اثرات مدت تنش‌ القایی اکسیداتیو ملایم پیش از انجماد بر کیفیت اسپرم گاو بعد از فرآیند انجماد-ذوب

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 گروه علوم دامی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران، کرج، ایران و گروه جنین شناسی، پژوهشکده علوم تولید مثل، پژوهشگاه رویان، تهران، ایران

2 گروه علوم دامی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران، کرج، ایران

3 گروه جنین شناسی، پژوهشکده علوم تولید مثل، پژوهشگاه رویان، تهران، ایران

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی اثرات زمان تنش‌ القایی اکسیداتیو ملایم با استفاده از نیتریک اکساید پیش از انجماد بر کیفیت اسپرم گاو پس از فرآیند انجماد- ذوب بود.
مواد و روش‌ها: در این آزمایش، زمان تعادل پیش از انجماد 120 دقیقه در نظر گرفته شد. مقدار یک میکرومول نیتریک اکساید در زمان صفر (T0)، 45 دقیقه (T45)، 90 دقیقه (T90) و 120 دقیقه (T120) دوره سرد سازی پیش از انجماد به رقیق‌کننده اضافه شد. فراسنجه‌های جنبایی، یکپارچگی غشا پلاسمایی، زنده‌مانی، سلامت آکروزوم، وضعیت آپوپتوزیس و فعالیت میتوکندری اندازه‌گیری شدند.
نتایج: ایجاد تنش اکسیداتیو با نیتریک اکساید در گروه‌های T0 و T45 باعث بهبود معنی‌دار جنبایی کل (8/2± 4/88 و 8/2±7/84) و پیش‌رونده (5/2±4/50 و 5/2±5/49) در مقایسه با سایر گروه‌ها شد (05/0p<). درصد یکپارچگی غشا و زنده‌مانی در گروه‌های  T0 (9/2±4/74 و 3/2±6/85) و T45 (9/2±6/75و 3/2±6/84) اختلاف معنی‌داری با هم نداشتند (05/0<p)، در حالی‏که در مقایسه با گروه‌‌های T90 (9/2±6/63 و 3/2±6/69) و T120 (5/61 و 54) به‏طور معنی‌داری بالاتر بودند (05/0p<). درصد میتوکندری فعال در گروه T0 با میزان (1/3±5/82) به‌طور معنی‌داری با گروه‌های 45، 90 و 120 (به‏ترتیب 1/3±7/65،‌ 1/3±42،‌ 1/3±43) اختلاف نشان دادند (05/0 p<). زمان تنش تاثیر معنی‌داری بر یکپارچگی آکروزوم و درصد خطی بودن اسپرم‌ها نداشت (05/0< p).
نتیجه‌گیری: به‏نظر می‌رسد که با القای تنش‌های اکسیداتیو ملایم با استفاده از غلظت یک میکرومول نیتریک اکساید در زمان‌های صفر و 45 دقیقه سردسازی، باعث بهبود کیفیت اسپرم گاو پس از فرآیند انجماد-ذوب شد.
 

