بررسی بیان مارکر سلولهای بنیادی SALL4 در مزنسفالن طی‌تکوین‌جنین جوجه

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه آزاد اسلامی واحد دامغان ، گروه زیست شناسی، دامغان، ایران

2 دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد، گروه زیست شناسی، مشهد، ایران

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی کمی بیان mRNA ژنSALL4  در مزنسفالن طی مراحل رشد و نمو جنینی جوجه است .  مواد و روش‏ها : در این پژوهش تجربی از تخم مرغ‏های نطفه دار انکوبه شده در حرارت37 تا 5/37 درجه سانتی‏گراد و رطوبت 60 تا 65 درصد  استفاده شد. پس از شروع رشد و نمو جنینی قسمتی از بافت پروزنسفالن مغز به‏طور روزانه از تخم مرغ‏ها جمع آوری گردید، از بافت تفکیک شده Total RNA استخراج و سنتز cDNA انجام شد. cDNA سنتز شده به‏عنوان الگو برای بررسی کمی بیان SALL4 mRNA ؛ به‏روش Real Time PCR مورد استفاده قرار گرفت. نتایج: نتایج حاصل از Real-time PCR رونوشت‌هایSALL4  در بافت مزونسفالون مغز در طی ‌تکوین جوجه نشان می‌‌دهد‌ که ‌بیان‌ ژنSALL4  در طول رشد و نمو جنین‌ در مزنسفالن متغیر است، درحالی‏که‌ بیان mRNA  ژن SALL4 در طول رشد و نمو جنینی بررسی‌شد، بیشترین تعداد نسخه‌هایmRNA ژنSALL4 از لحاظ کمی‌ در نوزدهمین روز جنینی یافت شد. نتیجه گیری: در بررسی سطح بیانmRNA  ژنSALL4 طی مراحل مختلف رشد و نمو جنینی جوجه، از روی شواهد می‏توان پیش‏بینی نمود که احتمالا ارتباطی بین بیانSALL4  درمراکزعصبی مزنسفالن مغز و تکامل اندام‏هایی بینایی وجود داشته باشد.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

یکی از ابزارهای بیولوژیکی مهم در جنین شناسی، مطالعه جنین جوجه می­باشد که به دلایل متعددی حائز اهمیت است، تشابه زیادی در نمو جنینی انواع پرندگان بالاخص جنین جوجه با انواع پستانداران دیده می­شود. علاوه بر این با به‏وجود آوردن سیستم مصنوعی جهت رشد و نمو جنینی مطالعه آن‏ها در آزمایشگاه به‏سهولت امکان پذیر است؛ این موجود برای سال‏های زیادی از پیشرفته­ترین مدل­های مناسب برای جنین شناسی تجربی بوده است و به این ترتیب نشان دهنده مکمل مهمی برای سیستم‏های نظیر مدل موش می‏باشد (1).

با استفاده از فهرست ساده­ای از آزمایش‏ها، جوجه سهم مهمی در درک تنظیم تکامل اعضا مختلف نظیر تشکیل سیستم عصبی، استخوان‏بندی، اندام زایی، الگوهای جنینی، تشکیل سر و صورت، تکامل عروق، رگ‏زایی، بهبود زخم­ و ایمونولوژی دارد (2). پیدایش ­و نمو مغز جوجه در اوایل دوره جنینی رخ می­دهد و بخش­های مختلف مغز جوجه شامل پروزنسفالن،­­ مزنسفالن و رومبنسفالن شکل می­گیرد (3). در روزهای 3و4 جنینی دو نیمکره حبابی ­شکل مغز (telencephalon) ­درمنطقه­ای واقع در پروزنسفالون از لوله عصبی تشکیل می­شود و در روز 4 مزنسفالون به عنوان ساختار مرکزی بزرگی شروع به رشد می­کند (4).

