata, VI, Characterization and immunological activities of a novel acidic polysaccharide.Chem Pharm Bull (Tokyo), 1990; 10: 2771-2774.

28. Zargari A. medicinal plants.Tehran: University of Tehran; 2007.

 

29. Burtis carl E, Daivid B, Tietz fundamentals of clinical chemistry.6th Ed.Tehran: Andishe Rafie; 2008; 930-955.

30. Rood A, McGavran P, Aanenson J, Till J. Stochastic estimates of exposure and cancer risk from carbon tetrachloride released to the air from the rocky flats plant.  Risk Anal. 2001; 21 (4): 675–695.

31. Achudume AOgunyemi K. EEffects of the extracts of Pycanthus angolensis against chemically induced acute hepatotoxicity. Pak J Biol Sci.  2007; 15, 10(18): 3231-2333.

32. Mohan G, Pallavi E, Ravi Kumar B, Ramesh M, et al. Hepatoprotective activity of Ficus carica Linn leaf extract against carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in rats. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences. 2007; 15(3): 162-166.

33. Gaurav L, Hemant S, Kamlesh P, Zeashan. Hepatoprotective effects of Calotropis giganteaextract against carbon tetrachloride induced liver injury in rats. Acta Pharmaceutica.Acta Pharmaceutica. 2009; 59(1):89–96.

34. Sang Wong P, CXhan Hon L, Yeong Shik K, Sam Sik K, et al. Protective effect of Baicalin Against Carbon Tetrachloride indused Acute Hepatic injery in mice. Pharmacol sie. 2008; 106(1) 136-143.

35. Thomas C, Aust S. Free radicals and environmental toxins Annals of Emergency Medicine. 1986; 15(9): 1075-1083.

36. Sahreen­ SKhan MKhan R. Hepatoprotective effects of methanol extract of Carissa opaca leaves onCCl4-induced damage in rat. BMC Complement Altern Med. 2011; 24: 11-48.

37. Islam MParvin MIslam M. Antioxidant and hepatoprotective activity of an ethanol extract of Syzygium jambos (L.) leave.  Rug Discov Ther. 2012; 6(4): 205-211.

38. Suresh R, Naik VS. Antioxidant and hepatoprotective effects of Ginkgo biloba phytosomes in carbon tetrachloride-induced liver injury in rodents, Article first published onlin 2007; 3: 393-399.

39. Al S, Al-Amin TH, Mohamed  A, Gameel  A. Hepatoprotective activity of aqueous and methanolic extracts of Capparis decidua stems against carbon tetrachloride induced liver damage in rats, Journal of Pharmacology and Toxicology. 2009; 4(4): 167-172.

40. Manjunatha BK, Vidya SM. Hepatoprotective Activity of Vitex trifolia against Carbon Tetrachloride-induced Hepatic Damage Indian J Pharm Sci, 2008; 70(2): 241–245.

41. Sahreen SKhan MKhan R. Hepatoprotective effects of methanol extract of Carissa opaca leaves onCCl4-induced damage in rat, BMC Complement Altern Med. 2011; 11:48.

42. Tbaraki R, Yusefi Z, Asadi Gharne H. Chemistry compounds and antioxidant effect of Malva neglecta. 1391; 86(1): 58-59.

43. Abu-Rizq HMansour MSafer A. Cyto-protective and immunomodulating effect of Curcuma longa in Wistar rats subjected to carbon tetrachloride-induced oxidative stress, Inflammopharmacology. 2008; 16(2): 87-95.

44. Salehi Surmaghi M. Medical Plants. Tehran: Donyay Taghzieh; 2006.

45. Barros L, Carvalho A, Ferreira IC.  Leaves, flowers, immature fruits and leafy flowered stems of Malva sylvestris: a comparative study of the nutraceutical potential and composition. Food Chem Toxicol. 2010; 48(6): 1466-1672.

46. Wojdylo A, Oszmiansky J, Czemerys R. Antioxidant activity and phenolic compounds in 32 selected herbs, Food Chem. 2007; 105: 940-949.