کلیدواژه‌ها


تلقیح مصنوعی تنها راه حصول بیشینه­ی بازده ژنتیکی و کاهش بیماری­های تولید­مثلی است و تلقیح مصنوعی موفق متاثر از عوامل متعددی می­باشد که یکی از اصلی­ترین و کلیدی­ترین آن‏ها دسترسی به اسپرم­های بارور بعد از فرآیند انجماد-ذوب می­باشد (1). از طرف دیگر، تنش­های اسمزی، شیمیایی و مکانیکی طی فرآیندهای انجماد-ذوب مهم‏ترین دلایلی هستند که تغییرات فراساختاری، بیوشیمیایی و عمل‏کردی را در اسپرم به‏وجود می‌آورد که در نتیجه آن، اسپرم تحت تاثیر این فرآیند قرار گرفته و مجموعه­ای از پدیده­های آبشاری منجر به کاهش باروری اسپرم خواهد شد (2). رادیکال­های آزاد را می­توان اصلی‫ترین عامل تنش شیمیایی یا تنش اکسیداتیو طی فرآیند انجماد-ذوب دانست که به دو نوع ROS و RNS دسته‏بندی می­شوند که آنیون سوپراکسید (O-2) هیدروژن پراکسید (H2O2)، هیدروکسیل،‌ نیتریک اکسید، نیتروز اکسید نمونه­هایی از فعال­ترین آن­ها می­باشند (3 و 4). آنچه که تاکنون نشان داده شده است این است که راهبرد کاربرد آنتی اکسیدانت­ها در راستای رفع آسیب­های وارد به سلول­ها و به‏خصوص کاهش صدمات ناشی از فرآیند انجماد-ذوب در اسپرم کافی نبوده است، زیرا که اسپرم قادر است تنها از مقدار اندکی از آنتی‏اکسیدانت‏های‏ اضافه شده به رقیق کننده استفاده کند و از همه مهم‏تر اینکه آنتی اکسیدانت­های استفاده شده طی زمان فرآوری و سردسازی اسپرم خصوصیات حفاظتی خود را از دست می­دهند[3]. این موضوع سبب شده است که محققین استفاده از روش­های مکمل آنتی اکسیدانتی را به‏عنوان یکی از راه‏کارهای نوین برای آماده سازی اسپرم در مقابل صدمات ناشی از فرآیند انجماد-ذوب به‏کار ببرند (5). به‏نظر می­رسد که تنش­های هیدروستاتیک، اسمزی و حتی تنش­های اکسیداتیو از جمله راه‏کارهایی باشند که با بررسی میزان و زمان تنش آن­ها به اسپرم راه‏کاری برای افزایش راندمان باروری در حیوانات به خصوص در افزایش کیفیت اسپرم بعد از فرآیند انجماد-ذوب باشد. در این آزمایش، هدف آن است که بتوان با بررسی زمان‏های مختلف ایجاد تنش­های اکسیداتیو ملایم در دوره­های مختلف سردسازی،‌ سیستم دفاعی اسپرم را در مقابل تنش­های جدی­تر در فرآیند انجماد-ذوب تحریک کرد. بنابراین، زمان ایجاد تنش تعدیل شده در دوره سردسازی را می­تواند اصلی­ترین موضوع مطالعه برای تعیین زمان بهینه­ی ایجاد تنش در این مطالعه دانست. ایجاد تنش اکسیداتیو در محیط انجماد اسپرم در این تحقیق راه‏کاری نوین در پژوهش­های اسپرم می­باشد. تاکنون ایجاد شوک­های اسمزی و هیدروستاتیک در محیط­های انجماد اسپرم، محیط بلوغ اووسیت و نیز محیط کشت رویان به میزان محدودی بررسی شده است اما این مطالعه تلاش بر آن دارد که با ایجاد تنش­های اکسیداتیو در زمان­های مختلف، اثرات آن­ها را بر کیفیت اسپرم پس از فرآیند انجماد-ذوب شامل فراسنجه­های جنبایی، یکپارچگی غشا، زنده­مانی، آپوپتوزیس، سلامت آکروزم و فعالیت میتوکندری بررسی نماید.

 

مواد و روش‏ها

جمع­آوری منی: در این آزمایش از شش گاو نر نژاد هلشتاین با میانگین سنی 2  تا 5/2 سال واقع در مرکز تولید اسپرم زر ژن (فیروزکوه، تهران) استفاده شد. گاوها در یک مکان مسقف و در شرایط نوری مناسب و استاندارد نگه‏داری شدند و جیره­ی گاوها در حد نگه‏داری و بر اساس توصیه استانداردهای گاو نر هلشتاین تنظیم شده بود. اسپرم­گیری از گاوها به صورت هفته­ای یکبار و با استفاده از واژن مصنوعی انجام شد و پس از اسپرم­گیری، نمونه­ها به آزمایشگاه منتقل شد و بررسی­های اولیه روی اسپرم­ها صورت گرفت. نمونه­هایی با جنبایی کل بیش از 70 درصد و حداقل غلظت 106×500 در هر انزال به‏عنوان نمونه طبیعی در نظر گرفته شد و سپس با توجه به احتمال وجود اثرات متقابل بین نمونه­ها، نمونه­های اسپرم دریافتی با هم مخلوط شدند (6). نمونه­های مخلوط شده به چهار بخش مساوی تقسیم شدند و با محیط انجماد رقیق سازی صورت گرفت.

آماده­سازی محیط انجماد: مطابق با دستورالعمل رقیق کننده اپتیدیل (Biovet, France)، رقیق سازی آن با آب دو بار تقطیر انجام شد و سپس به‏مدت پنج دقیقه مخلوط شدند. سپس لوله حاوی مایع رقیق­کننده داخل حمام آب گرم 37 درجه سانتی‏گراد  قرار گرفت. بعد از آن تیمارهای آزمایشی با نمونه‏های اسپرم گرفته شده از گاوها مخلوط و به‏خوبی هموژن شدند.