خانواده ژن  SALL نقش اساسی درطول تکامل حیوانات دارند، ژن­های مربوط به SALL در c.elegans، ماهی، قورباغه (زنوپوس)، موش ­و انسان تشخیص ­داده شده است (5). تاکنون سه عضو از خانواده ژنSALL شامل SALL1، SALL2، SALL4 در جوجه شناسایی شده است (6). ژن­های SALL4 وSALL1 درطول­ رشد و نمو جنینی در مغز، اندام­های در حال رشد و قوس­های احشایی به‏طور هم‏زمان بیان می­شوند، محل قرارگیری ژن SALL4 درناحیه20q13.2 است، ژن SALL4 در بازوی بلند (q) کروموزوم 20 و در موقعیت2/13 قرارگرفته است (7). در سلول­های بنیادی­ ژن SALL4 نقش اساسی ­در وقایع نمو جنینی و همچنین تعمیر و نگه‏داری سلول‏های پرتوان بنیادی جنینی برعهده دارد، بیان ژن SALL4 منتهی به تکثیر بسیار زیاد سلول‏های بنیادی­ جنینی می­­­شود به‏طوری‏که خاموش­سازی این ژن در موش سبب مرگ موجود در روز 7 جنینی ­می­شود (8). ژن SALL4 یک مارکر جدید و حساس­ در تشخیص­ ویژه تومورهای سلول زایشی ­اولیه­ی تخمدان­ و تومورهای سلول جنسی بیضه­ای است (9).

با توجه­ به نقش ژنSALL4  در رشد و نمو دوران جنینی، در این مطالعه به ارزیابی بیان ژن SALL4 در بافت مزنسفالن مغز جوجه در مراحل مختلف جنینی با روشReal Time PCR  پرداخته شده است.

 

مواد و روش‌ها

جمع آوری بافت مغز:تخم مرغ­‏های نطفه دارتهیه شده از تعاونی مر‏غ‏داران طوس مشهد، نژادROSS  جهت پرورش و سپس استخراج  بافت مغز در داخل دستگاه جوجه کشی مدل (korea،RCOM Digital incubator) با 37 تا 5/37 درجه سانتی‏گراد و­ رطوبت­ بین­60­ تا 65- ­­قرارداده ­شد. ­بافت­ مغز در زیر استرئومیکروسکوپ شامل پروزنسفالن، مزنسفالن ­و رومبنسفالن است، از روز4 جنینی به جداسازی بافت مزانسفالن پرداخته­ و از 5 الی6 نمونه در روزهای ابتدایی جنینی استفاده گردید و حجم بافت مزنسفالن جهت استخراجRNA  ­حدود50 میلی­گرم در هر نوبت استخراج است با توجه به اینکه در روزهای نزدیک به انتها رشد و نمو مزنسفالن افزایش­­ بیشتری دارد از2 الی3 نمونه استفاده گردید، پس از جدا کردن مزونسفالن، بافت­ در درون محلول RNAlater (USA ،ziestbaran) قرارداده شده و دردمای20- درجه سانتی‏گراد نگه‏داری گردید.

 استخراج RNA از بافت مزونسفالن: استفاده­ ازRNA­ سالم­ جهت ­به‏کارگیری درروش­های ژنتیک مولکولی ­­مانند­ میکرواریReal time PCR  یاRT PCR کمی، ضروری است. استفاده از RNAبا کیفیت پایین، ممکن است نتایج بعدی حاصل از کار بر روی اینRNA  را تحت تاثیر قراردهد. استخراج RNA با استفاده از دستورالعمل کیت تهیه شده از شرکت دنا زیست آسیا و برای هر روز جنینی طی سه مرحله تکرارگردید. بعد از استخراج،RNA  درآب فاقد RNAase دردمای20-  درجه سانتی‏گراد نگه‏داری می‏شود‏.