تیمار: تیمارهای آزمایشی در این آزمایش شامل چهار زمان اضافه شدن نیتریک اکساید به‏عنوان یک تنش اکسیداتیو در رقیق کننده اپتیدیل بود. دوره سرد سازی در این آزمایش 120 دقیقه در نظر گرفته شد و  زمان­های تنش به‏صورت زیر اعمال شد: تیمار 1 (T0): افزودن غلظت 1 میکرومول نیتریک اکسید در زمان صفر سردسازی (آغاز سرد سازی). تیمار 2 (T45): افزودن غلظت 1 میکرومول نیتریک اکسید در زمان 45 دقیقه سردسازی. تیمار 3 (T90): افزودن غلظت 1 میکرومول نیتریک اکسید  در زمان 90 دقیقه سردسازی. تیمار 4 (T120): افزودن غلظت 1 میکرومول نیتریک اکسید در زمان 120 دقیقه سردسازی.

 انجماد و  ذوب اسپرم: پس از طی شدن زمان تعادل، نمونه‏های اسپرم در داخل پایوت­های 25/0 کشیده شدند. سپس نمونه­های اسپرم بسته بندی شده و به­وسیله دستگاه انجمادگر قابل برنامه­ریزی (Digit Cools , IMVs Technologies, L’Aigle Cedex, France) منجمد شدند. شیب انجماد در این دستگاه به گونه­ای تنظیم شد که 4 تا 5- درجه در 4 دقیقه، 5- تا 110- در 25 دقیقه و 110- تا 140- درجه سانتی­گراد در 35 دقیقه بود این امر به‏دلیل جلوگیری از تنش­های شدید سرمایی و آسیب نزدن به‏موجب تشکیل کریستال­های یخ انجام می­شود. پس از رسیدن دما به 140- درجه سانتی‏گراد نمونه­ها به سرعت برداشته شده و در درون لیوان­های پر از ازت غوطه­ور شدند. برای ذوب منی، پس از خارج کردن پایوت­های از ازت، به‏مدت 30 ثانیه در داخل آب گرم 37 درجه سانتی‏گراد قرار داده شدند.

ارزیابی اسپرم پس از انجماد جنبایی: اولین فراسنجه مورد ارزیابی در این تحقیق بررسی جنبایی اسپرم پس از ذوب شدن بود. به این منظور سه پایوت از هر گروه ذوب و به‏داخل لوله­های 5 میلی­لیتری انتقال داده شدند. سپس 7 تا 10 میکرولیتر از منی روی لام گذاشته شده و جنبایی نمونه با استفاده از سیستم آنالیز اسپرم کامپیوتری (CASA) بررسی شد.

یکپارچگی غشا: در این مطالعه برای بررسی سلامت غشا اسپرم­ها از محلول هیپواسموتیک استفاده شد. در این آزمایش از محیطی با فشار اسمزی 100 میلی­اسمول استفاده شد. فشار اسمزی طبیعی برای اسپرم­های گاو 425 تا 525 میلی­اسمول در لیتر می­باشد. بنابراین، اسپرم با قرار گرفتن در یک محیط با اسمولاریتی پایین به‏سرعت واکنش نشان می­دهد. واکنش اسپرم­ها به محیط هایپواسمول به‏صورت تورم دم می­باشد. در این‏حالت اسپرم­هایی که غشا پلاسمایی سالمی دارند به محلول واکنش داده ولی اسپرم­های ناسالم بدون واکنش باقی می­مانند. در تحقیق حاضر آزمایش تورم هیپواسمتیک مطابق با روش ریوال و همکاران (7) انجام شد. ده میکرولیتر از اسپرم ذوب شده با 100 میکرولیتر از محیط هایپواسموتیک که حاوی فروکتوز )9 گرم/لیتر( و سیترات سدیم )9/4 گرم/لیتر( بود، مخلوط گردید. سپس، 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. پس از گذشت این زمان و با تهیه حداقل 3 قطره (10 میکرولیتر) از نمونه انکوبه شده، اسپرم­ها با استفاده از میکروسکوپ نوری بررسی شدند. بررسی میکروسکوپی با استفاده از یک صفحه داغ در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و با بزرگ‌نمایی 400 صورت گرفت. در هر گروه حداقل 200 اسپرم شمارش شد و درصد اسپرم­های دارای غشای یکپارچه برآورد شد.

سلامت آکروزم: برای ارزیابی سلامت آکروزوم، میزان 500 میلی‏لیتر از نمونه اسپرم با میکرولیتر اتانول 96 درصد تثبیت شد و سپس محلول به‏مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‏گراد قرار گرفت تا فرآیند تثیبت به‏طور کامل انجام شود. پس از آن، 20 میکرولیتر از رنگ PSA (Pisum sativum agglutinin) به آن اضافه و یک لام گسترش تهیه شد و پس از غوطه­ور کردن آن در آب اجازه داده می­شود تا لام خشک شود و با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس (Olympus 51;BX) تعداد اسپرم­های با آکروزم سالم شمرده ­شد. اسپرم­هایی با سر سبز به‏عنوان آکروزوم سالم و اسپرم با کمربند سبز به‏عنوان اکروزوم تخریب شده در نظر گرفته شد (8).

آپوپتوزیس: برای ارزیابی میزان آپوپتوزیس و زنده­مانی اسپرم، از کیت آنکسین-V (rland the Ne the ,Groningen ,IQP) و بر طبق دستورالعمل کارخانه استفاده شد. به‏طور خلاصه، اسپرم­ها در بافر کلسیم شسته شدند و پس از تنظیم غلظت آن به یک میلیون اسپرم در میلی­لیتر، 10 میکرولیتر آنکسین -VFITC به 100 میکرولیتر مخلوط اسپرم افزوده شد و برای مدت 20 دقیقه در دمای محیط انکوبه شد. سپس، 10 میکرولیتر PI (propidiuom Iodide) به مخلوط اسپرم افزوده شد و مجددا برای مدت 10 دقیقه در دمای محیط انکوبه شد و سپس با استفاده از دسگاه فلوسایتومتر (Becton Dickinson, San Khosoz, CA, USA) مورد ارزیابی قرار گرفتند. بر طبق نتایج فلوسایتومتری، اسپرم­های زنده )-PI/-Annexsin(، اسپرم­های مراحل ابتدایی آپوپتوزیس )-PI/+Annexsin( و اسپرم­های­ مرده )+PI/+Annexsin و +PI/-Annexsin( تعیین شدند (9). برای هر نمونه تعداد 10000 رخداد جمع­آوری شد.

میتوکندری: درصد اسپرم­هایی با میتوکندری فعال به­وسیله رودامین-123 (R123; Invitrogen, Eugene, OR, USA) و PI ارزیابی شد. به‏طور خلاصه، میزان 10 میکرولیتر از محلول رودامین-123 (01/0 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر) به 500 میکرولیتر نمونه منی رقیق شده افزوده شد و به‏مدت 20 دقیقه در مکان تاریک قرار گرفت. سپس، نمونه­ها به مدت 3 دقیقه با سرعت 500 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند و پلت اسپرم در 500 میکرولیتر بافر تریس مجددا مخلوط شد. سپس، 10 میکرولیتر PI (1 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر) به مخلوط اسپرم افزوده شد و در آخر، نمونه­ها به­وسیله فلوسایتومتر (Becton Dickinson, San Khosoz, CA, USA) ارزیابی شد (9). برای هر نمونه تعداد 10000 رخداد جمع­آوری شد.

آنالیز آماری: این آزمایش در قالب طرح آماری کاملا تصادفی با شش تکرار انجام شد و آنالیز داده­ها با نرم­افزار آماری SAS 9.1 و با رویه­ی GLM صورت گرفت. میانگین­های به‏دست آمده با استفاده از روش توکی مقایسه شدند.

 

نتایج

همان‏طور که در جدول 1 نشان داده شده است درصد جنبایی، جنبایی پیش رونده، سلامت غشا و سرعت در مسیر منحنی اسپرم در اسپرم­های گروه­های T0 (به‏ترتیب، با مقادیر 8/2±4/88، 5/2±4/50، 9/2±‌4/74 و5/3±6/60) و T45 (به‏ترتیب، با مقادیر 8/2±7/84، 5/2±‌5/49، 9/2±6/75 و 5/3±4/58) به‏طور معنی­داری در مقایسه با سایر گروه­ها افزایش پیدا کرده است (05/0p<). ایجاد تنش‏های القایی در زمان­های مختلف آزمایش موجب اختلاف معنی­داری در درصد خطی بودن اسپرم­ها پس از انجماد-ذوب نشد (05/0<p). همچنین، نتایج نشان می­دهد که گروه­های T90 و T120 در مقایسه با گروه­های T0 و T45 باعث کاهش معنی­داری در فراسنجه­های جنبایی اسپرم و سلامت غشای اسپرم گردید (05/0p<). همچنین، بین گروه­های T0 و T45 اختلاف معنی­داری از نظر فراسنجه­های فوق مشاهده نشد (05/0<p).