سنتز cDNA : RNA‏های استخراج شده در روزهای مختلف بافت مزنسفالن مغز (E4-E20) با استفاده از کیت تهیه شده از شرکت پارس توس جهت سنتز cDNA مورد استفاده قرار گرفت. ترکیبات لازم برای سنتز cDNA با حجم نهایی20 میکرولیتر، 5 میکرولیتر RNATotal، 1میکرولیتر Oligodt، 4 میکرولیتر sterilized D.Wکه در دمای65 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 5 دقیقه در دستگاه ترموسایکلر قرار داده شد. در مرحله بعدی10 میکرولیترRT-preMix(2X) به ترکیبات اولیه اضافه گردید و مجددا دردمای25 درجه سانتی‏گراد به‏مدت10 دقیقه در دستگاه قرار داده شد، سپس دستگاه برای مدت60 دقیقه دردمای50 درجه سانتی‏گراد و در مرحله آخر دستگاه برای مدت10 دقیقه در 70 درجه سانتی‏گراد تنظیم گردید.

بهینه سازی شرایط RT-PCR برای تکثیر ژن SALL4 : واکنشRT-PCR  طبق دستور العمل کیت تهیه شده از شرکت پارس توس انجام شد به‏طوری‏که Mastermix با حجم نهایی 29 میکرولیتر تهیه شده و شامل بافرX  10به‏میزان3 میکرولیتر، 5/0 میکرولیتر dNTPs 1میکرولیتر 2Mgcl، پرایمر2میکرولیتر، 2/0میکرولیترآنزیمDNApolymerase Taq ، 3/21 میکرولیتر sterilized D.W و1میکرولیتر cDNA  است. پس از آماده‫سازی مواد جهت RT-PCR تنظیمات­ دستگاه ترموسایکلر شامل30 چرخه شامل واسرشتگی (Denaturation) به‏مدت30 ثانیه دردمای 94 درجه سانتی‏گراد، اتصال(Annealing) به‏مدت30 ثانیه در دمای 56 درجه سانتی‏گراد و   بسط (Extention) به‏مدت30 ثانیه در دمای 72 درجه سانتی‏گراد حرارت داده شد.           

انجام Real time PCR : توالی پرایمرهایی­که برای بررسی ژن SALL4 استفاده شدند، شامل پرایمرهایی جهتReal time PCR و پرایمرهای مربوط به ژن GAPDH به‏عنوان کنترل داخلی جهت نرمال سازی است که از شرکت تکاپو زیست طبق جدول 1 تهیه گردید.

 

 

جدول 1: توالی پرایمرهای طراحی شده جهت واکنش Real time PCR

5´→3´

Real –time PCR primer

5-CGAAGGGGAACCTGAAGGTC-3

SALL4 Forward

5-GAGATCTCGTTGGTCTTCATTG-3

SALL4 Reverse

5´→3´

GAPDH primer

5-AGATGGTGAAAGTCGGAGTCA-3

GAPDH Forward

5-ATCATTGATGGCCACCACTTG-3

GAPDH Reverse

 

 

 

مواد مورد نیاز جهت انجام Real time PCR با حجم نهایی20 میکرولیتر شامل10 میکرولیتر Sybergreen، 4/0 میکرولیتر ROX dye ،6/0 میکرولیتر پرایمر،7 میکرولیتر Sterilized D.W. و2 میکرولیترcDNA است.

با استفاده از پرایمـرهایPCR Real time و استفاده ازSybergreen، بیان ژن SALL4 در نمونه هایcDNA  تهیه شده از بافت مغز در روزهای مختلف جنینی مورد ارزیابی قرار گرفت.

برنامه دمایی که دستگاه برای انجام Real time PCR  تنظیم شد شامل یک مرحله 10دقیقه ای در دمای 95 درجه سانتی‏گراد و چرخه‏های دمایی شامل10 ثانیه 95 درجه سانتی‏گراد،30 ثانیه دمای 56 درجه سانتی‏گراد و 30 ثانیه دمای 72 درجه سانتی‏گراد بود که در45 سیکل تکرار گردید )شکل   1، (A. همراه با واکنشReal time PCR منحنی استاندارد و تکثیر ژن SALL4 بر اساس میزان فلورسانت ساطع شده نیز رسم گردید (شکل1، B).