 

 

جدول 1: میانگین ± SEM فراسنجه­های جنبایی و سلامت غشای اسپرم گاو پس از انجماد در زمان­های مختلف تنش اکسیداتیو. a، b، c در هر ردیف، اعدادی که حروف مشترک دارند، تفاوت معنی­داری ندارند (05/0<P).

صفت

T0

T45

T90

T120

جنبایی کل (%)

4/88a6/2±

7/84a9/2±

5/74b7/2±

8/69c8/2±

جنبایی پیشرونده (%)

4/50a5/2±

5/49a1/2±

4/41b7/2±

8/32c6/2±

سرعت­ در مسیرمیانگین (µm/s)           

5/3±6/44

3±3/45

4/3±6/42

5/2±7/41

سرعت در مسیر مستقیم  (µm/s)                       

3/35b5/3±

6/49a1/3±

35b7/3±

6/31b3/3±

سرعت در مسیر منحنی (µm/s)                                     

6/60a8/3±

4/58a9/2±

2/54b3/3±

5/53b6/3±

خطی بودن جنبایی (%)

5/2±4/38

2±6/36

1/2±5/39

8/2±/41

سلامتی غشاء (%)

4/74a5/2±

6/75a4/3±

6/63b8/2±

5/61b5/2±

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1 میانگین درصد یکپارچگی آکروزم اسپرم و اسپرم­های دارای میتوکندری­های فعال را پس از تحمل تنش­های تعدیل شده نشان می‏دهد. درصد میتوکندری­های فعال در گروه T0 (1/3±5/82) به‏طور معنی­داری در مقایسه با گروه­های T45، T90 و T120 (به ترتیب، با مقادیر 71/3±7/65، 1/3±42 و 1/3±43) بالاتر بود (05/0p<). همچنین، درصد اسپرم­ها‏ی دارای میتوکندری­های فعال در گروه T45 (1/3±7/65) به‏طور معنی­داری در مقایسه با گروه­های T90 و T120 (به‏ترتیب، با مقادیر 1/3±42 و 1/3±43) بالاتر بود (05/0p<). در مقایسه بین گروه­های T90 و T120 اختلاف معنی­داری در اسپرم­ها‏ی دارای میتوکندری فعال پس از انجماد-ذوب مشاهده نشد (71/3±42 در مقابل 71/3±43). همچنین، نتایج نشان داد که اختلاف معنی­داری بین گروه­های مختلف از نظر یکپارچگی آکروزوم اسپرم وجود ندارد.

نتایج به‏دست آمده نشان می­دهد که در گروه­های T0 و T45 بیشترین درصد اسپرم­های زنده (به‏ترتیب، با مقادیر 3/2±6/85 و 3/2±4/84) و کمترین درصد اسپرم­های دچار آپوپتوزیس (به‏ترتیب، با مقادیر 4/2±8/10 و 4/2± 8/12) وجود دارند، که این مقادیر در مقایسه با گروه­های T45 و T90 دارای اختلاف معنی­داری بود (05/0p<). همچنین، اختلاف معنی­داری در درصد اسپرم­های مرده در گروه­های مختلف مشاهده نشد (05/0<p) (شکل 2).

 

 

 

شکل 1: میانگین ± SEMیکپارچگی آکروزم اسپرم  و فعالیت میتوکندری اسپرم گاو پس از انجماد در زمان‏های مختلف تنش اکسیداتیو. a، b، c نقاطی که حروف مشترک دارند، تفاوت معنی­داری ندارند (05/0<P).

 

 

 

شکل 2: : میانگین ± SEMدرصد اسپرم­های زنده، آپوپتوزیس و مرده پس از انجماد در زمان­های مختلف تنش اکسیداتیو. a، b، c ستون­هایی که حروف مشترک دارند، تفاوت معنی­داری ندارند (05/0<P).

 

 

بحث

فرآیند انجماد ذوب در اسپرم پستانداران به‏دلیل تولید رادیکال‫های آزاد و اثرات تخریبی آن­ها بر غشای پلاسمایی، با کاهش کیفیت اسپرم پس از فرایند انجماد-ذوب همراه است(10). همواره در سال­های اخیر محققین تلاش­های زیادی برای حذف رادیکال­های آزاد از محیطهای انجماد-ذوب داشته­اند. تمام روش­های جلوگیری از فعالیت رادیکال­های آزاد همواره روش­های تدافعی بوده است (11). این روش­ها به‏طور رایج شامل استفاده از آنتی اکسیدان­هایی همچون گلوتاتیون، سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و سایر آنزیم­های سنتتیک می‏باشد که قابلیت نسبتا خوبی برای مقابله با رادیکال­های آزاد دارند (12). اما آنچه که مهم است این است که همیشه در محیط­های انجماد- ذوب به‏دلیل تنش‌های شدید حرارتی و اکسیداتیو غلظت رادیکال­های آزاد بیشتر از آنتی اکسیدان­ها بوده است (13). این موضوع محققین را برآن داشته است که روش­های جایگزینی همچون روش­های تهاجمی کنترل شده را برای مقابله با تنش­های اکسیداتیو اسپرم بررسی کنند (14). تاکنون در زمینه تولید مثل، تنش­های متعددی مانند تنش­های حرارتی، تنش­های فشار هیدروستاتیک و تنش­های اسمزی بر روی اووسیت، رویان و اسپرم انجام شده است. مطالعات نشان می­دهد که القا کردن تنش­هایی مانند فشار هیدروستاتیک بر اسپرم باعث افزایش کیفیت آن­ها و بهبود جنبایی و زنده­مانی اسپرم پس از فرآیند انجماد-ذوب می­گردد. در مطالعه دیگری توسط کو و همکاران (15) با ایجاد تنش­های ملایم هیدروستاتیک بر اسپرم خوک، تفاوت معنی­داری در نرخ آبستنی پس از تلقیح مصنوعی مشاهده نشد ولی نرخ چند قلوزایی در گروه اسپرم­های با تنش ملایم­تر افزایش معنی­داری پیدا کرد. در این باره، محققین معتقدند که ایجاد تنش­های ملایم می­تواند باعث افزایش پروتئین­هایی در داخل اسپرم شود که نقش مهمی در فرآیند لقاح ایفا می­کنند. نتایج مطالعات اولیه ما نیز نشان می­دهد که تنش­های اکسیداتیو با استفاده از سطوح پایین نیتریک اکساید می­تواند باعث افزایشی معنی­دار در کیفیت اسپرم گاو گردد. پس از طرح ریزی اولین آزمایش که دامنه گسترده­ای از نیتریک اکساید برای ایجاد تنش مورد بررسی قرار گرفت، نتایج نشان داد که یک میکرومول نیتریک اکساید نه تنها اثرات تخریبی بر اسپرم ندارد بلکه باعث افزایش و فعال شدن سیستم درونی اسپرم می­گردد به‏طوری‏که کیفیت این گروه از اسپرم­ها به‏صورت معنی­داری در مقایسه با گروه شاهد بالاتر می­رود. نتایج نشان می­دهد که زمان القای تنش اکسیداتیو تاثیرات گوناگونی بر عمل‏کرد سلول خواهد گذاشت(11).