 

 

شکل 1: (A تنظیمات دستگاه برای برنامه دمایی جهت انجام Real time PCR، (B منحنی استاندارد سنجش کمیRNASALL4 شامل رقت های3-10-7-10و محاسبه تعداد کپی‏های ژنی است.

 

آنالیزهای آماری: نتایج با استفاده از آزمون‏های آماری Chi-square و t-test در محیط نرم افزاری SPSS، تجزیه و تحلیل شدند.

 

نتایج

براساس مطالعات ­آناتومیکی ­و استناد به جدول هامبورگ­-همیلتون (H-H) با استفاده از استرئومیکروسکوپ استخراج از بافت مزنسفالن صورت پذیرفت، مزنسفالن ­از روز3 جنینی شروع به بزرگتر شدن کرده و از قسمت­ خلفی به ­ناحیه باریکی از رومبنسفالن متصل می­گردد، تغییرات مورفولوژی مزنسفالن در روزهای مختلف جنینی در شکل2 (روز3 و6 جنینی) مشخص شده است .

 

 

 

 

شکل 2: A) جنین 72 ساعت جوجه با درشتنماییX 5/12، B) جنین 6 روزه با درشتنمایی ×10 (تصاویری از تغییرات مزنسفالن درطی­ رشدو نمو جوجه)

 

 

با استفاده از RNAاستخراج شده برای بهینه سازی واکنش PCR و انتخاب سیکل مناسب، قبل از انجام واکنش PCR ،Total RNA حاصل از مزنسفالن در طول رشد و نمو جنین جوجه درشرایطRNase-free  تهیه گردید و برای بررسی کیفیتRNA ‏های استخراج شده در روزهای رشد و نمو جنینی مزنسفالن از ژل آگارز استفاده شد، سپس سنتزcDNA  ازTotal RNA بافت ­جنینی مزنسفالن برای استفاده به‏عنوان الگو درReal time PCR  انجام گرفت شده­ و از ژنGAPDH  به‏عنوان نرمالایز استفاده ­شد (شکل-3).

 

 

 

 

شکل3: A) ا لکتروفورز RNA های استخراج شده در روزهای جنینی جهت بررسی کیفی حضور باندهای S28 وS 18بر روی ژل آگارز, B) الکتروفورز cDNA های مزنسفالن مغز جوجه (روز 19 جنینی) وژن GAPDH بر روی ژل آگارز جهت استفاده در Real time PCR چاهک 1 مربوط به ژن GAPDH ، چاهک  2 مربوط به نشانگر و چاهک 3 مربوط به ژن SALL4  می­باشد.

 

 

 

نتایج حاصل از Real time PCR بافت مزنسفالون مغز در طی تکوین جوجه نشان می­دهد بیان ژن SALL4 درطول رشد و نمو جنین در مزنسفالن متغیر است به‏طوری‏که در روز 6 جنینی104 × 72/1، روز10 جنینی104× 74/3، روز16 جنینی104 × 18/2 و در روز 19جنینی104×54/18 نسخه­های ژنی را نشان می­دهد که بیان بالاتری نسبت به ­روزهای دیگر جنینی دارد، بیان این ژن در روز 18 جنینی در بافت مزنسفالن مغز شروع به افزایش و در روز 19 به حداکثر بیان خود می‏رسد (نمودار 1).

 

 

 

نمودار 1: رشد و نمو در مزونسفالن مغز جنین جوجه در روزهای تکوین و میزان بیان ژن SALL4

 

 

بحث

ژن SALL4 ارائه دهنده دستور العمل برای ساخت پروتئین‫هایی است که در تشکیل بافت‏ها و اندام‏ها در طی رشد و نمو جنین نقش دارند، خانوادهSALL  از عوامل رونویسی است به این معنی که به مناطق خاصی از DNA متصل می­شود و به کنترل فعالیت ژن­های خاصی کمک می­کنند، براساس عمل‏کرد پروتئین­های مشابه SALL4 در دیگر ارگانسیم­ها مانند گوره خرماهی و موش به نظر می­رسد، این پروتئین نقش حیاتی در اندام­های در حال رشد ایفا می­کند، این پروتئین برای رشد عصب­های تحت کنترل حرکات چشم و برای جداسازی دیواره بین دهلیزهای قلب نقش کلیدی دارد (10). با توجه به نتایج به‏دست آمده بیان این ژن درطی3 روز انتهایی تکوین مزنسفالن جنین جوجه، افزایش بیشتری نشان می­دهد به‏طوری‏که در طول­ روز6 جنینی نیز افزایش دارد؛ و این زمان مطابق با تمایز لوب‏های بینایی می­باشد (11).

در تحقیق حاضر بیان ژن 4SALL در بافت مزنسفالن مغز جنین جوجه با استفاده از روش Real time PCR در طول رشد و نمو این موجود مورد بررسی قرار گرفت و تغییرات بیان این ژن در طی تکوین این بافت ارزیابی­گردید‏، به‏طوری‏که بیشترین بیان در روز 19جنینی مشاهده شد.

ژنSALL4 در برخی از مسیرهای سیگنالینگ در طول مهاجرت سلول­های تاج عصبی ­و تشکیل قلب نقش دارند (12-14)،           SALL4در طی مراحل ابتدایی رشد و نمو جنینی در توده سلول‏های داخلی بلاستوسیست و ترفواکتودرم و همچنین در مراحل پایانی جنینی در تشکیل لوله عصبی، تکوین مغز، قوس‫های ریوی و جوانه اندام­ها دخالت دارد، جهش درSALL4 طی اوایل دوران بارداری، سبب تغییر شکل در روده جنین و فقدان در بسته شدن لوله عصبی می­شود (8). Nanog وSALL4  به‏ترتیب فاکتورهای کلیدی در حفظ مرحله عدم تمایز و تکثیر سلولی می­باشند خاموش شدن بیان ژن SALL4 منتهی به تکثیر بسیار زیاد سلول­های بنیادی جنینی می­شود و در صورت از بین رفتن SALL4 موش­ها قادر به زنده ماندن تا روز 7 جنینی نمی باشند (15).

میزان بیانmRNA ،SALL4  در سرطان­های پستان به­وسیله روش RT-PCR روی نمونه بافت­های سرطانی و غیرسرطانی به‏دست آمده از بیماران مبتلا به سرطان پستان انجام گرفته است که سطح بیانmRNA ،SALL4  در بافت‏های سرطانی به‏طور قابل توجهی بیشتر از بافت‏های غیر سرطانی بود، میزان بیان Nanog در سلولهای سرطانی بیماران مبتلا به سرطان پستان افزایش می­یابد. تنظیم متقابل بیان ژن، بین SALL4 و Nanog که در سلول‏های بنیادی موش مشاهده شده­اند ممکن است در انسان هم اتفاق بیافتد به این ترتیب این امکان وجود دارد که چندین مولکول مرتبط سلول‏های بنیادی با همکاری این ژن نقش اساسی در رفتار سلول‏های سرطانی انسان را داشته باشند (10).

 

نتیجه گیری

با توجه به اینکه بیشترین بیان در روز 19 جنینی در مزنسفالن رخ داده است و این قسمت مغز دارای مراکز تطبیق و انعکاس برای پیام‏های بینایی­است تکوین کامل مراکز انعکاسی­ و تطابق و تمایز لوب­های بینایی در طی روزهای پایانی انجام یافته است. با مقاسیه بیان این ژن در روزهای مختلف جنینی در طی مراحل تکوین مزنسفالن جنین جوجه، در روزهای ابتدایی جنینی­که مغز در حال­تشکیل می‏باشد، نوسانات زیادی در بیان ژن 4SALL در بافت مزنسفالن مغزمشاهده نشد، در حالی‏که در روز19 جنینی که رشد و نمو مزنسفالن در حال تکمیل است بیان این ژن افزایش بیشتری­ نشان می­دهد. به نظر می­رسد افزایش ناگهانی بیان این ژن در روز­های آخر جنینی ­در مزنسفالن که مرکز انعکاس­های بینایی است به هدایت و پردازش اطلاعات حسی ­در این بخش و ارتباط بین اندام­های بینایی­ و مراکز عصبی جهت کنترل سیستم بینایی مربوط باشد که نیاز به مطالعات بیشتری دارد.