نتایج این مطالعه نشان می­دهد که ایجاد تنش‏های اکسیداتیو در ابتدای دوره­ی سرد سازی تاثیرات بهتری بر جنبایی، یکپارچگی غشا پلاسمایی، زنده­مانی و فعالیت میتوکندریایی اسپرم پس از فرآیند انجماد- ذوب دارد. با توجه به اینکه دوره­ی سردسازی در این انجماد 120 دقیقه بود، لذا چهار زمان برای ایجاد تنش اکسیداتیو شامل زمان­های صفر، 45، 90 و 120 انتخاب شد. در فراسنجه­های جنبایی، درصد جنبایی کل و پیش رونده در اسپرم­های تنش دیده در زمان‏های صفر و 45 بالاترین درصد مشاهده شد، در حالی‏که در اسپرم­های تنش دیده در زمان­های 90 و 120 درصد جنبایی کل و پیش رونده کاهش معنی­داری مشاهده شد (05/0p<). همچنین، فراسنجه‏های یکپارچگی غشا و زنده­مانی و فعالیت میتوکندریایی نشان می­دهد که در زمان­های صفر و 45 دقیقه بهبود قابل توجهی در مقایسه با سایر زمان­ها وجود دارد. نتایج این آزمایش نشان می­دهد که ایجاد تنش­های اکسیداتیو با استفاده از نیتریک اکساید در زمان­های ابتدایی سردسازی فرصت بیشتری برای فعال شدن سازوکارهای درونی اسپرم ایجاد می­کند. این سازوکارهای احتمالی شامل فعال شدن و فسفریلاسیون پروتئین­ها و چاپرون‫های درون سلولی مانند پروتئین­های شوک حرارتی است که می­توانند در اثر انواع مختلف تنش­ها افزایش پیدا کنند (16). این پروتئین­ها قادر هستند در ترمیم­های درون سلولی شامل ترمیم شکست DNA و فعال‏سازی ساز وکارهای پیام رسانی درون سلولی نقش مهمی ایفا کنند. همچنین، محققین معتقدند که فعال شدن پروتئین­های شوک حرارتی می­تواند باعث جلوگیری از فعال شدن مسیرهای داخلی و خارجی آپوپتوزیس در اسپرم شوند (17). نتایج مطالعه حاضر نیز موید این مطلب است، زیرا در گروه­هایی که اسپرم زمان بیشتری برای مقابل با تنش­های ملایم داشته است درصد اسپرم­های دچار آپوپتوزیس به‏طور معنی­داری کاهش پیدا کرده است (05/0p<). همچنین القای تنش اکسیداتیو ملایم در اوایل دوره سردسازی شامل زمان‌های صفر و 45 دقیقه سردسازی توانست به‏خوبی سطح اسپرم­های با میتوکندری فعال را افزایش دهد. در شرایط طبیعی، تولید رادیکال­های آزاد به‏طور کنترل شده­ای در اسپرم انجام می‫شود اما تحت تنش­های زیاد کنترل تولید آن از اسپرم خارج شده و میزان آن زیاد می­شود و منجر به تغییراتی در اسپرم می‌گردد (18). تحقیقات نشان می­دهد که پروتئین‌های ویژه­ای در میتوکندری وجود دارند که تحت شرایط خاص تنش افزایش پیدا می­کند. این پروتئین باعث افزایش تنفس میتوکندری و مهار فعالیت رادیکال­های آزاد می­شود. همچنین، این پروتئین­ها در زمان تنش نیز در مقابل تنش­های احتمالی از DNA محافظت می­کنند (19). از طرف دیگر با توجه به اینکه  هرچه تعداد میتوکندری­های فعال اسپرم افزایش پیدا کند انرژی لازم برای جنبایی اسپرم بیشتر فراهم می‏شود،‌ در تحقیق حاضر نیز یکی از دلایل افزایش میزان جنبایی اسپرم و به‏خصوص جنبایی پیش رونده اسپرم می‌تواند به حفظ شدن بهتر ساختار میتوکندری و تعداد میتوکندری‌های فعال اسپرم در گروه­های تنش ملایم باشد (20). با توجه به تحقیق انجام شده،‌ به‏نظر می‌رسد که استفاده از نیتریک اکساید در سطح یک میکرومول در ابتدای دوره سردسازی  بتواند تنش اکسیداتیو القایی مناسبی را برای اسپرم فراهم کند. این تنش در صورتی‏که به‏طور صحیحی به اسپرم القا شود می­تواند کیفیت اسپرم گاوهای نر هلشتاین را به‏طور معنی‏داری بهبود دهد.