 

تشکر و قدردانی

بدین وسیله مراتب قدردانی و سپاس خود را از همکاری و مساعدت‏های خانم‏ها مریم خالقی زاده و سیما اردلان ابراز داشته و همچنین از پرسنل پژوهشکده بوعلی مشهد بخش ژنتیک انسانی و همکاران آزمایشگاه زیست شناسی تکوینی دانشگاه آزاد اسلامی مشهد در اجرای این پژوهش نهایت سپاسگزاری را داریم.

 

 

1. Agudo D, Gomez-Esquer F, Diaz-Gil G, Martinez-Arribas F, et al. Proteomic analysis of the Gallus gallus embryo at stage-29 of development. Proteomics. 2005; 5(18): 4946-57.

2. Wang X, Erf GF. Melanocyte-specific cell mediated immune response in vitiliginous Smyth line chickens. Journal of autoimmunity. 2003; 21(2): 149-60.

3. Stiles J, Jernigan TL. The basics of brain development. Neuropsychology review. 2010; 20(4): 327-48.

4. Henshel DS, Martin JW, DeWitt JC. Brain asymmetry as a potential biomarker for developmental TCDD intoxication: a dose-response study. Environmental health perspectives. 1997; 105(7): 718-25.

5. Gassei K, Orwig KE. SALL4 expression in gonocytes and spermatogonial clones of postnatal mouse testes. PLoS One. 2013;8(1): e53976.

6. Sweetman D, Smith T, Farrell ER, Chantry A, et al. The conserved glutamine-rich region of chick csal1 and csal3 mediates protein interactions with other spalt family members. Implications for Townes-Brocks syndrome. The Journal of biological chemistry. 2003; 278(8): 6560-6.

7. Gao C, Kong NR, Chai L. The role of stem cell factor SALL4 in leukemogenesis. Critical reviews in oncogenesis. 2011; 16(1-2): 117-27.

8. Sakaki-Yumoto M, Kobayashi C, Sato A, Fujimura S, et al. The murine homolog of SALL4, a causative gene in Okihiro syndrome, is essential for embryonic stem cell proliferation, and cooperates with Sall1 in anorectal, heart, brain and kidney development. Development (Cambridge, England). 2006; 133(15): 3005-13.

9. Cao D, Guo S, Allan RW, Molberg KH, et al. SALL4 is a novel sensitive and specific marker of ovarian primitive germ cell tumors and is particularly useful in distinguishing yolk sac tumor from clear cell carcinoma. The American journal of surgical pathology. 2009; 33(6): 894-904.

10. Warren M, Wang W, Spiden  S, Chen-Murchie D, et al. A Sall4 mutant mouse model useful for studying the role of Sall4 in early embryonic development and organogenesis. Genesis (New York, NY: 2000). 2007; 45(1): 51-8.

11. Bellairs, R, Osmond, M.The Atlas of Chick Development; 2th Ed; London: Department of Anatomy and Developmental Biology, University College London, UK; 2005.

12. Barron M, Gao M, Lough J. Requirement for BMP and FGF signaling during cardiogenic induction in non-precardiac mesoderm is specific, transient, and cooperative. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 2000; 218(2): 383-93.

13. Delot EC, Bahamonde ME, Zhao M, Lyons KM. BMP signaling is required for septation of the

 

outflow tract of the mammalian heart. Development (Cambridge, England). 2003; 130(1): 209-20.

14. Cao D, Li J, Guo CC, Allan RW, et al. SALL4 is a novel diagnostic marker for testicular germ cell tumors. The American journal of surgical pathology. 2009; 33(7): 1065-77.

15. Kobayashi D, Kuribayashi K, Tanaka M, Watanabe N. Overexpression of SALL4 in lung cancer and its importance in cell proliferation. Oncology reports. 2011; 26(4): 965-70.