 

نتیجه گیری

با توجه به نتایج به‏دست آمده از این مطالعه به‏نظر می­رسد که بتوان با القای تنش اکسیداتیو ملایم با استفاده از غلظت یک میکرومول نیتریک اکساید در ابتدای دوره سردسازی شامل زمان‌های صفر و 45 دقیقه سردسازی، باعث بهبود فراسنجه­های کیفی اسپرم موثر در باروری پس از فرآیند انجماد-ذوب شد. انجام تحقیقات بیشتر به‏منظور آشکارسازی ساز و کارهای درون سلولی این فرآیند و ارزیابی­های بیشتر آزمایشگاهی و مزرعه­ای ضروری به‏نظر می­رسد.

 

تشکر و قدردانی

نویسندگان مقاله از شرکت تولید اسپرم زر ژن فیروزکوه و همچنین گروه بیولوژی اسپرم پژوهشگاه رویان برای حمایت­های بی­دریغشان تشکر و قدردانی می­کنند.   

1. Bailey JL, Bilodeau j, Cormier N. Semen cryopreservation in domestic animals: a damaging and capacitating phenomenon. J Androl. 2000; 21(1): 1-9.

2. Batista M. Successful artificial insemination using semen frozen and stored by an ultrafreezer in the Majorera goat breed. Theriogenology. 2009; 71: 1307-1315.

3. Bucak MN, Atessahin A, Varisli O, Yuce A, et al. The influence of trehalose, taurine, cysteamine and hyaluronan on ram semen Microscopic and oxidative stress parameters after freeze-thawing process. Theriogenology. 2007; 67: 1060-1067.

4. Chatdarong K, Chaivechakarn A, Thuwanut P, Ponglowhapan S. Effects of cold storage prior to freezing on superoxide dismutase, glutathione peroxidase activities, level of total reactive oxygen species and sperm quality in dogs. Reprod Dom Anim. 2012; 47: 274-277.

5. Baumber J, Ball Linfor JJ. Assessment of the cryopreservation of equine spermatozoa in the presence of enzyme scavengers and antioxidants. Am J Vet Res. 2005; 66: 772- 779.

6. Ijaz A, Hussain  A, Aleem M, Yousaf MS, et al. Butylated hydroxytoluene inclusion in semen extender improves the post-thawed semen quality of Nili-Ravi buffalo (Bubalus bubalis). Theriogenology. 2009; 71(6): 1326– 1329.

7. Revell S, Mrode R. An osmotic resistance test for bovine semen. Anim Reprod Sci. 1994; 36: 77-86.

8. Mendoza C, Carreras A, Moos J, Tesarik J. Distinction between true acrosome reaction and degenerative acrosome loss by a one-step staining method using Pisum sativum agglutinin. J Reprod Fertil. 1992; 95: 755-763.

9. Najafi A, Zhandi M, Towhidi A, Sharafi M, et al. Trehalose and glycerol have a dose-dependent synergistic effect on the post-thawing quality of ram semen cryopreserved in a soybean lecithin-based extender. Cryobiology. 2013; 66: 275–282.

10. Keskes-Ammar L, Feki-Chakroun N, Rebai T, Sahnoun Z, et al. Sperm oxidative stress and the effect of an oral vitamin E and selenium supplement on semen quality in infertile men. Syst Biol Reprod Med. 2003; 49: 83-94.

11. Pribenszky C, Vajta G, Molnar M, Du Y, et al. Stress for stress tolerance? A fundamentally new approach in mammalian embryology. Biol Reprod. 2010; 83: 690-697.

12. Shan B, Cai YZ, Sun M, Corke H. Antioxidant capacity of 26 spice extracts and characterization of their phenolic constituents. J Agric Food Chem. 2005; 53(20): 7749-7759.

13. Pena F, Johannisson A, Wallgren M, Rodriguez Martinez H. Antioxidant supplementation in vitro improves boar sperm motility and mitochondrial membrane potential after cryopreservation of

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

different fractions of the ejaculate. Anim Reprod Sci. 2003; 78(1-2): 85-98.

14. Vandaele L, Thys M, Bijttebier J, Van Langendonckt A, et al. Short-term exposure to hydrogen peroxide during oocyte maturation improves bovine embryo development. Reproduction. 2010; 139: 505-511.

15. Kuo YH, Pribenszky C, Huang SY. Higher litter size is achieved by the insemination of high hydrostatic pressure-treated frozen–thawed boar semen. Theriogenology. 2008; 70: 1366-1395.

16. Kaarniranta K, Elo M, Sironen R, Lammi M, et al. Hsp70 accumulation in chondrocytic cells exposed to high continuous hydrostatic pressure coincides with mRNA stabilization rather than transcriptional activation. Proc Natl Acad Sci. 1998; 95: 2319-2324.

17. Huang SY, Pribenszky C, Kuo YH, Teng SH, et al. Hydrostatic pressure pre-treatment affects the protein profile of boar sperm before and after freezing–thawing. Anim Reprod Sci. 2009; 112(1-2): 136-149.

18. Galley HF. Bench-to-bedside review: targeting antioxidants to mitochondria in sepsis. Crit Care. 2010; 14(4): 230.

19. Michan S, Sinclair D. Sirtuins in mammals: insights into their biological function. Biochem J. 2007; 404(1): 1-13.

20. Ramalho-Santos J, Varum S, Amaral S, Mota P, et al. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod Update. 2009; 15(5): 553-572.